左归复方对2型糖尿病妊娠大鼠组织CD4、TGF-β1的影响

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闷Ｍｌ靡婦？ＨＵＮＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＣＨＩＮＥＳＥＭＥＤＩＣＩＮＥ硕士学位论文——，＇论文题目：左归复方对２型糖尿病任娘大鼠组织ＣＤ４Ｆ－１的影响、ＴＧＰ研究生：彭胡战导师：刘慧萍教授专业：中西结合基础研究方向：内分泌疾病的中医药防治学位类型：科学学位 分类号：R2-031学校代码：10541密级：学号：20143267湖南中医药大学硕士学位论文论文题目：左归复方对2型糖尿病妊娠大鼠组织CD4、TGF-β1的影响研究生：彭胡战导师：刘慧萍教授专业：中西结合基础研究方向：内分泌疾病的中医药防治学位类型：科学学位中国·湖南·长沙二〇一七年五月 原创性声明本人声明，所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果。除了论文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得湖南中医药大学或其他单位的学位或证书而使用过的材料。与我共同的同志对本研宄所作的贡献均己在论文中作了明确的说明。作者签名：｜鱗Ａ年＃月７日关于学位论文使用授权说明本人了解湖南中医药大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文，允许学位论文被查阅和借阅；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以采用复印、缩印或其它手段保存学位论文；学校可根据国家或湖南省有关部门规定送学位￥作者签名：导师签名： 目录中文摘要Abstract中英文索引前言1材料与方法..................................................................................11.1实验材料.................................................................................................11.1.1实验动物.............................................................................................11.1.2主要试剂.............................................................................................11.1.3主要仪器及厂家.................................................................................11.2.实验方法................................................................................................11.2.1实验药物及制备..................................................................................11.2.2大鼠2型糖尿病模型的建立...............................................................21.2.3实验分组..............................................................................................21.2.4给药方法...............................................................................................21.3观察指标...................................................................................................21.3.1一般情况.........................................................................................21.3.2血糖检测.........................................................................................21.3.3标本采集.........................................................................................21.3.4常规HE染色...................................................................................31.3.5免疫组化.........................................................................................31.3.6大鼠胰岛素浓度水平.....................................................................31.4统计学方法................................................................................................42.结果与分析..............................................................................................................42.1一般情况观察..................................................................................................52.2大鼠血清胰岛素浓度水平测定......................................................................52.3大鼠胰腺及蜕膜组织病理学检测，常规HE染色........................................62.4大鼠免疫组化检测所有大鼠胰腺CD4...........................................................62.5大鼠免疫组化检测所有大鼠胰腺TGF-β1...................................................72.6大鼠免疫组化检测所有大鼠子宫的CD4.......................................................8 2.7大鼠免疫组化检测所有大鼠子宫的TGF-β1...............................................93．讨论........................................................................................................................104.结论........................................................................................................................13参考文献......................................................................................................................14致谢..............................................................................................................................17附录综述....................................................................................................................18 摘要目的：通过构建2型糖尿病（T2DM）雌性大鼠妊娠模型，探究左归复方对雌性大鼠2型糖尿病模型的作用及其干预胰岛素浓度水平、组织CD4、TGF-β1表达的影响进一步探讨左归复方对生殖免疫调节的机制。方法：对40只雌性SD大鼠随机分为5组，其中4组以高糖高脂饮食并腹腔注射链脲左菌素（STZ）建立2型糖尿病大鼠模型组，采用电化学法检测各组大鼠血糖的水平，按照血糖水平从低到高排序，随机将40只雌性SD大鼠分为：A正常对照组、B中药低剂量组、C中药高剂量组、D达美康组、E模型组。大鼠按2:1雌雄比例合笼，建立2型糖尿病大鼠妊娠模型。观察动物一般情况，妊娠0.5d开始，A、B、C、D、E组分别以等容量生理盐水、低剂量中药、高剂量中药、达美康混悬液、蒸馏水灌胃21d，腹主动脉采血，放射免疫法对各组大鼠胰岛素的水平进行比较，并观察各组大鼠胰腺组织、子宫及其蜕膜组织病理形态学的变化，免疫组化法检测相应组织CD4、TGF-β1蛋白的表达。结果：腹腔注射STZ后，与正常组大鼠比较，另外4组胰岛素水平则显著降低(P<0.01)。与模型组大鼠比较，中药低剂量组、中药高剂量组胰腺CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，达美康组无统计学意义(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，达美康组、模型组胰腺CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组、中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组胰腺CD4水平差异有统计学意义P<0.05)，中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与模型组大鼠比较，达美康组胰腺TGF-β1水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组、中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，中药低剂量组、模型组、达美康组、中药高剂量组均有胰腺TGF-β1水平差异有统计学意义(P<0.05)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组胰腺TGF-β1水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与模型组大鼠比较，达美康组、中药高剂量组子宫CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，中药低剂量组、模型组、达美康组、中药高剂量组均有子宫CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组子宫CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与模型组大鼠比较，达美康组组子宫TGF-β1水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组、中药大剂量未见明显差异(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，中药低剂量组、模型组、中药高剂量组子宫TGF-β1水平 差异有统计学意义(P<0.05)，达美康组无统计学意义(P>0.O5)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组、中药高剂量组子宫TGF-β1水平差异有统计学意义(P<0.05)。结论：与达美康组相比，左归复方能提高胰岛素水平，对于免疫因子的表达有促进作用，因此可认为其对2型糖尿病慢性并发症有着正性调节作用。关键词：2型糖尿病；左归助孕方；生殖免疫学；胰岛素；血糖 abstractObjective:Throughtheconstructionofthepregnancymodeloftype2diabeticfemalerats,theeffectofzuoguicompoundonthefemaleratswithtype2diabetesandthemechanismofinsulinconcentration,tissueCD4,TGF-β1,furtherexploretheeffectofzuoguicompoundonreproductiveimmunity.Methods:FortyfemaleSDratswererandomlydividedintofivegroups.fourgroupswererandomlydividedintothreegroups:highglucoseandhighfatdietandabdominalinjectionofstreptozotocin(STZ).40femaleSDratswererandomlydividedintonormalcontrolgroup,blargedosegroupandcgroup.2:1maleandfemaleratiomate,establishthepregnancymodeloftype2diabeticrats.Observationofthegeneralsituationofanimals,pregnancyfor0.5days,a,b,c,d,egroupwereisotonicsaline,smalldoseofChinesemedicine,largedoseoftraditionalChinesemedicine,dameikangsuspension,abdominalaortablood,radioimmunoassayforthelevelofinsulininrats.Results:AfterintraperitonealinjectionofSTZ,comparedwithratsingroupa,groupb,c,dandesignificantlyincreasedserumglucoselevel(p<0.01),andthelevelofinsulinsignificantlydecreased(p<0.01);B,c,eandgroupaanddweresignificantlydifferent(p>0.05).Comparedwithgroupeandgroupb,thelevelofbloodglucosewassignificantlydifferent(p<0.01),andthelevelofinsulindifferencewasnotsignificant(p>0.01).Comparedwithblankgrouprats,thepancreasCD4innormalgroup,smalldosegroupandtraditionalChinesemedicinegroupwassignificantlyhigher(p<0.05),reachednosignificantdifference(p>0.05);Comparedwiththenormalgroup,thelevelofCD4intheblankgroupwassignificantdifference(p<0.05),therewasnosignificantdifferencebetweenthetraditionalChinesemedicinelow-dosegroupandtraditionalChinesemedicinegroup(p>0.05);Comparedwithdarats,thenormalgroup,smalldosegroupandblankgroupofpancreasweresignificantlyhigher(p<0.05),thetraditionalChinesemedicinehigh-dosegroupdidnotseesignificantdifference(p>0.05).Comparedwithblankgrouprats,thelevelofTGF-βinnormalgroupanddameikangzugroupwashigher(p<0.05),therewasnosignificantdifferencebetweenthetraditionalChinesemedicinelow-dosegroupandtraditionalChinesemedicine(p>0.05);Comparedwiththenormalgroup,thelevelsofpancreaticTGF-βinthesmalldosegroup,blankgroupgroup,dameikangzugroupandtraditionalChinesemedicinegroupweresignificantlydifferent(p<0.05);Comparedwithdarats,thelevelofTGF-βinnormalgroup,smalldosegroupandblankgroupwassignificantlydifferent(p<0.05),therewasnosignificantdifferenceinlargedosegroup(p>0.05). Comparedwithblankgrouprats,theCD4levelofnormalgroup,dameikangzugroupandtraditionalChinesemedicinegroupwassignificantlyhigher(p<0.05),thetraditionalChinesemedicinesmalldosegroupdidnotseesignificantdifference(p>0.05);Comparedwiththenormalgroup,thelowdosegroup,blankgroupgroup,dameikangzugroupandtraditionalChinesemedicinegrouphavesignificantlylowerserumCD4level(p<0.05);Comparedwithdarats,thenormalgroup,traditionalChinesemedicinesmalldosegroup,blankzuzigongCD4levelsignificantlyhigher(p<0.05),thetraditionalChinesemedicinehigh-dosegroupdidnotseesignificantdifference(p>0.05).Comparedwithblankgrouprats,thelevelofTGF-βinnormalgroupanddameikangzuzugroupwassignificantlyhigher(p<0.05),littledifferenceoftraditionalChinesemedicinegroupandtraditionalChinesemedicine(p>0.05);Comparedwiththenormalgroup,thelevelofTGF-βinthesmalldosegroup,blankgroupgroupandtraditionalChinesemedicinegroupwassignificantlydifferent(p<0.05),reachedthemeikangzugroup(p>0.05);Comparedwithdarats,thelevelofTGF-βinsmalldosegroup,blankgroupgroupandtraditionalChinesemedicinegroupwassignificantlyhigher(p<0.05),nosignificantdifferencebetweenthenormalgroup(p>0.05).Conclusion:Comparedwithda,thelow-doseandlargedoseofontheleftcannotreducethelevelofdashuxietang,lefttoalargedoseofinsulin,lefttosmalldosegroupisnotobvious,butitisimportanttoimprovethereproductivedysfunctionofwomenwithtype2diabetes,andhasapositiveeffectonchroniccomplicationsoftype2diabetes.Keywords:Diabetesmellitustype2;compoundprescriptionofzuogui;Reproductiveimmunology;Insulin;Bloodsugar 中英文索引英文缩写英文名称中文全称INSInsulin胰岛素STZStreptozotocin链脲佐菌素T2DMDiabetesmellitustype22型糖尿病TGF-β1TGF-β1转化生长因子β1BsBloodsugar血糖 前言2型糖尿病（T2DM）在全球呈流行性发展趋势，其占比糖尿病的百分之九十左右。在第六版国际糖尿病联盟(IDF)对糖尿病地图中预测，2013年全球糖尿病患者达到3.8亿，其中80％的患者来自低中收入国家[1]。据调查，我国糖尿病患病率近几年增长迅速，从1980年的低于1％[2]，到1994年的2．5％[3]，至2002年的2．7％[4]，增加至2007年的9．7％[5]，而2型糖尿病中，女性占据了重要的一部分。糖尿病女性患者没有系统治疗前怀孕率仅为0.5％-2％[6]。与非糖尿病患者比较，2型糖尿病患者的生育能力均大幅下降，比值比分别是0.76及0.64[7]。一项在德国的调查研究发现[8]，平均每对健康妇夫生育小孩约1.36个，而每位2型糖尿病女性仅生0.88个小孩，而在这其中35.7%的女性患者是终身不育。2型糖尿病患者的后代明显较正常人群少，甚至终身不孕的比例有所增加。因而，2型糖尿病与生殖的相关性机理受到研究者的关注，其间相关性更是有着相当大的研究前景。众所周知，中国古代很早就对“糖尿病”相关病症有着深刻的认识，在传统中医学中有糖尿病的相关记载，其称为“消渴病”，传统中医中药在2型糖尿病及其并发症的防治有着非同寻常的地位。现代西医学的2型糖尿病相关的系列症状在古代有明确的记载，古书《素问˙奇病论》就有记载“此肥美之所发也，此人必数食甘美而多肥也，肥者令人内热，甘者令人中满，故其气上溢，转为消渴”，而这也是中医学关于“消渴病”的最早文献记载。“消渴”典型症状以多饮、多食、多尿或尿液带有甜味及身体渐瘦为主，基本病机为气阴两虚兼燥热偏胜。近年来，关于2型糖尿病及其慢性并发症中“慢性低度炎症相关性学说”，2型糖尿病及其慢性并发症通常具有的“虚、毒、瘀”的中医病机与炎症发病学说之间密切相关也受到业内学者的关注。“消渴”的“虚”，主要是两方面：肝肾阴虚以及脾气亏虚，是机体产生炎症反应的基本病机特点；而“瘀”、“毒”等相关病理产物的产生也同样反映着相关炎性因子的聚集以及相关炎症反应的发生发展。解放后，祝谌予教授[9]最早提出糖尿病血瘀的病机观点，认为是气阴两虚可以导致血瘀。气阴两虚致气滞血瘀，从而影响水津输布加重消渴，可见血瘀与消渴病间互为因果。祝氏认为“气阴两虚”贯穿于糖尿病整个病程，是糖尿病各个病理阶段所共有的特征。但气虚则推动血行无力，从而血行迟缓，久则致瘀：阴虚则血行滞涩不畅，一样可以致瘀。故气阴两虚是病理变化的关键所在，因此血瘀贯穿着整个病程。关于“消渴”瘀血阻滞,《黄帝内经》早有记载，《灵枢˙五变》中“怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆留……血脉不行，转而为热，热则消肌肤，1 故消瘅。”指出消瘅的发生与血脉不行有关。《金匮要略˙惊悸吐血下血胸满瘀血病脉证治第十六》中也有记载：“病者如热状，烦满，口干燥而渴，其脉反无热，此为阴状，是瘀血也，当下之”，也说明了瘀与“消渴”的关系。《血证论》中唐容川详细论证了瘀血致渴：“瘀血在里则渴。所以然者，血与气本不相离，内有瘀血，故气不得通，不能载水津上升，是以为渴”，认为瘀血阻滞气机运行,影响水津输布，故人渴。本实验中所用“左归复方”以张景岳之“左归丸”化裁而来，以“左归丸”“滋阴”为旨，加入益气、活血之品，而成滋阴益气、活血解毒之法，在临床中治疗2型糖尿病女性生殖功能障碍中见效。本实验所用“左归复方”组方为：生地黄18g，生黄芪18g，淮山药12g，枸杞子6g，菟丝子6g，山茱萸12g，当归6g，白芍6g，续断6g，桑寄生6g，甘草3g，全方11味，其中君药以生地黄和生黄芪养阴益气生津，臣药以枸杞子，山茱萸，菟丝子，白芍均能养阴，淮山药补肺脾肾，兼以当归补血活血，化淤毒，佐以甘草可调和诸味兼能清热毒，全方达滋阴益气，活血化瘀之效。免疫功能性相关引起的不孕[10]是指机体对“下丘脑-垂体-卵巢(睾丸)轴”某一组织抗原的免疫，无排卵、闭经等为女性的一般表现。女性受孕率的降低及流产率、畸形率的升高等女性生殖系统方面疾病越来越受到重视，从生殖免疫学的角度探究，免疫系统关键细胞及蛋白作为生殖免疫学机制中的重要部分，参与了生殖的全过程，本研究从2型糖尿病免疫系统关键细胞及蛋白表达的角度，揭示左归助孕方可调控免疫系统关键细胞及蛋白表达，阐明其在治疗2型糖尿病女性生殖系统功能障碍的所起的作用。2 1.材料与方法1.1实验动物清洁级8周龄雌性SD大鼠40只，雄性健康SD大鼠20只，质量为180-220g，由湖南中医药大学实验动物中心从实验动物有限公司(生产许可证编号：SCXK(湘)2013-0004)提供，大鼠动物质量合格证编号：43004700025632。实验场地：湖南中医药大学动物实验中心（场地许可证编号：SYXK(湘）2013-0005)。1.2实验试剂DEPC、明胶、缓冲液（3％柠檬酸、2xSSC，0.5xSSC、0.2xSSC、PBS）、甲醛；30％、60％、75％、80％、95％和100％乙醇、NaCl、10％甲醛、H-E染色剂、PFA、4％多聚甲醛固定液（湖南中医药大学东塘生物化学实验室）；水合氯醛、柠檬酸、柠檬酸钠（北京华英生物公司）；链霉素青霉素（Hyclone公司）；生理盐水；CrK(SO4)2.12H2O；NaH2PO4；H2O2；磷酸缓冲液（PBS）；二甲苯（分析纯）；免疫组化CD4试剂盒，免疫组化TGF-β1试剂盒,SABC-POD染色试剂盒、SABC免疫组化试剂盒，DAB显色试剂盒（北京华英生物公司）。1.3实验仪器解剖显微镜ClassicaS-30-2L研究型生物显微镜Motic-BA400离心机长沙平凡仪器仪表公司低温高速离心机长沙平凡仪器仪表公司全自动放免计数仪西安核仪器厂：XH-60201.4实验药物左归复方组成：生地黄18g，生黄芪18g，淮山药12g，枸杞子6g，菟丝子6g，山茱萸12g，当归6g，白芍6g，续断6g，桑寄生6g，甘草3g，共11味99g，以上中药材购自湖南中医药大学第一附属医院中药房经鉴定为正品后，经水煎2次合并煎液，过滤浓缩至1g生药/ml，4℃冰箱储存备用。根据体表面积，将60kg人的临床有效剂量折换成大鼠的用量（2.01g/100g即2.01ml/100g）。西药选用达美康（天津华津制药有限公司国药准字H10910053），配为混悬液，将60g人3 的临床剂量1片80mg折算为大鼠的灌胃量（1.62mg/100g,对应1.62mg/1ml即将80mg达美康配成49.38ml混悬液）。1.5模型建立将健康8周龄雌性SD大鼠40只，雄性健康SD大鼠20只分别称质量，按照随机数字表分5组，其中四组予以高糖高脂饮食28天，以25mg/kg浓度STZ连续两天固定时间点腹腔注射形成2型糖尿病模型组[11]。另外一组予以正常饮食，作为正常对照组。检测血糖，以血糖高低顺序，按照随机数字表分为四组。同时雄鼠以体重大小顺序标号，随机分为5组，随机对应合笼，均分别按2:1合笼交配，分别建立2型糖尿病妊娠大鼠模型与正常妊娠大鼠模型。检出阴栓者记为妊娠第0.5d，孕8天为早孕期，孕12天为中孕期。1.6实验分组正常妊娠模型（A组）和2型糖尿病妊娠模型组，其中2型糖尿病妊娠模型组又分为B组（左归复方低剂量组）、C组（左归复方高剂量组）、D组（达美康组）、E组（模型组）。实验共设5组，每组均为8只动物，共40只。1.7给药方法检出阴栓者记为妊娠第0.5d[12]，B、C组分别灌服左归复方低、高剂量，D组灌服达美康混悬液，E组和A组灌服等容量的蒸馏水，每天灌胃一次，连续给药治疗（孕0.5d开始给药）21d。大鼠每2天称重1次，根据质量调整给药剂量。具体如下：正常对照组、模型组：每天灌服等容量（2.01mL/200g大鼠体重）的蒸馏水。左归复方小剂量组：每天灌服剂量为1.01g/200g。左归复方大剂量组：每天灌服剂量为2.01g/200g。阳性对照组：每天灌服等容量浓度为1.62mg/200g达美康片混悬液。根据人临床用药与大鼠用药的剂量间换算方法计算出来用药量[13]。1.8观察指标及检查方法1.8.1一般情况每天定时观察每组雌性大鼠的精神状态、饮食、大小便量、色、味，毛发光泽度、疏密度，活动情况等。观察用药后有无不良反应，有无昏迷、中毒死亡等情况。1.8.2血糖检测分别于注射STZ后3d，怀孕21d，采用剪尾采血，以电化学法4 血糖仪进行血糖检测。1.8.3标本采集末次给药0.5h后腹主动脉采血，分离血清，用放射免疫分析方法测定血清胰岛素浓度，取胰腺及子宫（含蜕膜组织）做病理学检测及常规HE染色。1.8.4病理形态学常规HE染色剪取各组小鼠胰腺组织及1cm大小的子宫组织（含蜕膜组织），置于4％多聚甲醛固定液中固定24h后，再用70％、85％、95％、100％（无水一）、100％（无水二）的乙醇依次脱水，入二甲苯透明40分钟，软蜡中浸1h，石蜡包埋，蜡块冷冻柜12h后用石蜡切片机做连续冠状切片，厚度为4μm，做HE染色，染色完毕，封片，光镜观察、照相。1.8.5免疫组化按免疫组化试剂盒（北京华英生物公司）所示方法检测小鼠胰腺、子宫组织（含蜕膜组织）中CD4、TGF-β1蛋白表达水平。（1）试剂盒试剂如下：1）试剂：3%H2O2去离子水2）试剂1：聚合物辅助剂（即用型，三种试剂盒不可通用）3）试剂2：PV-9001辣根酶标记抗兔IgG聚合物（即用型）4）PV-9002辣根酶标记抗小鼠IgG聚合物（即用型）5）PV-9003辣根酶标记抗山羊IgG聚合物（即用型）（2）免疫染色步骤如下：1）脱蜡、水化组织切片。2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。3）3%H2O2去离子水孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶。4）PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。5）滴加一抗，室温或37℃孵育1-2小时或4℃过夜，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。6）滴加试剂1，室温或37℃孵育10-20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。7）滴加试剂2，室温或37℃孵育10-20分钟，PBS或TBS冲洗，2分钟×3次。8）应用DAB溶液显色。9）自来水充分冲洗、复染、脱水、透明、封片。1.8.6大鼠胰岛素浓度水平放射免疫分析法检测：大鼠4％水合氯醛麻醉后，腹5 主动脉取血，离心后分离血清，按照说明书用大鼠放射免疫试剂盒（北京华英生物技术研究所）对大鼠外周血血清进行检测。本检测由北京华英生物技术研究所（BEIJINGSINO-UKINSTITUTEOFBIOLOGICALTECHNOLOGY）完成，采用放射免疫法检测，放免仪器为XH-6020全自动放免计数仪。药盒组成：1251、I-INS1瓶2、INS抗体1瓶3、INS标准品6瓶，浓度为5、10、20、40、80、160цIU/ml4、缓冲液1瓶5、免疫分离剂(第二抗体)1瓶6、质控血清2瓶操作方法：表1INSRIAKIT操作程序（单位：ul）试剂TNSBS0S1~S6样品缓冲液200100标准品100标品100抗体100100100125I-胰岛素100100100100100然后充分混匀，37℃温育2小时，给试剂T、NSB、S0、S1~S6、样品加入分离剂0ul、500ul、500ul、500ul、500ul。混匀，室温15分钟，3500转/分离心15分钟，去上清，测定沉淀cpm-值。1.9统计学方法运用软件SPSS20.0对数据进行分析，计量资料以“±ｓ”表示，多组间比较检验水准α取0.05，P<0.05采用t检验；P>0.05，采用单因素方差分析；两组间相比较方差齐则用LSD检验，方差不齐则用DunnerT3检验。以P＜0.05表示差异有统计学意义。2.结果与分析2.1大鼠的一般情况观察通过仔细对各组大鼠的饮食量，毛色、光泽度、脱落，精神状态，大小便量、色、味，行为活动等一般情况观察发现，正常对照组大鼠饮食正常，生长发育正常，活动灵敏，皮毛荣润光泽，未见异常活动的出现，与实验前无明显差别。与正常对照组比较，2型糖尿病组大鼠经常蜷缩肢体，对光、6 声等刺激反应敏感度降低，皮毛为枯槁萎黄，有明显脱毛等迹象，进食量明显增多。灌胃达美康组较模型组及中药不同剂量灌胃后的大鼠，活动量及进食量逐渐增多，反应灵敏度好转，但中药高剂量灌胃组一般情况的改变较明显，说明左归复方能有效改善大鼠的一般情况，提高大鼠生存质量。2.2各组大鼠血清胰岛素浓度水平测定通过放射免疫法测定大鼠血清胰岛素浓度，检测结果如下表2：表2各组大鼠血清胰岛素浓度的比较（±ｓ）组别大鼠血清胰岛素浓度(uIU/ml)n（只）正常对照组24.45±1.517中药低剂量组19.99±2.21△△●7中药高剂量组22.26±2.41☆7达美康组23.68±1.79☆☆7模型组18.87±2.93△△7注：与模型组相比☆p<0.05，☆☆p<0.01；与正常组相比△p<0.05，△△p<0.01；与达美康组相比●P<0.01，●●P<0.01。由上可知，与模型组大鼠比较，正常组、达美康组、中药高剂量组胰岛素水平显著较高(P<0.05)，中药低剂量组未见明显差异(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，中药低剂量组、模型组胰岛素水平显著较低(P<0.05)，达美康组、中药高剂量组未见明显差异(P>0.O5)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组、模型组胰岛素水平显著较高(P<0.05)，正常组、中药高剂量组未见明显差异(P>0.O5)。2.3各组大鼠胰腺及蜕膜组织病理形态学检测结果见图1-2图1胰腺组织×40（HE染色）图2子宫组织×40（HE染色）7 2.4免疫组化检测各组大鼠胰腺组织CD4蛋白表达结果如下图3-7及下表3图3正常对照组×200图4中药低剂量组×200图5中药高剂量组×200图6达美康组×200图7模型组×2008 2.5免疫组化检测各组大鼠胰腺组织TGF-β1蛋白表达，结果见图8-12及表3图8正常对照组×200图9中药低剂量组×200图10中药高剂量组×200图11达美康组×200图12模型组×2002.6免疫组化检测各组大鼠子宫组织CD4蛋白表达结果见图13-17及下表39 图13正常对照组×200图14中药低剂量组×200图15中药高剂量组×200图16达美康组×200图17模型组×2002.7大鼠免疫组化检测所有大鼠子宫的TGF-β1蛋白表达结果见图18-22及下表3图18正常对照组×200图19中药低剂量组×20010 图20中药高剂量组×200图21达美康组×200图22模型组×200表3各组大鼠胰腺CD4、TGF，子宫CD4、TGF的比较（±ｓ）组别(n)胰腺CD4胰腺TGF-β1子宫CD4子宫TGF-β1正常对照组(6)0..33±0.060.52±0.010.40±0.020.48±0.03中药低剂量组(6)0.29±0.08☆☆●●0.29±0.08△△●●0.28±0.04△△●●0.36±0.04△△●●中药高剂量组(6)0.37±0.08☆☆0.37±0.08△△0.32±0.03☆△△0.39±0.04△△●达美康组(6)0.43±0.04☆△0.43±0.04☆△0.34±0.03☆△☆0.44±0.03☆☆模型组(6)0..52±0..01△△0.33±0.06△△0.27±0.03△△0.36±0.02△△注：与模型组相比☆p<0.05，☆☆p<0.01；与正常组组比△p<0.05，△△p<0.01；与达美康组相比●P<0.01，●●P<0.01由表3可知，与模型组大鼠比较，中药低剂量组、中药高剂量组胰腺CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，达美康组无统计学意义(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，达美康组、模型组胰腺CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组、中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组胰腺CD4水平显著较高(P<0.05)，中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)。与模型组大鼠比较，达美康组胰腺TGF水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组、中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，中药低剂量组、模型组、达美康组、中药高剂量组均有胰腺TGF水平差异有统计学意义11 (P<0.05)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组胰腺TGF水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)。与模型组大鼠比较，达美康组、中药高剂量组子宫CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组无统计学意义(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，中药低剂量组、模型组、达美康组、中药高剂量组均有子宫CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组子宫CD4水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药高剂量组无统计学意义(P>0.O5)。与模型组大鼠比较，达美康组组子宫TGF水平差异有统计学意义(P<0.05)，中药低剂量组、中药大剂量无统计学意义(P>0.O5)；与正常组大鼠比较，中药低剂量组、模型组、中药高剂量组子宫TGF水平差异有统计学意义(P<0.05)，达美康组无统计学意义(P>0.O5)；与达美康组大鼠比较，中药低剂量组、中药高剂量组子宫TGF水平差异有统计学意义(P<0.05)。3．讨论3.1关于左归复方的中医药研究可为在生殖免疫学的相关性提供理论的基础本课题组在前期临床研究与文献调研中认为，2型糖尿病主要病机为气阴两虚，以滋阴益气、活血解毒法组成的左归复方分别用于2型糖尿病等的防治[14]。瘀血作为糖尿病并发症的病机关键，总结血瘀形成的五个方面[15]：阴虛燥热灼血成痰；阴津亏损，血液稠、巡而为瘀；久病入络成瘀；阴虛日久，阴损及阳，阳虛寒凝致瘀；气虛，气不行血致瘀等。消渴病多为本虚（气阴两虚），标实（瘀血热毒互结），故予以滋阴益气，活血解毒法治疗，临床收效良好。生殖受“下丘脑-垂体-性腺轴”的调节，然而，近年来，“免疫-神经-内分泌”的调节越来越受到重视，生殖也受到“免疫-神经-内分泌”的调节。胰腺作为人体重要的内分泌器官之一，在调控免疫因子中起到重要作用。胰腺受损是2型糖尿病发病的重要环节，关于中药干预改善2型糖尿病女性生殖功能障碍的研究，逐渐涉及到生殖免疫学，而生殖免疫学是近来新兴的体系，免疫系统与生殖功能的联系，进一步密切了人体各个部分的关联性。随着“生殖内分泌-免疫-代谢调节网络”理论的提出，这个如同“黑箱”的理论不断被解析，将为相关疾病发病机制的研究提供理论基础。这个“黑箱”理论类似中医的整体观念，人体的每个部分都有其相关性，把握整体，才能够找到生命的平衡点。从生殖免疫学中探究，免疫系统关键细胞及蛋白是生殖免疫学机制中的重要部分，参与了生殖的全过程，我们试12 图从免疫系统关键细胞及蛋白表达的角度，揭示中医药调控免疫系统关键细胞及蛋白表达的作用，阐明其在治疗2型糖尿病女性生殖系统功能障碍中的作用机制。本文就生殖免疫学的作用机制及中药干预改善生殖功能障碍的现状做一综述，为进一步的实验研究提供理论基础。3.2娠免疫耐受机制研究妊娠免疫耐受机理是近年来国内外研究的热点，母体与胎儿免疫因素在女性生殖功能障碍发病中[16]的作用得到重视。生殖免疫学中，免疫调节细胞，如Treg，通过免疫抑制，活化后可使母体免疫系统保持妊娠维持状态，而足月分娩或早产等分娩发动意味胎儿免疫耐受状态在母体免疫系统下受到破坏[3]。正常妊娠时，半同种胚胎抗原呈免疫耐受，这有赖于一系列的免疫调节。若免疫调节失常，免疫耐受状态遭到破坏，可出现过度的免疫反应，胚胎便将遭到异常的免疫攻击，产生流产、不孕、胎儿生长受限、胎动、子痢前期等病理妊娠。近年，越来越多的研究表明，调节性T细胞(主要是CD4+CD25+调节性T细胞)在母胎耐受的形成中起重要作用[17-18]，Treg细胞具有负调节功能，CD4+T淋巴细胞亚群占健康个体外周CD4+T细胞的5%-10%，Treg细胞可通过抑制自身反应性T细胞的兔疫反应、抑制传统T细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌，维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受，是机体内以主动方式获得和维持自身耐受的重要方式，其平衡失调可能造成妊娠失败[19]。近代生殖免疫学研究表明，维持正常妊娠有赖于母胎免疫耐受的形成[20-21]。如果这一耐受失调，就可能导致流产，尤其是原因不明的复发性流产(unexplainedrecurrentmiscarriage，URM)。研究还表明，调节性T细胞(主要是CD4+CD25+Treg)在母-胎免疫耐受中起着重要的作用[8]。研究认为Th17细胞在孕早期蜕膜局部及外周血中的数量增多可致妊娠兔疫耐受失衡[9]。Treg细胞分为自然调节性T细胞nTreg和适应调节性T细胞iTreg两类，其中nTreg通过依赖细胞间的直接接触,由TCR介导的信号刺激活化后,产生抑制CD4+和CD8+，T细胞活化和增殖功能，而iTreg则由外周抗原诱导产生,其兔疫应答的调节主要通过分泌细胞因子IL-10和TGF-β1产生[10]。TGF-β1也是目前研究最多的参与滋养细胞浸润调节的细胞因子。研究发现，胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞及绒毛的间质滋养细胞、蜕膜腺体细胞和间质细胞均有不同程度的TGF-β1表达[22]，可见以上几种细胞均有合成分泌TGF-β1的可能[22-23]。TGF-β1对垂体前叶泌乳素细胞的增殖分化起调控作用，调节泌乳素分泌，间接影响生殖内分泌并调节生育[24]。TGF-β1参与着13 床前子宫内膜上皮、腺上皮和基质细胞的增殖，调节滋养层细胞的分化。在子宫蜕膜化的过程中，TGF-β1表达量升高。TGF-β1可刺激子宫内膜基质细胞合成基质蛋白，使子宫内膜形成蜕膜样变，并刺激基质细胞合成甲状旁腺激素相关蛋白，有利于滋养层细胞将钙从母体输送给胎儿。TGF-βl可诱导蜕膜基质细胞收缩[25-26]。TGF-β1可通过增加子宫内膜基质细胞胰岛素样生长因子结合蛋白来抑制基质细胞增殖形成分泌期子宫内膜低增殖状态。SimpsonH等[27]报道，胚泡着床过程，存在于细胞外基质中的TGF-βl可调节基质某些蛋白的合成，并使蛋白酶的活性降低，从而为胚泡的植入、生存提供适宜的微环境。生殖内分泌-免疫-代谢调节网络是一个极其复杂的“黑箱”人类不断解析这一“黑箱”，将为相关疾病发病机制的研究提供理论基础。免疫调节与妊娠结局密切相关，是目前研究的热点，许多研究试图从免疫调节入手寻找改善女性生殖能力相关性疾病的方法。UEMURA等有关动物实验,比较正常妊娠模型与RSA模型母-胎界面T细胞的Th1和Th2两个亚群,以及母-胎界面Th1/Th2型细胞因子表达水平存在的差异[28]。美国得克萨斯大学安德森癌症研究中心的董晨教授作了“免疫耐受与自身免疫间的调节机制”的专题报告[29]，他们的研究结果表明T细胞遇到抗原后的命运决定于活化及抑制性协同刺激分子间的组合信号；他们已起始了确定免疫耐受关键的细胞内调节子的研究；在自身免疫性疾病中，T细胞分化为产生细胞因子的效应T细胞；他们对小鼠自身免疫模型的研究揭示Thl7细胞关键的功能及调控机制；最近，他们研究了T滤泡辅助细胞(Tfh)的发育调控，Tfh细胞可调控B细胞的生发中心反应；他们的研究有助于进一步理解免疫耐受机制及自身免疫性疾病的防治。3.3左归复方的生殖免疫调节是多靶点、多途径的综合尽管生殖免疫学的研究有了很大的研究进展，但是对于2型糖尿病女性生殖功能障碍的防治，目前处于初级阶段，主要以控制血糖水平，改善症状对症治疗，缺乏系统治疗的特效药物。中药对免疫系统的调节是多途径、多环节的综合协调。生殖内分泌-免疫-代谢调节网络逐步受到重视，或许多靶点作用的中药能对其产生有明显影响。目前对于糖尿病生殖系统功能障碍的免疫调节机制还没有大量体外实验来证实，从中医药相关的体外研究在培养液中直接加入中药,应用血清药理学，用体内代谢干预体外培养细胞的分泌功能的研究甚少，在细胞水平研究中药干预免疫因子的调节机制还需要大量的研究。14 3.4左归复方整体调控作用有待进一步发现本实验可以得出，左归复方对于降低血糖，升高胰岛素水平并没有显著的作用，但是通过改善免疫因子的活力，提升机体的整体功能有着非常重要的作用。左归复方的作用效果因其剂量的不同而有显著差异，有待进一步研究。4.结论与达美康组相比，左归复方并不能降低模型大鼠血糖水平，但能提高胰岛素水平，对于免疫因子的表达有促进作用，因此可认为其对2型糖尿病慢性并发症有着正性调节作用。15 参考文献[1]nternationalDiabetesFederation．DiabetesAtlas:sixthedition(R)．Brussels:InternationalDiabetesFederation,2013.[2]KippJL,KilenSM,WoodruffTK,etal.Activinregu-latesestrogenreceptorgeneexpressioninthemouseovary[J].JBiolChem,2007,282(50):36755-36765.[3]ChoiY,RajkovicA.Geneticsofearlymammalianfolliculogenesis.CellMolLifeSci,2006,63(5):579-90.[4]SirotkinAV，LaukovaM，OvcharenkoD，etal．IdentificationofmicroRNAscontrollinghumanovariancellproliferationandapoptosis［J］．JCellPhysiol，2010，223（1）：49-56．[5]CarlettiMZ,FiedlerSD,ChristensonLK.MicroRNA21blocksapoptosisinmouseperiovulatorygranulosacells［J］．BiolReprod,2010,83（2）:286-295．[6]HuangM,ZhuC,LiangQL,etal.EffectofTangshenFormulaonphospholipidsmetabolismindiabeticfolliclesinthemouseovary.J.Reprod.Fertil.1968,5(5):5-7.[7]刘艳秋，包娟，周萍.原因不明反复自然流产的免疫治疗[J].江西医药.2009.44.（2）：98-100.[8]苗正友，胡芙蓉，蒋琰瑛.反复自然流产的免疫治疗[J].江西医药，2005，40（5）：543-544.[9]高友安，王瑞哲.祝谌予教授治疗糖尿病经验的临床应用[J].现代中医药，2012,32（3）:5.[10]王艳，周彬.中西药治疗免疫性不孕不育症临床效果分析[J].医学信，2014，27（11）:415.[11]陈欣，文武，郁正亚.高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素制备SD大鼠2型糖尿病模型[J].中国医药导刊.2015,17(7):737-738.[12]赵春梅，郑文兰.阴道脱落细胞检查对确定大鼠妊娠价值的探讨[J]，内蒙古医药，2013,32（2）：31-32.[13]贺石林，王键，王净净.中医科研设计与统计学[M]，湖南科技出版社出版，2012：48.[14]喻嵘，陈大舜,梅志刚,等．左归双降方对葡萄糖、胰岛素、低密度脂蛋白诱导损伤的血管内皮细胞ICAM—l、tPA、PAl的影响[J]．中医药学刊，2005，16 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致谢时光荏苒，研究生阶段即将结束。回首三年的历程，幸运与感谢充斥于我心间，有太多的话要对老师、同学们说，是你们的指导与帮助，让我度过了充实而收获颇丰的三年时光!首先要感谢我的导师刘慧萍教授，从论文拟题到论文撰写，刘老师总是耐心指导。渊博的知识、朴实无华的治学、清晰的思维方式、勤恳的工作作风是我人生的导师，让我受益终身，在人生的关键阶段能够师从刘老师，我感到很幸运。其次，感谢实验室的老师,严青师姐在学习生活中给我很多的帮助。正是在你们的帮助下，我才能够解决各种困难，顺利的完成各项实验操作，和你们在实验室一起学习的这段时间，我很难忘；感谢同寝同学彭熙伟、文阳、刘琦、张雅捷，三年同寝生活充满温暖和欢乐，在一起互相鼓励的日子也是非常令我难忘。最后，还要感谢我的父母亲及家人对我生活及学习上的支持，正是有你们这样强大后盾，我才得以安心学习，从而顺利完成三年的学业。即将告别母校，在此我再次向我的老师们、同学们、朋友们道声谢谢！19 附录综述中药干预2型糖尿病女性生殖功能障碍的研究进展摘要：女性受孕率的降低及流产率、畸形率的升高等女性生殖系统方面疾病越来[1]越受到重视，糖尿病是导致女性生殖系统障碍的重要原因之一。生殖免疫学中，免疫系统关键细胞及蛋白作为生殖免疫学机制中的重要部分，参与了生殖的全过程，从免疫系统关键细胞及蛋白表达的角度，揭示中药调控免疫系统关键细胞及蛋白表达，阐明其在治疗2型糖尿病性生殖系统功能障碍的所起的作用。ResearchprogressoftraditionalChinesemedicineinterventiononfemalereproductivedysfunctionintype2diabetesmellitus.PENGHuzhan,LIUHuiping,Abstract:Femalepregnancyrateandreducetheabortionrate,deformityrateofrisehigherfemalereproductivesystemdiseaseshasbeenpaidmoreandmoreattention,whichknownfromreproductiveimmunology,thekeycellsoftheimmunesystemandproteinasanimportantpartofthemechanismofreproductiveimmunology,participateinthereproductionoftheentireprocess.Keycellsoftheimmunesystemandproteinexpressionofangle,revealingcompoundprescriptionofZuoguicanregulatekeycellsoftheimmunesystemandproteinexpressionandtoelucidateitsinthetreatmentoftype2diabetesinfemalereproductivesystemdysfunctionoftherole.关键词：左归助孕方，2型糖尿病，女性生殖功能障碍，生殖免疫学;TraditionalChinesemedicinetohelppregnantwomen,Type2diabetesmellitus,reproductivedysfunctionoffemale,reproductiveimmunology;众所周知，生殖受“下丘脑-垂体-性腺轴”的调节，然而，近年来，“免疫-神经-内分泌”的调节越来越受到重视，生殖也受到“免疫-神经-内分泌”的调节。胰腺作为人体重要的内分泌器官之一，处于生殖学中起到举足轻重的地位。胰腺受损是2型糖尿病发病的重要环节，关于中药干预改善2型糖尿病女性生殖功能障碍的研究，逐渐涉及到生殖免疫学，而生殖免疫学是近来新兴的体系，免疫系统与生殖功能的联系，进一步密切了人体各个部分的关联性。随着“生殖内分泌-免疫-代谢调节网络”理论的提出，这个如同“黑箱”的理论不断被解析，将为相关疾病发病机制的研究提供理论基础。这个“黑箱”理论类似中医的整体观念，人体的每个部分都有其相关性，把握整体，才能够找到生命的平衡点。从生殖免疫学中探究，免疫系统关键细胞及蛋白是生殖免疫学机制中的重要部分，20 参与了生殖的全过程，我们试图从免疫系统关键细胞及蛋白表达的角度，揭示中医药调控免疫系统关键细胞及蛋白表达的作用，阐明其在治疗2型糖尿病女性生殖系统功能障碍中的作用机制。本文就生殖免疫学的作用机制及中药干预改善生殖功能障碍的现状做一综述，为进一步的实验研究提供理论基础。1.妊娠免疫耐受机制研究妊娠免疫耐受机理是近年来国内外研究的热点，母体与胎儿免疫因素在女性[2]生殖功能障碍发病中的作用得到重视。生殖免疫学中，免疫调节细胞，如Treg，通过免疫抑制，活化后可使母体免疫系统保持妊娠维持状态，而足月分娩或早产[3]等分娩发动意味胎儿免疫耐受状态在母体免疫系统下受到破坏。正常妊娠时，半同种胚胎抗原呈免疫耐受，这有赖于一系列的免疫调节。若免疫调节失常，免疫耐受状态遭到破坏，可出现过度的免疫反应，胚胎便将遭到异常的免疫攻击，产生流产、不孕、胎儿生长受限、胎动、子痢前期等病理妊娠。近年，越来越多的研究表明，调节性T细胞(主要是CD4+CD25+调节性T细[3-4]胞)在母胎耐受的形成中起重要作用，Treg细胞具有负调节功能，CD4+T淋巴细胞亚群占健康个体外周CD4+T细胞的5%-10%，Treg细胞可通过抑制自身反应性T细胞的兔疫反应、抑制传统T细胞的活化以及促进一些抑制性细胞因子的分泌，维持机体内环境的稳定、诱导移植物的耐受，是机体内以主动方式获得和维[5]持自身耐受的重要方式，其平衡失调可能造成妊娠失败。近代生殖免疫学研究[6-7]表明，维持正常妊娠有赖于母胎免疫耐受的形成。如果这一耐受失调，就可能导致流产，尤其是原因不明的复发性流产(unexplainedrecurrentmiscarriage，URM)。研究还表明，调节性T细胞(主要是CD4+CD25+Treg)在母-[8]胎免疫耐受中起着重要的作用。研究认为Th17细胞在孕早期蜕膜局部及外周[9]血中的数量增多可致妊娠兔疫耐受失衡。Treg细胞分为自然调节性T细胞nTreg和适应调节性T细胞iTreg两类，其中nTreg通过依赖细胞间的直接接触,由TCR介导的信号刺激活化后,产生抑制CD4+和CD8+，T细胞活化和增殖功能，而iTreg则由外周抗原诱导产生,其兔疫应答的调节主要通过分泌细胞因子[10]IL-10和TGF-β产生。TGF-β1参与着床前子宫内膜上皮、腺上皮和基质细胞的增殖，调节滋养层细胞的分化。在子宫蜕膜化的过程中，TGF-β1表达量升高。TGF-β1可刺激子宫内膜基质细胞合成基质蛋白，使子宫内膜形成蜕膜样变，并刺激基质细胞合成甲状旁腺激素相关蛋白，有利于滋养层细胞将钙从母体输送给[11-12]胎儿。TGF-βl可诱导蜕膜基质细胞收缩。TGF-β1可通过增加子宫内膜基质21 细胞胰岛素样生长因子结合蛋白来抑制基质细胞增殖形成分泌期子宫内膜低增[13]殖状态。SimpsonH等报道，胚泡着床过程，存在于细胞外基质中的TGF-βl可调节基质某些蛋白的合成，并使蛋白酶的活性降低，从而为胚泡的植入、生存提供适宜的微环境。免疫调节与妊娠结局密切相关，是目前研究的热点，许多研究试图从免疫调节入手寻找改善女性生殖能力相关性疾病的方法。TGF-β1也是目前研究最多的参与滋养细胞浸润调节的细胞因子。研究发现，胎盘绒毛小叶的合体滋养细胞、细胞滋养细胞及绒毛的间质滋养细胞、蜕膜腺体细胞和间质细胞有TGF-β1表达[14]报道，说明TGF-β1可能主要由以上几种细胞合成分泌。TGF-β1对垂体前叶泌乳素细胞的增殖分化起调控作用，并调节泌乳素分泌，间接影响生殖内分泌并调[15]节生育。UEMURA等有关动物实验,比较正常妊娠模型与RSA模型母-胎界面T细胞的Th1和Th2两个亚群,以及母-胎界面Th1/Th2型细胞因子表达水平存在的差[16]异。2.中药干预糖尿病生殖功能障碍的研究进展（1）理论基础传统中医认为，气阴两虚兼燥热偏胜是2型糖尿病发病的基本病机。近年来，2型糖尿病及其慢性并发症与慢性低度炎症相关性学说的产生，而2型糖尿病及其慢性并发症通常具有的“虚、毒、瘀”的中医病机与炎症发病学说之间有相当的认同性。2型糖尿病的“虚”，主要是肝肾阴虚，脾气亏虚，是机体产生炎症反应的基本条件；而“瘀、毒”等病理产物的形成与聚集又标志着炎性因子的聚集[17]和炎症反应的发生发展。祝湛予认为气阴两虚贯穿于糖尿病整个病程，是糖尿病诸病理阶段所共有的一个特征。然而气虚则无力推动血行，血行迟缓，久而致瘀：阴虚则血液粘腻而滞涩不畅，同样可以致瘀。故气阴两虚是病理变化的焦点，[17]血瘀贯穿本病的整个过程。消渴病瘀血阻滞的病机,源自于《内经》。《灵枢˙五变》云：“怒则气上逆，胸中蓄积，血气逆留……血脉不行，转而为热，热则消肌肤，故为消瘅。”指出消瘅的发生与血脉不行有关。《金匮要略˙惊悸吐血下血胸满瘀血病脉证治第十六》记载：“病者如热状，烦满，口干燥而渴，其脉反无热，此为阴状，是瘀血也，当下之”，也说明了瘀血与消渴的关系。唐容川在《血证论》中论证了瘀血致渴的机理：“瘀血在里则渴。所以然者，血与气本不相离，内有瘀血，故气不得通，不能载水津上升，是以为渴”，认为瘀血阻滞气机运行,影响水津输布，故人渴。祝谌予教授最先提出糖尿病血瘀的病机，认为22 血瘀是气阴两虚所导致的。气阴两伤导致气滞血瘀，影响水津输布从而加重消渴，血瘀与消渴病间互为因果。尽管生殖免疫学的研究有了很大的研究进展，但是对于糖尿病女性生殖功能障碍的防治，目前处于初级阶段，主要以控制血糖水平，改善症状对症治疗，缺乏治疗的系统的特效药物。根据中药复方作用的多靶点性，或许可探讨细胞免疫调节参与糖尿病女性生殖功能障碍的分子机制及滋阴益气、活血解毒法中药的干预作用。通过细胞实验，应用血清药理学，提供生殖免疫系统在细胞水平对生殖系统调节作用机制。阐明以滋阴益气、活血解毒法的中药复方可通过调控免疫系统关键细胞及蛋白表达而改善生殖能力，从而为临床治疗2型糖尿病女性生殖系统障碍提供新思路和新方法。生殖内分泌-免疫-代谢调节网络是一个极其复杂的“黑箱”人类不断解析这一“黑箱”，将为相关疾病发病机制的研究提供理论基础。美国得克萨斯大学安德森癌症研究中心的董晨教授作了“免疫耐受与自身免疫间的调节机制”的专[18]题报告，他们的研究结果表明T细胞遇到抗原后的命运决定于活化及抑制性协同刺激分子间的组合信号；他们已起始了确定免疫耐受关键的细胞内调节子的研究；在自身免疫性疾病中，T细胞分化为产生细胞因子的效应T细胞；他们对小鼠自身免疫模型的研究揭示Thl7细胞关键的功能及调控机制；最近，他们研究了T滤泡辅助细胞(Tfh)的发育调控，Tfh细胞可调控B细胞的生发中心反应；他们的研究有助于进一步理解免疫耐受机制及自身免疫性疾病的防治。（2）实验及临床研究本课题组在前期临床研究与文献调研中认为，2型糖尿病主要病机为气阴两虚，夹瘀血热毒(虚、瘀、毒)，佐以滋阴益气、活血解毒法组成的左归复方分别[19][20]用于2型糖尿病及其合并症的防治。刘彦晶将瘀血作为糖尿病并发症的病机关键，总结血瘀形成的五个方面：阴虛燥热灼血成痰；阴津亏损，血液稠、巡而为瘀；久病入络成瘀；阴虛日久，阴损及阳，阳虛寒凝致瘀；气虛，气不行血致瘀等。消渴病多为本虚（气阴两虚），标实（瘀血热毒互结），故予以滋阴益气，[21]活血解毒法治疗，临床收效良好。陆智慧等引采用益气养阴，活血化痰，清热解毒之中药配合西药治疗胰岛素抵抗综合征34例，总有效率达97.1％。进一步的实验有待开展，生殖免疫的机制能够在实验室获得新的发现。23 3.展望中药对免疫系统的调节是多途径、多环节的综合协调。生殖内分泌-免疫-代谢调节网络逐步受到重视，或许多靶点作用的中药能对其产生有明显影响。目前对于糖尿病生殖系统功能障碍的免疫调节机制还没有大量体外实验来证实，从中医药相关的体外研究在培养液中直接加入中药,应用血清药理学，用体内代谢干预体外培养细胞的分泌功能的研究甚少，在细胞水平研究中药干预免疫因子的调节机制还需要大量的研究。因此,中药在对免疫学在糖尿病生殖系统功能障碍中影响如何,及具体机制都有待于进一步的研究。从细胞水平探讨中药对免疫系统在糖尿病生殖功能障碍中起到的作用，对于临床具有重要的意义。以大鼠作为载体，应用细胞培养技术，从细胞分子水平对免疫系统功能进行研究，符合人道主义，也是实验研究发展的趋势。参考文献[1]InternationalDiabetesFederation．DiabetesAtlas:sixthedition(R)．Brussels:InternationalDiabetesFederation,2013.[2]NealeDM,MorG.TheroleofFasmediatedapeptosisinpreeclampsia[J].JPerinatMed,2005,33(6):471-477.[3]刘艳秋，包娟，周萍.原因不明反复自然流产的免疫治疗[J].江西医药.2009，44（2）：98-100.[4]苗正友，胡芙蓉，蒋琰瑛.反复自然流产的免疫治疗[J].江西医药，2005，40（5）：543-544.[5]李卫鹏,王福庆.CD4+CD25+Treg的免疫调节作用机制以及临床研究进展[J].现代免疫学,2006,26(2):164-167.[6]TduriA.AlferinkJ,MoilerP,eta1.Teelawarenessofpater.science,1995,270,630-633.[7]StephenLA,MottetC,MasonDeta1.HumanCD4(+)CD25(+)thymocytesandperipheralTcellshaveimmunesuppressiveactivityinvirto[J].EurJImmunol,2001,31:1247-1254.[8]AluvihareVR.KallikourdisM.BetzAG.Tolerance,suprressionandthefetal24 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