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分类号：密级：．ＵＤＣ：编号：安徽医科大学学位论文ＥＶ７１型手足口病患儿外周血树突状细胞及细胞因子产生的调节机制研究ＯｎｒｅｕｌａｔｏｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｃｔｏｋｉｎｅｓａｎｄｄｅｎｄｒｉｔｉｃｇｙｙｙｃｅｌｉｌｏｆＨＦＭＤｉｎｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｖｉｒｕｓＥＶ７１高勇指导教师姓名徐元宏教授安徽医科大学第一附属医院＿＿＿申请学位级别硕士专业名称临床检验诊断学＿＿＿＿．提交论文日期２０．１２１６０９论文答辩日期２０１６＿学位授予单位和日期安徽医科大学—答辩委员会主席费广鹤＿评阅人双盲２０１６年１２月 安徽医科大学ANHUIMEDICALUNIVERSITY硕士学位论文EV71型手足口病患儿外周血树突状细胞及细胞因子产生的调节机制研究OnregulatorymechanismsofinflammatorycytokinesanddendriticcellofHFMDinfectedwithintestinalvirusEV71作者姓名：高勇指导教师：徐元宏教授学科专业：临床检验诊断学申请学位级别：硕士论文工作时间：2015年04月至2016年06月 学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确说明并表示谢意。？学位论文作者签名ｌｂ（１：日期：先今ｃ＾＾学位论文使用授权声明本人完全了解安徽医科大学有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。愿意将本人的学位论文提交《中国博士学位论文全文数据库》、《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》，在《中国博硕士学位论文评价数据库》中使用和在互联网上传播。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：导师签名 安徽医科大学硕士学位论文目录英文缩略词表...............................................................................................1中文摘要.......................................................................................................3英文摘要.......................................................................................................61.前言........................................................................................................102．材料与方法...........................................................................................112.1病人资料........................................................................................112.2外周血单个核细胞的制备............................................................132.3流式细胞术（FlowCytometryMethod，FCM）检测DC表面标志物.......................................................................................................152.4免疫蛋白印迹（Westernblot法）检测信号传导通路蛋白......172.5酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）定量检测血清中细胞因子水平...........................................252.6实验结果的统计学处理................................................................293.EV71感染手足口患者基本临床信息分析..........................................293.1三组研究对象的性别构成比和年龄分布....................................293.2EV71感染手足口病轻症和重症组患者临床常见指标分析......303.3EV71感染对DC成熟的影响.......................................................333.4细胞因子表达水平........................................................................374讨论.........................................................................................................38I 安徽医科大学硕士学位论文5.结论和创新点：......................................................................................415.1结论：.............................................................................................415.2创新点：.........................................................................................41参考文献.....................................................................................................42附录.............................................................................................................45致谢.............................................................................................................47综述.............................................................................................................48II 安徽医科大学硕士学位论文英文缩略词表(Abbreviation)英文缩写英文全名中文全名EV71Enteroviruses71肠道病毒71型HFMDhand-foot-mouthdisease手足口病DCdendriticcells树突状细胞ILInterleukin白细胞介素TNF-αTumornecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子-αODOpticaldensity光密度SPSSStatisticPackageforSocialScience社会科学统计软件包PP-valueP值PBMCPeripheralbloodmononuclearcell外周血单个核细胞MAPKsmitogen-activatedproteinkinases丝裂原活化蛋白激酶p-p38phosphorylatedp38MAPK磷酸化p38MAPKphosphorylatedc-JunN-terminalp-JNK磷酸化c-Jun氨基末端激酶kinaseextracellularsignalregulatedprotein磷酸化细胞外信号调节蛋白p-ERK1/2kinases1/2激酶1/2FCMFlowCytometryMethod流式细胞术WesternblotWesternblot免疫蛋白印迹Enzyme-linkedimmunosorbentELISA酶联免疫吸附试验assayWBCWhitebloodcellcount白细胞计数NeuNeutrophil中性粒细胞CRPC-reactiveproteinC反应蛋白ASTAspartateaminotransferase天门冬氨酸氨基转移酶CKCreatinekinase肌酸激酶1 安徽医科大学硕士学位论文CK-MBCreatinekinaseisoenzyme肌酸激酶同工酶LDHLactatedehydrogenase乳酸脱氢酶Alphahydroxybutyricacidα-HBDHα-羟丁酸脱氢酶dehydrogenaseGLUBloodglucose血糖2 安徽医科大学硕士学位论文EV71型手足口病患儿外周血树突状细胞及细胞因子产生的调节机制研究中文摘要背景：肠道病毒71型（Enteroviruses71,EV71）是儿童手足口病的主要致病病原体，该病起病紧急、进展迅速，轻度感染患儿预后良好，重度感染患儿多伴随脑膜炎及神经源性肺水肿等并发症且致死率高。研究显示EV71感染可使患儿机体免疫系统紊乱，并通过感染树突状细胞（dendriticcells，DC）导致细胞因子表达水平改变。目前有关EV71感染对树突细胞成熟及细胞因子释放影响的相关研究，均采用EV71体外感染DC的细胞模型以观察DC变化，这不能反映EV71感染手足口病患者体内外周血中DC表面标志CD80、CD83及CD86表达百分比变化的真实情况。本研究旨在通过分析EV71感染手足口病患者外周血中DC表面标志表达百分比变化、DC中MAPK信号传导通路激活状况及细胞因子水平变化情况，以期为EV71型手足口病的早期诊断与重症患者预防治疗提供更多参考。目的：探讨肠道病毒EV71型感染对树突状细胞成熟、DC中信号传导通路激活、细胞因子释放的作用机制。方法：收集确诊为肠道病毒EV71型感染儿童40例，结合临床资料分析40例样本分为20例轻症型组及20例重症型组，同时收集正常对照组儿童20例。采用流式细胞仪技术检测法检测60例儿童外周血DC表面标志分子CD11c、CD86、CD80和CD83表达的百分比；采用Westernblot法检测DC中MAPK信号传导通路分子磷酸化水平包括p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白；ELISA法检测同期血清中细胞因子IL-6、IL-12/P70及TNFα的表达水平。3 安徽医科大学硕士学位论文结果：1.临床资料分析：在40例EV71感染HFMD中男女患者比例为1.11:1（21/19）；患者年龄范围在7个月~5岁区间，平均年龄为1.84±1.10岁，≤3岁年龄段的患者所占比率为85.0%（34/40）。重症患者WBC、Neu(%)、CK-MB、CRP、GLU、体温6个指标水平显著高于轻症组患者（P＜0.05），其余临床常见指标如AST、CK、LDH、HBDH4个指标随着疾病症状的加重有升高趋势，但是差异无统计学意义（P＞0.05）。2.流式细胞仪技术检测结果显示：随着EV71感染程度的加深，外周血DC中标志着细胞成熟的表面标志分子水平均有增加。重症感染组CD80（1.64±0.88%）与对照组（0.96±0.83%）比较发现差异存在统计学意义（P＜0.05），重症感染组CD83（2.04±1.35%）与轻症感染组（1.41±0.63%）和对照组（0.82±0.55%）比较发现都有统计学意义（P＜0.05），CD11c、CD86在DC上表达的百分比虽有增加，但与对照组比较差异无统计学意义。3.Westernblot法检测DC中MAPK信号传导通路分子磷酸化水平：p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白质表达量与对应GAPDH相除得到相对表达量在重症感染组分别为0.84±0.15%、0.12±0.13%、0.45±0.15%；在轻症感染组分别为0.55±0.19%、0.11±0.21%、0.28±0.26%；在对照组分别为0.06±0.01%、0.02±0.01%、0.04±0.02%。三种蛋白相对表达量均随着感染程度加深而增大，三种蛋白在重症感染组和轻症感染组分别与对照组中发现其相对表达量都比对照组的相对表达量要高，且有医学统计学意义（P＜0.05）。4.ELISA法检测血清中细胞因子IL-6、IL-12/P70及TNFα表达水平：重症感染组（29.80±13.30ng/L）和轻症感染组（26.44±8.16ng/L）和对照组（23.95±8.39ng/L）比较发现IL-12/P70差异无统计学意义，但是对于IL-6（重症感染组：16.89±3.20ng/L；轻症感染组：12.86±2.86ng/L；对照组：7.88±2.12ng/L）和TNFα（重症感染组：212.54±62.08ng/L；轻症感染组：245.41±54.07ng/L；对照组：137.63±23.50ng/L）在三组之间两两对照分析发现均有统计学意义（P＜0.05）。4 安徽医科大学硕士学位论文结论：EV71感染手足口患者WBC、Neu(%)、CK-MB、CRP、GLU、体温6个临床常见指标可以作为手足口疾病重症化的临床预警指标。流式细胞技术法对EV71感染后的患儿外周血中DC的表面标志物的表达百分比进行分析后，在EV71感染组各标志物的表达水平均高于对照组，同样在各种标志物中CD83、CD80的上调表现地尤为显著，因此EV71的感染对DC的成熟起到了明显的促进作用。Westernblot法检测DC中MAPK信号传导通路分子磷酸化水平和ELISA法检测血清中的细胞因子的水平显示EV71感染后MAPK信号传导通路被激活，同时导致血清中的细胞因子水平增高。综上所述：EV71感染可促进树突状细胞成熟、激活MAPK信号传导通路并增加细胞因子的释放，MAPK信号传导通路在EV71感染的DC中发挥显著调控作用。关键词：肠道病毒EV71树突状细胞MAPK信号传导通路细胞因子5 安徽医科大学硕士学位论文OnregulatorymechanismsofinflammatorycytokinesanddendriticcellofHFMDinfectedwithintestinalvirusEV71AbstractBackground:Enterovirus71(EV71)wasthemainpathogenofhand,footandmouthdisease(HFMD)inchildren.HFMDwasacuteandrapidprogressiondiseasepathway,butseverepatientsweremostlyassociatedwithseriouscomplicationssuchasmeningitisandneurogenicpulmonaryedema.StudiesdisplayedthatthedisorderofpatientsimmunesystemcausedbytheinfectionofEV71wasimportant.Anddendriticcells(DC)infectedbyEV71ledtochangeofthecytokinelevel.ThepresentexperimentadoptedvitromodelofDCinfectedbyEV71inordertoresearchdendriticcellsmaturationandthecytokinesrelease.Itcouldn'treflecttherealchangeofCD80,CD83,CD86percentageintheperipheralbloodDCoftheHFMDinfectedbyEV71.ThestudymainlyanalyzedthechangeofCD80,CD83,CD86percentageintheperipheralblood,theactivatedstatusofMAPKsignalingpathwaysinDCandthelevelofcytokineinordertoprovideearlydiagnosis,preventionandtreatmentofseriousHFMDinfectedbyEV71.Objective：Tostudymaturation,apoptosis,signalpathwayandinflammato-rycytokinesofdendriticcellwheninfectedwithintestinalvirusEV71.Methods：Diagnosedpatientsweredividedintothreegroupsaccordingtothedegreeofinfectionandclinicalanalysis:thecontrolgroup(n=20),themildgroup(n=20)andthe6 安徽医科大学硕士学位论文severeone(n=20).DCofeachgroupwasseparated.Andthenthesurfacemarkers,activationofMAPKsignalingpathwayandthecellculturesupernatantsofinfla-mmatorycytokinelevelsweredetected.Results：1.Clinicalinformationanalyzedthat:In40casesofEV71infectioncases,maletofemaleratiowas1.11:1（21/19）,agerangefor7monthsto6yearsold,theaverageageof1.84±1.10years,EV71infectionisgivenprioritytowithchildrenundertheageof3,85.0%（34/40）ofthepatientswithEV71infection.TherewassignificantdifferenceofWBC,Neu(%),CK-MB,CRP,GLU,temperaturelevelbetweenmildandseverecases（P＜0.05）.Asthedeepeningdegreeofinfection,levelsofAST,CK,LDHandHBDHwererising,buttherewasnosignificantdifference(P＞0.05).2.Flowcytometry(FCM)technologyshowedthat:Asthedeepeningdegreeofinfection,levelsofmaturecellsurfacemarkerswererising.ThemeanlevelsofCD80incontrolgroup,mildgroupandseveregroupwere0.96±0.83%,1.11±0.80and1.64±0.88%,andCD83were0.82±0.55%,1.41±0.63%and2.04±1.35%,respectively.TherewassignificantdifferenceofCD83levelamongeachtwoofthegroups（P＜0.05）.HoweveronlyseveregroupandcontrolgrouphadsignificantdifferenceaboutCD80level（P＜0.05）.LevelsofCD11candCD86wereincreasingwiththedeepeningdegreeofinfection,buttherewasnosignificantdifferenceamongeachtwoofthegroups.3.Westernblotappearedthat:Theratiosofp-p38MAPK,p-JNKandp-ERK1/2proteinlevelstocorrespondingtoGAPDHwere0.84±0.15%,0.12±0.13%and0.45±0.15%inseveregroup,respectively.Thosewere0.55±0.19%,0.11±0.21%and0.28±0.26%Inmildgroup,respectively.Andthosewere0.06±0.01%,0.02±0.01%and0.04±0.02%incontrolgroup.Theratiosofp-p38MAPK,p-JNKandp-ERK1/2proteinlevelstoGAPDHhadsignificantdifferenceamongeachtwoofthegroups（P7 安徽医科大学硕士学位论文＜0.05）.Andwiththedeepeningdegreeofinfection,levelsofp-p38MAPK,p-JNKandp-ERK1/2proteinwererising.4.ELISAshowedthat:TheserumlevelsofIL-6incontrolgroup,mildgroupandseveregroupwere7.88±2.12,12.86±2.86and16.89±3.20ng/L,IL-12/P70were23.95±8.39,26.44±8.16and29.80±13.30ng/L,andTNFαwere137.63±23.50,245.41±54.07,and212.54±62.08ng/Lrespectively.TherewassignificantdifferenceofIL-6andTNFαlevelamongeachtwoofthegroups（P＜0.05）.ButthelevelofIL-12/P70wasnosignificantdifferenceamongeachtwoofthegroups.Conclusion：ThelevelofWBC,Neu(%),CK-MB,CRP,GLU,bodytemperaturewasusedasaearlywarningindexesinseverepatientsofEV71infection.Asthedeepeningdegreeofinfection,levelsofmaturecellsurfacemarkerswererising,especiallyinCD83andCD80.SoweestimatedthatEV71infectionplayedanobviousroleinpromotingmatureofDC.TheresultsshowedthattheactivationofMAPKsignalingpathwaystrengthenedgradually,theexpressionofcytokinesincreasedsignificantly.Inconclusion,EV71infectioncanpromotedendriticcellmaturationandcytokinesecretion.Keywords：intestinalvirusenterovirus71/dendriticcells/MAPKsignalingpathway/cytokines8 安徽医科大学硕士学位论文技术路线图手足口病患儿入院同期正常对照组符合《手足口病诊疗指南（2010年版）》诊断现标准，结合临床筛选出资料完整的EV71感染场确诊病例，根据分类标准分为轻症、重症感染病组。例资料及轻症组（即普通EV71重症组（包括发展为重标感染患儿）症和重症重型患儿）本采集收集外周血标本，随访、个案调查全血血清红细胞裂解液裂解获得PMBC实+DC表面标记CD11C、P-P38MAPK、P-JNK、血清细胞因子水验+++CD80、CD83、CD86P-ERK1/2蛋白磷酸化水平—ELISA法室检测—流式细胞仪平—Westernblot法检测建立数据库，进行数据处理与分析9 安徽医科大学硕士学位论文EV71型手足口病患儿外周血树突状细胞及细胞因子产生的调节机制研究1.前言肠道病毒71型（Enteroviruses71,EV71）是儿童尤其是学龄前及婴幼儿手足[1]口病（hand-foot-mouthdisease，HFMD）的主要致病病原体之一。1973年，在美国加利福尼亚，采集年龄九个月的伴有脑炎儿童的粪便作分析时分离出了EV71[2]型病毒的首例病毒株。手足口病主要在10岁以下的儿童会表现出典型临床症状，如发热及手、足、臀部、口腔等多处有小疱疹和溃疡，由EV71感染所致的[3]手足口病起病紧急、进展迅速。EV71感染程度比较轻的患儿，药物治疗后状况良好，感染程度严重的会导致患儿死亡，如波及脑膜和神经而引发脑膜炎和肺水[4]肿等致残致死的并发症，引起社会广泛的关注。目前针对该类手足口病尚未有确切安全的疫苗及特效的药物，故而患儿的早期诊断治疗显得格外重要。EV71导致的儿童手足口病的具体机制也尚未明确，对于其免疫方面的机制有大量的研[5]究，EV71可使感染患儿机体免疫系统紊乱。机体的免疫系统是一个有机体系，健康状况下机体的免疫系统处于动态平衡。尤其是学龄前儿童及婴幼儿，其生理性免疫功能较成人低下，这可能成为各种致病微生物提供了一个侵入通道。国内外对其免疫方面的机制也进行了大量的研究，EV71能够入侵很多细胞如多能性人胚胎干细胞，人肌肉横纹瘤细胞，鼠脑来源的神经前祖细胞，人结直肠腺癌细[6-9]胞，未成熟树突状细胞等不同类型的细胞。EV71感染树突状细胞（dendriticcells，DC）导致细胞因子表达水平改变。大量研究都致力于细胞模型建立研究其+免疫方面的机制，也有研究者研究发现患儿感染EV71后，其外周血中CD3、++[10]CD4、CD8T淋巴细胞数量都在上升，但尚未见到检测患者体内EV71感染DC中丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs)信号传导通路调节等相关研究。本研究从患者出发，分析EV71感染后呈现出不同临床表现的儿童DC中MAPK信号传导通路激活状况，也分析外周血中DC表面标志表达的百分比变化，以期为EV71型手足口病的早期诊断与重症患者预防治疗提供更10 安徽医科大学硕士学位论文多参考。同时也检测了患儿血清中一些细胞因子包括白细胞介素6（Interleukin6，IL-6）、白介素12（Interleukin12，IL-12）、肿瘤坏死因子α（Tumornecrosisfactoralpha，TNF-α）等在感染EV71后随病情严重程度的表达情况，可能临床诊断起到辅助作用。2．材料与方法2.1病人资料2.1.1手足口疾病患者的诊断标准和分组2.1.1.1手足口疾病的诊断标准所有患者临床诊断均符合卫生部《手足口病诊疗指南（2010年版）》及《肠道病毒71型感染重症病例临床救治专家共识(2011年版)》，该院对于EV71感染手足口患者诊断依据：（一）临床诊断病例。诊断标准：1.在流行季节发病，常见于学龄前儿童，婴幼儿多见；2.发热伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可无发热，极少数重症病例皮疹不典型，临床诊断困难，需结合病原学或血清学检查做出诊断。如无皮疹病例，临床不宜诊断为手足口病。（二）确诊病例。临床诊断病例具有下列之一者即可确诊。1.咽拭子、疱疹液、粪便等样本肠道病毒EV71－RNA检测阳性；2.急性期与恢复期血清EV71型肠道病毒中和抗体有4倍以上的升高；3.咽拭子、疱疹液、粪便等样本分离出并鉴定为EV71肠道病毒。(三)临床分类。1.普通病例诊断依据：手、足、口、臀部皮疹，伴或不伴发热。2.重症病例（包括重症重型）诊断依据：出现下列指标即提示为重症病例①持续高热：体温（腋温）大于39℃，常规退热效果不佳；②神经系统表现：出现精神萎靡、呕吐、易惊、肢体抖动、无力、站立或坐立不稳等，极个别病例出现11 安徽医科大学硕士学位论文食欲亢进。③呼吸异常：呼吸增快、减慢或节律不整。若安静状态下呼吸频率超过30~40次/分（按年龄），需警惕神经源性肺水肿。④循环功能障碍：出冷汗、四肢发凉、皮肤花纹，心率增快（＞140~150次/分，按年龄）、血压升高、毛细血管再充盈时间延长（＞2秒）。⑤外周血WBC计数升高：外周血WBC超过915×10/L，除外其他感染因素。⑥血糖升高：出现应激性高血糖，血糖大于8.3mmol/L。2.1.1.2.手足口疾病患者的分组根据上述临床诊断及分类标准，将手足口病患儿分成两组即轻症感染组和重症感染组（包括重症重型）。2.1.2EV71型肠道病毒感染儿童资料自2015年6月起至2016年4月，从阜阳市第二人民医院感染科及应急科住院患者中收集肠道病毒感染的手足口病临床诊断病例89例，排除患者咽拭子、疱疹液、粪便等样本肠道病毒EV71-RNA检测阴性或血清EV71-IgM阴性以及未检测肠道病毒EV71-RNA的病例49例。剩余40例均符合手足口疾病诊断标准，且为临床确诊的EV71型肠道病毒感染手足口病病例。40例患者年龄为：7个月~5岁（平均年龄为1.84±1.10岁），男女比例约为1∶1。临床主要表现为有发热伴手、足、口、臀部皮疹，部分病例可无发热。2.1.3正常对照组儿童临床资料同样时间段从阜阳市第二人民医院体检中心收集了20例健康儿童作为正常对照组（平均年龄和男女比例与感染组一致）。2.1.4外周全血及血清样本本课题标本收集提前已经与临床医生和护理部沟通，并发给相关科室护士―标本采集指导书‖，且在获得手足口病患儿家属签署知情同意书的情况下采集标本。所有EV71感染手足口病患儿均于入院当日或次日早晨空腹采集2ml静脉抗凝全血2管、2ml促凝血1管。外周全血标本采集：采集2ml静脉全血置于10ml内有1.5~2.2mg/ml的EDTA-2K抗凝管中，来回颠倒混匀6-8次，制备成抗凝全血标本。EDTA抗凝全12 安徽医科大学硕士学位论文血抽取两管，一管用于DC表面标志物检测，另一管用于信号通路的蛋白质检测。血清样本留取：同时采集2ml注入含促凝剂的真空采血管，室温放置2小时后，3000rps/min，离心5min，分离血清，储存于-80℃冰箱中冷冻，用于白介素-6、白介素-12/P70及肿瘤坏死因子α的检测。正常对照组研究对象采取同样方法采集外周血备用。同时整理好患儿临床相关资料如性别、年龄、白细胞计数（Whitebloodcellcount，WBC）、中性粒细胞百分比(Neutrophil，Neu%)及心肌酶谱项目结果等。2.2外周血单个核细胞的制备2.2.1外周血单个核细胞（Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC）用途：外周血PBMC的分离主要用于DC表面标志物的检测及信号传导通路中蛋白质的Westernblot检测所需。2.2.2制备原理采用美国BD公司生产含有NH4CL的FACSLysingSolution红细胞裂解液，裂解外周全血标本中的红细胞。2.2.3主要试剂1.FACSLysingsolution浓缩红细胞裂解液（×10）：美国BDPharmingen上海公司公司，货号：349202。2.0.01%PH7.4PBS缓冲液。3.1.5-2.2mg/ml的EDTA-2K。2.2.4主要溶液配制1.FACSLysingsolution红细胞裂解液（×10）：购自美国BD公司的浓缩红细胞裂解液，货号：349202，使用前用无离子水做1：10稀释，其优点是可以在流式细胞仪上清楚地将淋巴细胞、单核细胞、粒细胞及红细胞碎片区分开来。2.0.01%PH7.4PBS缓冲液：Na2HPO4·12H2O2.89gNaH2PO4·2H2O0.3g13 安徽医科大学硕士学位论文NaCl8.0gKCl0.2g蒸馏水调整容积至1000ml先将上述溶质加入到800ml蒸馏水至完全溶解，用盐酸调整PH为7.4，再加水至1000ml。115℃高压灭菌15min，储存于4℃冰箱备用。2.2.5实验所需主要设备1.L-500低速台式离心机：上海利鑫坚离心机有限公司。2.10ml一次性聚丙烯吸管。3.A1004电子分析天平：上海光学仪器一厂生产。4.2-8℃医用冷藏箱：HaierHYC-290。5.超低温医用保存箱：HaierDW-86L626。6.中佳KDC-40低速离心机：科大创新股份有限公司中佳分公司生产。2.2.6实验步骤1.先用PBS缓冲液清洗全血：在2ml外周全血管中加入等量的PBS缓冲液，充分混匀，然后1500rpm离心5min，弃去上清液；用PBS缓冲液重复清洗2次。2.裂解红细胞获得单个核细胞（PMBC）：在每个PBS缓冲液清洗的全血管中加入2-3ml含有NH4CL的FACSLysingsolution红细胞裂解液，反复吹打充分混匀，室温放置10min待全血中红细胞完全裂解，然后1500rpm离心5min，弃去上清液；再次加入2-3ml含有NH4CL的FACSLysingsolution红细胞裂解液，充分混匀，室温放置10min待全血中红细胞完全裂解，然后1500rpm，离心5min，弃去上清液。在试管底部少量薄层的―白色云雾状‖即为富含树突状细胞（DC）的单个核细胞（PMBC），主要是淋巴细胞和单个核细胞。3.PMBC细胞浓度的调整：用10ml一次性聚丙烯吸管小心加入适量的PBS缓冲6液到上述制备好的PMBC中，调整样品的浓度至PMBC为1×10cells/ml，用于外周血DC表面标志物检测。4.同样方法制备单个核细胞（PMBC），也用10ml一次性聚丙烯吸管插到―云雾状层‖，小心吸取单个核细胞至另一试管中，加入5倍体积0.9%生理盐水，1500rpm14 安徽医科大学硕士学位论文离心10min，弃上清液，重复洗涤3次。分组标号，放入-80℃保存，以用于信号通路中的蛋白质提取。2.3流式细胞术（FlowCytometryMethod，FCM）检测DC表面标志物2.3.1实验用主要试剂FCM标记荧光抗体：（1）Lin1混合抗体（HumanLineageFlowCocktail）（包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56荧光抗体）-FITC（50T），货号340546。（2）小鼠抗人单克隆抗体HUCD80-PE（100T）货号557227。（3）HUCD86-FITC（100T）：货号555657。（4）HUCD83-APC（100T）：货号551073。（5）HUCD11c-PerCP-Cy™5.5（50T）：货号565227（6）阴性对照：鼠抗人PE-IgG1抗体（MouseIgG1-PE），货号：349043。以上荧光抗体均购自美国BDPharmingen上海公司。2.0.01%PH7.4PBS缓冲液3.1%多聚甲醛2.3.2主要溶液配制1.0.01%PH7.4PBS缓冲液：同上。2.0.01%PBS配制的1%多聚甲醛：将1g多聚甲醛加入到0.01%PH7.4PBS缓冲液中，至体积为100ml，加热到70℃后再冷却至室温，用盐酸调整PH为7.4，4℃储存备用。2.3.3实验所需主要设备流式细胞仪FACSCalibur：美国BD公司生产。一次性BDFALCON专用测试管：美国BD公司生产，货号：352052。可调微量加样器（5~50μl、50~250μl）：芬兰ThermoFinnpipette雷勃单道微量可调加样器。XW-80A旋涡混合器：上海驰唐电子有限公司生产。15 安徽医科大学硕士学位论文其他：加样枪头、10ml一次性聚丙烯吸管（EP管)、一次性塑胶手套、试管架等。2.3.4标本处理时间要求新鲜标本采集后应立即分析，确保外周全血DC的分离及分析在4小时内完成。2.3.5DC荧光抗体标记染色1原理：采用直接荧光素抗体标记法。2实验步骤：第一步荧光抗体标记染色：取以上感染组及对照组研究对象外周血已分离并且调整好浓度的DC分别用相应的荧光抗体标记染色。取制备好的感染组细胞数6量级为1×10cells/ml悬液100μl分别加入3支一次性BDFALCON专用测试管中，同时3只测试管依次分别加入20μlCD83-APC+20μlCD11c-PerCP-Cy、20μlCD86-FITC+20μlCD11c-PerCP-Cy、20μlCD80-PE荧光单克隆抗体进行标记，再在每管中加入FITC标记的Lin1混合抗体20μl。阴性对照组采用与感染组同样的操作，在细胞悬液中加入20μlPE标记的鼠抗人IgG1抗体，旋涡混合器混匀数秒，4℃避光孵育30min，用PBS缓冲液洗涤细胞2次。第二步细胞固定：每管中加入1%的多聚甲醛200μl，固定30min，PBS缓冲液洗涤细胞2次。每管加入400μlPBS缓冲液重悬细胞后，立即上机分析。一般此检测过程应在1小时内完成。采用美国BD公司FACSCalibur仪器及试剂检测阳性细胞百分比，对单个核细胞进行表面标志分析，根据免疫表型分析结果比较两组DC成熟度。2.3.6FCM检测DC表面标志物1.流式细胞仪工作原理：使用美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪分析，采用488nm空气冷却式氩离子激光器和635nm红光二极管激光器双激光立体空间激发方式实现四色荧光分析，以CellQuestPro软件获取分析细胞信息，以前向角荧光（FSC）和侧向角荧光（SSC）分别作为纵坐标、横坐标的散点图，去除细胞碎片及死亡细胞，调节荧光补偿，获得50000个细胞/管。2.CellQuestPro软件使用：使用CellQuestPro软件区分细胞与细胞碎片、圈定Lin116 安徽医科大学硕士学位论文－/±混合抗体弱阳性和阴性区细胞群，并对FITC-Lin细胞群（包括CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56阴性群，分别排除T、B淋巴细胞、单核细胞、嗜++++酸细胞及NK细胞）进行CD11C、CD80、CD83、CD86表面标志物分析，并以此获得4个荧光抗体染色阳性细胞百分数数据。软件优点：获得DC纯度高、速度快，可以准确反映感染组患者外周血中DC的体内状况。3.上机检测：溶血过程、样本染色处理完后立即上机检测；打开流式细胞仪：预热及进行质控程序；运行CellQuestPro软件选择EXP模式；上样检测，调节FSC/SSC探测器，设置Gate，调节荧光补偿；收集实验数据分析。2.4免疫蛋白印迹（Westernblot法）检测信号传导通路蛋白2.4.1实验用主要试剂及所需主要设备1.主要试剂：⑪.分装聚偏氟乙烯膜（PVDF膜）采购于瑞士Thermo公司；⑫.化学发光底物试剂盒同样采购于瑞士Thermo公司；⑬.PMSF采购于上海生物工程有限公司；⑭.蛋白质分子量标准品采购于美国Fermentas公司；⑮.小鼠抗人磷酸化p38MAPK(phosphorylatedp38MAPK，p-p38)抗体、小鼠抗人磷酸化c-Jun氨基末端激酶(phosphorylatedc-JunN-terminalkinase，p-JNK)、小鼠抗人磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶1/2(extracellularsignalregulatedproteinkinases1/2，p-ERK1/2)抗体（均为一抗）；GAPDH抗体及HRP标记的山羊抗小鼠IgG第二抗体购自上海碧云天生物科技有限公司。2.主要溶液配制⑪.10×PBS缓冲液（500mL）：称取NaCl、KCl、Na2HPO4、KH2PO4粉末分别40g、1g、14.5g、1g装于500mL的锥形瓶中，加入480mL的ddH2O，玻璃棒顺时针搅拌，加速以上粉末的溶解，待其完全溶解后，将其定容至500mL；⑫.1×PBS缓冲液（500mL）：取10×PBS缓冲液50mL加入到500mL的锥形瓶中，然后加入ddH2O至500mL的刻度；17 安徽医科大学硕士学位论文⑬.PMSF试剂（浓度为17.4mg/mL）：称取0.174g的PMSF蛋白酶抑制剂加入50mL的烧杯中，然后加入异丙醇10mL溶解粉末，待其溶解后，分装于1.5ml的EP管中，放置-20℃保存，配制过程中注意防护，PMSF蛋白酶抑制剂具有神经毒性；⑭.1molTris-HCl（1L，PH6.8）：称取Tris粉末121g至1L的烧杯中，倒入ddH2O约800mL，用浓盐酸（浓HCl）调节该粉末溶解后的溶液，调至PH值为6.8，定容至1L，高压灭菌，室温保存；⑮.1.5molTris-HCl（1L，PH8.8）：称取Tris粉末181.7g至1L的烧杯中，倒入ddH2O约800mL，用浓盐酸（浓HCl）调节该粉末溶解后的溶液，调至PH值为6.8，定容至1L，高压灭菌，室温保存；⑯.10%SDS（100mL）：称取SDS粉末10g于烧杯中，加入约80mL的ddH2O，置于水浴锅中68℃加热溶解，使用玻璃棒按顺时针搅拌加速溶解，待其溶解后，将其酸碱度PH值调至为7.2后，定容为100mL，室温保存；⑰.30%丙烯酰胺（1L）：称取丙烯酰胺290g和甲叉丙烯酰胺10g一同加入至烧杯中，再加入600mLddH2O，充分搅拌使其溶解，然后定容至1L，再利用滤器滤去杂质，利用铝纸包住放置4℃保存；⑱.10%过硫酸铵（APS，10mL）：称取1gAPS加入烧杯中，加入10mLddH2O搅拌溶解，4℃保存；⑲.5×SDS-PAGE缓冲液（1L）：称取Tris、Gly、SDS分别为15.1g、94g、5.0g置于烧杯中，加入ddH2O使其溶解，定容至1L，注意SDS粉末比较难容而且有气泡；⑳.1×TBS（1L，PH7.2）：称取Tris-base和NaCl分别1.21g和8.8g，ddH2O溶解，浓HCl调节至PH值为7.2，定容。⑴.TBST（0.1%）洗脱液：500mLTBS溶液中加入Tween-20表面活性剂。3.主要设备：⑪.电泳槽和电泳仪：采购于北京市六一仪器厂；⑫.湿电转膜仪：采购于美国BIO-RAD公司；18 安徽医科大学硕士学位论文⑬.TGL-16M湘仪高速低温离心机：采购于湖南长沙湘仪离心机仪器有限公司；⑭.恒温水浴锅：采购于北京市六一仪器厂。2.4.2PMBC中蛋白的提取第一步：取样：从-80℃中取出保存的已分离出的PMBC。第二步：洗脱：用本实验室配制的洗脱液PBS（体积为PMBC体积的2倍）去稀释PMBC，混匀，至少静置30s后，将稀释后的PMBC置于低温离心机（设置温度为4℃，设置温度为4℃避免破坏蛋白，转速为25,000×g，时间为20min）离心，待离心机停止后取出样本，将上清液弃去，保留试管底部细胞。第三步：再洗脱：再用洗脱液PBS同第二步方法去洗脱PMBC，弃去上清液，保留试管底部细胞。第四步：裂解液裂解细胞：向试管中加本实验室配制lysis裂解液500μl，然后分别添加成2mMEDTA，1mMPMSF，静置5min后，添加DTT，终浓度为10mM。将样本冰浴20min后用于超声细胞破碎仪。第五步：超声破碎：采用超声波细胞破碎仪在冰浴中将PMBC（相关参数：超声6s间隔10s，功率300W，15min）破碎。然后将破碎后的PMBC置于低温离心机（设置温度为4℃，设置温度为4℃避免破坏蛋白，转速为25,000×g，时间为20min）离心，待离心机停止后取出样本，保留上清液。第六步：二硫键的打开：使用10mMDTT还原剂处理1h（放置温箱中，设置温度为56℃），还原打开二硫键。第七步：封闭：打开二硫键的样本在暗室利用55mMIAM处理45min后，使半胱氨酸的烷基化被封闭。第八步：烷基化封闭之后向里加入丙酮（经过冷冻处理的）1ml，放置-20℃过夜。第九步：过夜的样本置低温离心机25,000×g离心20min，弃上清液，保留沉淀。第十步：再次破碎：300μl0.5MTEAB重悬沉淀后，冰浴20min后，同第五步超声破碎15min。第十一步：破碎后溶液置低度离心机25,000×g离心20min后，留取上清液，弃去沉淀。上清液-20℃保存，用于后续定性与定量。19 安徽医科大学硕士学位论文2.4.3蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝G-250测定蛋白的含量法进行蛋白含量的测定：步骤一：标准蛋白溶液BSA线性方程的构建：①.准备好已高压消毒的EP管（1.5mL）七支，分别标上号0、10、30、50、70、90、100（数字代表即加入BSA标准蛋白溶液的体积）；②.将浓度为0.22mg/mL的BSA，以0μl、10μl、30μl、50μl、70μl、90μl、100μl加入到以上准备好的对应的七支EP管中；③.将去离子水（ddH2O）加入至上面的七支EP管中，将所有EP管中溶液的体积加至最终为100μl；④.再向每管中加入1mL的考马斯亮蓝染液，吹打混匀；⑤.利用紫外分光光度仪检测595nm处的OD值。具体过程及检测结果如下表格1和曲线图1；表1标准蛋白溶液BSA线性方程的构建EP管01030507090100BSA（μl）01030507090100ddH2O（μl）10090705030100G-250（mL）1111111OD值00.070.230.290.370.420.43浓度（μg/mL）0261014182020 安徽医科大学硕士学位论文图1标准蛋白溶液BSA线性方程⑥.最终标准蛋白溶液BSA线性方程为Y=0.02134X+0.0447。步骤二：PMBC提取总蛋白浓度的测定：取已高压灭菌消毒后的EP管，做好标记，将待测蛋白50μl和ddH2O加入到EP管混匀，然后加入1mL的考马斯亮蓝染液混匀后，再次利用紫外分光光度仪检测待测蛋白的OD值。利用曲线方程计算出待测蛋白的浓度。2.4.4Westernblot法分析信号传导通路蛋白的相对表达量1.12%SDS-PAGE凝胶的配制：包括12%分离胶以及5%浓缩胶。操作过程：①.玻璃板两块ddH2O洗净，放温箱中烘干备用；②.取出玻璃板，两板合并，然后放入夹槽中对齐夹紧，扣住；③.向玻璃块夹层中加入2mL的ddH2O进行检查夹槽是否漏液，加入后静置10min后，观察检漏结果；④.确定不漏液后，按照表依次加入分离胶溶液，加至绿色柱子以上大概4cm高，21 安徽医科大学硕士学位论文然后加入ddH2O，使其胶面压到一个水平面上，然后放置实验台30min（根据室温调整静置时间）是其自然凝胶。⑤.30min后，轻轻地将架子倾斜，观察是否是否形成水平线，如形成，利用移液枪将上层ddH2O吸出，并用吸水纸轻轻将水份吸干；⑥.接着按照表格2和3加入浓缩液，加至里夹槽口还差1cm左右的位置，停止加液，插上0.75mm的梳子，同样静置待其浓缩液自然凝固；⑦.待其凝固后轻轻地将梳子垂直的拔出，看见加样槽，12%SDS-PAGE凝胶配制完成。表212%分离胶的配制12%分离胶5mL（下层）溶液体积（μl）ddH2O160030%丙烯酰胺20001.5molTris(PH8.8)130010%SDS5010%APS50TEMED2表35%浓缩胶的配制浓缩胶5mL（下层）溶液体积（μl）ddH2O140030%丙烯酰胺3301.5molTris(PH6.8)25010%SDS2010%APS20TEMED22.p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白三种蛋白以p-p38MAPK为例，做Westernblot法分析的具体过程如下所述：22 安徽医科大学硕士学位论文（1）目的蛋白的12%SDS-PAGE凝胶电泳的分离：①.将蛋白放置100℃变性5min；②.在已配制好的12%SDS-PAGE凝胶的加样孔中依次加入对照组、轻症感染组、重症感染组、蛋白Marker10μl；③.加样后向电泳槽中加入1×SDS-PAGE缓冲液，连接电源，设置电压110V，分离胶分离2h；观察蛋白Marker分离情况，当其基本分离后换电压为55V，时间设置为2h；④.待观察到溴酚蓝线出来离分离胶底部2cm处，停止电泳；⑤.取出玻璃板，玻璃板平放，将上层玻璃板轻轻地撬开，撬开之后，切下需要的胶片；⑥.将切下的胶片用ddH2O清洗5次，除去胶片上残留的1×SDS-PAGE缓冲液，然后将切下来的胶片浸泡于湿转转移液中待以下的湿转操作。（2）湿转法：①.准备一个泡沫盒，利用制冰机制备一盒冰备用；②.将PVDF膜按照胶片的大小裁剪，稍微比胶片大点，在将PVDF膜的左上角裁剪掉，来区别蛋白转移到PVDF膜上后，蛋白处于哪一面，本实验以PVDF膜左上角残缺正对操作者面为蛋白面；放置甲醇里浸泡15min左右；③.准备一个陶瓷盘，向陶瓷盘里倒入大约5cm高的水位的湿转转移液，然后将两片海绵垫、小镊子、拨胶板、滤纸、夹板（两块包括黑板和白板）还有赶泡器放于该陶瓷盘里；④.将黑面板放于陶瓷盘中；⑤.将一片海绵垫放在黑面板的中央，然后在海绵垫上放三层滤纸（提前裁剪好的），利用赶泡器轻轻的在滤纸上滚动，赶走滤纸与海绵垫之间的气泡；⑥.用小镊子和拨胶器轻轻将胶片从浸泡于湿转转移液中的切下的胶片取出，放置三层滤纸上，再用赶泡器赶走滤纸与胶片之间的气泡；⑦.用小镊子将PVDF膜从甲醇溶液中取出，放置胶片上，将胶片全部覆盖住，同样利用赶泡器将胶片与PVDF膜之间的气泡赶走，防止影响后面电泳的转移效果；23 安徽医科大学硕士学位论文⑧.再将三层滤纸覆盖于PVDF膜上，赶泡器轻轻地赶走气泡；⑨.然后将另一片海绵垫放于滤纸上；⑩.将白面板与黑面板合上夹住，将夹板放于电泳槽中，黑面对黑面，白面对红面，倒入转移液，然后将整个转移装置放于泡沫盒中置于冰里进行湿转，电压保持80V，电流200mA，转膜大约2h。（3）免疫反应：①.完成转膜后，将膜从―三明治‖中取出PVDF膜，对膜上的转移液进行洗脱，利用1×TBST洗脱液洗脱三次（该过程是将PVDF膜放于固体培养平皿的盖里，倒入洗脱液然后在摇床上缓慢的每次洗脱5min，该过程中防止PVDF膜干涸）；②.将洗脱干净的PVDF膜放于干净的玻璃板上，利用1×丽春红染液染色来观察转膜情况，染色约15s，然后用ddH2O去冲洗PVDF膜，待观察到蛋白红色条带时利用铅笔小心翼翼地在PVDF膜上标出参考蛋白的位置；③.再次利用1×TBST洗脱液洗脱三次，将膜上的1×丽春红染液洗脱干净；④.洗脱干净后，将PVDF膜浸泡于封闭液中，置于摇床上封闭2h，出去PVDF膜上的杂质，避免干扰后面抗原抗体反应时出现非特异性反应；⑤.封闭2h后，取出PVDF膜，同样利用1×TBST洗脱液洗脱三次，将膜上的封闭液洗脱干净；⑥.将PVDF膜利用小镊子装入大管中，将蛋白面对管中，加入稀释好的一抗中稀释比例为1∶200，将管装满，但要保证，PVDF膜紧贴管壁，不能有气泡存在，有气泡应该用玻璃棒将气泡赶走，然后盖上管盖，将管放入4℃冰箱摇床上，孵育过夜；⑦.将过夜的PVDF膜取出，利用1×TBST洗脱液洗脱三次，洗脱时间相对长点，每次10min，将膜上的一抗洗脱干净；⑧.将洗脱干净的PVDF膜，放置平皿里，加入已经稀释好的二抗（1∶2000），置于室温摇床上孵育1h；⑨.二抗孵育完后，再次利用1×TBST洗脱液洗脱三次，将二抗洗脱干净；同样每次洗脱10min。24 安徽医科大学硕士学位论文（4）曝光及显影定影：整个过程需要在暗室里进行，避光，洗脱好的PVDF膜放在保鲜膜上，加发光剂ECL：将膜放在平板上，利用吸水纸将水吸干，加入70μlAECL和70μlBECL，利用枪头将ECL在膜上滑开，使其铺满PVDF膜，然后利用吸水纸将周边的ECL吸干；接下来，用保鲜膜把膜和平板包裹住，中间不能有气泡，操作过程需注意；将包裹住的膜和平板整体放置暗盒中，然后把事前裁剪好的胶片放在PVDF膜上压好，放置5s；再将胶片取出，将其浸泡在显影液中，见到一点黑时，立即取出胶片放置定影液中，显现出蛋白免疫条带。2.5酶联免疫吸附试验（Enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）定量检测血清中细胞因子水平2.5.1ELISA检测试剂盒本实验研究了白介素-6（IL-6）、白介素-12/P70（IL-12/P70）及肿瘤坏死因子α（TNF-α）细胞因子在感染组及对照组血清中的表达水平。TNF-α、IL-6及IL-12/P70三种细胞因子试剂盒检测范围分别为：20-400ng/L、0.8-20ng/L、2-54ng/L。IL-6、IL-12/P70及TNF-α的ELISA检测试剂盒均购自美国Raybiotech广州公司。ELISA试剂盒组成：序号试剂名称规格序号试剂名称规格辣根过氧化物酶IL-6、IL-12/P70及（Horseradish13ml×1瓶7TNF-α单克隆抗体包12孔×4条Peroxidase，HRP）标被板记抗体2样品稀释液3ml×1瓶8标准品0.5ml×1瓶320倍浓缩洗涤液20ml×1瓶9标准品稀释液1.5ml×1瓶品4显色剂A液（TMB-A）3ml×1瓶10封板膜2张5显色剂B液（TMB-B）3ml×1瓶11密封袋1个6终止液3ml×1瓶12说明书1份25 安徽医科大学硕士学位论文2.5.2实验仪器1.金怡BATHEHH-W420电热三用恒温水箱：江苏省金坛市医疗仪器厂生产。2.标准96孔RT-6000酶标仪（Rayto酶标仪）：深圳雷杜。3.可调微量加样器（5-50μl、50-250μl）：同上。4.1.5ml100%聚丙烯EP管。2.5.3检测原理三种试剂盒均采用的双抗体夹心法，原理均见如下图所示：2.5.4操作步骤三种细胞因子均按试剂盒说明书操作，具体过程在说明书的基础上进行如下。1.TNF-α双抗体夹心法检测步骤：步骤一：试剂盒及血清样本的准备：将TNF-α试剂盒和血清标本分别从4℃和-80℃冰箱中取出，放置实验台，约30min待其平衡至室温。步骤二：1×浓缩洗条液的配制：利用去离子水稀释20×浓缩洗涤液，按照1∶20的比例稀释，配好500ml备用。步骤三：不同浓度标准溶液的配制：取5个1.5mlEP管放置EP管架上，按顺序标上1~5序号。原TNF-α的标准液浓度为800ng/L，在1号EP管中加入15026 安徽医科大学硕士学位论文μl的原倍标准溶液，然后再加入150μl样品稀释液使其浓度变为400ng/L。在2号EP管中加入150μl的1号标准溶液，然后再加入150μl样品稀释液使其浓度变为200ng/L。在3号EP管中加入150μl的2号标准溶液，然后再加入150μl样品稀释液使其浓度变为100ng/L。在4号EP管中加入150μl的3号标准溶液，然后再加入150μl样品稀释液使其浓度变为50ng/L。在5号EP管中加入150μl的4号标准溶液，然后再加入150μl样品稀释液使其浓度变为25ng/L。如表4所示：表4标准品的稀释浓度标准品稀释方法400ng/L1标准品150μl的原标准品基础上加入150μl样本稀释液200ng/L2标准品150μl的1号标准品基础上加入150μl样本稀释液100ng/L3标准品150μl的2号标准品基础上加入150μl样本稀释液50ng/L4标准品150μl的3号标准品基础上加入150μl样本稀释液25ng/L5标准品150μl的4号标准品基础上加入150μl样本稀释液步骤四：样品以及标准品的加入：实验设计有空白孔、标准孔、待测样品孔。实验采用的是48孔酶标板，标准品5种浓度占用最后一列孔。空白孔占用3个。其余用于待测样本的加入，将样本编号，按照一定顺序加入酶标孔中即可。具体溶液的体积：标准品每孔加入50μl，待测样本最终稀释度为5倍，其总加入量同样为50μl，空白对照组加入50μl的样品稀释液。整个加样过程中需要将样品加于酶标板孔的底部，尽量不要去碰触孔壁，加完后拿起酶标板轻轻摇晃使其将酶标板的底部铺满覆盖。步骤五：温育：用封板膜将酶标板封住，放置已经提前设置好温度为37℃且温度已达到37℃的温箱中温育30min。步骤六：洗涤：洗涤过程很重要，需要将未与酶标板底部抗体结合的成分洗净，防止本底过高导致结果的不准确性。将温箱中的酶标板拿出，轻轻地揭掉封板膜，用力弃去孔中的液体，用干净的纱布将酶标板裹住，平拍，将孔中的液体拍干，然后每孔加入300μl的1×洗涤液，静置30s后弃去，拍干，此过程重复527 安徽医科大学硕士学位论文次。步骤七：酶标记物的加入：按照每孔50μl的体积加入酶标记物，空白对照组不需要加入酶标记物。步骤八：温育：过程如同步骤五。步骤九：洗涤：过程如同步骤六。步骤十：显色及终止显色：每孔加入显色液A和显色液B个50μl，轻轻混摇晃匀，瞬速用锡纸盖住酶标板，使其避光，放置温箱37℃显色10min。10min后取出酶标板，揭去锡纸，每孔加入50μl的终止液，终止反应，待其颜色变为黄色。终止15min内去检测OD值。步骤十一：OD值测定：使用酶标仪在450nm波长处检测各个孔的OD值。2.IL-12/P70以及IL-6双抗体夹心法检测：具体操作步骤同TNF-α双抗体夹心法检测的过程。操作流程示意图：准备试剂、样本和标准品加入准备好的样本贺标准品，37℃反应30分钟洗板5次，加入酶标试剂，37℃反应30分钟洗板5次，加入显色剂A、B，37℃显色10分钟加入终止液15分钟之内上酶标仪读OD值计算结果28 安徽医科大学硕士学位论文2.6实验结果的统计学处理采用SPSS19.0对数据进行统计分析，计数资料采用单样本K-S检验正态分布，符合正态分布以xs呈现的，多组间数据比较采用单因素方差分析（ANOVA），2组间比较采用Student’st-test的分析方法，P<0.05表示差异有统计学意义。3.EV71感染手足口患者基本临床信息分析3.1三组研究对象的性别构成比和年龄分布收集2015年6月至2016年4月本院感染科及应急科住院患者中肠道病毒感染的手足口病临床诊断病例89例，排除患者肠道病毒EV71-RNA检测阴性或血清EV71-IgM阴性以及未做肠道病毒EV71-RNA检测的病例49例，剩余40例为EV71感染手足口病临床确诊病例，其中轻症、重症组患者各20例，另同期收集正常对照组20例。40例EV71感染手足口病患者平均年龄1.84±1.10岁，其中≤1岁3例（7.5%），1岁到≤3岁31例（77.5%），＞3岁6例（15.0%）。40例中男性21例（52.5%），女性19例（47.5%）。经统计学检验轻症、重症组患者的年龄与对照组之间比较差异无统计学意义（F分别为0.703、1.366，P均＞0.05）；2同时三组间研究对象男女性别构成比之间也无统计学差异（χ=0.134，P＞0.05）。因此三组研究对象之间具有可比性。结果见表5。表5三组研究对象的性别构成和年龄基本情况组别例数(n)男例数/女例数（比例）年龄(岁)对照组2011/9（1.22）2.08±1.21＊轻症组2010/10（1.00）1.99±1.02＃重症组2011/9（1.22）1.81±0.952统计量χ=0.134P0.935＊＃注：表示轻症组患者年龄与对照组比较F1=0.703，P1=0.676（P＞0.05）；表示重症组患者年龄与对照组比较F2=1.366，P2=0.204（P＞0.05）。29 安徽医科大学硕士学位论文3.2EV71感染手足口病轻症和重症组患者临床常见指标分析3.2.1EV71感染手足口病轻症和重症组患者临床常见指标的正态性验证通过对40例EV71感染手足口轻症、重症组患者进行随访和调查分析，患者临床常见指标包括：白细胞计数（Whitebloodcellcount，WBC）、中性粒细胞（Neutrophil，Neu%）、天门冬氨酸氨基转移酶(Aspartateaminotransferase，AST)、肌酸激酶（Creatinekinase，CK）、肌酸激酶同工酶（Creatinekinaseisoenzyme，CK-MB）、乳酸脱氢酶（Lactatedehydrogenase，LDH）、α-羟丁酸脱氢酶（Alphahydroxybutyricaciddehydrogenase，α-HBDH）、C-反应蛋白（C-reactiveprotein，CRP）、血糖（Bloodglucose，GLU）及体温（temperature，℃）。采用单样本Kolmogorov-Smirnov（K-S检验）验证上述项目结果的正态性。40例EV71感染手足口轻症及重症组患者临床常见指标WBC、Neu(%)、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH、CRP、GLU、体温结果均呈正态分布（P＞0.05）。结果见表6。表6EV71感染手足口轻症、重症组患者临床常见指标的正态性验证结果轻症组重症组项目Z值P值Z值P值9WBC(10/L)0.5480.9250.8020.542Neu(%)0.6030.8610.5830.886AST(U/L)0.7710.5920.5920.874CK(U/L)1.1420.1471.2870.073CK-MB(U/L)0.8550.4580.6540.786LDH(U/L)0.4820.9740.8600.450HBDH(U/L)0.6560.7830.5860.883CRP(g/L)1.5460.0570.6970.717GLU(mmol/L)0.4230.9940.8900.407体温(℃)0.4480.9880.5230.948注：P＞0.05表示结果呈正态性分布。30 安徽医科大学硕士学位论文3.2.2EV71感染手足口患者轻症、重症组患者临床常见指标之间比较两组患儿临床常见指标WBC、Neu(%)、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH、CRP、GLU、体温水平比较分析见表7所示。重症组患者外周血中WBC、Neu(%)9均值分别为12.63×10/L、60.12%，WBC升高的阳性率为75%（15/20），范围在998.05×10/L~26.84×10/L、30.4%~85.9%之间；轻症组患者外周血中WBC、Neu(%)9均值分别为8.48×10/L、39.37%，WBC升高的阳性率为15%（3/20），范围在993.56×10/L~14.22×10/L、14.6%~77.5%之间。重症组患者心肌酶谱中CK、CK-MB两项目均值分别为108.9U/L、35.7U/L，范围在27U/L~348U/L、16U/L~66U/L之间；轻症组患者CK、CK-MB均值分别为95.7U/L、28.4U/L，范围在30U/L~260U/L、20U/L~34U/L之间。重症组患者心肌酶谱中AST、LDH、HBDH三项目均值分别为47.9U/L、307.1U/L、253.1U/L，范围在28U/L~69U/L、250U/L~437U/L、213U/L~341U/L之间；轻症组患者AST、LDH、HBDH三项目均值分别为40.4U/L、284.6U/L、237.8U/L，范围在30U/L~63U/L、234U/L~353U/L、189U/L~296U/L之间。重症组患者血糖有4例升高（＞6.11mmol/L），轻症组患者血糖均正常。重症组患者CRP均值为30.06g/L，范围在2.0g/L~108g/L之间；轻症组患者血糖均值为11.97g/L，范围在3.3g/L~31.7g/L之间。重症组患者平均体温为38.1℃，范围在36.5℃~39.8℃之间，体温超过38℃有10例（50%），连续发热在39℃以上超过3天的有4例，其中3例患者并发呼吸系统及循坏系统衰竭属于重症重型，转入重症监护病房（ICU）；轻症组患者体温均值为37.3℃，范围在36.2℃~38.8℃之间，体温超过38℃仅2例（10%）。两组患儿临床常见指标WBC、Neu(%)、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH、CRP、GLU、体温结果柱状图见图2。经过统计学分析，EV71感染重症手足口患者临床常见指标中WBC、Neu(%)、CK-MB、CRP、GLU、体温6个项目水平显著高于轻症组患者（P＜0.05），其余临床常见指标如AST、CK、LDH、HBDH4个项目随着疾病症状的加重有升高趋势，但是差异无统计学意义（P＞0.05）。31 安徽医科大学硕士学位论文表7EV71感染手足口轻症、重症组患者WBC、Neu(%)、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH、CRP、GLU、体温水平比较项目轻症组重症组F值P值9WBC(10/L)8.48±2.4012.63±4.081.0740.000Neu(%)39.37±17.6260.12±15.610.0930.000AST(U/L)40.4±7.141.9±10.42.6010.597CK(U/L)95.7±51.8108.9±94.15.4720.586CK-MB(U/L)28.4±4.435.7±11.68.4290.013LDH(U/L)284.6±34.9307.1±46.70.4820.092HBDH(U/L)237.8±30.1253.1±34.30.3140.141CRP(g/L)11.97±7.7730.06±24.3710.6090.003GLU(mmol/L)3.84±0.735.01±1.539.3140.003体温(℃)37.3±0.638.1±0.92.6320.00332 安徽医科大学硕士学位论文图2EV71感染手足口轻症、重症组患者WBC、Neu(%)、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH、CRP、GLU、体温结果柱状图；**表示重症组与轻症组比较有统计学意义。3.3EV71感染对DC成熟的影响3.3.1EV71感染后CD11c、CD80、CD83及CD86表达百分比的正态性验证采用单样本K-S法验证EV71感染后患儿外周血DC表面标志物CD11c、CD80、CD83及CD86表达百分比的正态性。结果CD11c、CD80、CD83及CD86表达百分比均呈正态分布，以xs表示。正态性验证结果见表8。表8EV71感染后CD11c、CD80、CD83及CD86表达百分比的正态性验证CD11c+CD80CD83CD86统计量对照组轻症组重症组对照组轻症组重症组对照组轻症组重症组对照组轻症组重症组x1.761.811.890.961.111.640.821.412.041.321.491.87SD0.950.800.890.830.800.880.550.631.350.980.860.82K-S值0.510.540.960.850.790.690.620.551.190.910.650.57P0.960.930.320.470.560.720.840.920.120.380.790.90注：P＞0.05表示结果呈正态性分布。33 安徽医科大学硕士学位论文3.3.2EV71感染对DC成熟的影响EV71感染后患儿外周血DC表面标志物流式细胞仪检测结果及散点图分别见表9、图3。与对照组比较，EV71感染后CD80、CD83及CD86在DC上表达的百分比随着感染程度的加重而增加。其中CD11c、CD86在DC上表达的百分比虽有增加，但与对照组比较差异无统计学意义；而CD80上升幅度较小，CD83上升幅度尤为明显，CD80、CD83百分比与对照组比较差异有统计学意义（P<0.05）（图4）。说明EV71感染可诱导DC趋向成熟。表9不同组之间DC表面标志物检测结果比较(n=20，%，xs)CD11cCD80CD83CD86对照组1.76±0.950.96±0.830.82±0.551.32±0.98*轻度感染组1.81±0.801.11±0.801.41±0.631.49±0.86*,#*,#重症感染组1.89±0.891.64±0.882.04±1.351.87±0.82*#与对照组比较：P＜0.05；与轻症感染组比较：P＜0.0534 安徽医科大学硕士学位论文图3EV71感染患儿的DC表面标志物流式细胞仪检测散点图***图4外周血DCs表面标志物百分比。与对照组比较：P＜0.05；与轻症感染组比较：P＜0.05.3.4EV71感染后信号传导通路活化情况35 安徽医科大学硕士学位论文将标本中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白质表达量与对应GAPDH相除，得到相对表达量。感染组及对照组儿童DC中蛋白磷酸化水平的检测结果见表10和图5。统计结果显示，p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白表达量均随着感染程度加深而增大。表10感染组及对照组儿童DC中蛋白磷酸化水平的相对表达量对照组轻症组重症组项目MeanSDNMeanSDNMeanSDNp-p380.05840.0073200.55470.1898200.83940.14620MARPKp-JNK0.02190.0073200.10950.219200.11680.131420p-ERK1/20.04380.0146200.27740.2555200.45260.14620图5外周血磷酸化水平变化A：Westernblot法检测p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2磷酸化水平变化；B：3组外周血p-p3836 安徽医科大学硕士学位论文MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白质表达量与对应GAPDH相对表达量比较***与对照组比较：P＜0.05；与轻症感染组比较：P＜0.053.4细胞因子表达水平EV71感染患儿血清中细胞因子检测结果显示：IL-6及IL-12/P70表达水平随着感染程度的加重而表现为上升趋势，其中IL-6变化明显，3组间比较差异有统计学意义（P<0.05），IL12略有升高3组间比较差异无统计学意义；TNF-α表达水平随着感染程度的加重呈现先升高后降低的趋势，3组间差异有统计学意义（P<0.05）。见表11、图6。表11不同组之间细胞因子定量检测结果比较(ng/L，n=20，xs)IL-6IL-12/P70TNFα对照组7.88±2.1223.95±8.39137.63±23.50**轻度感染组12.86±2.8626.44±8.16245.41±54.07*,#*,#重症感染组16.89±3.2029.80±13.30212.54±62.08*#与对照组相比：P＜0.05；与轻症感染组比较：P＜0.05图6血清中细胞因子表达水平变化***与对照组比较：P＜0.05；与轻症感染组比较：P＜0.05.37 安徽医科大学硕士学位论文4讨论手足口病是由EV71型肠道病毒（enterovirus71，EV71）、柯萨奇病毒（coxsackievirus，CoxA16、A4、A5、A9、B2、B5型）和埃可病毒等引起的急性感染性性疾病，多发生于学龄前儿童。大多数患者症状轻，以发热和手、足、口腔等部位的皮疹或疱疹为主要症状。少数患者可出现脑膜炎、脑炎、脑脊髓炎、神经源性肺水肿、心肌炎及循环系统障碍等，个别重症患儿病情进展快，死亡率[11，12，13，14]较高。[14]之前研究证实手足口病感染的主要病原体为EV71病毒，且是引起手足口病重症病例的主要病原体，3岁以内婴幼儿发病率较高。通过对40例EV71感染的手足口患者发病年龄段、性别构成比基本信息的统计分析发现，≤3岁年龄段的儿童发病率为85.0%（34/40），与2011年阜阳市手足口病患儿中3岁以内发病率80.08%相近。这推测可能与3岁以下婴幼儿的自身免疫机能尚未发育完善、免[14]疫力低下有关。但男女性别构成比为1.11:1（21/19），明显低于之前1.91:1，可能原因有两点，其一可能由于本次纳入调查统计的病例数较少，其二有可能是EV71感染的手足口病例中男女性别构成比差异较小。基于此今后将继续增加观察病例，积累较多临床资料，以便更客观统计出发病的男女性别构成比。通过对40例EV71感染手足口患者轻症、重症组患者临床常见指标进行分析发现，重症患者WBC、Neu(%)、CK-MB、CRP、GLU、体温6个指标水平显著高于轻症组患者（P＜0.05），其余临床常见指标如AST、CK、LDH、HBDH4个指标随着疾病症状的加重有升高趋势，但是差异无统计学意义（P＞0.05）。重症组患者平均体温为38.1℃，最高体温达39.8℃，并且出现体温在39℃及以上、超过3天重症病例，其中3例患者并发呼吸系统及循环系统衰竭的手足口病重症重型病例；而轻症组患者体温超过38℃占10%，重症占50%。这说明发热、[15]高热可成为EV71感染手足口患儿神经性并发症的预测指标。从本研究中手足口病患儿心肌酶检测结果来看，CK-MB在轻症型及重症型手足口病患者中均有不同程度的增高且有显著差异（P＜0.05），提示手足口病患儿可能存在一定的心38 安徽医科大学硕士学位论文肌损伤，虽然AST、CK、LDH、HBDH也随着疾病症状的加重有升高趋势，但是其在体内分布较广，特异性差，其活力增高可有非心肌因素影响。因此要确认手足口病患儿是否存在心肌损伤还需结合心电图、心肌肌钙蛋白及临床指征进一步分析。EV71感染手足口患儿轻症组患者血糖正常，重症组患者中有4例升高（20%）,说明血糖增高常提示病情加重，可能与脑干损害和患者危重情况下应激[14]增强有关，病情越危急，应激越强，其血糖升高越明显，预后越差。因手足口病多为病毒感染所致，固大多数病例WBC计数正常，本研究中重症手足口病患9者WBC升高的阳性率和均值分别为75%、12.63×10/L，明显高于轻症患者（15%、98.483×10/L）。这可能与重症病例较多合并细菌感染以及机体处于应激状态WBC释放增加有关，Neu、CRP也同步升高。本次40例EV71感染手足口患者性别、年龄基本信息及临床常见指标统计分[14]析结果与之前研究结果基本符合，这说明本次纳入研究的患者分组符合手足口疾病的临床轻、重症分类标准。同时观察到EV71感染所致手足口患者发热超过3天在39℃以上、高血糖、白细胞总数增多、中性粒细胞百分比升高、CRP升高以及CK-MB升高成为EV71感染手足口病向重症发展的危险因素。因此EV71感染手足口患者WBC、Neu(%)、CK-MB、CRP、GLU、体温6个临床常见指标[16，17，18]可以作为手足口病重症化的临床预警指标。DC是人体内最强大的抗原递呈细胞，依据刺激T细胞增殖能力及发育分化阶段的不同分为未成熟DC和成熟DC，未成熟DC的主要功能为摄取加工抗原以及随体内循环系统迁移，成熟DC负责递呈抗原以刺激T细胞增殖并激活免疫系[19]统。CD83作为成熟DC特有的表面标志，通常被用来识别和分离成熟DC；CD86、CD80、CD11c也是成熟DC表达的重要共刺激因子，其表达量的上调也[20]意味着DC的成熟程度的加深。国内对于EV71感染后外周血中DC表达的共[21]刺激因子的水平有所研究，如李维春等人观察了手足口病患儿外周血中CD80[22]和CD86的水平变化和Shietal研究发现EV71型病毒感染后MEK/ERK信号通路在不成熟树突状细胞的复制中起到重要的作用，研究中提到CD86、CD80、CD83的水平在感染后表达百分率升高，而对于国外还很少有所报道。本研究中，通过39 安徽医科大学硕士学位论文流式细胞技术法对EV71感染后的患儿外周血中DC的表面标志物的表达百分比进行了分析，在EV71感染组各标志物的表达水平均高于对照组，同样在各种标志物中CD83、CD80的上调表现地尤为显著，推测EV71的感染对DC的成熟起到了明显的促进作用。成熟DC在激活机体免疫系统的同时分泌各种细胞因子，[23]参与免疫应答并发挥免疫调节作用，在儿童感染EV71病毒患上手足口病时外[24][25]周血中的一些炎性因子会升高如IL-4、IL-12和IL-18。彭宏君等发现EV71[26]感染可以促进DC成熟、提高体外培养DC活性并增强细胞因子表达量。Linetal在体外实验进一步证明EV71病毒感染可增加DC活性，并促进DC释放细胞因子。以上研究者都证明了EV7感染儿童使其患上手足口病后会通过成熟的DC激活机体分泌一些炎性细胞因子，本实验组，通过ELISA法去检测了EV71不同感染程度组患儿外周血中IL-6、IL-12以及TNF-α分泌量。结果显示：感染组IL-6、IL-12/P70的表达水平明显比对照组高，在感染组中重症组IL-6、IL-12/P70均比轻症组的表达水平高，而TNF-α加在感染初期表达水平较高，在重度感染时反而出现降低的现象。炎性因子的增加又可继续刺激DC成熟，成熟DC可能对EV71[27]繁殖有抑制作用。而重度感染时TNF-α表达量的下降推测是由于此时DC成熟程度较高，对TNF-α较产生了负反馈而导致。[28]p38MAPK信号传到通路参与介导DC的成熟及凋亡，宿主细胞凋亡在病毒感染发病过程中起重要作用。p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2这3种蛋白质均为此信号传导通路的重要节点，其含量的上调，表明此信号传导通路被激活。本实验室采用了检测蛋白磷酸化最经典的一种方法即Westernblot观察患儿外周血中这3种关键蛋白表达的含量有何变化，p-p38MAPK蛋白在感染EV71病毒后呈现显著的表达量增高的趋势，其次是p-ERK1/2蛋白，而p-JNK蛋白表达量变化不明显，研究结果表明此信号传导通路参与介导的促进细胞凋亡信号在增强。MAPK信号传导通路在EV71感染DC过程中起到促进细胞凋亡,有利于正向调节DC释放细胞因子。目前在临床上很少检测患者外周血中的细胞因子，从本实验中可以看出测定患者外周血中的细胞因子对于临床控制患者病情有一定的辅助作用。下一步的工作就是打算扩大标本采集量，同时收集治疗后患儿的外周血，去40 安徽医科大学硕士学位论文观察其中一些细胞因子的表达水平随病情的变化，期望能为临床治疗手足口病提供一定的帮助。综上所叙，EV71感染可促进树突状细胞成熟、激活MAPK信号传导通路并分泌细胞因子，MAPK信号传导通路在EV71感染的DC中发挥显著调控作用。相关机制的研究可以为疫苗及治疗药物的制备提供新的突破点。5.结论和创新点：5.1结论：1.EV71感染重症患者WBC、Neu(%)、CK-MB、CRP、GLU、体温6个指标水平显著高于轻症组患者（P＜0.05），其余临床常见指标如AST、CK、LDH、HBDH4个指标随着疾病症状的加重有升高趋势，但是差异无统计学意义（P＞0.05）。2.流式细胞技术法对40例EV71感染后患者外周血中DC的表面标志物表达百分比分析：EV71感染组各标志物的表达水平均高于对照组，同样在各种标志物中CD83、CD80的上调表现地尤为显著，因此EV71的感染对DC的成熟起到了明显的促进作用。3.Westernblot法检测DC中MAPK信号传导通路分子磷酸化水平结果为：p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2蛋白磷酸化水平均随着感染程度加深而增大（P＜0.05）。4.ELISA法检测患者血清中的细胞因子的水平显示：EV71感染后MAPK信号传导通路被激活，导致血清中IL-6、TNF-α水平随着感染程度的加重而上升显著（P＜0.05），IL-12/P70表达水平随着感染程度的加重而表现为上升趋势。5.2创新点：1.本研究采用检测EV71感染手足口病患者外周血中CD80、CD83及CD86在DC上表达的百分比，以观察和论证EV71感染对DC的成熟、凋亡起到的明41 安徽医科大学硕士学位论文显促进作用。目前有关EV71感染对树突细胞成熟的影响资料，均采用EV71体外感染DC的细胞模型以观察DC变化，这不能真实反映EV71感染手足口病患者外周血中DC表面标志CD80、CD83及CD86的表达百分比变化情况。2.直接检测EV71感染手足口病患者体内外周血DC中p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK1/2信号通路的蛋白磷酸化水平的表达量。3.检测EV71感染手足口病患者外周血细胞因子水平，以此佐证EV71感染导致DC中MAPK信号传导通路的激活，导致有利于正向调节DC释放细胞因子的增加，从而发挥机体抗EV71感染的系列免疫反应。参考文献[1].YanLongEdmundLui,TuanLinTan,PeterTimms,etal.Elucidatingthehost-pathogeninteractionbetweenhumancolorectalcellsandinvadingEnterovirus71usingtranscriptomicsprofiling[J].FEBSOpenBio,2014,4:426-31.[2].LuiYLE,TanTL,TimmsP,etal.Elucidatingthehost–pathogeninteractionbetweenhumancolorectalcellsandinvadingEnterovirus71usingtranscriptomicsprofiling[J].FEBSopenbio,2014,4(1):426-431.[3].KohWM,BogichT,SiegelK,etal.TheEpidemiologyofHand,FootandMouthDiseaseinAsia:ASystematicReviewandAnalysis[J].ThePediatricinfectiousdiseasejournal,2016.[4].KorolevaGA,LukashevAN,KhudiakovaLVetal.Encephalomyelitiscausedbyenterovirustype71inchildren[J].VoprVirusol,2010,55(6):4.[5].ZengM,RenPJ,TuSY,etal.SeroepidemiologyofEnterovirus71infectionpriortothe2011seasoninchildreninShanghai[J].JClinVirol,2012,53(4):285-9.[6].YapMS,TangYQ,YeoY,etal.PluripotentHumanembryonicstemcellderivedneurallineagesforinvitromodellingofenterovirus71infectionandtherapy[J].Virologyjournal,2016,13(1):1.[7].HuangHI,LinJY,ChenHH,etal.Enterovirus71infectsbrain-derivedneural42 安徽医科大学硕士学位论文progenitorcells[J].Virology,2014,468:592-600.[8].LuJ.Viralkineticsofenterovirus71inhumanabdomyosarcomacells[J].Worldjournalofgastroenterology,2011,17(36).[9].PengH,ShiM,ZhangL,etal.ActivationofJNK1/2andp38MAPKsignalingpathwayspromotesenterovirus71infectioninimmaturedendriticcells[J].BMCmicrobiology,2014,14(1):1.[10].谭斌，王建华，周明军，等．铜仁地区肠道病毒EV71基因分型与体液免疫水平关系的研究[J]．中国免疫学杂志，2015，31：1250-6．[11].YangT,XuG,DongH,etal.Acase-controlstudyofriskfactorsforseverehand–foot–mouthdiseaseamongchildreninNingbo,China,2010-2011[J].Europeanjournalofpediatrics,2012,171(9):1359-1364.[12].ChongCY,ChanKP,ShahVA,etal.Hand,footandmouthdiseaseinSingapore:acomparisonoffatalandnon-fatalcases[J].ActaPaediatrica,2003,92(10):1163-1169.[13].手足口病诊疗指南(2010年版)[J].柳州医学,2012,02:140-143.[14].高勇,韩明锋,李秀勇,等.阜阳市2011年手足口病实验室检测结果分析[J].检验医学,2013,28(9):796-800.[15].OoiMH,WongSC,MohanA,etal.Identificationandvalidationofclinicalpredictorsfortheriskofneurologicalinvolvementinchildrenwithhand,foot,andmouthdiseaseinSarawak[J].BMCinfectiousdiseases,2009,9(1):1.[16].李丽,庞保东,艾智慧,阚亚楠,王志峰.重症手足口病患儿心电图特征及实验室预警指标的研究[J].中国全科医学,2013,30:2839-2841.[17].陈迪,李卫华,姜朕.重症手足口病早期预警指标筛选及其预警价值[J].山东医药,2016,08:81-82.[18].何丽平,吴世群.危重症手足口病患儿早期预警指标临床观察[J].慢性病学杂志,2016,02:224-226.[19].王赛，周国华．树突状细胞发育及迁移机制的研究进展[J]．临床消化病杂43 安徽医科大学硕士学位论文志，2015，27（6）：389-91．[20].刘秀红，付萍．树突状细胞表面标志及功能研究进展[J]．皮肤病与性病，2009，03：22-4．[21].李维春,武荣,周艳,等.手足口病患儿外周血共刺激分子CD80,CD86的变化观察[J].中华全科医学ISTIC,2013,11(1).[22].ShiW,HouX,PengH,etal.MEK/ERKsignalingpathwayisrequiredforenterovirus71replicationinimmaturedendriticcells[J].Virologyjournal,2014,11(1):1.[23].MogensenTH.Pathogenrecognitionandinflammatorysignalingininnateimmunedefenses[J].Clinicalmicrobiologyreviews.2009,22(2):240-73.[24].李宏波,吴志刚,徐爱芳.重症手足口病患儿外周血炎性细胞因子表达与临床意义[J].中华医院感染学杂志,2015,25(19):4371-4.[25].彭宏君，侯雪玲，李祥，等．肠道病毒71型体外感染人树突状细胞后启动免疫应答反应的研究[J]．中华实验和临床病毒学杂志，2014，28（2）：114-6．[26].LinYW,WangSW,TungYY,etal.Enterovirus71infectionofhumandendriticcells[J].ExpBiolMed(Maywood),2009,234(10):1166-73.[27].SatoshiN,TomoyukiO,MasatoM,etal.P38mitogen-activatedproteinkinasemediatesdualroleofultravioletBradiationininductionofmaturationandapoptosisofmonocyte-deriveddendriticcells[J].JInvestDermatol,2004,123(3):361.[28].WeifengShi,XuelingHou,XiangLi,etal.DifferentialgeneexpressionsoftheMAPKsignalingpathwayproteinsinenterovirus71-infectedrhabdomyosarcomacells.BrazJInfectDis,2013,17(4):410-7.44 安徽医科大学硕士学位论文附录个人简历1.基本教育姓名：高勇性别：男出生年月：1973年12月24日政治面貌：中共党员籍贯：安徽省阜阳市阜南县2.学习及工作经历：1988年9月至1991年6月安徽省阜南县一中高中1991年9月至1996年6月蚌埠医学院医学检验专业本科1996年10月至2008年3月阜阳市第二人民医院检验科检验技师副主任技师2008年3月至2008年12月西藏错美县人民医院安徽省第六批援藏医疗队2009年9月至2016年12月安徽医科大学在职研究生班硕士3.学术技术地位：⑪安徽医科大学兼职副教授⑫安徽省医学会检验分会生化学组委员⑬阜阳市医学会医学检验副主任委员4.在职研究生期间发表文章及申报科研课题发表论文：⑪高勇，徐元宏，陈晓枫，等.EV71型手足口病患儿外周血树突状细胞及细胞因子产生的调节机制研究[J].安徽医科大学学报,2016,56(12):(待定).⑫高勇,唐振华,蒋影,张峰,徐丹丹,黄帅.不同时间点尿白蛋白/肌酐比值在诊断2型糖尿病早期肾损伤中的应用[J].实用医学杂志,2014,19:3172-3175.⑬高勇,韩明锋,李秀勇,陈晓枫,唐振华.阜阳市2011年手足口病实验室检测结果分析[J].检验医学,2013,09:796-800.⑭高勇,张峰,李团团,唐振华,谭林.血清CysC尿mAlb和尿β2-MG联合检测在肝45 安徽医科大学硕士学位论文硬化及原发性肝癌早期肾功能损伤中的应用价值[J].安徽医学,2013,04:484-487.⑮高勇,唐振华,蒋影,等.尿白蛋白/肌酐比值在2型糖尿病早期肾损伤中的应用[J].蚌埠医学院学报,2014,08:1110-1112.科研课题：1.2009年-2011年阜阳市手足口病患儿临床检验结果综合分析，阜阳市卫生局，2011年科研课题，负责人。2.血清胱抑素C和尿微量白蛋白、β2-微球蛋白联合检测在妊娠期高血压早期肾损伤中的应用，阜阳市卫生局2012科研课题，负责人。3.尿白蛋白不同评价指标在诊断糖尿病早期肾损伤中的临床应用研究，阜阳市卫生局2013年科研课题，负责人。4.手足口病患者外周血树突细胞和细胞因子研究，安徽省教育厅科研课题（KJ2011A181），参与。46 安徽医科大学硕士学位论文致谢我作为安徽医科大学在职研究生，自2009年入校学习研究生课程以来，英语和西医综合先后经过3次考试，最终有幸过关合格，接下来是能否找到一位导师的接纳。徐元宏教授是安徽省检验界的领头人，有机会拜在徐教授的门下得到他的收留，是每位检验专业人员梦寐以求的奢望，也是我今生的最大荣幸和福气。本课题是在我的导师徐元宏教授的精心选题、充分的实验准备及严格要求下进行的，其中饱含了徐老师的辛勤的汗水和无私的奉献。几年的研究生学习生活即将告一段落，首先诚挚的谢谢导师徐元宏，是您在学业上、工作上以及在生活上给与我的无微不至的关心及指导，同时您的严谨治学态度、精益求精的教学科研理念和全心力工作精神将对我的一生起到激励和鞭策作用。在您的悉心指导和关注下，我能在科研水平、实验技能、数据统计处理和论文撰写等方面均有明显提升，并且为我今后的专业发展方向、科研重点及人生轨迹指明了道路，对此我将永远铭记在心，并把您的谦和的待人态度、严谨的带教风格和无私的工作作风传承下去。借此机会，我谨向您致以崇高的敬意和真诚的感激。感谢您一路的栽培和指导，您永远是我学习、工作、生活中崇拜的偶像和榜样。今后我会时刻严格要求自己，不辜负您对我的期望。我真诚的感谢安徽医科大学第一附属医院检验科郑美娟老师在本课题中流式细胞仪检测树突细胞标志的实验中给予无私的的帮助以及数据资料的统计和分析给予高质量的教导。我真诚的感谢阜阳市第二人民医院感染科袁子清主任、应急科陈晓枫主任给予的临床病例资料诊断收集方面的指导，以及相关科室护理人员在帮助完成此课题所需的患者沟通指导、标本采集及临床病例资料完善给予的的重要支持！我由衷的感谢我的同事李团团、汪小五在课题免疫蛋白印迹技术、ELISA免疫学检测细胞因子技术中给予的指导和帮助，以及在论文撰写中给与的支持！我也非常感谢这几年在我背后一直默默支持和理解我的妻子和女儿；感谢给我鼓励、给我动力的父母，谢谢你们一直以来对我的养育之恩，你们一直是我奋发向47 安徽医科大学硕士学位论文上的的力量和源泉。再次诚挚谢谢所有在我成长、发展道路上给予我援手的每位，因为有了你们，我的生活才更加精彩！48 安徽医科大学硕士学位论文综述小儿手足口病的病原体EV71的研究进展摘要人肠道病毒71型（HumanEnterovirus71，EV17）是引起小龄儿童手足口病（Hand,Foot,andMouthDisease，HFMD）的主要流行病原体，主要通过粘液、唾液以及粪便密切接触和呼吸道感染儿童。笔者针对小儿手足口病的病原体EV17的研究进展写一篇综述。关键词小儿手足口病；病原体；EV71型HFMD是由微小核糖核酸病毒科人肠道病毒属病毒感染引起的常见及轻微、但其传染度颇高的一种传染病，引起HFMD的病毒类型很多，包括人EV17型、柯萨奇病毒（Coxsackievirus，Cox）A16/A5/A10/A19/B2/B5型以及埃可病毒，其[1-2]中以人EV17型和CoxA16型为主要传播。EV17是目前引起手足口病常见的[3]及重症病例的病原体，婴幼儿易感染，以5岁以下为主。在过去十年里，HFMD在世界各地大范围流行，主要是在亚洲地区和太平洋沿岸地区，已成为全球公共[4-9]健康的紧迫问题。1EV71病毒结构EV17型病毒颗粒为直径20~30nm而无包膜的20面体形状，其衣壳为长度+7.6kb的SSRNA，其基因组结构：5’端到3’端分别为为病毒非编码区、蛋白质编码区（编码蛋白VP1、VP2、VP3、VP4）、P1基因区（编码2A、2B、2C非结构蛋白）及P3基因区（编码3A、3B、3C、3D非结构蛋白）组成，其中VP1~VP3[7,10]蛋白分布有抗原决定簇。VP1蛋白中有4个氨基酸区域如27~97、99~144、146~210、258~288可能与该病毒的抗原性有着紧密的联系，而对于VP2蛋白可[11]能对病毒的毒力有着必不可少的作用。49 安徽医科大学硕士学位论文EV71基因组结构图（由中国疾病预防控制中心提供）2EV71感染儿童后的临床症状EV17病毒感染具有中枢神经系统感染、手足口病两个最常见的特征，易导致儿童发热、皮肤黏膜疱疹尤其是疱疹性咽炎，是不定时引起大爆发性的病原体[3]之一。EV17引起的手足口病是一种自限性疾病：大部分情况下主要以轻度发烧、丘疹性伴水泡性皮疹以及手掌心、脚掌心和口腔溃疡；在少数情况下，EV71会导致严重甚至威胁生命的疾病，如感染神经系统并发症无菌性脑膜炎、急性广义弛缓性麻痹、脑干脑炎（脑干脑炎可能会导致严重的神经源性肺水肿和严重心肺[12]衰竭）。在实验模型中，EV17感染沙鼠后，沙鼠肺部出现肺部病变特征间质性肺炎、[13]肺淤血、肺出血过多神经系统症状。恒河猴感染了EV17病毒同样可观察到肺部炎症，还有与肺泡损伤严重的间质性肺炎、肺淤血、过渡性肺出血和淋巴细胞[14]的增殖毛囊。虽然EV17感染诱导肺部并发症的具体机制尚未弄清楚,但是老鼠EV17感染后释放的促炎细胞因子IL-6、IL-13、IFN-γ已被证明是轻微肺水肿和[15]肺外症状重要的影响因子。3EV71感染致病机制目前对EV71的具体致病机制尚不清楚，现认为EV17感染引起的HFMD与该病毒的基因型和与体液免疫是无关的，而是由于EV17感染后细胞免疫引起机[16]体损伤。EV17病毒感染宿主细胞主要通过吸附、穿入、翻译、复制、释放五个过程：第一步是病毒吸附到宿主细胞：病毒一般吸附于宿主细胞主要分为非特异性可逆50 安徽医科大学硕士学位论文的静电结合和其衣壳表面的配体特异性不可逆的与宿主细胞表面的受体结合，而EV17主要是通过细胞膜上的三种受体包括清道夫受体B2（scavengerreceptorB2，SCARB2）、人类P-选择素糖蛋白配体-1（humanP-selectinglycoprotein[17]ligand-1，PSGL-1）和SA聚糖吸附感染宿主。2011年YangSL,ChouYT等研究者研究发现了一种可以增强该病毒吸附到宿主的能力的宿主蛋白annexinII[18](Anx2)，其蛋白可以与EV17的蛋白编码区VP1的第40至100位的氨基酸结合；第二步是EV17病毒穿入到宿主细胞内：病毒吸附宿主的细胞膜之后，无包膜的EV17病毒以吞饮的形式穿入细胞，故需要由受体和多种相关因子介导以吞饮的形式穿入宿主细胞，其宿主细胞表面的受体是能与细胞专一的信号分子也就是叫做配体的物质结合的引起细胞反应的一种蛋白质，当EV17病毒与受体蛋白结合后引起一系列的分子构象的变化，从而发生一系列的细胞反应：细胞介导的信号[19]传导和病毒感染吸附宿主后的感染过程吞饮等；第三步第四步分别为是病毒在宿主细胞内的翻译和复制：EV17病毒是以吞饮形式穿入到宿主细胞后，该病毒[20]翻译和复制的模板是mRNA；第五步是病毒进行装配后释放。病毒侵犯宿主后宿主细胞会发生引起细胞免疫反应，有研究者证明儿童表现出严重的神经系统性疾病症状有可能是由于感染EV17后引起细胞凋亡或者是产[21,22]生细胞因子所导致的。EV17感染机体后，由模式识别受体（patternrecognitionreceptors，PRRs）调控后机体才会以天然免疫反应以及调节反应抵抗EV71的侵犯。机体宿主细胞识别病原体是利用PRRs识别病原体相关模式分子（pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs）。PRRs能识别位于细胞表面、胞浆及核内体中PAMPs，包括细菌的脂多糖蛋白、鞭毛蛋白、核酸以及病毒和真[23]菌的核酸。PRRs种类主要包括Toll样受体(Toll-likereceptors，TLRs)、膜结合C型凝集素受体(membrane-boundC-typelectinreceptors，CLRs)、胞质蛋白质NOD样受体(cytosolicproteinssuchasNOD-likereceptors，NLRs）和RIG-I样受体（RIG-I-likereceptors，RLRs）等，TLRs是到目前为止研究最多的PRRs主要受[24]体。目前对于TLRs认知：TLRs（TLR3、TLR7、TLR8和TLR9）和细胞质内的RNA传感器RLRs（RIG-I和MDA5）能够识别病毒的核酸；TLR3,RIG-I51 安徽医科大学硕士学位论文和MDA5能识别双链RNA（dsRNA）以及刺激I型干扰素（IFN-I）的产生；TLR7/8[25]能识别单链RNA（ssRNA）以及诱导IFN-I和类浆细胞DCs的产生等。TLRs在EV71感染宿主细胞后，机体产生免疫防御中的作用目前国内外有很多研究者[26]都在探索：Gong等研究者采用灭活和未灭活的EV71病毒感染人类的巨噬细[27]胞，发现TLR2、TLR7和TLR8mRNA的表达都出现上调的情况；李斌等研究者采用免疫组化法定性分析TLR7/8在宿主感染了EV71病毒死亡病例脑组织和肺组织中的表达并应用了积分光密度值法对其组织里的TLR7/8进行了半定量，发现TLR7/8在感染EV71后死亡的患者的脑组织和肺组织中呈现出高表达的情况，故推测TLR7、8在EV71感染后的中枢神经系统及肺部病变中具有促进作用，[28]可能与EV71型病毒感染引起手足口病发病机制密切相关；栾明春等研究者应用了荧光定量RT-PCR法检测了EV71感染后的人结肠癌SW620细胞后TLR3、TLR7的表达情况，发现感染EV71后TLR3、TLR7在人结肠癌SW620细胞中的表达量有变化，故认为可以选择此细胞作为检测模型。从上面的叙述中可以看出Toll样受体的研究对于EV71感染的机制更进一步的研究有着非常重要的意义。EV71感染宿主后宿主出现严重的神经系统性疾病可能原因之一是感染细胞后诱导细胞出现凋亡，很多研究者在对此做了大量工作。研究最多的引起细胞凋亡的丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinases，MAPKs）信号传导通路，该系统广泛存在于真核生物细胞并参与了调节细胞增长，导致炎症反应，以及诱导细胞凋亡等细胞反应的过程。目前已经了解哺乳动物细胞的MAPKs信号通路主要包括如下：p38有丝分裂原激活蛋白激酶通路（p38，mitogen-activatedproteinkinase，p-p38MAPK）、细胞外信号调节激酶(extracellularreglulatedkinase，ERK)通路、c-Jun氨基端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）通路、ERK5/大丝[29-31][32]裂原活化蛋白激酶（bigMAPkinase，BMK）4条途径：PengHJ等研究肠道病毒71型（EV71）感染未成熟树突状细胞（DCs）中JNK1/2和p38MAPK细胞信号通路的相关分子基因差异表达，发现EV71感染可以激活DCs中JNK1/2和p38MAPK信号通路，JNK1/2和p38MAPK蛋白激酶磷酸化水平以及信号通路下游转录因子c-Fos和c-Jun的蛋白磷酸化水平均升高，促进DCs分泌IL-2、52 安徽医科大学硕士学位论文IL-6、IL-10、TNF-α生产，也增加IFN-β和IL-12/p40释放；应用JNK1/2和p38MAPK特异性抑制剂SP600125和SB203580阻断细胞信号通路，结果EV71感染后DCs分泌IL-6、IL-10、TNF-α受抑制。因此JNK1/2和p38MAPK信号通路在EV71感染DCs过程中起到促进细胞凋亡,有利于EV71感染和正向调节DCs炎性[33]细胞因子和干扰素的分泌。罗丹等就EV71感染对小鼠脑组织p38MAPK信号通路影响进行研究，结果显示Treg细胞的数目随着病毒感染滴度的增加而增加，同时IFN-γ的表达水平也呈现出增加趋势，高滴度组大约是对照组的30倍；TNF-α表达水平先随着病毒滴度增加而稍微有所下降，随后在高滴度组又明显上升。表明EV71感染影响p38MAPK信号通路的基因表达而间接调节TNF-α和IFN-γ体[34]内的大量表达，诱导宿主病理性免疫反应及功能的紊乱。侯学玲等用肠道病毒71型（EV71）病毒感染横纹肌肉瘤细胞（RD）后观察MAPK信号通路分子基因差异表达的变化，发现EV71感染RD细胞20h时MAPK信号通路相关基因中十几个相关基因和细胞因子都出现上调情况；而且感染组IL-4、IL-10和TNF-α表达浓度随着感染时间的延长，其浓度升高；EV71感染后RD细胞后能够引起MAPK信号通路相关基因激活，诱导炎症细胞因子的产生，并且通过一系列级联反应，引起细胞凋亡。[35]ShiWF等对肠道病毒71型（EV71）感染未成熟树突状细胞（DCs）中MEK/ERK细胞信号通路影响进行研究，结果显示EV71感染未成熟DCs细胞24h后CD80、CD83、CD86和HLA-DR表达的百分比明显增加。EV71感染未成熟DCs中的MEK/ERK信号通路的分子基因表达显著上调，EV71感染激活MEK1/2和ERK1/2通路，磷酸化其下游转录因子c-fos、c-jun、c-myc和ELK1；同时使用U0126抑制剂能明显抑制MEK/ERK信号通路的分子基因表达和严重消弱EV71病毒复制。此外，EV71感染增加IL-2、IL-6、IL-1α、IL-12、TNF-α、IFN-β和IFN-γ的分泌，而且使用U0126抑制剂有效抑制IL-1α、IL-2、IL-6和TNF-α[36]的释放，王波等也发现EV71的复制可引起细胞内ERK信号通路的活化，用MEK1/2特异抑制剂U0126可以抑制ERK信号通路的活化，有效地抑制EV71在宿主细胞内的复制。进一步阐明EV71在宿主细胞内的复制机制、寻找新型抗53 安徽医科大学硕士学位论文病毒靶标药物等研究奠定了良好的基础。4EV71的实验室检测EV71感染所致的手足口病（HFMD）临床症状较重，极易感染中枢神经系统出现脑炎、急性肺水肿等，重症患者的病死率较高。因此准确、快速的实验室相关检查对手足口病的诊断和治疗至关重要。目前关于EV71感染所致HFMD实验室检测包括病毒病原学检查、常规实验室检查和特殊实验室检查。4.1病毒病原学检查：是临床确诊HFMD的标准之一，实验室关于EV17病毒病原学检测方法主要包括病毒分离法、PCR技术检测法和血清学检测。4.1.1病毒分离培养法是检测EV71病毒的经典方法。该法最常用标本是病人粪便标本，其他如咽拭子、脑脊液、疱疹液等。优点是对流行病学分析具有重要意义，其次适合于含有PCR抑制因素的标本检测；缺点：首先分离培养时间长需要4到15天，易延误诊断治疗，其次病毒分离法易受病毒低度低或抗原飘移等影响，技术要求高，有些临床标本不适宜或无法进行分离培养。4.1.2PCR法对于检测EV71病毒特异性核酸具有较好的敏感性、特异性和较高[37]的阳性检出率，是肠道病毒病原学检测的―金标准‖，对于HFMD的早期诊断及治疗具有重要价值。其主要缺点是分泌物、大便或血液等含有大量的杂质或抑制PCR扩增的物质，导致结果假阴性或定量值偏低现象。目前检测EV71的PCR法主要有RT-PCR（逆转录聚合酶链反应）及FQ-PCR（荧光定量聚合酶链反应）。[38,39]有文献使用RT-PCR及FQ-PCR法分别对疑似手足口病患者的咽拭子标本检测进行比较，结果显示FQ-PCR检测EV71病毒的阳性率明显高于RT-PCR（p＜0.05），FQ-PCR比RT-PCR法适用于HFMD病原学检测及RT-PCR初筛为阴性的疑似HFMD样本的复查，且不受标本种类的限制，具有较高的灵敏度和特异性；而RT-PCR法适合于HFMD流行期间大规模的标本筛查。4.1.3血清学检测方法：目前主要有酶联免疫吸附试验（ELISA法）、免疫层析法（ICA）和中和抗体检测等方法，其中ELISA法最常用，主要检测机体感染EV71病毒针对其VP1基因产生的血清IgM抗体。ELISA法优点为方便、快速，且对54 安徽医科大学硕士学位论文实验室技术要求不高，基层医院普ELISA通实验室均可开展；缺点是对EV71感[40]染的早期诊断灵敏度不高。杜昆等对ELISA和ICA两种方法检测血清EV71-IgM进行比较，结果两种方法检测EV71-IgM抗体阳性率相近分别为21.48％和20.74％，因此ICA法或ELISA法检测EV71-IgM抗体阳性者均可用于[41]确诊手足口病。同时梁剑琦也对ELISA法和荧光RT-PCR检测手足口病EV71进行比较，发现荧光RT-PCR法灵敏度（sensitivity，SEN）为30.4％略高于ELISA法28.2％，特异性（Specificity，SPE）均为100%，两种检测方法SPE和SEN差[42]异不显著，同时两种检测方法总体符合率高达96.4％。谢靖婧等也应用ELISA、RT-PCR两方法EV71型手足口病得出了一致的结果，即用ELISA法检测EV71-IgM与RT-PCR法检测核酸的检出率没有差异。综上所述，EV71感染后患者的病情确诊需要从临床症状，以及EV71感染后机体细胞因子和检测其病原体几个方面综合考虑。4.2特殊实验室检查4.2.1细胞因子和趋化因子检测EV71感染所致HFMD合并脑炎及肺水肿重症患者外周血中细胞因子和趋化[43]因子水平均有明显改善。YeN等研究发现重症危重症HFMD患者血浆中促炎细胞因子IL-1β、IL-6水平显著高于轻症和正常对照组，且危重症患者血浆中IL-6、IL-10、IL-8水平明显高于重症组；同时重症及危重症患者脑脊液中IL-6、IL-10、IL-8水平明显高于血浆，而RANTES水平低于血浆中。这说明EV71感染所致HFMD特点是血浆和脑脊液中存在重要的细胞因子反应和炎症，炎症加剧疾病重[44]症化。李宏波研究EV71感染HFMD患者外周血中炎性细胞因子和趋化因子的表达与临床病理关系分析。结果重症组HFMD患儿中所有检测的细胞因子（IL-4、IL-12、IL-18、TNF-α、IFN-γ）和趋化因子（IL-8、IL-12、RANTES、MCP-1、IP-10）水平均明显高于轻症组与正常对照组（p＜0.01）；且伴有脑炎和肺水肿患儿外周血中除IL-8和IL-14外所有细胞因子和趋化因子的水平均显著高于单纯伴有脑炎的患儿（p＜0.05）。因此检测EV71感染HFMD患者外周血中细胞因子及趋化因[45]子水平对疾病进展和预后有着重要价值。HanJ等进一步对EV71感染HFMD55 安徽医科大学硕士学位论文患者早期至恢复期病程不同阶段（第2天-10天）血清细胞因子谱进行分析，细胞因子谱包括Th1细胞因子（IL-2、IL-12、IL-18、IFN-γ）、Th2细胞因子（IL-4、IL-10、IL-13）、炎性细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α）。结果显示在重症HFMD急性期和轻症HFMD患者外周血中均观察到―细胞因子风暴‖，即细胞因子快速、显著升高。轻症患者血清IL-8、IL-10在病程第6天达峰值，而IL-18则在第4天；而重症患者所有细胞因子均在第3天显著升高，第14天达峰值。且病程后期除IL-6、IL-8、IL-18、TNF-α外所有细胞因子均与EV71-VP1-IgM水平呈明显正相关。上述细胞因子谱变化可有效评估HFMD严重程度，并指导临床治疗。4.2.2细胞免疫和体液免疫功能检测HFMD患儿因EV71感染导致机体免疫功能紊乱，可通过外周血中T淋巴细胞亚群、NK细胞和B淋巴细胞百分比以及它们分泌的相应细胞因子和免疫球蛋白的检测来了解其免疫功能状态，防止疾病向重症化发展，为临床掌握病情进展[46,47,48,49]和早期兔疫功能治疗提供依据。目前很多文献报道EV71病毒感染手足口病患儿外周血中T细胞亚群、B细胞、NK细胞百分比和免疫球蛋白(IgG、IgA+和IgM)水平的检测。发现EV71病毒感染手足口病患儿外周血中CD3（成熟T++++淋巴细胞）、CD3CD4（T辅助细胞，Th）、CD3CD8（细胞毒性T细胞）、-++-+CD3CD16CD56（NK细胞）的含量都显著降低，而CD3CD19（B淋巴细胞）+++显著增高(P均＜0.05)；且在HFMD患儿随着病情的加重，CD3、CD3CD4、++-++-+CD3CD8、CD3CD16CD56含量的不断降低，而CD3CD19不断增高(P＜0.05)。EV71病毒感染手足口病患儿外周血中IgG、IgA显著低于正常对照组，而IgM变化不显著。因此EV71感染所致HFMD患儿出现细胞和体液免疫功能紊乱，并与患者手足口病的严重程度有关。［50］刘晶晶等还探讨了EV71感染手足口病患儿外周血中辅助性T细胞17++（Th17）、CD4CD25调节性T淋巴细胞（regulatoryTcells，Tregcells）以及其分泌的细胞因子IL-17、转化生长因子-β（TGF-β）变化，以了解其在发病机制中所发挥的作用。发现重症型和普通型HFMD患儿的Th17、IL-17水平均明显升高；56 安徽医科大学硕士学位论文而Treg细胞、TGF-β水平则显著下降，且HFMD患儿外周血Th17、IL-17水平随病情加重而增高，而Treg细胞、TGF-β水平随病情严重而降低。Treg细胞是一类具有免疫抑制调节功能的T淋巴细胞亚群，可通过细胞接触或细胞因子抑制两种机制抑制抗原提呈细胞（APC）或T淋巴细胞活化，抑制过度免疫反应来起到维持免疫系统稳态的作用。Th17细胞一种新发现的CD4+效应细胞，生物学功能不同于Th1、Th2细胞，能够分泌IL-17可诱导单核巨噬细胞、内皮细胞产生多种前炎性细胞因子及趋化因子参与机体炎性反应或自身免疫反应。因此EV71阳性HFMD患儿体内存在Th17与Treg细胞比例失衡，可能在HFMD发病机制中起重要作用。综上所述，EV71病毒感染所致HFMD多以3岁以内儿童为主，同时易出现重症病例。因此了解充分EV71病毒结构、致病机制、临床症状及实验室相关检测，有助于临床对HFMD疾病的诊断和及时治疗，防止HFMD重症化病例的出现，对减少该病死亡病例的发生有着重要意义。参考文献：[1]LiuJ.ThresholddynamicsforaHFMDepidemicmodelwithperiodictransmissionrate[J].NonlinearDynamics,2011,64(1-2):89-95.[2]FujimotoT,IizukaS,EnomotoM,etal.Hand,foot,andmouthdiseasecausedbycoxsackievirusA6,Japan,2011[J].Hand,2012.[3]OoiMH,WongSC,LewthwaiteP,etal.Clinicalfeatures,diagnosis,andmanagementofenterovirus71[J].TheLancetNeurology,2010,9(11):1097-1105.[4]NgQ,HeF,KwangJ.RecentprogresstowardsnovelEV71anti-therapeuticsandvaccines[J].Viruses,2015,7(12):6441-6457.[5]ZhuangZC,KouZQ,BaiYJ,etal.Epidemiologicalresearchonhand,foot,andmouthdiseaseinmainlandChina[J].Viruses,2015,7(12):6400-6411.[6]MaE,ChanKC,ChengP,etal.Theenterovirus71epidemicin2008—publichealthimplicationsforHongKong[J].InternationalJournalofInfectiousDiseases,57 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