IGFBP-1和IGFBP-3基因多态性与原发性高血压遗传易感性的分子流行病学研究

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分类号：Ｒ１８１．３＋３密级：公开单位代码：１０３６８学号：２０１５０６２虼皖南医学院ＷａｎＮａｎＭｅｄｉｃａｌＣｏｌｌｅｇｅ硕士学位论文ＴＨＥＳＩＳＯＦＭＡＳＴＥＲＤＥＧＲＥＥ学术学位（学历教育）ＩＧＦＢＰ－１和ＩＧＦＢＰ－３基因多态性与原发性高血压遗传易感性的分子流行病学研究研究生方正美指导教师姚应水教授学科专业名称流行病与医学统计学研究方向慢性病流行病学研究研究起止时间２０１６年６月－２０１７年１２月所在单位公共卫生学院２０１８年３月 IGFBP-1和IGFBP-3基因多态性与原发性高血压遗传易感性的分子流行病学研究研究生方正美指导教师姚应水教授学科专业名称流行病与医学统计学研究方向慢性病流行病学研究2018年3月 Insulin-LikeGrowthFactorbindingprotein-1and-3ContributeGeneticSusceptibilitytoEssentialHypertensionADissertationSubmittedtoWanNanMedicalCollegeByZhengmeiFangEpidemiologyandMedicalStatisticsDissertationSupervisor:Prof.Ying-shuiYaoMarch,2018 学位论文独创性声明本人所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果＝＞也不包括为获得皖南医学院或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料一同工作的同志对本研究所做的任。与我何贡献均已在论文令作了明确说明并表示谢意。学位论文作者签名：＾日期：汾戍年（月ｙ日学位论文使用授权声明本人完全了解皖南医学院有关保留、使用学位论文的规定：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，有杈将学位论文的标题和摘要汇编出版。本人愿意将本人的学位论文提交《中国优秀硕士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》中全文发表，并可以以电子、网络及其他数字媒体形式公开出版，并同意编入ＣＮＫＩ《中国知识资源总库》。保密的学位论文在解密后适用本规定。学位论文作者签名：：导师签名£Ｉ签字曰期：年月日签字日期 中英文缩略词表英文缩写英文全名中文名BMIBodyMassIndex体重指数CHBChinaBeijingHan中国北京汉族人群DBPDiastolicBloodPressure舒张压EHEssentialHypertension原发性高血压eNOSendothelialnitricoxidesynthase内皮型一氧化氮合酶GLMGeneralLinearModel一般线性模型GLUGlucose葡萄糖HDL-CHighDensityLipoproteinCholesterol高密度脂蛋白胆固醇HRHazardratio风险比HWEHardy-WeinbergEquilibrium哈迪-温伯格平衡定律IGF-1Insulin-LikeGrowthFactor-1胰岛素样生长因子-1胰岛素样生长因子-1IGF-1RInsulin-LikeGrowthFactor-1receptor受体胰岛素样生长因子结IGFBPInsulin-likegrowthfactor-bindingprotein合蛋白IQRInterquartilerange四分位数间距LDLinkagedisequilibrium连锁不平衡LDL-CLowDensityLipoproteinCholesterol低密度脂蛋白胆固醇 MAFMinorAlleleFrequency最小等位基因频率NationalCenterforBiotechnology美国国立生物技术信NCBIInformation息中心OROddsRatio比值比PProbability概率PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应PI3Kphosphatidylinositol3-kinase磷脂酰肌醇－3激酶Real-timeQuantitativePolymeraseChain实时荧光定量多聚核qPCRReaction苷酸链式反应SBPSystolicBloodPressure收缩压SNPSingleNucleotidePolymorphism单核苷酸多态性TCTotalCholesterol总胆固醇TGTriglyceride甘油三酯VSMCVascularSmoothMuscleCell血管平滑肌细胞χ2Chi-square卡方95%CI95%ConfidentialIntervals95%可信区间 目录摘要................................................................................................................................1ABSTRACT..................................................................................................................4前言................................................................................................................................7研究内容与方法..........................................................................................................111研究对象的选择...............................................................................................112基线调查...........................................................................................................113高血压随访.......................................................................................................124实验方法..........................................................................................................134.1DNA工作液的制作................................................................................134.2SNP位点的选择....................................................................................144.3基因分型.................................................................................................144.4IGFBP-1和IGFBP-3蛋白水平的测定..............................................164.5主要试剂.................................................................................................164.6主要仪器.................................................................................................175质量控制...........................................................................................................176统计分析...........................................................................................................18结果..............................................................................................................................191研究对象的人口学资料...................................................................................192关联分析...........................................................................................................203血清IGFBP1与IGFBP-3蛋白水平分析......................................................40讨论..............................................................................................................................43结论..............................................................................................................................47参考文献......................................................................................................................48综述..............................................................................................................................56作者简介及读研期间主要科研成果..........................................................................72致谢..............................................................................................................................74 皖南医学院硕士学位论文IGFBP-1和IGFBP-3基因多态性与原发性高血压遗传易感性的分子流行病学研究研究生：方正美导师：姚应水教授摘要目的：原发性高血压是由多基因和环境相互作用的复杂性疾病。动物及人群研究均提示，胰岛素样生长因子-1（Insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）信号通路参与了高血压的发生发展。本研究拟从群体遗传学角度分析IGF结合蛋白（bindingprotein，IGFBP）-1和IGFBP-3的遗传变异与高血压的关系，为探讨高血压发病的分子机制及疾病诊治和预后评价提供指标。方法：采用以社区为基础的流行病学调查方法，于2009年对江苏南部两个社区人群进行抽样调查，纳入高血压病例2012例和健康对照2210例，并对研究对象进行了平均5.16年的随访，收集对照人群在随访期间的新发高血压事件。采用TaqMan技术对IGFBP-1基因的3个位点（rs1065780、rs2453853、rs1874479）和IGFBP-3基因的4个位点（rs3110697、rs13223993、rs2132572、rs2453839）进行基因分型。Logistic回归分析和Cox回归模型分析分别用于病例对照研究和随访研究中IGFBP-1和IGFBP-3基因多态性与高血压的关联，并进一步以年龄、性别、是否吸烟和饮酒因素分层进行关联分析。多位点单体型与高血压关联的分析采用HAPSTATA3.0软件。采用一般线性模型分析血压数量性状与基因型之间的关系。IGFBP-1和IGFBP-3蛋白水平经过对数及平方根等多次转换后仍不满足正态分布，因此高血压组与对照组以及基因型之间的IGFBP-1和IGFBP-3蛋白水平比较采用非参数检验。结果：病例对照研究结果显示，IGFBP-3基因的rs3110697和rs2132572位点与高血压存在关联，显性模型的OR值（95%CI）分别为1.153（1.021-1.303）和1.218（1.072-1.384），P值分别为0.022和0.002。进一步校正年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、血糖、BMI、吸烟和饮酒混杂因素后，关联仍有统1 皖南医学院硕士学位论文计学意义。分层分析结果显示，病例对照研究的吸烟人群中，携带IGFBP-1rs1874479位点G等位基因个体的高血压患病风险是携带A等位基因的1.278倍（1.023-1.597），P=0.031。随访研究发现，IGFBP-3基因rs2132572位点的TT基因型携带者高血压发病风险是CT+CC基因型携带者的1.57倍（1.034-2.383），P=0.034。在进一步调整协变量年龄、性别、TC、TG、LDL-C、HDL-C、糖尿病、BMI、吸烟和饮酒后，其关联仍有统计学意义，HR（95%CI）为1.694（1.113-2.579），P=0.014。随访研究中，携带IGFBP-1rs1065780位点G等位基因的男性高血压发病风险是携带A等位基因的1.204倍（1.015-1.428），P=0.033。携带IGFBP-3rs3110697位点G等位基因的女性发病风险是携带A等位基因的1.234倍（1.037-1.468），P=0.018；在不吸烟人中携带G等位基因的个体发病风险是携带A等位基因的1.189倍（1.019-1.386），P=0.028。携带IGFBP-3rs2132572位点T等位基因的女性发病风险是携带C等位基因的1.281倍（1.058-1.551），P=0.011；在不吸烟人群中，携带T等位基因的个体发病风险是携带C等位基因的1.227倍（1.035-1.454），P=0.018。在服用降压药的患者中，rs3110697的AA携带者收缩压水平（148.82±20.35）mmHg明显高于GG（142.03±16.27）mmHg和GA（142.89±16.18）mmHg，P值为0.021；rs2453839CC携带者收缩压水平为（147.24±18.7）mmHg高于TT（141.94±15.87）mmHg和TC（143.39±17.21）mmHg，P值为0.042。在137例高血压病例和159例健康对照中，血清IGFBP-1水平的中位数（P25，P75）在高血压病例中为16.77（6.97，50.35）ng/ml显著低于对照组32.37（10.12，73.72）ng/ml，P=0.011。IGFBP-1基因rs1065780位点突变型携带者的血清IGFBP-1水平比野生型和纯合型携带者的IGFBP-1水平高（P＜0.001），而IGFBP-1基因位点rs2854843和IGFBP-3基因位点rs13223993突变型携带者的IGFBP-1水平比野生型和纯合型携带者IGFBP-1水平低（P＜0.05）。2 皖南医学院硕士学位论文结论：IGFBP-3基因rs2132572位点TT基因型和rs3110697位点AA基因型可能与中国汉族人群高血压患病风险增加相关。携带IGFBP-1基因rs1874479位点G等位基因会增加高血压的患病风险。携带IGFBP-1基因rs1065780位点G等位基因是男性高血压风险增加的危险因素。IGFBP-3基因rs3110697G等位基因是女性和不吸烟人群高血压风险增加的危险因素，rs2132572位点T等位基因是女性和不吸烟人群高血压风险增加的危险因素。高血压患者服用降压药物的疗效有可能受到rs3110697和rs2453839位点变异的影响。血清IGFBP-1降低与高血压密切相关，提示IGFBP-1可作为临床间接反映其进展的血清学指标之一。关键词：关联研究；高血压；基因多态性；IGFBP-1基因；IGFBP-3基因3 皖南医学院硕士学位论文IGFBP-1andIGFBP-3ContributeGeneticSusceptibilitytoEssentialHypertensionPostgraduate:ZhengmeiFangSupervisor:Prof.YingshuiYaoABSTRACTObjective:Essentialhypertensionisacomplextrait,andbothgeneticandenvironmentaldeterminantscontributetoitspathogenesis..PreviousstudieshaveshowedthattheInsulin-likegrowthfactor-1(IGF-1)axisisinvolvedinthedevelopmentofhypertension..TheaimofthisstudyistoanalyzetherelationshipbetweenIGFbindingprotein-1(IGFBP-1)andIGFBP-3geneticvariantsandhypertension,andtoexplorethemolecularmechanismofhypertensionpathogenesis.Methods:Thestudywasdesignedasacommunity-basedepidemiologicalsurveymethod.In2009,twocommunityresidentswereexaminedinsouthernofJiangsu.Weselected2012hypertensivecasesand2210healthycontrolsfromthispopulation.Thesubjectswerefollowedupforanaverageof5.16yearsandnewincidencesofhypertensionwerecollectedfromthehealthycontrolsduringtheperiod.Threesingle-nucleotidepolymorphisms(SNPs)inIGFBP-1(rs1065780,rs2453853,rs1874479)andfourSNPsinIGFBP-3(rs3110697,rs13223993,rs2132572,rs2453839)wereselectedforTaqMangenotypingin4222subjects.MultiplelogisticregressionandCoxregressionwereperformedtoevaluatetheassociationofthesesevenSNPswithhypertensionincasecontrolstudyandfollow-upstudy.Thefurtherstratificationassociationwasanalyzedbyage,gender,smokinganddrinkingfactors.AssociationbetweenhaplotypeandhypertensionwasperformedusingHAPSTATA3.0software.Agenerallinearmodelwasusedtoanalyzetherelationshipbetweenbloodpressurequantitativetraitsandgenotypes.TheIGFBP-1andIGFBP-34 皖南医学院硕士学位论文proteinlevelsdidnotfollowGaussiandistributionsafterlogarithmandsquareroottransition,soIGFBP-1andIGFBP-3proteinlevelsbetweenhypertensiongroupandcontrolgroupandgenotypeswerecomparedbynonparametrictest.Agenerallinearmodelwasusedtoanalyzetherelationshipbetweenbloodpressurequantitativetraitsandgenotypes.Results:Inthecase-controlstudy,rs2132572andrs3110697atIGFBP-3weresignificantlyassociatedwithincreasedhypertension,andtheORs(95%CIs)ofthedominantmodelwere1.153(1.021-1.303)and1.218(1.072-1.384),andthePvalueswere0.022and0.002,respectively.Afteradjustmentforage,gender,TC,TG,LDL-C,HDL-C,GLU,BMI,smokingstatus,anddrinkingstatus,theassociationremainedstatisticallysignificant.Insmokers,comparingwiththosewithIGFBP-1rs1874479Gallele,thehypertensionriskofAallelewas1.278fold.Inthefollow-upstudy,Coxregressionanalysisshowedthatrs2132572wassignificantlyassociatedwithhypertension.TheincidenceriskofhypertensionintheTTgenotypewas1.57timesashighasthatoftheCTandCCgenotypes(P=0.034).Theassociationwasstillstatisticallysignificantafteradjustmentforage,gender,TC,TG,HDL-C,LDL-C,T2DM,BMI,smokinganddrinking.Stratifiedanalysisshowedthatinmales,thehypertensionincidenceriskintheIGFBP-1rs1065780Gallelewas1.204timesashighasthatoftheAallele,P=0.033.Infemalesandnon-smokers,thehypertensionincidenceriskintheIGFBP-3rs3110697Gallelewas1.234and1.189timesashighasthatoftheAallele,respectively.Infemalesandnon-smokers,thehypertensionincidenceriskintheIGFBP-3rs2132572Tallelewas1.281and1.227timesashighasthatoftheAallele,respectively(allP<0.05).Intheuseofantihypertensivedrugspatients,thers3110697AAgenotypecarriers’systolicbloodpressure(SBP)was(148.82±20.35)mmHgwassignificantlyhigherthanthatofGG(142.03±16.27)mmHgandGA(142.89±16.18)mmHg,P=0.021;rs2453839CCgenotypecarriers’ofSBP(147.24±18.7)mmHghigherthanthatofTT(141.94±15.87)mmHgandTC(143.39±17.21)mmHg,P=0.042.5 皖南医学院硕士学位论文Inthe137hypertensivepatientsand159healthycontrols,themedian(P25,P75)ofserumIGFBP1levelsinhypertensivepatients16.77(6.97,50.35)ng/mlwassignificantlylowerthanthatinthecontrolgroup32.37(10.12,73.72)ng/ml,P=0.011.Bothinthecontrolandhypertensiongroup,carriersoftheminoralleleofbothrs1065780hadhigherserumIGFBP-1levelscomparedtowildtypeandhomozygouscarriers(P<0.001).Whilethers2854843andrs13223993minorallelecarriershadlowerlevelsofIGFBP-1comparedwiththewildtypeandhomozygouscarriers(allP<0.05).Conclusion:ThesefindingssuggestthatIGFBP-3rs2132572TTgenotypeandrs3110697AAgenotypemaybeassociatedwithhypertensioninChineseHanpopulation.TheriskofsmokersindividualhypertensionisincreasedbycarryingtheIGFBP-1rs1874479Gallele.CarryingtheIGFBP-1rs1065780Galleleisariskfactorforhypertensioninmales.CarryingtheIGFBP-3rs3110697Galleleandrs2132572Talleleareriskfactorsforhypertensioninfemalesandnon-smokers.Thevariationofrs3110697andrs2453839mightaffecttheantihypertensivedrugseffect.ThedecreaseofserumIGFBP-1iscloselyrelatedtohypertension.SerumIGFBP-1isconfirmedtobeaninformativeriskmarkerforhypertension.Keywords:associationstudy;hypertension;genepolymorphism;IGFBP-1;IGFBP-36 皖南医学院硕士学位论文前言高血压是当今世界重要的公共卫生挑战之一，是全球疾病负担和死亡率最高的疾病，每年约有940万人死于高血压[1]。高血压影响了全球16-37%的人口[2]。2004-2009年期间，中国慢性病前瞻性研究数据指出，大约三分之一的中国成年人患有高血压[3]。中国2015年居民营养与慢性病报告显示，2012年中国成人高血压的知晓率、治疗率和控制率分别是46.5%、41.1%和13.8%，控制率仍处于较低水平[4]。在2017年的美国高血压指南中，取消了高血压前期的概念，当血压≥130/80mmHg即可诊断为高血压[5]。这一指南体现了高血压早期干预的重要性。开展高血压的病因机制研究，做到早期干预，对人群防控有十分重要的意义。高血压是可同时累及血管壁和心室壁增厚和硬化的疾病[6]，其病理改变可导致一系列的心血管疾病，包括冠心病、脑卒中、心律失常、心衰和血管性痴呆等[7]。高血压是环境因素和遗传因素共同作用的复杂性疾病，其中约30%的血压变化可归因于遗传因素[8]。而随着高血压相关遗传因素研究的不断深入，对血管收缩和舒张起重要调控作用的胰岛素样生长因子-1（Insulin-likegrowthfactor-1，IGF-1）信号通路进入广大研究者的视野。IGF-1信号通路由IGF-1、IGF-1受体（IGF-1receptor，IGF-1R）、IGF结合蛋白1~6（IGFbindingprotein，IGFBP1~6）及IGFBP水解酶组成。IGF-1通过与其受体结合来发挥广泛的生物学作用，包括促细胞增殖和分化、增强新陈代谢活动，通过抗凋亡通路来维持细胞生存等[9]。流行病学研究证据提示，IGF-1与高血压的发生发展密切相关[10,11]。IGFBPs在循环中通过绑定IGF-1抑制与受体结合，调节其生物活性，并参与IGF-1的转运，延长生物半衰期[12]。其中，IGFBP-3，绑定了循环中80%以上的IGF-1，是调节IGF-1生物活性最主要的结合蛋白，主要在肝脏生成[13]。研究指出，IGFBP-1和IGFBP-3可分别对IGF-1进行急性和长期调节[14]。除了IGF依赖性活动方式外，IGFBP-1和7 皖南医学院硕士学位论文IGFBP-3还可以通过与细胞表面特异性受体结合发挥IGF非依赖方式的功能[15-18]。动物实验发现，在胸腔内注射葡萄糖引起血压增高的小鼠模型中，与野生型小鼠相比，过表达人类IGFBP-1的转基因小鼠收缩压显著下降，出现低收缩压反应；并且，转基因小鼠的胸主动脉血管中一氧化氮合酶（endothelialnitricoxidesynthase，eNOS）mRNA的表达和一氧化氮（nitricoxide，NO）的产生明显增加[19]。最近的小鼠实验发现，通过向小鼠体内增加人IGFBP-1的浓度可增加血管内NO的产生，使小鼠血管舒张，从而降低小鼠血压，其机制是通过激活磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol3-kinase，PI3K）/丝氨酸激酶（serine-threoninekinase，Akt）信号通路来刺激eNOS的磷酸化，同时发现IGFBP-1的过表达可减少动脉粥样硬化的作用[20]。体外实验表明，IGFBP-1可通过激活细胞外信号调节激酶来刺激血管平滑肌细胞（vascularsmoothmusclecells，VSMC）增殖[21]。这些研究提示，IGFBP-1在高血压病理过程的形成和发展中发挥了重要的作用。据报道，IGF-1可增加主动脉eNOS的表达和刺激NO的产生[22]，并且IGF-1可以通过对NO的调节来控制血压和部分血液流动[23]。动物实验发现IGF-1缺失和功能受损均可引起血压的升高，并参与高血压的发生发展[24,25]。IGFBP-3作为循环中IGF-1主要的结合蛋白，通过绑定IGF-1，影响其血管活性可起到间接调控血压的作用。在缺氧所致的血管退化小鼠模型中，IGFBP-3可趋化CD34+内皮祖细胞，增强其分化成熟为血管细胞，参与更有效促血管再生活动[26]，并在血管功能丧失时对血管重塑发挥重要作用[27]。体外实验证明，缺氧状态下的肺动脉血管平滑肌细胞（pulmonaryarterysmoothmusclecells，PASMC）可刺激转化生长因子-β1（transforminggrowthfactor-β1,TGF-β1）产生，通过PI3K/Akt的方式诱导IGFBP-3自分泌，IGFBP-3进一步增加NADPH氧化酶4基因表达，导致PASMC增殖，提示IGFBP-3在循环和组织中可能是一个内源性血管保护性蛋白，在血管损伤后，IGFBP-3水平增加能适当地促进血管再生[28]。大血管和微血管的内皮细胞均可分泌IGFBP-3[29]，其蛋白水平可受到TGF-β1的影响[30]；人类的VSMC可表达IGFBP-3的mRNA，其在8 皖南医学院硕士学位论文VSMCs的表达受多个因素的影响，肿瘤坏死因子可显著增加IGFBP-3的mRNA表达量和蛋白水平[31]，提示炎性因子对IGFBP-3表达的调节作用。上述研究阐明了IGFBP-3对血压调节可能机制。大量研究表明IGFBP-1和IGFBP-3蛋白水平与多种心血管疾病（Cardiovasculardiseases，CVD）密切相关。报道指出高水平的IGFBP-3与高血压[32,33]、冠心病（coronaryheartdisease，CHD）[34]、缺血性心脏病（ischemicheartdisease，IHD）[35]以及动脉粥样硬化发展[36]有关。同时也有研究发现，低水平的IGFBP-3参与了脑卒中[37]和冠状动脉事件的发生[38]。Prentice等发现与健康对照相比，CHD患者中的IGFBP-1水平升高[39]，但Heald等指出降低的IGFBP-1水平与CVD患病增加[40]之间存在关联，与高血压发病也有相关报道[41]。而Nolte等在女性随访人群中发现，＜30%和＞70%IGFBP-1水平均与CVD死亡率风险上升有关[42,43]。尽管流行病学研究结果存在不一致性，但提示IGFBP-1和IGFBP-3可能涉及了CVD的病理过程。IGFBP-3是由IGFBP-3基因编码的一类蛋白。双胞胎研究表明，血循环中IGFBP-3浓度60%的差异是由于基因造成的[44]。全基因组关联研究（GenomeWideAssociationStudy，GWAS）指出，IGFBP-3基因多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）与IGFBP-3水平有关，并影响了IGF-1的表达水平[45]。IGFBP-3基因多态性影响IGFBP-3的蛋白水平[46-49]。rs2854744，位于IGFBP-3的启动子区，其位点变异与基因启动子区的活性及表达有关[50]。对GWAS荟萃分析发现，欧洲人群中，位于IGFBP-3附近的rs2949837位点的变异与平均脉搏血压长期的增加显著相关[51]。基于非洲人群的GWAS发现，IGFBP-3附近位点rs11977526变异与收缩压的降低、舒张压的增加和高血压显著相关[52]，并且在东非人群中rs11977526与舒张压升高和高血压的关联得到了验证[53]。Kato等[54]对东亚、欧洲和南亚的32万多种族人群的GWAS研究发现，位点rs10260816与脉搏压显著相关，并且认为DNA甲基化参与了位点变异对高血压作用的调控途径。此外，在中国汉族的冠状动脉疾病患者中，rs2854744的位点变异与降低患者脑卒中发病风险密切相关[55]。研究表明IGFBP-1水平的变化有9 皖南医学院硕士学位论文37%归因于遗传因素的影响[56]，也有部分文献报道IGFBP-1的基因多态性与慢性疾病相关，例如Ⅱ型糖尿病[57]和心血管疾病[52]。本课题组前期已发现在中国汉族成人中，IGF-1基因位点rs6219与高血压发病风险降低相关，IGF-1R基因位点rs13379905与成人和儿童青少年高血压相关[58]。基于以往的文献报道和我们课题组前期的研究发现，本课题组进一步在大样本中国汉族人群中探讨IGFBP-1和IGFBP-3基因多态性与高血压之间的关联，将有助于进一步了解高血压遗传机制中的“黑箱子”。10 皖南医学院硕士学位论文研究内容与方法1研究对象的选择本研究全部对象来自江苏省南部两个社区2009年的流行病学调查，通过整群抽样的方式纳入了2012例原发性高血压患者，根据病例-对照研究的设计方法，同时匹配2210例性别和年龄匹配的健康对照。高血压对象的纳入标准：根据2005年修订的《中国高血压防治指南》诊断高血压的标准确定高血压患者：均在未服用治疗高血压药物的情况下，收缩压（Systolicbloodpressure，SBP）≥140mmHg和/或舒张压（diastolicbloodpressure，DBP）≥90mmHg（经临床医生确诊患有高血压史，或正在服用治疗高血压药物，血压＜140/90mmHg者）。本研究中新发高血压为非同日三次测量均符合高血压诊断标准。排除标准：血压测量＜140/90mmHg，既往未患高血压且未服用抗高血压药，或者由其它疾病所引起的继发性高血压。对照的纳入和排除标准：选择与病例同一居住地的血压正常的成年人群，并且按照病例的同性别、年龄（≤5岁）进行匹配。按病史排除有严重心、脑、肾疾病及肿瘤患者。2基线调查基线调查采用整群抽样的方法，对江苏省南部两个社区进行人群的流行病学调查，于2009年在当地社区卫生中心开展。基线调查的内容主要包括问卷信息填写、体格检查和血样本的采集。问卷调查均有培训合格的调查员询问和填写，并对问卷填写进行严格的质量控制。问卷调查的详细信息主要包括：（1）一般人口学资料：性别、年龄、民族、婚姻、籍贯、受教育程度和职业等。（2）疾病史（现病史、既往史、家族史）、用药史和月经史等。其中疾病史中主要是心脑血管疾病、糖尿病、肾脏疾病、血脂异常等。用药史包括降压、11 皖南医学院硕士学位论文降糖和调节血脂类的药物等。（3）生活方式资料：吸烟状况、饮酒饮茶习惯、睡眠和体力活动等。吸烟的定义是>20支/星期并且持续>3个月/年。饮酒的定义是>2次/星期并且持续>6个月/年。（4）体格检查：血压、身高、体重、腰围和臀围等。血压测量的方法：被测量者需在清晨空腹、未剧烈运动的情况至少静坐5分钟，且测量血压前30分钟内禁止吸烟，禁饮咖啡浓茶等刺激性食物饮料，测量时尽可能的保持周围环境安静；统一取坐位体位，测量右臂肱动脉血压，保持右肘部与心脏同一水平位；被测者重复测量血压3次，每次需间隔30s以上，若3次SBP或DBP差值≥8mmHg，则需加测一次，最终血压取平均值。体质指数（Bodymassindex，BMI）=体重（kg）/身高的平方（m2）。（5）实验室检查：采集研究对象清晨空腹外周静脉血于EDTA抗凝管中，并于24小时内处理血样本，在4000r/min离心10分钟，血浆分装在1.5ml的离心管中。血浆用于检测生化指标，剩余血样暂放-20℃冰箱保存，用于提DNA。生化指标主要有：空腹血糖（GLU）、甘油三脂（TG）、血清总胆固醇（TC）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）等。3健康人群的随访队列开始于2009年的流行病学调查，高血压新发病例主要通过疾控中心的慢性病管理系统、医院以及当地社区卫生服务中心慢病常规登记获得。在2014年5月到2016年1月期间，对2116例（基线中94例用于匹配年龄的老年对照不纳入随访）健康对照进行全面随访并收集新发病例信息，对随访对象的体格和生化指标进行复查。对于迁出原居住地的研究对象，用电话等方式代替问卷进行随访，若联系不上则归为失访。队列开始时间是基线参加日期，新发高血压患者以首诊日期为结束时间；因其他原因死亡的对象以死亡时间为结束时间；失访对象的随访时间统一以随访结束时间的一半计算，结束时间为2016年1月13日；其他调查对象以末次随访时间为结束时间。12 皖南医学院硕士学位论文4实验方法4.1DNA的提取4.1.1酚氯仿法提取外周血DNA（1）先对环境进行卫生处理，84液擦拭台面等，紫外灯消毒空气；（2）取出待提DNA血样本，放置4℃冰箱化冻；（3）待血样化冻后，加入裂解液2-3ml，放置数分钟，颠倒混匀，使血细胞充分溶于裂解液当中，4000r/min离心10min；（4）弃去上清，再次加入裂解液，混匀，4000r/min离心10min；（5）弃去上清，加入含蛋白酶K的抽提液1ml，摇匀后转移至5ml离心管中，涡旋震荡，使其充分混匀，37℃水浴过夜；（6）第二日取出样本，待其冷至室温，加入Tris-饱和酚1ml，摇晃样本15min后，4000r/min离心10min；（7）轻轻取出样本，将上清吸取至干净的5ml离心管中。（8）向5ml离心管中加入氯仿与异戊醇的混合液1ml，摇晃颠倒15min使液体充分混匀，4000r/min离心10min；（9）将上清平均分装至2个2ml离心管中，分A、B两管，均加入3摩尔的醋酸钠60ul和预冷的无水乙醇1ml，颠倒混匀，可见白色絮状物析出，12000r/min离心10min。（10）弃去上清，加入预冷无水乙醇1.5ml冲洗，A管12000r/min离心10min。B管直接保存；（11）A管弃去上清，室温风干；（12）A管中加入TE缓冲液100ul，于室温下放置一天，后转移至4℃冰箱静置一周，使DNA充分溶解；（13）使用NanoDrop2000分光光度计（ThermoScientific，美国）。保存在-20℃冰箱。4.1.2DNA的稀释和分装13 皖南医学院硕士学位论文（1）样本取出，4℃冰箱化冻，离心。将所有浓度在100ng/ul以上的DNA，加入TE缓冲液稀释至100ng/ul；（2）将蒸馏水和DNA按一定的比例加入灭菌96孔板，使96孔板中的DNA浓度在10ng/ul，总体积共100ul；原DNA-20℃长期保存。4.2SNP位点的选择利用软件Genomevariationserver（http://gvs.gs.washington.edu/GVS147/）下载美国国立生物技术信息中心数据库提供的中国北京汉族人群（Hapmap-HCB）的基因型数据，搜索范围包括基因上游2kb至下游1kb之间的区域；根据连锁不平衡（linkagedisequilibrium，LD）r2≥0.8和最小等位基因频率（MinorAlleleFrequency，MAF）≥5％的条件筛选tagSNPs；运用美国国立卫生研究院提供的功能预测网站（SNPinfo，https://snpinfo.niehs.nih.gov/）对筛选的tagSNPs进行功能预测，优先选择预测有功能性的tagSNP。共选取了两个基因上7个位点，信息见表1。表1IGFBP-1基因和IGFBP-3基因tagSNPs及生物信息学预测生物信息学MAF基因SNPs位置常见等位基因最小等位基因预测功能IGFBP-1rs1065780upstreamgenevariantGA0.482TFBSrs2854843intronvariantTC0.329-rs1874479intronvariantAG0.161-IGFBP-3rs3110697intronvariantGA0.226TFBSrs13223993downstreamgenevariantGA0.345-rs2132572upstreamgenevariantCT0.185TFBSmiRNATCrs2453839intronvariant0.167（Sanger）TFBS，转录因子结合位点；miRNA，miRNA结合位点4.3基因分型4.3.1TaqMan探针及引物序列14 皖南医学院硕士学位论文本研究基因分析技术采用TaqMan探针法。聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）中各位点的引物和探针详细情况见表2。表2IGFBP-1和IGFBP-3的基因分型的探针和引物序列基因探针和引物序列FAM-TTGTTTTCTGCGTTTGVIC-TTGTTTTCTGCATTTGAGIGFBP-1rs1065780探针序列MGBNFQAMGBNFQ引物序列5’CATTGTTTTCTGCGTTTG3'5’TTGTTTTCTGCATTTGAGA3'FAM-CAAAATCTAGAAATGVIC-ATTCAAAATCTAGAAACrs2854843探针序列TCTTCMGBNFQGTCMGBNFQ5’CAAAATCTAGAAATGTC5’ATTCAAAATCTAGAAACGT引物序列TTC3'C3'FAM-CTTCACGGGCAATGMVIC-CTGCTTCACAGGCAAMGrs1874479探针序列GBNFQBNFQ引物序列5’CTTCACGGGCAATG3'5’CTGCTTCACAGGCAA3'FAM-HEX-CTAGGATTCATAGCAGTIGFBP-3rs3110697探针序列CTAGGATTCATAGTAGGG-MGBTGGC-MGB5’TGGCCTCAGGGTGACCAT5’AATGGCAATGGAGGAAAG引物序列AT3'CTT3'FAM-AGAACCGGCTTGCMGVIC-TACAGAACCGACTTGCMrs13223993探针序列BNFQGBNFQ引物序列5’AGAACCGGCTTGC3'5’TACAGAACCGACTTGC3'FAM-ACCGCAAGTCTCCAA-HEX-ACCGCAAGTCCCCAA-rs2132572探针序列MGBMGB5’CGCAAGAAGACTCTCACG5’TGCCTTAAGGACGCATTG引物序列TGTT3'G3'FAM-VIC-TCAACTCACGTTTTCMGrs2453839探针序列TCTCAACTCATGTTTTCBNFQMGBNFQ引物序列5’TCTCAACTCATGTTTTC3'5’TCAACTCACGTTTTC3'4.3.2PCR反应体系及程序PCR反应体系体积共5ul，包括2×TaqMan®PCRMasterMix2.5ul，上下游引物各0.2ul，探针各0.125ul，DNA模板1ul，去离子水0.85ul。PCR扩增反应在ABI9700上运行。PCR反应条件见表3。15 皖南医学院硕士学位论文表3PCR反应程序步骤温度（℃）时间预反应502（min）预变性9510（min）PCR扩增变性9515（sec）45个循环退火、延伸601（min）保存1510（min）4.3.3结果检测运用ABI7900HT荧光定量PCR仪读取实验数据，基因分型结果通过软件SDS2.3获得。基因分型成功率为99.8%。4.4IGFBP-1和IGFBP-3蛋白水平的测定在研究人群中随机挑选159例健康对照和137例未使用降压药治疗的高血压患者，应用酶联免疫吸附法测定其血浆中IGFBP-1和IGFBP-3蛋白的水平。具体实验使用IGFBP-1酶联免疫试剂盒（CUSABIO，商品编号：No.CSB-E04586h）和IGFBP-3酶联免疫试剂盒（CUSABIO，商品编号：No.CSB-E04590h）测定。4.5主要试剂（1）提取DNA的试剂裂解液：0.3摩尔蔗糖，1.0摩尔pH7.5Tris-HCl，5.0摩尔MgCl2，1%TritoneX-100。抽提液：75毫摩尔NaCl，24毫摩尔pH7.8EDTA，20mg/ml蛋白酶K，0.5%SDS。TE缓冲液：10毫摩尔pH7.6Tris-HCl，1.0毫摩尔pH8.0EDTA。3摩尔pH5.0醋酸钠，平衡酚，24:1氯仿，异戊醇，无水乙醇。（2）基因分型试剂16 皖南医学院硕士学位论文IGFBP-1的3个位点（rs1065780、rs1874479、rs2854843）和IGFBP-3位点（rs13223993、rs2453839）的TaqMan探针引物由美国应用生物公司（AppliedBiosystems）提供，IGFBP-3另外2个位点（rs3110697、rs2132572）的TaqMan探针引物和qPCR反应的mix由南京骥骜生物公司提供。4.6主要仪器表4实验主要使用的仪器及相关耗材仪器名称设备厂家DK-600S型恒温水浴箱上海精宏试验设备有限公司H1650台式高速离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司L550台式低速离心机湖南湘仪离心机仪器有限公司NanoDrop2000核酸蛋白分析仪美国Thermo公司-20℃冰箱江苏白雪电器股份有限公司-4℃冰箱青岛海尔股份有限公司单道移液器美国SorensonBioScience,Inc.公司八道移液器美国SorensonBioScience,Inc.公司Bio-Rad680酶标仪美国伯乐公司FY型紫外线杀菌灯车江阴市飞扬器械有限公司VS-1300L-U超净工作台江苏苏净集团有限公司ABIPrism®9700型PCR仪美国AppliedBiosystems公司ABIPrism®7900HT型PCR仪美国AppliedBiosystems公司5质量控制现场调查：对调查人员进行统一培训和考核；进行预调查发现问卷及现场可能存在的问题；安排专门的质控人员进行现场的问卷信息核实，保证资料完整；测量采用统一的标准；当日收集的血样本当日送检；问卷资料双轨录入和一致性检验，对可能存在问题的数据进行核实。实验操作：实验操作之前进行环境消毒，包括紫外灯和84消毒；基因分型工作前，进行预实验；实验数据导出勿手动划分基因分型结果；数据整理，双17 皖南医学院硕士学位论文轨录入；以卡方检验来描述基因型的分布情况；判断基因分型是否存在错误则采用哈迪-温伯格平衡定律（Hardy-Weinbergequilibrium，HWE）对基因分型进行检验。数据结果严格按照研究设计分析。6统计分析6.1统计方法本研究中采用均数±标准差（x±S）表示计量资料，用两独立样本t检验比较两组间均数，用单因素方差分析比较多组间均数。不服从正态分布的资料用中位数表示，比较采用非参数检验。分类变量用构成比表示，组间比较采用χ2检验，同时采用χ2检验对对照组的基因型频率进行HWE检验，若P＞0.05，则说明样本符合HWE平衡。病例对照中各基因位点变异与原发性高血压的关联采用二元Logistic回归分析，结果用比值比（oddsratio，OR）和95%可信区间（intervalconfidence，CI）表示。校正性别、年龄、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、吸烟和饮酒状况变量。随访中各基因位点变异与高血压发病的关联采用Cox回归分析，结果用风险比（Hazardratio，HR）和95%CI表示，调整性别、年龄、BMI、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖尿病、吸烟和饮酒情况。血压在各位点基因型中的水平比较采用一般线性模型（GLM）分析。统计软件为SPSS18.0（SPSS,Inc,Chicago,IL）。位点单体型与高血压关联的分析采用HAPSTATA3.0软件。以双侧P＜0.05表示差异有统计学意义。异质性检验采用Q检验和I2指数，Q检验P＜0.05或I2＞50%为有异质性，统计软件为Stata11.0。6.2把握度计算计算和分析把握度用样本量计算软件Quanto（http://hydra.usc.edu/gxe/）来操作。设α为0.05，高血压病例2012例，健康对照2210例，候选位点中MAF最低的位点rs1874479，MAF为0.161，假设估计的OR值为1.2，则本研究的统计把握度可以达到85%。18 皖南医学院硕士学位论文结果1研究对象的一般资料1.1研究对象的基线资料本研究共纳入研究对象4222人，包括2210例对照（男性40%）和2012例高血压病例（男性41.2%）。两组人群在性别、HDL-C水平、吸烟和饮酒行为均无统计学差异。病例组平均年龄62.35±10.73岁，对照组平均年龄58.93±10.45岁，本研究采用了年龄（-5岁）匹配对照组，病例组平均年龄仍比对照组平均年龄大3.42岁（P<0.001）。对照组的SBP、DBP、TC、TG、LDL-C、GLU和BMI的水平低于高血压组，差异均有统计学意义（P<0.001）。纳入对象的具体基线资料见表4。表4研究对象的基线资料[±S/n（%）]变量分组对照组（n=2210）高血压组（n=2012）t/χ2P男性884（40）829（41.2）性别0.6320.427女性1326（60）1183（58.8）年龄（岁）58.93±10.4562.35±10.7310.484<0.001收缩压124.24±11.36142.86±14.346.523<0.001血压（mmHg）舒张压79.08±6.5187.53±8.5435.918<0.001TC（mmol/L）4.7896±1.014.9343±1.054.574<0.001TG（mmol/L）1.5351±1.211.8628±1.587.526<0.001HDL-C（mmol/L）1.3634±0.331.3651±0.330.1750.861LDL-C（mmol/L）2.6464±0.732.801±0.896.17<0.001GLU（mmol/L）5.4551±1.615.8331±2.056.609<0.001BMI（kg/m2）23.6434±3.224.7634±3.5110.798<0.001是533（24.1）480（23.9）吸烟0.0390.843否1677（75.9）1532（76.1）是476（21.5）423（21）饮酒0.1660.683否1734（78.5）1589（79.0）19 皖南医学院硕士学位论文1.2健康对照随访的高血压发病状况对基线2116例健康对照进行随访，在平均5.01年（中位数）的随访期间内，共有613例高血压新发病例。总随访9332.56人年，高血压的发病密度为656.84（/10万人年）。其中男性患者266例，平均年龄62.19±9.36岁。女性患者347例，平均年龄59.60±9.57岁。在613例新诊断高血压患者中，饮酒者155例，吸烟者159例，高血压家族史者120例。2关联分析2.1高血压病例-对照研究的关联分析本研究7个位点在对照组的基因型频率分布均符合HWE（P>0.05），表明对照组研究对象具有很好的群体代表性。关联分析结果显示，IGFBP-3基因位点rs3110697和rs2132572多态性与高血压相关。rs3110697位点的三种基因型GG、GA、AA在对照组的分布频率是58.96%、35%、6.04%，在高血压组的频率是55.47%、39.06%、5.47%。Logistic回归显示携带rs3110697（GA+AA）基因型个体与携带GG基因型相比，其高血压患病风险增加了15.3%，P=0.022。在校正年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、血糖、BMI、吸烟和饮酒状况等相关协变量后，关联仍有统计学意义，P值为0.013。rs2132572位点的三种基因型TT、TC、CC在对照组的分布频率是68.29%、28.22%、3.49%，在高血压组的分布频率是63.86%、32.56%、3.58%，两组等位基因分布比较有统计学差异。与携带T等位基因者相比较，携带rs2132572C等位基因个体其高血压患病风险是T等位基因的1.160倍（1.040-1.294），P=0.008。在调整协变量后，关联仍有统计学意义，OR=1.167，P值为0.080。本研究未见IGFBP-1基因变异与原发性高血压相关。详细结果见表5和表6。20 皖南医学院硕士学位论文表5IGFBP-1和IGFBP-3基因与原发性高血压的关联分析OR（95%CI）位点组别野生/杂合/突变P-HWE相加模型显性模型隐性模型rs1065780对照661/1091/4550.985（0.904-1.073）0.99（0.867-1.129）0.967（0.833-1.124）0.901（A>G）病例607/1001/404P=0.727P=0.877P=0.665rs2854843对照964/991/2541.059（0.968-1.16）1.105（0.978-1.249）1.013（0.839-1.224）0.977（T>C）病例829/949/234P=0.211P=0.11P=0.894rs1874479对照1461/666/801.075（0.964-1.198）1.096（0.966-1.244）1.044（0.758-1.437）0.704（A>G）病例1290/646/76P=0.193P=0.156P=0.793rs3110697对照1299/771/1331.083（0.98-1.197）1.153（1.021-1.303）0.901（0.695-1.169）0.194（G>A）病例1115/785/110P=0.116P=0.022P=0.433rs13223993对照939/1007/2591.057（0.966-1.158）1.099（0.972-1.242）1.019（0.845-1.228）0.66（G>A）病例810/960/240P=0.228P=0.132P=0.845rs2132572对照1505/622/771.16（1.039-1.294）1.218（1.072-1.384）1.027（0.74-1.424）0.202（C>T）病例1283/654/72P=0.008P=0.002P=0.874rs2453839对照1363/738/1051.093（0.987-1.211）1.102（0.974-1.247）1.18（0.898-1.551）0.691（T>C）病例1196/703/112P=0.087P=0.125P=0.23521 皖南医学院硕士学位论文表6IGFBP-1和IGFBP-3基因与原发性高血压关联的多因素分析OR（95%CI）a位点组别野生/杂合/突变相加模型显性模型隐性模型rs1065780对照661/1091/4550.974（0.89-1.065）0.984（0.857-1.129）0.942（0.806-1.102）病例607/1001/404P=0.562P=0.814P=0.457rs2854843对照964/991/2541.058（0.963-1.163）1.105（0.972-1.255）1.007（0.827-1.226）病例829/949/234P=0.243P=0.126P=0.942rs1874479对照1461/666/801.057（0.944-1.184）1.063（0.931-1.214）1.094（0.782-1.53）病例1290/646/76P=0.339P=0.363P=0.599rs3110697对照1299/771/1331.099（0.99-1.22）1.176（1.035-1.336）0.908（0.691-1.192）病例1115/785/110P=0.076P=0.013P=0.486rs13223993对照939/1007/2591.052（0.957-1.156）1.093（0.962-1.243）1.011（0.832-1.228）病例810/960/240P=0.291P=0.173P=0.915rs2132572对照1505/622/771.167（1.041-1.309）1.235（1.081-1.411）0.992（0.703-1.399）病例1283/654/72P=0.008P=0.002P=0.962rs2453839对照1363/738/1051.105（0.993-1.23）1.117（0.982-1.271）1.192（0.895-1.587）病例1196/703/112P=0.066P=0.093P=0.23a调整协变量：年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、BMI、吸烟和饮酒情况22 皖南医学院硕士学位论文2.2IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压的关联分层分析为了进一步探讨IGFBP-1和IGFBP-3基因变异与高血压关联是否受到混杂因素的干扰，根据研究对象的性别、年龄、吸烟、饮酒状况进行分层分析，分别估计在不同的性别层、年龄层、吸烟层、饮酒层中，IGFBP-1和IGFBP-3基因上选定的7个位点多态性对高血压的作用；并对性别层、年龄层、吸烟层、饮酒层OR值进行异质性检验。结果显示rs2132572在男性层、≥55岁层、不吸烟和饮酒层人群中，rs2453839在≥55岁层中，rs1874479在吸烟层中，rs3110697在饮酒层中显示了更加显著的增加高血压风险的意义，在校对相关协变量后，上述关联仍具有统计学意义。但是经异质性检验并未发现各层间存在明显的异质性（P＞0.05，I2＜50%），除了rs1874479在吸烟层中存在异质性（P＞0.05，I2=62.1%），在吸烟人群中，携带rs1874479位点G等位基因个体的高血压患病风险是携带A等位基因的1.278倍（1.023-1.597），P=0.031。结果详见表7-10所示。23 皖南医学院硕士学位论文表7IGFBP-1和IGFBP-3基因与原发性高血压的关联性别分层分析对照组病例组c异质性位点分层OR（95%CI）aPaOR（95%CI）bPb野生/杂合/突变野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780男性267/434/182245/422/1620.992（0.867-1.136）0.9090.995（0.865-1.145）0.94400.892女性394/657/273362/579/2420.98（0.877-1.095）0.7220.955（0.85-1.074）0.445rs2854843男性382/386/115337/408/840.994（0.862-1.146）0.9310.987（0.852-1.144）0.86523.10.254女性582/605/139492/541/1501.106（0.984-1.244）0.0921.11（0.98-1.256）0.1rs1874479男性590/259/34515/278/361.176（0.994-1.39）0.0591.146（0.963-1.363）0.12546.10.173女性871/407/46775/368/401.006（0.873-1.16）0.9350.995（0.856-1.156）0.946rs3110697男性528/305/49452/329/471.161（0.991-1.359）0.0641.174（0.997-1.382）0.05516.40.274女性771/466/84663/456/631.034（0.909-1.177）0.6081.054（0.919-1.209）0.449rs13223993男性370/397/116329/411/870.989（0.858-1.14）0.8770.979（0.845-1.134）0.77929.80.233女性569/610/143481/549/1531.106（0.983-1.244）0.0931.111（0.982-1.257）0.095rs2132572男性614/239/29530/267/301.216（1.022-1.446）0.0271.208（1.009-1.446）0.03900.502女性891/383/48753/387/421.125（0.976-1.296）0.1041.145（0.986-1.33）0.076rs2453839男性546/294/43497/291/401.053（0.896-1.238）0.5321.05（0.888-1.241）0.5700.55女性817/444/62699/412/721.122（0.983-1.279）0.0881.145（0.996-1.316）0.057a未调整协变量b调整协变量年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、BMI、吸烟和饮酒情况c对未调整协变量的OR值的异质性检验24 皖南医学院硕士学位论文表8IGFBP-1和IGFBP-3基因与原发性高血压的关联年龄分层分析对照组病例组c分层异质性位点OR（95%CI）aPaOR（95%CI）bPb（岁）野生/杂合/突变野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780<55265/411/180164/270/1000.96（0.823-1.118）0.5980.936（0.798-1.097）0.41500.737≥55396/680/275443/731/3040.991（0.892-1.101）0.8650.988（0.886-1.102）0.833rs2854843<55369/388/99225/250/591.01（0.859-1.189）0.9011.021（0.862-1.209）0.81400.489≥55595/603/155604/699/1751.082（0.968-1.208）0.1641.076（0.96-1.207）0.209rs1874479<55567/250/40338/177/191.056（0.873-1.276）0.5751.062（0.872-1.293）0.55200.771≥55894/416/40952/469/571.093（0.956-1.25）0.1931.061（0.923-1.219）0.407rs3110697<55501/295/59286/217/301.101（0.924-1.312）0.281.116（0.93-1.338）0.23700.907≥55798/476/74829/568/801.087（0.961-1.23）0.1841.094（0.962-1.244）0.171rs13223993<55363/395/99219/252/621.031（0.876-1.213）0.7131.041（0.879-1.233）0.64300.732≥55576/612/160591/708/1781.067（0.955-1.192）0.251.058（0.944-1.187）0.332rs2132572<55580/239/37327/188/181.186（0.98-1.435）0.0791.195（0.981-1.455）0.07700.882≥55925/383/40956/466/541.165（1.017-1.334）0.0281.159（1.007-1.335）0.04rs2453839<55515/296/45319/182/321.03（0.86-1.233）0.7481.025（0.849-1.236）0.800.369≥55848/442/60877/521/801.138（1.003-1.291）0.0451.152（1.011-1.313）0.034a未调整协变量b调整协变量年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、BMI、吸烟和饮酒情况c对未调整协变量的OR值的异质性检验25 皖南医学院硕士学位论文表9IGFBP-1和IGFBP-3基因与原发性高血压的关联吸烟分层分析对照组病例组c异质性位点分层OR（95%CI）aPaOR（95%CI）bPb野生/杂合/突变野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780不吸烟497/833/345466/752/3140.983（0.891-1.085）0.7340.965（0.871-1.07）0.500.946吸烟164/258/110141/249/900.99（0.83-1.182）0.9141.000（0.83-1.206）0.998rs2854843不吸烟724/767/186640/700/1921.065（0.961-1.181）0.2311.062（0.953-1.183）0.27800.828吸烟240/224/68189/249/421.04（0.862-1.255）0.6811.055（0.866-1.284）0.596rs1874479不吸烟1095/517/62994/481/571.018（0.899-1.152）0.7820.994（0.873-1.132）0.92562.10.104吸烟366/149/18296/165/191.278（1.023-1.597）0.0311.273（1.008-1.608）0.042rs3110697不吸烟977/589/105847/601/831.064（0.949-1.193）0.2871.084（0.962-1.222）0.18600.54吸烟322/182/28268/184/271.148（0.934-1.412）0.1891.17（0.942-1.454）0.156rs13223993不吸烟707/773/192626/709/1961.062（0.958-1.178）0.2531.055（0.947-1.175）0.32900.856吸烟232/234/67184/251/441.041（0.862-1.257）0.6751.045（0.858-1.274）0.661rs2132572不吸烟1133/479/60969/505/571.161（1.025-1.315）0.0191.168（1.025-1.331）0.0200.964吸烟372/143/17314/149/151.154（0.918-1.45）0.221.197（0.94-1.525）0.144rs2453839不吸烟1033/559/82909/533/901.099（0.978-1.235）0.1121.115（0.987-1.259）0.0800.853吸烟330/179/23287/170/221.074（0.867-1.329）0.5131.073（0.857-1.343）0.539a未调整协变量b调整协变量年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、BMI、吸烟和饮酒情况c对未调整协变量的OR值的异质性检验26 皖南医学院硕士学位论文表10IGFBP-1和IGFBP-3基因与原发性高血压的关联饮酒分层分析对照组病例组c异质性位点分层OR（95%CI）aPaOR（95%CI）bPb野生/杂合/突变野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780不饮酒508/861/362480/787/3220.97（0.881-1.069）0.5370.969（0.876-1.073）0.54800.52饮酒153/230/93127/214/821.041（0.864-1.254）0.6750.995（0.817-1.213）0.963rs2854843不饮酒761/774/198664/725/2001.075（0.972-1.19）0.161.064（0.957-1.183）0.2500.515饮酒203/217/56165/224/340.998（0.814-1.223）0.9841.037（0.837-1.284）0.74rs1874479不饮酒1145/526/611027/505/571.051（0.93-1.189）0.4231.04（0.915-1.183）0.54800.472饮酒316/140/19263/141/191.161（0.922-1.462）0.2041.113（0.873-1.419）0.388rs3110697不饮酒1012/605/111885/622/811.042（0.931-1.166）0.4721.052（0.935-1.183）0.40247.20.169饮酒287/166/22230/163/291.252（1.007-1.557）0.0431.324（1.052-1.666）0.017rs13223993不饮酒746/783/200649/737/2021.079（0.975-1.194）0.1421.061（0.955-1.18）0.27100.378饮酒193/224/59161/223/380.977（0.798-1.195）0.8181.03（0.833-1.274）0.786rs2132572不饮酒1175/491/631015/520/531.131（0.999-1.279）0.0521.124（0.987-1.279）0.07800.41饮酒330/131/14268/134/191.272（1.003-1.613）0.0471.362（1.06-1.75）0.016rs2453839不饮酒1074/576/81946/554/891.103（0.983-1.238）0.0951.105（0.98-1.247）0.10400.742饮酒289/162/24250/149/231.058（0.849-1.32）0.6151.11（0.879-1.401）0.382a未调整协变量b调整协变量年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、GLU、BMI、吸烟和饮酒情况c对未调整协变量的OR值的异质性检验27 皖南医学院硕士学位论文2.3IGFBP-1和IGFBP-3基因变异与高血压关联的队列研究Cox回归分析显示，IGFBP-3基因的rs2132572位点C＞T变异增加了高血压的发病风险，携带CC、CT、和TT基因型患者的发病密度分别是6531.63、6462.24和8107.73（/10万人年）。与携带野生纯合和杂合（CT+CC）基因型者比较，携带TT突变纯合基因型个体高血压的发病风险是（CT+CC）基因型的1.57倍（1.034-2.383），差异有统计学意义（P=0.034）。在校正年龄、性别、TC、TG、LDL-C、HDL-C、糖尿病、BMI、吸烟和饮酒相关协变量后，其关联仍有统计学意义，TTVS.（CT+CC）的HR（95%CI）为1.694（1.113-2.579），P=0.014。经Cox回归分析，高血压的发病人数在IGFBP-1基因和其他IGFBP-3基因位点的野生型、杂合型和突变型之间的分布频率无统计学差异（P＞0.05）。结果详见表11，12。28 皖南医学院硕士学位论文表11IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压发病的关联分析发病密度HR（95%CI）位点基因型发病例数（/10万人年）相加模型显性模型隐性模型rs1065780AA1816535.121.024（0.916-1.145）1.088（0.914-1.295）0.965（0.791-1.177）AG3096681.11P=0.676P=0.344P=0.726GG1226321.77rs2854843TT2796752.910.919（0.816-1.034）0.928（0.792-1.088）0.817（0.63-1.06）TC2706525.14P=0.159P=0.359P=0.128CC646037.28rs1874479AA4256788.050.956（0.824-1.11）0.992（0.835-1.179）0.663（0.39-1.127）AG1736324.58P=0.557P=0.93P=0.129GG144237.8rs3110697GG3556421.541.118（0.979-1.278）1.105（0.941-1.299）1.346（0.961-1.885）GA2196653.3P=0.1P=0.223P=0.084AA367388.71rs13223993GG2616507.870.945（0.84-1.064）0.968（0.824-1.136）0.843（0.654-1.088）GA2846734.13P=0.349P=0.688P=0.189AA676129.36rs2132572CC4156531.631.108（0.956-1.285）1.074（0.906-1.273）1.57（1.034-2.383）CT1736462.24P=0.174P=0.414P=0.034TT238107.73rs2453839TT3794830.620.99（0.857-1.144）0.974（0.827-1.148）1.105（0.714-1.709）TC2116698.58P=0.892P=0.754P=0.655CC215363.4429 皖南医学院硕士学位论文表12IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压发病的关联多因素分析HR（95%CI）a位点基因型发病例数相加模型显性模型隐性模型rs1065780AA1811.029（0.918-1.154）1.056（0.886-1.259）1.017（0.832-1.242）AG309P=0.622P=0.543P=0.869GG122rs2854843TT2790.894（0.792-1.008）0.887（0.755-1.043）0.812（0.625-1.055）TC270P=0.068P=0.147P=0.118CC64rs1874479AA4250.935（0.803-1.09）0.946（0.795-1.125）0.768（0.451-1.308）AG173P=0.391P=0.528P=0.332GG14rs3110697GG3551.125（0.982-1.29）1.092（0.928-1.285）1.489（1.057-2.098）GA219P=0.09P=0.292P=0.023AA36rs13223993GG2610.921（0.816-1.039）0.926（0.787-1.09）0.84（0.65-1.085）GA284P=0.18P=0.354P=0.181AA67rs2132572CC4151.096（0.942-1.274）1.047（0.881-1.244）1.694（1.113-2.579）CT173P=0.235P=0.601P=0.014TT23rs2453839TT3791.004（0.867-1.162）0.985（0.834-1.162）1.163（0.75-1.803）TC211P=0.96P=0.856P=0.499CC21a调整协变量：年龄、性别、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖尿病、BMI、吸烟和饮酒情况30 皖南医学院硕士学位论文2.4IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压发病风险关系的分层分析在随访发病人群中继续以基线人群年龄（<55岁或≥55岁）、性别、吸烟和饮酒状况进行分层分析。结果显示，IGFBP-1位点rs1065780变异在男性人群中增加了高血压的发病风险，其携带G等位基因的男性是携带A等位基因的1.204倍（1.015-1.428），P=0.033；性别层之间存在显著的异质性，P=0.022，I2=80.9%。校正相关协变量后，关联仍有统计学意义。进一步交互作用发现，性别与rs1065780存在负相乘交互作用，P值是0.03。在饮酒分层中，rs1065780位点在饮酒人群中增加了高血压的发病风险，校正相关协变量后，发现关联没有统计学差异，P值分别是0.032和0.084。IGFBP-3位点rs3110697变异在女性和不吸烟人群中增加了高血压的发病风险，携带G等位基因的女性是携带A等位基因的1.234倍（1.037-1.468），P=0.018，异质性P=0.081，I2=67.1%；在不吸烟人群中，携带G等位基因的个体是携带A等位基因的1.189倍（1.019-1.386），P=0.028，异质性P=0.082，I2=66.9%；校正协变量后，关联仍有统计学意义。IGFBP-3位点rs2132572变异在女性人群中增加了高血压的发病风险，携带T等位基因的女性是携带C等位基因的1.281倍（1.058-1.551），P=0.011，异质性P=0.021，I2=81.1%。在吸烟层中，rs2132572在不吸烟人群中增加了高血压的发病风险，携带T等位基因的个体是携带C等位基因的1.227倍（1.035-1.454），P=0.018，异质性P=0.008，I2=85.7%。校正相关协变量后，关联仍有统计学意义。交互作用发现，性别与rs2132572存在正相乘交互作用，P值是0.003。吸烟与rs2132572存在负相乘交互作用，P值是0.031。结果详见表13-16。31 皖南医学院硕士学位论文表13IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压发病风险的关联的性别分层分析发病例数c异质性位点分层HR（95%CI）aPaHR（95%CI）bPb野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780男性78/128/601.204（1.015-1.428）0.0331.21（1.013-1.445)0.03680.90.022女性103/181/620.915（0.789-1.061）0.2380.92（0.791-1.07)0.278rs2854843男性123/111/320.854（0.717-1.018）0.0790.849（0.71-1.016)0.0738.80.295女性156/159/320.97（0.826-1.139）0.7080.939（0.797-1.107)0.456rs1874479男性186/73/60.946（0.754-1.187）0.6320.884（0.702-1.114)0.29600.908女性239/100/80.963（0.791-1.173）0.7110.966（0.788-1.185)0.743rs3110697男性158/93/140.969（0.785-1.196）0.7670.98（0.789-1.218)0.85567.10.081女性197/126/221.234（1.037-1.468）0.0181.257（1.052-1.502)0.012rs13223993男性115/120/310.85（0.712-1.015）0.0730.847（0.707-1.014)0.07156.40.13女性146/164/361.022（0.872-1.198）0.790.993（0.844-1.169)0.933rs2132572男性188/68/90.897（0.707-1.137）0.3690.861（0.673-1.102)0.23481.10.021女性227/105/141.281（1.058-1.551）0.0111.323（1.088-1.609)0.005rs2453839男性168/90/70.822（0.656-1.029）0.0870.801（0.636-1.009)0.05978.30.032女性211/121/141.135（0.939-1.372）0.1891.222（1.007-1.482)0.042a未调整协变量b调整协变量：年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖尿病、BMI、吸烟和饮酒状况c对未调整协变量的HR值的异质性检验32 皖南医学院硕士学位论文表14IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压发病风险的关联的年龄分层分析发病例数c异质性位点分层HR（95%CI）aPaHR（95%CI）bPb野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780<5557/85/411.132（0.927-1.381）0.2231.084（0.889-1.322)0.42442.90.186≥55124/224/810.955（0.833-1.095）0.5080.976（0.848-1.123)0.73rs2854843<5583/81/190.834（0.672-1.034）0.0980.842（0.676-1.049)0.12549.10.161≥55196/189/450.999（0.866-1.152）0.9880.961（0.831-1.112)0.595rs1874479<55133/43/70.869（0.66-1.144）0.3180.891（0.672-1.182)0.42400.336≥55292/130/71.018（0.851-1.217）0.8480.968（0.807-1.163)0.732rs3110697<55106/64/131.082（0.853-1.373）0.5141.005（0.787-1.284)0.96800.594≥55249/155/231.17（0.993-1.378）0.061.17（0.991-1.381)0.064rs13223993<5577/86/200.881（0.711-1.092）0.2470.888（0.713-1.104)0.28410.80.29≥55184/198/471.01（0.876-1.164）0.890.977（0.845-1.129)0.749rs2132572<55128/46/91.003（0.762-1.319）0.9850.952（0.718-1.262)0.73113.20.283≥55287/127/141.195（1.001-1.427）0.0491.171（0.979-1.402)0.085rs2453839<55112/62/90.92（0.708-1.197）0.5350.92（0.704-1.202)0.53900.332≥55267/149/121.072（0.902-1.273）0.4291.06（0.89-1.263)0.514a未调整协变量b调整协变量：年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖尿病、BMI、吸烟和饮酒状况c对未调整协变量的HR值的异质性检验33 皖南医学院硕士学位论文表15IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压发病风险的关联的吸烟分层分析发病例数c异质性位点分层HR（95%CI）aPaHR（95%CI）bPb野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780不吸烟134/235/840.954（0.837-1.086）0.4740.967（0.847-1.105)0.62675.60.043吸烟47/74/381.27（1.021-1.58）0.0321.172（0.934-1.47)0.172rs2854843不吸烟202/203/490.98（0.853-1.126）0.7780.933（0.81-1.075)0.33970.60.065吸烟77/67/150.771（0.616-0.966）0.0240.84（0.663-1.064)0.148rs1874479不吸烟314/128/110.969（0.815-1.153）0.7230.959（0.802-1.147)0.64700.663吸烟111/45/30.899（0.672-1.204）0.4770.788（0.578-1.075)0.133rs3110697不吸烟259/165/271.189（1.019-1.386）0.0281.175（1.004-1.376)0.04566.90.082吸烟96/54/90.912（0.694-1.199）0.510.985（0.741-1.309)0.918rs13223993不吸烟191/210/521.003（0.873-1.151）0.9710.959（0.833-1.104)0.55866.10.086吸烟70/74/150.802（0.64-1.005）0.0560.863（0.681-1.095)0.226rs2132572不吸烟301/133/181.227（1.035-1.454）0.0181.204（1.013-1.431)0.03685.70.008吸烟114/40/50.785（0.572-1.077）0.1340.808（0.582-1.123)0.205rs2453839不吸烟280/155/181.091（0.923-1.29）0.3061.095（0.924-1.297)0.29483.20.015吸烟99/56/30.736（0.549-0.986）0.040.75（0.557-1.011)0.059a未调整协变量b调整协变量：年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖尿病、BMI、吸烟和饮酒状况c对未调整协变量的HR值的异质性检验34 皖南医学院硕士学位论文表16IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压发病风险的关联的饮酒分层分析发病例数c异质性位点分层HR（95%CI）aPaHR（95%CI）bPb野生/杂合/突变I2Q检验rs1065780不饮酒135/230/920.957（0.84-1.089）0.5020.967（0.847-1.104)0.624750.045饮酒46/79/301.276（1.021-1.594）0.0321.225（0.973-1.543)0.084rs2854843不饮酒207/201/500.965（0.841-1.107）0.6140.933（0.811-1.074)0.33449.50.159饮酒72/69/140.8（0.634-1.009）0.060.816（0.643-1.035)0.093rs1874479不饮酒317/131/101.006（0.847-1.195）0.9450.987（0.826-1.179)0.88637.30.207饮酒108/42/40.81（0.598-1.097）0.1740.78（0.569-1.068)0.122rs3110697不饮酒264/161/311.144（0.983-1.33）0.0821.135（0.972-1.327)0.1100.528饮酒91/58/51.033（0.778-1.373）0.8221.161（0.873-1.544)0.304rs13223993不饮酒196/209/520.989（0.862-1.134）0.8710.958（0.833-1.102)0.547420.189饮酒65/75/150.83（0.658-1.047）0.1160.842（0.662-1.071)0.162rs2132572不饮酒305/134/181.161（0.981-1.373）0.0821.137（0.957-1.35)0.14421.90.258饮酒110/39/50.951（0.693-1.306）0.7571.059（0.775-1.449)0.717rs2453839不饮酒280/160/171.078（0.912-1.274）0.3771.088（0.918-1.289)0.33177.30.036饮酒99/51/40.766（0.571-1.027）0.0750.852（0.634-1.145)0.289a未调整协变量b调整协变量：年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C、糖尿病、BMI、吸烟和饮酒状况c对未调整协变量的HR值的异质性检验35 皖南医学院硕士学位论文2.5单体型分析运用千人基因组计划（1000genomes:Adeepcatalogofhumangeneticvariation.URLhttp://1000genomes.org），下载中国人群的IGFBP-1和IGFBP-3基因数据。然后应用Haploview4.2软件打开数据并构建单体型区块。结果显示IGFBP-1基因上的rs2854843和rs1874479位于同一染色体LDBlock（图1）。单体型分析排除单体型频率小于1%的基因型组合，以频率较高的基因型C-A为参照，调整年龄、性别、吸烟、饮酒、GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C和BMI协变量后，结果显示各单体型在对照组和高血压组的分布频率无统计学差异（P＞0.05）。结果见表17。图1IGFBP-1基因部分SNPsLD图表17高血压对照组与病例组IGFBP-1基因单体型分析对照组频率病例组频率单体域单体型HR（95%CI）P（%）（%）rs2854843-44.82451/rs1874479CA（aB）IGFBP-1TA（AB）21.0621.090.96（0.86-1.07）0.464TG（Ab）33.8633.921.02（0.93-1.13）0.628校正年龄、性别、吸烟、饮酒、GLU、TC、TG、HDL-C、LDL-C和BMI36 皖南医学院硕士学位论文2.6血压数量性状分析本研究根据高血压人群是否服用降压药分为服药组和未服药组，同时对照人群也归为未服药组，来分析IGFBP-1和IGFBP-3基因多态性对SBP和DBP水平的影响。同时对性别、年龄、BMI、吸烟和饮酒情况、TC、TG、HDL-C、LDL-C和GLU等相关变量进行调整。结果表明，在未服药组中，IGFBP-1基因位点rs2854843TT基因型携带者收缩压水平（131.18±13.7）mmHg高于CC和CT携带者收缩压水平（129.39±14.44和130.25±14.34）mmHg，P=0.021。结果详见表18。在IGFBP-3基因中，未服药组中rs3110697突变基因型携带者收缩压水平低于野生型和杂合型携带者血压水平，P值为0.004。在服用降压药的情况下，rs3110697突变基因型携带者收缩压水平（148.82±20.35）mmHg明显高于野生型（142.03±16.27）和杂合型（142.89±16.18），P值为0.021。结果详见表19。在未服药者，rs2132572位点GG和AA基因型携带者与AG基因型相比有较低的收缩压，P为0.024。此外，在未服药组中，收缩压水平在rs2453839突变基因型比杂合型携带者低，P值为0.02；但在降压药组中rs2453839突变基因型携带者收缩压水平为（147.24±18.7）mmHg高于杂合型（143.39±17.21）mmHg和野生型为（141.94±15.87）mmHg，P值为0.042。结果详见表19。37 皖南医学院硕士学位论文表18IGFBP-1基因多态性与血压水平的关系（±S）收缩压（mmHg）舒张压mmHg）位点基因型未服药组（n）降压药组（n）未服药组（n）降压药组（n）rs1065780AA130.53±13.96（965）143.1±16.56（303）81.89±7.94（965）87.72±9.03（303）AG129.7±14.31（1559）142.64±16.38（533）81.42±7.87（1559）87.75±9.26（533）GG129.91±14.86（657）142.25±16.89（202）82.05±8.18（657）86.37±9.24（202）F1.0940.2311.7761.667P0.3350.7940.1690.189rs2854843CC129.39±14.44（1365）142.62±16.88（428）81.59±7.9（1365）87.09±9.68（428）CT130.25±14.34（1436）142.79±16.38（504）81.82±8.05（1436）87.92±9.05（504）TT131.18±13.7（382）142.57±15.8（106）81.55±7.85（382）86.92±7.76（106）F3.0530.0220.3181.564P0.0470.9780.7270.21rs1874479TT129.9±14.35（2080）142.49±16.86（671）81.64±7.82（2080）87.09±9.43（671）TC130.05±14.43（976）142.97±15.95（336）81.7±8.31（976）87.97±8.82（336）CC131.3±12.77（125）144.21±15.31（31）82.51±7.47（125）90.4±7.53（31）F0.80.2830.6822.892P0.4490.7530.5060.056调整协变量：性别、年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C、血糖、BMI、吸烟和饮酒状况38 皖南医学院硕士学位论文表19IGFBP-3基因多态性与血压水平的关系（±S）收缩压（mmHg）舒张压（mmHg）位点基因型未服药组（n）降压药组（n）未服药组（n）降压药组（n）rs3110697TT129.47±14.06（1825）142.03±16.27（589）81.62±7.89（1825）87.39±8.93（589）TC131.08±14.82（1162）142.89±16.18（394）81.86±8.12（1162）87.48±9.5（394）CC128.46±13.29（189）148.82±20.35（54）81.29±7.72（189）88.49±9.97（54）F5.5323.8760.5320.375P0.0040.0210.5880.687rs13223993GG129.4±14.37（1333）142.63±17.02（416）81.59±7.94（1333）87.14±9.75（416）GA130.23±14.43（1458）142.66±16.34（509）81.83±8.01（1458）87.82±8.99（509）AA131.23±13.67（388）143.2±15.61（111）81.57±7.83（388）87.18±8（111）F2.90.060.2591.142P0.0550.9410.7720.319rs2132572GG129.6±14.28（2124）142.11±15.96（664）81.64±7.89（2124）87.3±8.93（664）GA130.99±14.48（943）143.59±17.13（333）81.88±8.21（943）87.88±9.73（333）AA129.2±13.38（110）146.03±19.83（39）81.15±7.06（110）87.41±9.14（39）F3.7511.6920.8380.466P0.0240.1850.4330.628rs2453839AA129.46±14.05（1920）141.94±15.87（639）81.48±7.87（1920）87.4±8.88（639）AG130.88±14.75（1100）143.39±17.21（341）81.96±8.12（1100）87.47±9.76（341）GG130.48±14.25（160）147.24±18.7（57）82.43±7.88（160）88.42±9.41（57）F3.9373.1722.2570.367P0.020.0420.1050.693调整协变量：性别、年龄、TC、TG、HDL-C、LDL-C、血糖、BMI、吸烟和饮酒状况39 皖南医学院硕士学位论文3血清IGFBP-1与IGFBP-3蛋白水平分析3.1高血压组和对照组间IGFBP-1和IGFBP-3血清水平的比较血清IGFBP-1水平的中位数（四分位间距）在高血压患者中16.77（6.97，50.35）ng/ml显著低于对照组32.37（10.12，73.72）ng/ml，P=0.011。高血压患者和对照组之间观察到血清IGFBP3浓度无显著性差异（P=0.112）。3.2基因型间IGFBP-1和IGFBP-3血清水平的差异研究结果表明，对照组和高血压组的血清IGFBP-1水平在IGFBP-1基因位点rs1065780基因型（AA，AG，GG）中存在统计学差异（P<0.001），对照组中携带AA、AG、和GG基因型的IGFBP-1水平的中位数分别是6.86、33.68和65.97ng/ml，在高血压组中分别是5.31、18.11和53.80ng/ml。IGFBP-1基因中，对照组IGFBP-1水平的中位数在携带rs2854843CC、CT和TT基因型中分别是37.89、26.51和8.04ng/ml，在高血压组中分别是20.94、15.74和5.45ng/ml，差异有统计学意义，P值为0.002和0.003。IGFBP-3基因位点rs13223993基因型间的IGFBP-1水平存在统计学差异，对照组和高血压组的P值分别是0.008和0.002。对照组AA、AG和GG基因型携带者的IGFBP-1水平中位数分别是37.89、25.88和8.88ng/ml，在高血压组中分别是21.12、16.46和5.31ng/ml。基因型间IGFBP-1水平差异见表20。未观察到七个SNP位点的基因型之间血清IGFBP-3水平存在显著差异。结果详见表21。40 皖南医学院硕士学位论文表20IGFBP-1蛋白水平（ng/ml）在各位点之间的差异比较对照组高血压组位点NMedian（IQR）PNMedian（IQR）Prs1065780AA376.86（3.31，13.20）<0.001425.31（3.38，17）<0.001AG8733.68（15.16，84.66）6718.11（8.65，43.21）GG3265.97（32.97，142.44）2853.80（16.90，162.54）rs2854843TT7237.89（12.45，104.42）0.0026620.94（10.4，70.97）0.003TC7226.51（12.1，67.51）5815.74（4.83，42.23）CC148.04（4.13，17.89）135.45（4.43，19.32）1874479AA11134.54（11.76，87.8）0.1028416.2（6.21，51.65）0.327GA4216.87（5.44，52.20）4717.95（9.45，44.05）GG316.51（7.73，-）55.36（2.12，335.82）rs3110697GG8735.83（12.29，84.99）0.4157316.77（7.53，53.09）0.668GA5725.27（5.84，67.92）5216.98（5.12，44.19）AA1235.99（14.81，101.12）1215.22（6.31，74.73）rs13223993GG6837.89（12.45，101.75）0.0086121.12（10.3，71.73）0.002GA7325.88（11.05，67.41）5916.46（5.96，43.22）AA148.88（5.14，26.04）145.31（4.12，16.11）rs2132572CC10234.11（11.56，81.84）0.1988516.46（7.19，50.09）0.702CT4723.4（5.49，52.17）4418.94（5.12，51.39）TT835.99（16.86，192.51）712.91（6.23，17.95）rs2453839AA9836.01（12.33，88.59）0.227217.16（7.93，59.13）0.32AG5325.27（6.78，51.63）5613.33（5.12，49.71）GG721.98（0.06，52.17）612.03（5.65，18.13）Median（IQR），中位数（四分位间距）41 皖南医学院硕士学位论文表21IGFBP-3蛋白水平（ng/ml）在各位点之间的差异比较对照组高血压组位点NMedian（IQR）PNMedian（IQR）Prs1065780AA37857.82（452.49，1009.18）0.17342770.97（572.08，1030.06）0.838AG87865.6（591.53，1132.83）67827.23（599.66，1017）GG32957.98（789.91，1098.47）28860.27（555，1046.87）rs2854843TT72939.98（610.46，1086.68）0.61766824.52（570.13，1016.72）0.457TC72889.56（672.38，1091.05）58815.63（594.78，1046.43）CC14795.08（473.63，1030.84）13703.67（578.52，917.15）1874479AA111921.26（511.31，1033.81）0.46184790.2（617.31，1026.43）0.348GA42920.2（683.6，1136.39）47857.67（589.82，1068.5）GG3794.15（44.85，-）5567.22（330.42，867.62）rs3110697GG87925.41（414.83，1102.84）0.36673797.02（618.5，1043.72）0.823GA57904.54（677.94，1026.16）52829.74（573.83，1019.53）AA12755.56（622.49，931.55）12780.48（565.46，987.77）rs13223993GG68926.2（610.46，1074.84）0.92461834.06（662.34，1046.15）0.376GA73904.54（629.17，1068.34）59827.23（580.12，1042.72）AA14857.37（507.18，1052.77）14717.6（584.17，899.72）rs2132572CC102924.5（570.28，1124.8）0.29785797.02（606.34，1030.54）0.219CT47895.87（689.05，997.98）44849.52（582.55，1094.23）TT8711.35（177.5，968.18）7619.66（210.68，842.45）rs2453839AA98924.5（663.48，1107.69）0.62672824.52（630.59，1031.02）0.534AG53860.94（574.01，1036.73）56774.96（527.52，1005.65）GG7950.54（335.39，1033.81）6841.92（487.76，1035.77）Median（IQR），中位数（四分位间距）42 皖南医学院硕士学位论文讨论IGF-1在调节血管平滑肌细胞的生长、增殖和迁移以及细胞存活方面起着重要作用[9]。IGFBPs通过绑定IGF-1，抑制其与IGF-1R结合，减少IGF-1的活性，同时延长其半衰期来调节IGF-1的生物学功能[12]。此外，IGFBP-1和IGFBP-3还可通过与自身细胞表面分子相互作用，发挥抗增殖和促凋亡作用的独立作用[14-17]。本课题组前期已发现在中国汉族成人中，IGF-1基因位点rs6219与高血压发病风险降低相关，IGF-1R基因位点rs13379905变异可增加高血压的发病风险；且在儿童青少年中rs13379905位点与高血压相关[58]。GWAS的荟萃分析报道IGFBP-1和IGFBP-3基因附近位点rs11977526与非洲人群SBP降低和DBP升高有关[52]。提示IGF-1通路与高血压的遗传易感性密切相关。本研究通过病例对照研究及对健康对照随访来探讨IGFBP-1和IGFBP-3基因多态性与高血压遗传易感性的关系，以助于阐明基因-环境和基因-药物在高血压的发病和治疗中的作用。在本研究中，首次发现在中国人群中，IGFBP-3基因位点rs2132572和rs3110697突变与高血压相关，并且经过平均5.01年的随访后，携带rs2132572TT基因型的个体其高血压的患病风险是携带CC+CT基因型的个体的1.57倍。rs2132572位于IGFBP-3基因的启动子区，而rs3110697位于基因的第三个内含子。研究指出，SNPs在启动子或开放阅读框区域，可能上调或下调基因表达及蛋白质功能[59]，而在内含子区域的SNP可能主要涉及转录、翻译调控和组织特异性表达[60]。功能网站预测，rs2132572和rs3110697位点是转录因子结合位点，可通过结合转录因子来调节相应蛋白水平的表达。以往的研究表明，在多种族人群中rs3110697位点突变与非裔美国人、日裔美国人和拉丁美洲循环中IGFBP-3水平降低有关，与夏威夷和白人未见关联[48]。临床研究发现，rs2132572T等位基因的存在与白人乳腺癌患者循环中IGFBP-3水平减少有关[49]，在英国的一项冠心病的巢式病例对照研究中，未发现rs2132572突变与IGFBP-3水平有关[61]。在本研究中，两个位点突变与IGFBP-3蛋白水平的关联并未得到43 皖南医学院硕士学位论文验证。同时本研究也未发现血清IGFBP-3的水平在高血压组和健康组间存在差异。这些发现提示，rs2132572和rs3110697对高血压风险的影响可能不是直接通过调控IGFBP-3自身的蛋白水平来实现的。有研究指出，rs2132572和rs3110697与未绝经的白人女性的IGF-1水平升高有关[62]。而在良性乳腺疾病中，rs3110697突变与IGF-1水平升高之间的关联也有报道[63]。推测rs2132572和rs3110697变异对高血压的风险的影响有可能涉及影响血清中IGF-1浓度。大量的人群研究提示，循环IGF-1水平变化在高血压的发生发展中发挥了重要的作用[10,11]。IGFBP-3作为循环中IGF-1的主要结合蛋白，其基因多态性对高血压的影响有可能通过影响IGF-1的途径，但是具体机制还不清楚。分层发现，在随访人群中，rs1065780位点突变是男性高血压的危险因素，而rs2132572和rs3110697位点在女性人群中的高血压风险更显著。Framingham心脏研究指出，男性人群的高血压发病率高于女性[64]。大约到60岁出现交叉，女性高血压的发病率高于男性[65]。这些结果提示，性别在位点变异对高血压的影响中存在一定的效应修饰作用。研究曾经指出，不同性别之间的激素水平差异会影响IGFBP-1和IGFBP-3的浓度[66,67]。因此性别作为效应修饰因素，其机制是否与蛋白水平的变化有关还需要进一步验证。而在吸烟分层中，rs2132572和rs3110697在不吸烟人群中增加了高血压的发病风险，在饮酒中，rs1065780在饮酒人群有增加高血压的发病风险的趋势。高血压是一种受多种遗传因素和环境因素的交互影响的复杂疾病。生活方式研究证明，吸烟会明显导致血压升高[68-72]。因此，有必要研究基因与环境交互作用对EH风险的影响。Framingham心脏研究发现新的基因-吸烟的交互作用的血压位点[73]。在中国人群中，有研究报道基因变异与男性吸烟对高血压存在交互作用[74]。吸烟和高血压风险报告已证实，吸烟可导致兴奋中枢神经和交感神经，使心率加快，大量具有收缩血管作用的儿茶酚胺从肾上腺释放，因此机体小血管收缩引起血压升高。尽管吸烟和IGFBP-3基因之间相互作用的详细机制尚不清晰，本研究结果表明，吸烟对IGFBP-3基因多态性与高血压的关联具有修饰效应。虽然饮酒对于血压的危害仍有争议，但是研究证实，大量的酒精摄入会44 皖南医学院硕士学位论文加重高血压[75]并影响冠状动脉疾病与脑卒中的其他风险指标水平[76,77]。Benowitz等[78]的研究指出，酒精与尼古丁对正常人的心率上升具有相加作用，但是尼古丁的升压作用却被酒精拮抗。基因与环境的相互作用在高血压的发病过程中扮演了重要的角色。高血压药物的基因组学研究曾指出高血压患者服用降压药后的效果和副作用存在明显的个体差异。从遗传因素角度来说，其主要涉及到药物靶点、药物运输蛋白、药物代谢酶和其他参与药物代谢的辅酶的基因变异，会改变药物与靶蛋白间的相互作用和药物的代谢及安全性[79]。rs3110697突变基因型的收缩压水平在没有降压药物作用下，比野生型和杂合型的血压水平低1.5mmHg左右；但在服用降压药的患者中，突变基因型的收缩压水平却比野生型和杂合型的血压水平高6mmHg。rs2453839在未服药情况下，其野生型、杂合型和突变型之间收缩压水平差异小于1mmHg，在降压药组中，携带突变基因型患者的血压水平高于野生型患者5.3mmHg。研究表明有rs3110697和rs2453839位点突变的患者其降压效果要低于未突变患者，药物疗效受到位点多态性的影响。因此，根据遗传变异制定个体化用药方案，将有助于血压控制，减少医疗资源的浪费。但是本研究未对降压药物的具体种类作出分析，存在一定的局限性。动物实验证实，通过增加小鼠体内人IGFBP-1的浓度可增加血管内NO的产生，进而降低血压，主要的机制是通过激活PI3K/Akt信号通路来刺激eNOS的磷酸化[20]。说明IGFBP-1是血压调节的重要活性物质。以往的人群研究观察到IGFBP-1水平与高血压风险之间的关系存在不一致的结果。横断面研究发现，IGFBP-1在欧洲男性健康受试者的水平与舒张压呈负相关，在巴基斯坦男性人群中与收缩压和舒张压呈负相关[80]。在欧洲、巴基斯坦和非洲的160例Ⅱ型糖尿病患者的研究中发现，低水平的IGFBP-1会增加高血压的患病风险，并且磷酸化的IGFBP-1与收缩压、舒张压和平均动脉压均呈负相关[41]。但是，在1727例美国成年白种人[81]和331例芬兰老年男性人群中也未发现IGFBP-1与血压水平有关[40]，也未发现与老年高血压相关[32]。在本研究中，高血压患者的IGFBP-1水平明显低于健康对照者，结果与Heald等的结果一致[41][80]，提示血清45 皖南医学院硕士学位论文IGFBP-1与高血压的发生发展密切相关，低水平的IGFBP-1是高血压的危险因素。Framingham心脏研究报道，在3977社区人群中IGFBP-3水平与收缩压呈正相关[33]。Diez等[82]的研究指出，高血压病人中IGF-1/IGFBP-3和IGFBP-1/IGFBP-3的比例较血压正常的人有所增加，提示IGF-1及其结合蛋白有可能参了高血压病理过程。而在非洲人群的随访研究中和欧洲的小样本女性高血压病例对照研究并未发现IGFBP-3水平与高血压之间存在关联[83,84]。在本研究中，观察到IGFBP-3水平在对照组的中位数比高血压组高92.68ng/ml，但是没有达到统计学上的差异。出现此结果的可能解释有：1）由于样本量的限制，使得统计效能不足；2)种族、居民和环境的差异可能导致这些报道的数据存在差异。有研究推测血中IGFBP-3水平在多个流行病学研究存在冲突的结果有可能涉及到IGFBP-3对IGF-1的双重调节效应。IGFBP-3对IGF-1调节的净效应在很大程度上取决于IGFBP蛋白酶活性而不是IGFBP-3自身的水平，特别是在靶组织[85]。IGFBP-3与高血压的关系存在争议，需要进一步的大样本量来验证这一关系。虽然本研究提供了IGFBP-1和IGFBP-3基因与高血压关联的线索，但也存在一定的局限性，主要表现在以下几个方面。首先，未发现IGFBP-3基因多态性与血清IGFBP-3水平之间的关联，部分原因可能是样本量较小，使得统计效能降低。其次，本研究未进行进一步的功能验证，具体机制还有待研究。虽然本研究存在不足，鉴于这是基于大样本人群，并且随访5年以上的前瞻性研究，减少了混杂偏倚，在分析过程中采用分层分析和对可能的混杂因素进行了调整以减少这些因素对结果的影响，使我们的研究结果真实可靠。同时在本次研究中，各位点在对照组中基因型分布均符合HWE平衡，提示因研究对象选择，而导致基因型在对照中分布产生偏倚的可能性较小。46 皖南医学院硕士学位论文结论1.本研究发现IGFBP-3基因rs2132572位点TT基因型和rs3110697位点AA基因型可能与中国汉族人群高血压患病风险增加相关。2.携带IGFBP-1基因rs1874479位点G等位基因会增加吸烟人群的高血压患病风险。携带IGFBP-1基因rs1065780位点G等位基因是男性高血压风险增加的危险因素。携带rs3110697位点G和rs2132572位点T等位基因是女性和不吸烟人群高血压风险增加的危险因素。3.IGFBP-3基因rs3110697和rs24538339位点变异有可能影响高血压患者服用降压药物的疗效。4.血清IGFBP-1降低与高血压密切相关，提示IGFBP-1在高血压的发生发展中发挥了重要的作用，可作为临床间接反映其进展的血清学指标之一。47 皖南医学院硕士学位论文参考文献[1]LimSS,VosT,FlaxmanAD,etal.Acomparativeriskassessmentofburdenofdiseaseandinjuryattributableto67riskfactorsandriskfactorclustersin21regions,1990-2010:asystematicanalysisfortheGlobalBurdenofDiseaseStudy2010[J].Lancet.2012,380(9859):2224-2260.[2]PoulterNR,PrabhakaranD,CaulfieldM.Hypertension[J].Lancet.2015;386:801-812.[3]LewingtonS,LaceyB,ClarkeR,etal.TheBurdenofHypertensionandAssociatedRiskforCardiovascularMortalityinChina[J].JAMAInternMed.2016,176(4):524-532.[4]国家卫生计生委疾病预防控制局.中国居民营养与慢性病状况报告（2015年）.北京：人民卫生出版社.2015.[5]CareyRM,WheltonPK.Prevention,Detection,Evaluation,andManagementofHighBloodPressureinAdults:Synopsisofthe2017AmericanCollegeofCardiology/AmericanHeartAssociationHypertensionGuideline[J].AnnInternMed.2018,168(5):351-358.[6]O'RourkeMF,SafarME,DzauV.TheCardiovascularContinuumextended:agingeffectsontheaortaandmicrovasculature[J].VascMed.2010,15(6):461-468.[7]BlacherJ,LevyBI,MouradJJ,etal.Fromepidemiologicaltransitiontomoderncardiovascularepidemiology:hypertensioninthe21stcentury[J].Lancet.2016,388(10043):530-532.[8]TaniraMO,AlBalushiKA.Geneticvariationsrelatedtohypertension:areview[J].JHumHypertens.2005,19(1):7-19.[9]DelafontaineP,SongYH,LiY.Expression,regulation,andfunctionofIGF-1,IGF-1R,andIGF-1bindingproteinsinbloodvessels[J].ArteriosclerThrombVascBiol.2004,24(3):435-444.[10]SchutteAE,VolpeM,TocciG,etal.Revisitingtherelationshipbetweenbloodpressureandinsulin-likegrowthfactor-1[J].Hypertension.2014,63(5):1070-1077.48 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皖南医学院硕士学位论文综述胰岛素样生长因子结合蛋白1和3与心血管疾病的研究进展方正美综述姚应水审校主要在肝脏中合成的胰岛素样生长因子（Insulinlikegrowthfactor，IGF）是一类多功能的细胞增殖调控因子。IGF-1通过与其受体结合来发挥广泛的生物学作用，包括促细胞增殖和分化、增强新陈代谢活动和通过抗凋亡通路来维持细胞生存[1]。胰岛素样生长因子结合蛋白（IGF-bindingproteins,IGFBPs）是一类IGF-1的载体蛋白，其家族成员主要包括6个与IGF-1有高亲和力及高度保守结构的蛋白（IGFBP-1~6）[2]。IGFBPs分子量大小约为24-45kDa，其家族成员间约有50%的同源性。该蛋白家族能够调控IGF-1的生物利用度，具有调节细胞增殖分化的作用。体内的IGFBPs几乎可完全结合循环中的IGF-1（99%），从而抑制IGF-I与其受体（IGF-1receptor，IGF-1R）的结合，减少IGF-I的生物活性，抑制其功能的发挥[3]，其中IGFBP-3因其具有与IGF-1强大的结合能力而被广泛研究。IGFBP-3-和IGFBP-1的作用方式都可呈现IGF-1依赖和非依赖两种。研究表明二者均有促进血管平滑肌增殖的作用，并在心血管疾病发生发展过程中扮演了重要的角色。1IGFBPs的结构1.1IGFBP-1IGFBP-1是结合蛋白超家族中的第一个成员，其分子量约为30kDa，由234个氨基酸组成，主要在肝脏和肾脏合成分泌，其他组织器官几乎不合成[4]。它包含三个独特的结构域：高度同源且保守的N端和C端，高特异性的中间连接区域，N端含有79个氨基酸，是结合IGF-1的主要区域[5]。C端含有后90个56 皖南医学院硕士学位论文氨基酸，其中221到223位氨基酸为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列，它可以与细胞表面的整合蛋白结合，是IGFBP-1发挥作用的重要结构[6]。在人类IGFBP-1上有三个丝氨酸磷酸化位点，分别是第101位、119位和第169位[7]。已经证实磷酸化的IGFBP-1对IGF-1亲和力比非磷酸化形式的IGFBP-1高出6倍，并有报道指出磷酸化的IGFBP-1能够抑制IGF-1活性而非磷酸化则增强IGF的生物利用度[8]。除此之外，IGFBP-1有很强的刺激血管平滑肌增殖和迁移的功能[9]。1.2IGFBP-3IGFBP-3结合了血循环中75%到90%IGF-1，它是调节IGF-1生物活性最主要的结合蛋白，主要在肝脏生成[10]。IGFBP-3可以与酸敏感亚基（ALS）和IGF形成一个复杂的三元络合物IGF–IGFBP-3。其中，ALS是在肝脏中产生的直接效应生长激素，对该复合物起稳定调节作用，可减少IGF-1向血管外转移，延长其半衰期[11]。IGFBP-3作为一种多功能蛋白，在细胞内外环境中都发挥了重要作用。成熟去糖基化的人IGFBP-3分子量为28.7kDa，由264个氨基酸组成，含3个区：保守的N端、高度特异的中间区域和保守的C端[12]。N端是半胱氨酸富集区域，与其他结合蛋白家族成员存在58%的同源性，由87个氨基酸组成。另外，N端还含有一段GCGCCXXC序列，一个高度保守的含有12个半胱氨酸区（IGFBP-3有18个）。N端是结合IGF的最主要区域，与IGF的高亲和力结合功能有关[13]。中间区域是位于N端和C端之间的区域，含有95个氨基酸，与家族其他结合蛋白只有不到15%的同源性，是蛋白进行翻译后修饰（糖基化和磷酸化）的主要区域，是IGFBP-1～6发挥不同作用的结构基础，并影响其他家族成员与IGF的亲和性[13]。这一区域也是IGFBP-3与其可能的靶细胞表面的受体结合来发挥非依赖的IGF-1功能，同时也含有多个蛋白水解酶的水解位点[14]。C端氨基酸数为82个，与其他结合蛋白家族成员有34%的同源性，含有6个半胱氨酸，是结合IGF-1的另一个主要区域[15]。此区域的第215到232位氨基酸是肝素、其他葡萄糖胺多糖、蛋白多糖、纤维蛋白原、纤维蛋白结合区域57 皖南医学院硕士学位论文[16,17]，其中228到232位氨基酸的区域负责与ALS和转铁蛋白分子区域结合[18]。这些独特的结合其他蛋白分子的功能也揭示了IGFBP-3独立于IGF-1的强大生物学作用。2IGFBPs与心血管疾病的关系2.1IGFBP-1与高血压IGFBP-1水平与高血压的关系尚未有完全统一的报道。一项在欧洲和巴基斯坦男性人群的横断面研究发现，IGFBP-1的水平与舒张压呈负相关，在巴基斯坦男性人群中与收缩压呈负相关[19]。在欧洲、巴基斯坦和非洲的160例二型糖尿病患者的研究中发现，低循环水平的IGFBP-1与高血压密切相关，并且磷酸化的IGFBP-1与收缩压，舒张压和平均动脉压均呈负相关，但是未发现非磷酸化形式的IGFBP-1与高血压有关，表明循环中的IGFBP-1的不同形式有可能发挥不同的生物学效应[20]。瑞典的一项研究指出，在男性人群中，IGFBP-1水平与舒张压呈负相关，女性中却未发现此关联，但是发现其水平与高密度脂蛋白呈正相关[21]。不一致的结果也有报道。欧洲人群的病例对照研究指出，临界舒张压组和血压正常对照组之间IGFBP-1水平无显著差别，不过研究发现IGFBP-1与脂蛋白和体质指数呈负相关，提示IGFBP-1可以作为高血压人群的代谢综合征的标记变量[22]。在1727例美国成年白种人[23]和331例芬兰老年男性人群中也未发现IGFBP-1与血压水平有关[24]。这些不一致流行病学研究证据提示，IGFBP-1在高血压的调节作用可能受到环境因素、不同种族的影响。研究表明IGFBP-1水平的变化有37%归因于遗传因素的影响[21]，但是IGFBP-1基因变异与高血压的关系却少见报道。尽管目前对IGFBP-1与高血压的关系尚无定论，但上述研究结果提示，在高血压遗传易感性关系研究的领域，IGFBP-1是一个令人关注和感兴趣的基因之一。2.2IGFBP-3与高血压近年来，IGFBP-3蛋白水平与血压水平被广泛研究，但二者之间的关系一直存在争议。对参加非洲SABPA(SympatheticactivityandAmbulatoryBlood58 皖南医学院硕士学位论文PressureinAfricans)研究的人群中，抽取具有高血压倾向的148个黑人和200个白人进行横断面研究，结果显示IGFBP-3在黑人中的水平比对照组平均低26nmol/L[25]。SABPA研究还显示动态收缩压和IGF-1/IGFBP-3在黑人之间存在显著的负相关关系（r=−0.37）[26]。Diez等[27]研究报道，与血压正常人群相比，高血压病人中IGF-1/IGFBP-3和IGFBP-1/IGFBP-3所占人数比例增加，提示IGF-1及其结合蛋白有可能参与了高血压病理过程。上述研究表明IGFBP-3的水平下降可能是高血压的危险因素。但多种族前瞻性队列分析-年轻人冠脉危险发生研究（CoronaryArteryRiskDevelopmentinYoungAdults，CARDIA）的结果发现，研究开始第2年的白人男性的收缩压和研究开始第7年的黑人男性舒张压均与IGFBP-3呈正相关关系[28]。而在前瞻性城市农村流行病学（ProspectiveUrbanRuralEpidemiology，PURE）随访研究中和一个欧洲的小样本女性高血压病例对照研究均未发现IGFBP-3水平与高血压之间存在关联[29,30]。上述不一致的结果可能与研究人群的种族差异及研究设计的不同有关，环境因素的影响也不可忽视。IGFBP-3是由IGFBP-3基因编码的一类蛋白。双胞胎研究表明，血液循环中60%的IGFBP-3浓度差异是由于基因造成的[31]。IGFBP-3基因位于人类7号染色体上，长12kbps，含有5个外显子。全基因组关联研究（GenomeWideAssociationStudy，GWAS）指出IGFBP-3基因多态性（singlenucleotidepolymorphisms，SNPs）与IGFBP-3水平有关，并影响了IGF-1的表达水平[32]。IGFBP-3基因多态性影响IGFBP-3的蛋白水平[33-36]。rs2854744，位于IGFBP-3的启动子区，其位点变异与基因启动子区的活性及表达有关[37]。在中国汉族的冠状动脉疾病患者中rs2854744的位点变异与降低患者脑卒中发病风险密切相关[38]。对GWAS荟萃分析发现，在欧洲人群IGFBP-3附近位点rs2949837的变异与平均脉搏血压长期的增加显著相关[39]。另一非洲人群GWAS发现，IGFBP-3附近位点rs11977526变异与收缩压的降低、舒张压的增加和高血压的发病显著相关[40]，并且MEPI-CVD（MedicalEducationPartnershipInitiativeforCardiovascularDisease）调查表明，在东非人群中rs11977526与舒张压升高和高血压发病的关联[41]。Kato等[42]对东亚、欧洲和南亚的32万多种族人群的59 皖南医学院硕士学位论文GWAS研究发现，rs10260816位点与脉搏压显著相关；并且认为DNA甲基化参与了位点变异对高血压作用的调控途径。2.3IGFBP-1和IGFBP-3与动脉粥样硬化冠状动脉斑块的血管平滑肌可表达IGFBP-1。动物实验发现IGFBP-1的过表达有减少动脉粥样硬化的作用[43]。体外实验指出多种炎性因子，如IL-1、IL-6和肿瘤坏死因子（TNF）可刺激IGFBP-1在斑块血管平滑肌细胞（VSMC）的表达，IGFBP-1又可诱导ERK1/2的激活来增加VSMC的增殖[44]。动脉粥样硬化斑块纤维帽中SMC的增殖对维持斑块稳定性起着重要的作用[45]。Wang等在人颈动脉斑块中发现，IGFBP-1mRNA和蛋白的表达量均显著上升，可能是炎症刺激的结果，提示IGFBP-1可能是通过影响SMC增殖来参与斑块稳定性的调控[44]。而Leinonen等人对芬兰239个糖尿病患者进行研究，发现IGFBP-1水平与患者颈动脉的内中膜厚度（carotidintima-mediathickness，cIMT）增加呈负相关[46]，提示IGFBP-1的抗动脉粥样硬化的作用。小鼠实验表明IGF-1可预防动脉粥样硬化，特别是对抗氧化压力和炎症通路的作用，它还可以抑制动脉粥样硬化斑块促炎细胞因子的产生，增加eNOS的表达[47]。但研究也指出中度氧化应激和IGF-1可协同促进VSMC生长，促进动脉粥样硬化，特别是在VSMC迁移和增殖占主导地位的病变形成初期[48]。另一方面，在进展期，IGF-1可以抑制细胞凋亡和增加VSMC防止斑块不稳定和破裂[49]。而IGF-1的这些活动受到IGFBP-3的影响。也有研究指出IGFBP-3可通过特定的受体以及参与NF-KB信号通路来发挥独特的抗炎作用[50]。IGF-1/BP-3在动脉粥样硬化过程中的机制是非常复杂的。Kawachi等[51]对330名日本健康男性研究发现，IGFBP-3浓度与早期劲动脉粥样硬化正相关（r=0.17），提示IGFBP-3在动脉粥样硬化早期的危险作用。但在德国小于70岁的男性人群中，低IGFB-3被认为是冠状动脉粥样硬化病变的一个独立的预测风险因子[52]。英国一项纳入2886人的横断面研究也指出，低IGFBP-3水平和增加的IMT有关[53]。在欧洲310人的横断面研究中，结果提示IGFBP-3浓度与斑块的不稳定性呈正相关关系，可能与IGFBP-3结合IGF-1，使IGF-1活性降低有关[54]。60 皖南医学院硕士学位论文SABPA研究发现cIMT和IGF-1/IGFBP-3在白人之间呈负相关关系（r=−0.38）[26]。而在荷兰老年男性之间和瑞典白人中并未发现IGFBP-3水平与cIMT存在关联[55,56]。现有的研究提示IGFBP-3与动脉粥样硬化之间的关联尚存在争议，可能受到IGF-1系统中其他蛋白的影响，与动脉粥样硬化的不同阶段也存在一定的关系。2.4IGFBP-1和IGFBP-3与缺血性心脏病在Rancho-Bernardo研究中，低水平的IGFBP-1增加了老年人的缺血性心脏病（ischemicheartdisease，IHD）风险，并且最低的20%水平IGFBP-1组中的IHD死亡率是高水平组的3倍[23]。在一项含有75个欧洲人的小样本的IHD病例对照研究中，IHD的患者血清中的磷酸化IGFBP-1和非磷酸化IGFBP-1的水平都明显低于未患有心血管疾病的人群（P<0.01）[57]，提示低浓度的IGFBP-1是IHD的风险预测因子，其机制有可能与其对IGF-1活性的调节有关。在前瞻性的DAN-MONICAI研究中，经过15年的随访发现四分位组最高组IGFBP-3浓度的IHD发病风险是最低组浓度的2.16倍，表明IGFBP-3水平增高有可能是IHD的危险因素[58]。上述研究表明IGFBP-1和IGFBP-3在IHD中发挥了不同甚至是相反的作用，未来更多的机制研究和人群研究还需要开展。2.5IGFBP-1和IGFBP-3与冠心病在中国人群中IGFBP-1的水平与冠状动脉病变的严重程度呈正相关关系[59]。Harrela等人对622名西班牙老年男性约10年的随访结果表明，基线高水平血清的IGFBP-1（＞75%）会显著增加心血管病和冠心病（coronaryheartdisease，CHD）的死亡率[60]。美国妇女健康倡议研究发现IGFBP-1水平的增加是CHD的风险因素，进一步经过随访发现IGFBP-1水平的纵向变化与CHD风险增加有关[61]。土耳其一项病例对照研究发现IGFBP-3在CHD患者中的平均水平（2204.48ng/ml）明显低于健康对照者（8499.50ng/ml）[62]。Akanji等[63]研究了105例CHD患者和97例健康对照，结果提示CHD组与对照组相比，IGFBP-361 皖南医学院硕士学位论文水平显著降低。Kaplan等[64]的前瞻性研究中发现低水平的IGFBP-3与CHD发病存在关联。但是Fischer等[]在95个男性CHD患者研究发现CHD与IGFBP-3水平存在显著的正向关联。与冠状动脉性疾病尚无统一的定论，这可能与研究设计有关，研究疾病所伴发的相关的慢性疾病也有可能影响研究发现，单一的疾病和大样本的人群研究有待开展，以明确IGFBP-1在心血管疾病中的诊断和预后价值。2.6IGFBP-1和IGFBP-3与心肌梗死在SHEEP（Stockholmepidemiologyprogramme）中，研究者未发现IGFBP-1与总人群MI存在关联，在女性中低水平的IGFBP-1（<10的百分位）显示了MI增高的趋势，但是没有达到统计学意义[66]。在绝经妇女的前瞻性的研究中，也未发现IGFBP-3四分位组间存在线性关系，不足的是此研究没有评估其他人口，包括年轻女性[67]。在最近的来自美国4个社区人群的前瞻性研究中，IGFBP-1和IGFBP-3与MI事件均没有统计学关联[68]。但在中国台湾人群中，研究显示与正常人相比，急性心肌梗死（myocardialinfarction，MI）患者血清中IGFBP-1的水平下降，IGFBP-3的水平却上升[69]。Kaplan等[70]对老年白人的前瞻性研究发现在非致死性的MI患者中，中高组的IGFBP-3的水平呈保护性，但是与致死性的MI没有关联，此研究也没有观察到IGFBP-1与MI有关。这些结果提示IGFBP-3的水平与MI的关系，有可能受到疾病的严重程度的影响。值得注意的是，Li等[71]发现急性MI患者在入院第1天有较高的血清IGFBP-3，2-3天水平降低，7-21天水平反弹高于之前的控制水平，提示急性MI患者循环IGFBP-3水平的时间依赖性变化。2.7IGFBP-1和IGFBP-3与动脉瘤动脉瘤通常伴有动脉壁胶原代谢受损，而IGF-1在胶原合成的过程中起着重要的刺激作用，因此主动脉瘤胶原代谢紊乱可能在一定程度上是由于IGF-1稳态失调所致[72]。Panek等[72]研究指出欧洲人群的血清IGFBP-1和IGFBP-3在主动脉瘤患者中的水平显著高于对照人群。Ramos-Mozo等[73]发现在腹主动脉62 皖南医学院硕士学位论文瘤（abdominalaorticaneurysm，AAA）病例中，IGFBP-1的水平显著增高，在扩大样本后验证结果一致；并在另一独立样本发现IGFBP-1血浆水平与AAA严重程度呈正相关，并推测AAA中高IGFBP-1水平可能与AAA中炎性细胞因子增加有关，其中包括肿瘤坏死因子-干扰素[74]。在这方面，大鼠研究曾指出肿瘤坏死因子可以增加IGFBP-1水平与肝和肾中IGFBP-1mRNA表达[75]。在澳大利亚西部70岁以上社区老年男性人群中，高IGF-1和IGF-1/IGFBP-3比例增加与AAA有关，而IGFBP-1与胸主动脉直径和动脉瘤增加独立的相关，提示IGF系统中的组成蛋白可能有助于或成为老年男性主动脉扩张的标志物；IGFBP-1对AAA的影响可能是其参与调整了IGF-1的血小板聚集作用[76]。小结综上所述，IGFBP-1和IGFBP-3在血压的调节中发挥了重要作用。鉴于IGFBP-1蛋白由IGFBP-1基因编码，而其蛋白水平的变化与高血压密切相关，因此开展IGFBP-1基因多态性与高血压易感性的研究是极其必要的。高血压作为可干预的遗传性疾病，加强疾病的遗传学基础研究，有利于阐明其复杂的疾病易感性。同时为改进高血压预防、个体化诊断和治疗、减轻经济和社会负担提供帮助。63 皖南医学院硕士学位论文参考文献[1]DelafontaineP,SongYH,LiY.Expression,regulation,andfunctionofIGF-1,IGF-1R,andIGF-1bindingproteinsinbloodvessels[J].ArteriosclerThrombVascBiol.2004,24(3):435-444.[2]JonesJI,ClemmonsDR.Insulin-likegrowthfactorsandtheirbindingproteins:biologicalactions[J].EndocrRev.1995,16(1):3-34.[3]ClemmonsDR,BusbyWH,AraiT,etal.Roleofinsulin-likegrowthfactorbindingproteinsinthecontrolofIGFactions[J].ProgGrowthFactorRes.1995,6(2-4):357-366.[4]YakarS,LiuJL,FernandezAM,etal.Liver-specificigf-1genedeletionleadstomuscleinsulininsensitivity[J].Diabetes.2001,50(5):1110-1118.[5]SitarT,PopowiczGM,SiwanowiczI,etal.Structuralbasisfortheinhibitionofinsulin-likegrowthfactorsbyinsulin-likegrowthfactor-bindingproteins[J].ProcNatlAcadSciUSA.2006,103(35):13028-13033.[6]SalaA,CapaldiS,CampagnoliM,etal.StructureandpropertiesoftheC-terminaldomainofinsulin-likegrowthfactor-bindingprotein-1isolatedfromhumanamnioticfluid[J].JBiolChem.2005,280(33):29812-29819.[7]JonesJI,BusbyWH,Jr.,WrightG,etal.Identificationofthesitesofphosphorylationininsulin-likegrowthfactorbindingprotein-1.Regulationofitsaffinitybyphosphorylationofserine101[J].JBiolChem.1993,268(2):1125-1131.[8]JonesJI,D'ErcoleAJ,Camacho-HubnerC,etal.Phosphorylationofinsulin-likegrowthfactor(IGF)-bindingprotein1incellcultureandinvivo:effectsonaffinityforIGF-I[J].ProcNatlAcadSciUSA.1991,88(17):7481-7485.[9]Bayes-GenisA,ConoverCA,SchwartzRS.Theinsulin-likegrowthfactoraxis:Areviewofatherosclerosisandrestenosis[J].CircRes.2000,86(2):125-130.[10]JuulA,MainK,BlumWF,etal.Theratiobetweenserumlevelsofinsulin-likegrowthfactor(IGF)-IandtheIGFbindingproteins(IGFBP-1,2and3)decreaseswithageinhealthyadultsandisincreasedinacromegalicpatients[J].ClinEndocrinol(Oxf).1994,41(1):85-93.64 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皖南医学院硕士学位论文[73]Ramos-MozoP,RodriguezC,Pastor-VargasC,etal.PlasmaprofilingbyaproteinarrayapproachidentifiesIGFBP-1asanovelbiomarkerofabdominalaorticaneurysm[J].Atherosclerosis.2012,221(2):544-550.[74]GolledgeALV,WalkerP,NormanPE,etal.Asystematicreviewofstudiesexamininginflammationassociatedcytokinesinhumanabdominalaorticaneurysmsamples[J].DisMarkers.2009,26(4):181-188.[75]LangCH,NystromGJ,FrostRA.Tissue-specificregulationofIGF-IandIGF-bindingproteinsinresponsetoTNFalpha[J].GrowthHormIgfRes.2001,11(4):250-260.[76]YeapBB,ChubbSA,McCaulKA,etal.AssociationsofIGF1anditsbindingproteinswithabdominalaorticaneurysmandaorticdiameterinoldermen[J].EurJEndocrinol.2012,166(2):191-197.71 皖南医学院硕士学位论文作者简介及读研期间主要科研成果姓名方正美性别女出生年月1988年10月民族汉族籍贯皖池州联系方式工作及学习经历2004年9月-2007年6月池州市杏花村中学高中2008年9月-2013年6月皖南医学院护理学系本科2013年7月-2015年8月池州市人民医院工作2015年9月-2018年7月皖南医学院公共卫生学院流行病与医学统计学专业研究生已发表学术论文及其他科研成果一．公开发表的学术论著（1）HuiZhu，LijunZhu，ZhengmeiFang，SongYang，YanchunChen，YuelongJin，XianghaiZhao，ChongShen，YingshuiYao,CommonVariantsatSomatostatinAreSignificantlyAssociatedwithHypertensionIncidenceinSmokingandDrinkingPopulations.JournaloftheAmericanSocietyofHypertension,2018,12(3):230-237.（SCI收录）（2）YingshuiYao,LijunZhu,ZhengmeiFang,etal.Insulin-LikeGrowthFactor-1andReceptorContributeGeneticSusceptibilitytoHypertensioninaHanChinesePopulation.AmericanJournalofHypertension,2018,31(4):420-430.（SCI收录）（3）ZhengmeiFang,SongYang,LijunZhu,etal.AssociationstudyofIGFBP1andIGFBP3polymorphismswithhypertensionandcardio-cerebralvasculardiseasesinaChineseHanpopulation.Oncotarget,2017,8(44):77836-77845.（SCI收录）（4）YingshuiYao,ZhengmeiFang,SongYang,etal.EvaluationofgeneticeffectofNOS3andG_EinteractiononthevariabilityofserumbilirubininaHanChinesepopulation.NitricOxide,2017,70:25-30.（SCI收录，导师第一作者）72 皖南医学院硕士学位论文（5）SongYang,YanpingZhao,YuanruiTian,YanchunChen,XianghaiZhao,YingLi,HailongZhao,XiaotianChen,LijunZhu,ZhengmeiFang,YingShuiYao,ZhibingHu,ChongShen.CommonvariantsofROCKsandtheriskofhypertension,andstroke:Twocase-controlstudiesandafollow-upstudyinChineseHanpopulation.BBA-MolecularBasisofDisease,2017,1864(3):778-783.（SCI收录）（6）方正美,姚应水.原发性高血压与胰岛素样生长因子1关系的研究进展.中国临床药理学.2016,32（15）:1437-1440.二．参与课题情况1.国家自然基金面上项目，81673266，环状RNA参与高血压及其并发缺血性脑卒中机制的分子流行病学研究，2017/01-2020/12，项目参与者。三．参加学术会议/培训班1.2017年12月参加安徽医科大学举办的“安徽省2017年度流行病与卫生统计学学术年会”。2.2017年8月参加中华医学会与国家心血管病中心主办的“中国心脏大会（CHC）”。3.2016年9月参加南京医科大学举办的“金陵转化医学国际研讨会”。四．研究生期间获奖情况1.2015-2016学年皖南医学院一等学业奖学金2.2015-2016学年皖南医学院“三好学生”荣誉称号3.2014-2015学年皖南医学院一等学业奖学金73 皖南医学院硕士学位论文致谢惊风飘白日，光景西驰流，三年的研究生求学时光已接近尾声。回忆过去，曾经发生的点点滴滴还历历在目，仿佛昨日，感动和离愁萦绕在心头。在此，我由衷的感谢对我最重要的两位老师，我的导师姚应水教授和南京医科大学公共卫生学院沈冲副教授，从我的论文选题、实验的顺利开展完成、到最后论文撰写，三年来，每个小小的进步都离不开老师的谆谆教诲和无微不至的关怀，在研究生阶段我的每一次进步都凝结着老师的心血和汗水。在本科阶段第一次听姚老师的统计课，我就深深被老师的课堂魅力所吸引，完美的板书、风趣的谈吐、专业的讲解，从此姚老师便是我努力的方向。离开工作岗位再次回到母校能报考姚老师的研究生是我莫大的荣幸，成为姚老师课题组的成员更是幸运。由于本科的非专业学习，使我在研究生期间需要学习更多的知识，老师总能指出我学习的不足和方向。学习期间，老师对我高标准、严要求，学业上精心指导、倾囊相授，并且督促我不断提升自我学习的能力。老师教会我的不仅是做学问的态度，更重要的是为人处事的道理。姚老师时常强调要有团队精神，要懂得尊师重教，同学之间相互帮助、共同进步。姚老师于我，不仅是学业上的导师，也是人生中重要的引路人。沈老师治学严谨、知识渊博、谦虚平和，与他的每一次交流都让我受益匪浅，同时沈老师对学术研究的热情与执着让我无限仰慕。在论文修改过程中，从初稿，到修回，再到发表，每一次沈老师倾注了大量心血，经常修改至深夜。两年来沈老师言传身教，是老师的严谨与勤奋鼓舞和激励着我们不断进步。沈老师时常强调我们要学会培养科研思维，遇到问题从不绕道，每走一步我们要看十步，绝不拘泥于眼前。这两年在沈老师课题组我学会了实验技术，提高了文献阅读与检索能力，提升了数据分析处理的技巧，更加系统地学习了流行病与卫生统计相关知识，最重要的是培养了严谨的科研思维和端正的学术态度。其次，还要感谢给与我帮助与关怀的课题组的小伙伴们，他们陪我度过了快乐的、充实的研究生生活，让我收获知识的同时也收获到最珍贵的友谊。感74 皖南医学院硕士学位论文谢给与我帮助与关怀的师兄师姐们。特别感谢郭道遐、王林红、朱丽君、张婷师姐们在生活上对我关怀备至，在实验技术学习上对我耐心指导。感谢贺连平、聂中华、文进博、梁伟师兄们在我遇到困难时的无私帮助，指导我论文的写作和统计软件的应用。感谢我的同门张晓宇和陈逍天，在三年的时光里我们共同学习、一起探讨问题、共同进步。感谢给与我理解与支持的师弟师妹们，感谢朱汇、樊垚、刘春兰、田元睿、李梦夏师妹，感谢你们陪我度过实验室的美好时光，感谢郎俊杰、金来润、刘凌师弟，感谢你们给我带来阳光灿烂般的春天气息。感谢大家大家让我的生活变得丰富多彩！感谢检验学院的文育锋老师，公共卫生学院的金岳龙老师、袁慧老师、黄月娥老师和陈燕老师在学习上给予辅导和帮助！最需要感谢是我的家人。我的父母，感谢你们在任何时候都无条件支持我的决定，给予最大的鼓励，在我迷茫和无助的时候，只要想到你们，我就会充满信心。还有我的哥哥，谢谢你在父母身边的陪伴，让我可以自由的学习。最后，我还要向在百忙之中评阅论文和参加答辩的各位专家、教授致以真诚的谢意!75