《鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
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博士学位论文鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究作者姓名：孙园园指导教师：孙黎研究员中国科学院海洋研究所学位类别：理学博士学科专业：海洋生物学研究所：中国科学院海洋研究所2017年6月 AstudyonthepathogenicmechanismofPseudomonasfluorescensandtheeffectofhostanti-bacterialimmunefactorsADissertationSubmittedtoUniversityofChineseAcademyofSciencesInpartialfulfillmentoftherequirementForthedegreeofDoctorofPhilosophyByYuan-yuanSunDissertationSupervisor:ProfessorLiSunInstituteofOceanology,ChineseAcademyofSciencesJune2017 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是在导师指导下进行的研宄工作及取得的。研究成果除文中己经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。丨论文作者签名：日期：＞％＠Ｔ学位论文版权使用授权书本人完全了解中国科学院海洋研宄所有关保留、使用学位论文的规定，同意海洋研宄所保留并向国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅。本人授权中国科学院海洋研宄所可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存、汇编本学位论文。（保密论文在解密后适用本授权书）论文作者签字：日期：？料 摘要海水养殖鱼类经常被病原微生物所感染，导致产量下降，给水产养殖业带来巨大的经济损失。目前鱼类病害防治仍没有有效的措施，原因之一是病原的致病机制和宿主的免疫防御机制尚未完全阐明。本文从病原和宿主免疫两方面入手，研究了鱼类常见病原菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)的致病机制和鱼类宿主半滑舌鳎(Cynoglossussemilaevis)免疫因子(杀菌/通透性增强蛋白BPI和B型甘露糖结合凝集素BML)的抗细菌感染功能。本文通过蛋白质组学技术，首先比较了在正常和缺铁培养环境中荧光假单胞菌TSS全菌蛋白的差异表达情况。在蛋白表达谱中发现了22个具有显著性差异表达的蛋白，通过查阅文献和结构分析，选取了其中四个，即HemO(血红素加氧酶)、PspB(丝氨酸蛋白酶)、Sod(超氧化物歧化酶)和TfeR(TonB依赖型外膜受体)，分别构建了基因突变株，即TSShemO、TSSpspB、TSSsod和TSStfeR并进行了功能研究。实验表明，与野生株TSS相比，TSShemO、TSSpspB和TSStfeR在组织侵染、致死率和抗宿主血清杀伤等方面的能力都显著降低，表明pspB、hemO和tfeR是参与感染的毒力基因；对宿主的免疫保护实验结果显示，当重组的TfeR和PspB以亚单位疫苗的形式免疫鱼类宿主后，宿主对于TSS的侵染产生了显著的免疫保护效应；抗体阻断实验表明，抗TfeR的抗体抑制了荧光假单胞菌TSS对宿主细胞的侵染。这些结果表明，环境中铁的含量会影响荧光假单胞菌大量蛋白的表达发生变化，其中包括一些重要的毒力因子。利用蛋白质组学技术，比较了在正常和缺铁培养条件下荧光假单胞菌TSS外分泌蛋白的差异表达情况。在外分泌蛋白表达谱中，发现了15个具有显著性差异表达的蛋白，选取了一个差异蛋白——丝状血凝素(FHA)，构建了编码该蛋白的基因突变株TSSfha，比较分析了突变株与野生株在毒力及生理方面的差异。体外实验表明，相较于野生株TSS，突变株（1）生长速度基本没有改变，但生物膜的形成能力和产生胞外丝状物的能力显著下降；（2）鞭毛受到破坏，运动性下降；（3）粘附宿主细胞的能力和自凝集能力显著下降；（4）凝血能力和抗宿主血清杀伤的能力显著下降。体内感染实验表明，突变株感染宿主组织的能力显著I 降低，对宿主的致死率下降；抗体阻断天然FHA后，野生株TSS感染能力降低。此外，免疫保护实验表明，重组FHA免疫大菱鲆后可以显著提高大菱鲆抵抗TSS侵染的能力。这些结果表明了荧光假单胞菌FHA是一个关键的毒力因子，并且在与致病相关的生理过程中发挥重要作用。以荧光假单胞菌的鱼类宿主半滑舌鳎为研究对象，探究了其两个免疫因子在抵抗荧光假单胞菌侵染过程中所发挥的作用。杀菌/通透性增加蛋白(BPI)是先天免疫中一个重要分子，在哺乳动物中可以清除入侵的革兰氏阴性菌。在硬骨鱼中，BPI的功能还未可知。因此，在本论文中，我们研究了半滑舌鳎BPI(CsBPI)在抵抗荧光假单胞菌等病原感染方面所发挥的生物学功能。蛋白定位结果表明，CsBPI可以被半滑舌鳎外周血白细胞分泌到细胞外环境中。重组CsBPI（rCsBPI）能够结合荧光假单胞菌等革兰氏阴性菌，且对荧光假单胞菌的结合力最强，但不能结合革兰氏阳性菌；rCsBPI通过与荧光假单胞菌的结合，进而增强其细胞膜的通透性，破坏其结构最终导致细菌死亡，并且与rCsBPI结合的荧光假单胞菌更容易被外周血白细胞吞噬。体内实验表明，rCsBPI上调一系列参与抗菌和抗病毒的免疫基因的表达，并且能够增强半滑舌鳎抗荧光假单胞菌以及抗病毒感染的能力。这些结果首次表明，硬骨鱼类的BPI具有显著的免疫调节及抗菌和抗病毒功能。凝集素是一类糖结合蛋白，在先天免疫系统中发挥重要作用。本研究分析了半滑舌鳎三个B型甘露糖结合凝集素(CsBML1、CsBML2和CsBML3)在抗荧光假单胞菌等细菌感染中的功能。分析发现，这三个凝集素均具有三个保守的甘露糖结合基序QXDXNXVXY，在肝脏中表达量最高，细菌感染之后表达均上调。CsBML1、CsBML2和CsBML3的重组蛋白（分别命名为rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3）以剂量依赖的方式结合荧光假单胞菌等多种鱼类病原菌，但对于不同细菌具有不同结合力。进一步研究发现这三个凝集素均具有甘露糖结合特异性和钙离子依赖性，但三者对细菌的凝集能力有所差异。体外实验表明rCsBML1和rCsBML2可以杀死细菌，体内实验表明rCsBML1和rCsBML2能抑制细菌对宿主组织的侵染，但rCsBML3无此功能。这些结果表明，在硬骨鱼类中，B型甘露糖结合凝集素对于抵抗病原菌侵染发挥着重要作用，并且此家族的不同成员在抗菌方面可能扮演着不同的角色。II 关键词：荧光假单胞菌，毒力因子，疫苗，半滑舌鳎，抗感染III ABSTRACTMariculturefishareofteninfectedbypathogenicmicroorganisms,resultinginreducedyieldsandeconomiclosses.However,thereisnoeffectivemeasuresatpresent.Oneofthereasonsisthatthepathogenicmechanismofpathogenandtheimmunedefensemechanismofthehostarenotelucidatedclearly.Inthisstudy,wehaveinvestigatedthepathogenicmechanismofPseudomonasfluorescens,whichisacommonpathogenoffish.Atthesametime,wehavestudiedtheanti-bacterialfunctionoftheimmunefactors(bactericidal/permeabilityincreasingproteinandB-typemannose-specificlectins)inafishhosthalf-smoothtonguesole(Cynoglossussemilaevis).Inthisstudy,weperformedproteomicanalysisfirstlytocomparetheglobalproteinprofilesofP.fluorescensstrainTSSculturedunderiron-repleteandiron-depleteconditions.Twentytwodifferentiallyexpressedproteinswereidentifiedofglobalproteins.Thegenesencodingfourofthe22proteins,i.e.HemO(hemeoxygenase),PspB(serineprotease),Sod(superoxidedismutase),andTfeR(TonB-dependentoutermembraneferricenterobactinreceptor),wereknockedout,andthepathogenicityofthemutantswasexamined.Theresultsshowedthatcomparedtothewildtype,thehemO,pspB,andtfeRknockoutsweresignificantlyimpairedintheabilitytosurviveinhostserum,toinvadehosttissues,andtocausehostmortality.ImmunizationofturbotwithrecombinantTfeRandPspB(rTfeRandrPspB)inducedproductionofspecificserumantibodiesandsignificantprotectionsagainstlethalTSSchallenge.FurtheranalysisshowedthatrTfeRantibodiesrecognizedandboundtoTSS,andthattreatmentofTSSwithrTfeRantibodiessignificantlyimpairedtheinfectivityofTSStofishcells.Takentogether,theseresultsindicateforthefirsttimethatinpathogenicP.fluorescens,ironaffectstheexpressionofalargenumberofproteinsincludingthosethatareinvolvedinhostinfection.ThenwecomparedthesecretedproteinprofilesofTSSculturedunderiron-repleteIV andiron-depleteconditionsbyproteomicanalysis.Fifteendifferentiallyexpressedproteinswereidentified.Inthisstudy,weidentifiedfilamentoushemagglutinin(FHA)asaniron-responsiveproteinsecretedbyTSS,furthermore,thefhamutantTSSfhawasconstructed.Invitrostudy,comparedtothewildtype,thefhamutant(i)exhibitedalargelysimilarvegetativegrowthprofilebutsignificantlyretardedintheabilityofbiofilmgrowthandproducingextracellularmatrix,(ii)displayednoapparentflagellaandmotility,(iii)wasdefectiveintheattachmenttohostcellsandunabletoformself-aggregation,(iv)displayedmarkedlyreducedcapacityofhemagglutinationandsurvivinginhostserum.Invivoinfectionanalysisrevealedthatmutantwassignificantlyattenuatedintheabilityofdisseminationinfishtissuesandinducinghostmortality,andthatantibodyblockingofthenaturalFHAproducedbythewildtypeTSSimpairedtheinfectivityofthepathogen.Furthermore,whenintroducedintoturbotasasubunitvaccine,recombinantFHAelicitedasignificantprotectionagainstlethalTSSchallenge.Takentogether,theseresultsindicateforthefirsttimethatP.fluorescensFHAisakeyvirulencefactoressentialtomultiplebiologicalprocessesassociatedwithpathogenicity.WeinvestigatedtheroleoftwoantibacterialfactorsoftonguesoleintheprocessofresistancingtoTSS.Bactericidal/permeability-increasingprotein(BPI)isanimportantfactorofinnateimmunitythatinmammalsisknowntotakepartintheclearanceofinvadingGram-negativebacteria.Inteleost,thefunctionofBPIisunknown.Inthepresentwork,westudiedthefunctioninresistancingtoTSSoftonguesoleBPI,CsBPI.WefoundthatCsBPIwasproducedextracellularlybyperipheralbloodleukocytes(PBL).RecombinantCsBPI(rCsBPI)wasabletobindtoanumberofGram-negativebacteriabutnotGram-positivebacteria.BindingtoTSSledtobacterialdeaththroughmembranepermeabilizationandstructuraldestruction,andtheboundTSSweremorereadilytakenupbyPBL.Invivo,rCsBPIaugmentedtheexpressionofawidearrangeofgenesinvolvedinantibacterialandantiviralimmunity.Furthermore,rCsBPIenhancedtheresistanceoftonguesoleagainstTSSaswellasviralinfection.TheseresultsindicateforthefirsttimethatateleostBPIpossessesimmunoregulatoryeffectandplaysasignificantroleinantibacterialandantiviralV defense.Lectinsareagroupofsugar-bindingproteinsthatareimportantfactorsoftheinnateimmunesystem.Inthisstudy,weexamined,inacomparativemanner,theexpressionandfunctionofthreeBulb-type(B-type)mannose-specificlectins(namedCsBML1,CsBML2,andCsBML3)fromtonguesole.AllthreelectinspossessthreerepeatsoftheconservedmannosebindingmotifQXDXNXVXY.ExpressionofCsBML1,CsBML2,andCsBML3wasmostabundantinliverandupregulatedbybacterialinfection.Recombinant(r)CsBML1,CsBML2,andCsBML3boundtoawidearrangeofbacteriaincludingTSSinadose-dependentmannerandwithdifferentaffinities.Allthreelectinsdisplayedmannose-specificandcalcium-dependentagglutinatingcapacitiesbutdifferedinagglutinatingprofiles.rCsBML1andrCsBML2,butnotrCsBML3,killedtargetbacteriainvitroandinhibitedbacterialdisseminationinfishtissuesinvivo.Theseresultsindicateforthefirsttimethatinteleost,differentmembersofB-typemannose-specificlectinslikelyplaydifferentrolesinantibacterialimmunity.KeyWords:Pseudomonasfluorescens,VirulenceFactor,Vaccine,Cynoglossussemilaevis,Anti-infectionVI 目录摘要..........................................................................................................................IABSTRACT.............................................................................................................IV第一章绪论..............................................................................................................11.1荧光假单胞菌..................................................................................................11.1.1荧光假单胞菌的生物学特征................................................................11.1.2荧光假单胞菌与疾病............................................................................11.1.3荧光假单胞菌研究现状........................................................................21.2细菌毒力因子..................................................................................................21.2.1细菌的铁吸收利用................................................................................21.2.2丝氨酸蛋白酶........................................................................................41.2.3血红素加氧酶........................................................................................61.2.4TonB依赖型外膜受体.........................................................................111.2.5丝状血凝素..........................................................................................121.3杀菌/通透性增加蛋白BPI...........................................................................161.3.1鱼类天然免疫及研究现状..................................................................161.3.2BPI的结构...........................................................................................171.3.3BPI的功能...........................................................................................181.3.4BPI与疾病...........................................................................................191.3.5鱼类BPI研究现状.............................................................................201.4凝集素............................................................................................................201.4.1凝集素的分布与结构..........................................................................201.4.2凝集素的分类......................................................................................201.4.3凝集素的功能......................................................................................211.4.4鱼类凝集素研究现状..........................................................................221.5本论文研究的目的及意义............................................................................23第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功I 能研究........................................................................................................................252.1材料、方法及仪器设备................................................................................252.1.1伦理规范..............................................................................................252.1.2实验材料及仪器设备..........................................................................252.1.3细菌全蛋白样品制备..........................................................................272.1.4双向电泳..............................................................................................282.1.5实时荧光定量PCR分析....................................................................282.1.6敲除株TSShemO、TSSΔpspB、TSSΔsod和TSSΔtfeR的构建..282.1.7生长曲线测定......................................................................................332.1.8细菌抗宿主血清杀菌能力测定..........................................................332.1.9细菌组织侵染能力检测......................................................................342.1.10细菌对宿主致死率的测定................................................................342.1.11重组蛋白原核表达纯化....................................................................342.1.12疫苗保护效应....................................................................................352.1.13ELISA检测血清效价........................................................................362.1.14rTfeR多克隆抗体制备......................................................................362.1.15荧光显微实验....................................................................................362.1.16抗体封闭细菌粘附细胞实验............................................................362.2实验结果........................................................................................................372.2.1蛋白质组学分析鉴定铁胁迫下TSS全蛋白表达变化.....................372.2.2mRNA水平验证基因差异表达..........................................................422.2.3分析并突变编码四种差异表达蛋白的基因......................................432.2.4TSSΔhemO、TSSΔpspB、TSSΔsod和TSSΔtfeR的生物学功能....432.2.5重组蛋白rTfeR和rPspB作为疫苗的潜力......................................472.2.6rTfeR抗体与TSS的相互作用...........................................................482.2.7抗rTfeR的血清对细菌感染的影响..................................................492.3讨论................................................................................................................49第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究...................................................................................................................523.1材料、方法及仪器设备................................................................................52II 3.1.1实验材料及仪器设备..........................................................................523.1.2制备荧光假单胞菌胞外蛋白..............................................................523.1.3双向电泳、质谱分析鉴定..................................................................523.1.4构建突变株TSSfha.............................................................................523.1.5细菌粘附FG细胞能力的检测..........................................................533.1.6细菌自凝集效应和胞外基质的产生..................................................533.1.7细菌运动性能力检测..........................................................................533.1.8细菌鞭毛检测......................................................................................543.1.9细菌生物膜形成能力检测..................................................................543.1.10细菌凝血实验....................................................................................543.1.11抗宿主血清杀菌功能........................................................................543.1.12组织侵染和对宿主致死率分析........................................................543.1.13蛋白原核表达纯化及抗体制备........................................................553.1.14免疫荧光显微观察TSS表面PfFha..................................................553.1.15免疫荧光显微观察rFha与FG细胞之间的作用...........................553.1.16抗体血清封闭TSS侵染宿主实验...................................................553.1.17疫苗保护效应....................................................................................563.2实验结果........................................................................................................563.2.1双向电泳分析......................................................................................563.2.2mRNA水平验证基因差异表达..........................................................603.2.3分析鉴定PfFha.....................................................................................613.2.4细菌运动性、鞭毛形成和自凝集效应..............................................613.2.5生长曲线、生物膜和细胞外基质产生..............................................623.2.6免疫荧光和粘附宿主细胞实验..........................................................643.2.7PfFha结合宿主细胞..............................................................................663.2.8凝集血细胞和在宿主血清中存活能力..............................................673.2.9突变株的体内实验..............................................................................683.2.10rFha的免疫保护效应........................................................................703.3讨论................................................................................................................70第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究..................734.1材料、方法及仪器设备................................................................................73III 4.1.1实验材料及仪器..................................................................................734.1.2序列分析..............................................................................................734.1.3组织分布特异性..................................................................................734.1.4基因在病原刺激后的组织中表达......................................................744.1.5蛋白原核表达纯化..............................................................................744.1.6抗体制备..............................................................................................744.1.7提取舌鳎外周血白细胞......................................................................744.1.8CsBPI细胞定位...................................................................................754.1.9蛋白结合细菌实验..............................................................................754.1.10蛋白杀菌实验....................................................................................754.1.11rCsBPI破坏荧光假单胞菌TSS膜完整性.......................................764.1.12rCsBPI促进PBL吞噬荧光假单胞菌TSS.......................................764.1.13rCsBPI调节半滑舌鳎体内免疫基因表达........................................764.1.14rCsBPI促进鱼体抵抗微生物侵染....................................................764.2实验结果........................................................................................................774.2.1CsBPI的序列特征...............................................................................774.2.2CsBPI在鱼组织中的表达模式...........................................................774.2.3检测PBL中CsBPI的产生................................................................804.2.4rCsBPI与病原菌的相互作用..............................................................824.2.5rCsBPI的杀菌活性..............................................................................834.2.6rCsBPI改变细菌膜结构完整性..........................................................844.2.7rCsBPI促进PBL对TSS的吞噬........................................................854.2.8rCsBPI调节鱼体内免疫基因的表达..................................................864.2.9rCsBPI促进鱼体抵抗微生物感染......................................................874.3讨论................................................................................................................88第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖特异性凝集素抗菌功能研究.........905.1材料、方法及仪器设备................................................................................905.1.1实验材料及仪器..................................................................................905.1.2序列分析..............................................................................................905.1.3组织分布特异性..................................................................................905.1.4基因在病原刺激后的组织中表达......................................................90IV 5.1.5蛋白原核表达纯化..............................................................................905.1.6蛋白结合细菌实验..............................................................................915.1.7蛋白凝集细菌实验..............................................................................925.1.8蛋白杀菌实验......................................................................................925.1.9蛋白促进鱼体内抵抗细菌侵染..........................................................935.2实验结果........................................................................................................935.2.1序列分析..............................................................................................935.2.2基因在舌鳎组织中的表达模式..........................................................945.2.3蛋白与细菌的结合..............................................................................965.2.4蛋白凝集细菌的能力..........................................................................985.2.5蛋白杀菌活性....................................................................................1005.2.6蛋白对舌鳎抗细菌感染作用............................................................1005.3讨论..............................................................................................................102第六章结论与展望............................................................................................1056.1结论..............................................................................................................1056.2创新点..........................................................................................................1066.3展望..............................................................................................................106参考文献.................................................................................................................107致谢........................................................................................................................130作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果........................131V 第一章绪论第一章绪论1.1荧光假单胞菌1.1.1荧光假单胞菌的生物学特征假单胞菌属（Pseudomonas）是生态系统中广泛分布的一类革兰氏阴性细菌，包含140余个种类，大多是腐生细菌，还有一部分是机会致病菌。荧光假单胞菌（Pseudomonasfluorescens）属于好氧或兼性厌氧的革兰氏阴性细菌，不产芽孢。菌体呈杆状且两端钝圆，部分菌体呈现微微弯曲状，大小为0.5-1.0μm×l.5-5.0μm。荧光假单胞菌有单根或数根极生鞭毛，绝大多数有运动能力，但也有极少数不能运动，还有一些在菌体周边生有短的侧毛。荧光假单胞菌生长温度范围为4–40℃，最适生长温度为25–30℃。化能营养异养，不需要有机生长因子。在固体Luria-Bertani（LB）培养基上生长良好，在酸性条件下几乎不能生长。菌落表面呈现出半透明光滑湿润、边缘整齐的状态，颜色为浅黄绿色或灰白色。在LB液体培养基中生长快速，呈均匀浑浊状态，颜色为黄绿色，液面易形成一层生物膜。荧光假单胞菌最大的特点是在缺铁的生长环境中，能产生荧光色素来获取外界环境中的铁(BuchananandGibbons,1984)。1.1.2荧光假单胞菌与疾病荧光假单胞菌中既有腐生菌也有致病菌。在临床上，荧光假单胞菌最主要的危害是污染血液及血制品。荧光假单胞菌对健康的正常人不具有致病性，但一旦进入人体血液，会引发败血症、感染性休克以及血管内凝血，给人类健康带来严重危害(Gershmanetal.,2008)。在植物体中，荧光假单胞菌可以与一些病虫协同作用，从而加重对植物体的危害，如松材线虫在结合致病性荧光假单胞菌时，能够加重黑松的致病率(池树友等,2008)。在水产养殖业中，荧光假单胞菌是一类常见的水生生物条件致病菌，对鱼虾的危害尤其严重(Swainetal.,2007)。荧光假单胞菌一旦进入对虾幼体，会在幼体体内大量繁殖，使虾苗减少食量或不摄食，加剧虾苗死亡。大鲵感染荧光假单胞菌时，出现全身肿胀，布满红斑，鳞片脱落，引发赤皮病(王高学等,1999)。在中国常见的水产养殖鱼类中，包括草鱼、鲤鱼和大菱鲆等，都有荧光假单胞菌引起赤皮病的报道(Wangetal.,2009a)。在捕捞运1 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究输的过程中，鱼类表皮如果受到损伤，给予荧光假单胞菌可乘之机，更易引发此病，给水产养殖业带来巨大损失。1.1.3荧光假单胞菌研究现状虽然目前对于荧光假单胞菌引发的水产病害已经引起重视，但关于荧光假单胞菌致病机制的研究仍十分有限。有报道表明，荧光假单胞菌胞外蛋白酶AprX，是参与细菌毒力发挥的重要蛋白，Ca2+和Zn2+能增强其活性，而加入Co2+则减弱其活性(Zhangetal.,2009)；荧光假单胞菌pfa1的突变可以显著减弱细菌毒力，并影响该菌的生物膜形成、与宿主细胞的相互作用以及在宿主血液中的传播(Huetal.,2009)；荧光假单胞菌TonB依赖型外膜受体P698与细菌侵染宿主组织的能力有关，并且重组蛋白作为亚单位疫苗，对大菱鲆有一定的免疫保护效应(Zhangetal.,2014b)；铁吸收调节蛋白Fur对荧光假单胞菌的致病性至关重要，可以调节该菌大量蛋白表达发生变化，并且oprF和clpP基因在抗宿主血清杀伤、侵染宿主组织和导致宿主死亡等过程中发挥重要作用，重组OprF作为亚单位疫苗免疫大菱鲆，可产生特异性血清抗体，并对荧光假单胞菌感染具有显著的免疫保护作用(Liuetal.,2015)。但是这些蛋白在感染宿主过程中的作用尚未完全明了，目前对荧光假单胞菌所引起的水产病害仍没有一种切实有效的防治手段。1.2细菌毒力因子1.2.1细菌的铁吸收利用铁是大多数生物体的必需营养素，因为它是许多参与基础代谢通路的酶的辅因子。虽然铁是地球上最常见的元素，但由于其在有氧条件下溶解度很低，因此很难被生物体所利用(LitwinandCalderwood,1993)。在脊椎动物中，铁可以被铁结合蛋白，如转铁蛋白，乳铁蛋白和铁蛋白所螯合，因此对于外界入侵的微生物，脊椎动物体内能够利用的可溶性铁数量极其稀少(BraunandHantke,2011)。对于病原菌，克服宿主体内铁的限制是细菌感染宿主以及在宿主体内存活最基本的毒力机制。另一方面，由于铁能产生对细胞有害的高活性氧，因此对铁的摄取利用必须进行十分严格的调控，因此获取外界铁的蛋白仅在缺铁条件下表达。之前的报道显示，对于已经充分研究的病原菌，如大肠杆菌和铜绿假单胞菌，许多参与铁调节的基因同样是与细菌感染相关的毒力因子(SchaibleandKaufmann,2004)。2 第一章绪论兵来将挡水来土掩，病原菌通过其细胞感应和对特异的铁摄取系统表达的调节，进化出了多种机制来获取铁，比如铁载体和血红素摄取系统（图1.1）。铁载体(Siderophores)来自希腊语“ironcarriers”，是对铁离子特异性螯合的，由细菌和真菌在低铁生长环境下所释放出的分子量相对较小的一类分子。铁载体可以被释放到环境中，以其高亲和力结合环境中的铁并通过特异性外膜受体转运到细菌的细胞质内(Guerinot,1994)，这对于微生物的生存来说是非常必要的。铜绿假单胞菌能够产生两种铁载体，pyoverdine和pyochelin，同时还利用大量异鼠李素用于外界铁摄取(CornelisandBodilis,2009)，异鼠李素也被看作铁载体的另一种存在形式。所有荧光假单胞菌类都可以产生结构相关的pyoverdine，由于它们对铁的高亲和力，pyoverdines被认为是这些细菌最主要的铁载体。相比之下，pyochelin对铁的亲和力相对较低，因此被称为二级假单胞菌铁载体，这一类分子除了作为铁载体，还经常参与其他生物学功能(Cornelis,2010)。铁载体还与致病微生物的毒力机制有关。此外，铁载体还有临床应用价值，并且在农业方面发挥很重要的作用。图1.1微生物铁运输途径。（Lietal.,2014）Figure1.1PathwaysofFetransportinmicroorganism.病原菌表面的特异性受体可以结合含有血红素的蛋白。在革兰氏阴性菌中，血红素通过依赖于TonB/ExbB/ExbD复合物的特异性受体转运过外膜(WandersmanandDelepelaire,2004)。随后依赖ABC通透酶的周质结合蛋白携带3 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究配体进行主动转运。在革兰氏阳性菌中，底物在膜中被脂蛋白识别和固定，然后转移到类似于革兰氏阴性菌的细胞质膜系统的ABC通透酶中。然而血红素摄取系统并不能够在缺铁环境中被无限制地诱导，并且血红素也不是自然状态下可被利用的铁源。1.2.2丝氨酸蛋白酶丝氨酸蛋白酶是一种肽键内切酶，功能是切割肽链。其活性位点中的丝氨酸残基可以通过蛋白质水解来调节其它功能(Gasteigeretal.,2003)，如蛋白质代谢、消化、凝血、凋亡、发育和受精等(GoharaandDiCera,2011；DiCera,2009)。虽然丝氨酸蛋白酶的作用非常复杂，但是水解第一步都是分解蛋白酶活化受体，以及分解上皮、血管、神经和免疫细胞上的G蛋白偶联受体(Sohetal.,2010)。由此可见丝氨酸蛋白酶的功能至关重要，并且存在于自然界从病毒到人类所有的生物体内。丝氨酸是一种极性氨基酸，由6个密码子编码（UCU、UCC、UCA、UCG、AGU和AGC），是所有氨基酸中拥有最多密码子数的一类(Rota-Stabellietal.,2013)。富含丝氨酸的食物包括肉、乳制品、坚果、面筋、芝麻籽和大豆，这些食物都与过敏相关。人体可以合成它，并且可以在维生素B的帮助下由甘氨酸羟甲基化形成，并反过来转化为半胱氨酸/甲硫氨酸(Tammenetal.,2013)。l型和d型丝氨酸均存在于人体内，l型在脑星形胶质细胞中合成，通过丝氨酸消旋酶又可以转化为d型(Ehmsenetal.,2013)。丝氨酸非常容易结合，容易使其所在的蛋白质失活，杀虫剂就是利用了这种原理(NomuraandCasida,2011)。存在于细菌和真菌外分泌蛋白中的丝氨酸蛋白酶，其丝氨酸残基经常是糖基化的(Gonzalezetal.,2012)，这使得蛋白酶容易变成复合物(Horvatetal.,2011)。报道表明蛋白酶糖基化与糖尿病、癌症、以及一系列神经退行性疾病有关(Jennyetal.,2015；Hwangetal.,2010)。1.3.1.1丝氨酸蛋白酶与疾病人类丝氨酸蛋白酶家族非常庞大，约有180个变种，例如核蛋白，乳铁蛋白，II型跨膜家族丝氨酸蛋白酶（TTSP）等。TTSP家族与流感病毒的发病相关，能够切割血凝素(OhlerandBecker-Pauly,2012)。人类皮肤角质层中有炎症细胞因子和蛋白酶，就包括了丝氨酸蛋白酶。这些丝氨酸蛋白酶能够发挥多种蛋白酶活性，4 第一章绪论包括激肽释放酶5、激肽释放酶7、尿激酶、纤溶酶和类胰蛋白酶以及白细胞弹性蛋白酶活性(Voegelietal.,2007)。由于强烈的酶活性，皮肤容易发生屏障损伤，并且耐受性差。病原体经常利用宿主的丝氨酸蛋白酶进行入侵和致病。据报道，II型跨膜家族丝氨酸蛋白酶允许丙型肝炎病毒进入，并且参与了致病(Esumietal.,2015)。此外，人类气管胰蛋白酶样蛋白酶能够被流感病毒所定位(Böttcheretal.,2006)。已有研究表明埃博拉病毒和冠状病毒能够依赖宿主细胞的丝氨酸蛋白酶用于其包膜糖蛋白激活(Zhouetal.,2015)。幽门螺杆菌和结核分枝杆菌能够结合宿主的纤溶酶原（血浆中的糖蛋白），将其转化为丝氨酸蛋白酶的活性形式，并通过结缔组织和胞外基质降解进而逃避宿主防御系统(Shea-Donohueetal.,2014；Sanderson-Smithetal.,2012)。与其他的肽和较大的蛋白一样，丝氨酸蛋白酶可以穿过胃肠道的粘膜屏障，到达血液和淋巴(Changetal.,2012)。已报道人群中l和d型丝氨酸与神经疾病如癫痫、肌萎缩侧索硬化、阿尔茨海默氏病、精神分裂症有关(Jiraskova-Vanickovaetal.,2011)。在细菌中，丝氨酸蛋白酶由丝氨酸家族的多个基因编码，比如病原菌结核分枝杆菌、地衣芽孢杆菌和铜绿假单胞菌。它们都属于枯草杆菌蛋白酶、信号肽酶、Lon-A肽酶、Clp蛋白酶、羧肽酶等家族。研究表明丝氨酸蛋白酶可以帮助杆菌进入人体巨噬细胞(Upadhyeetal.,2009)。金黄色葡萄球菌分泌的剥脱性表皮松解毒素表现出丝氨酸蛋白酶的特征，除了使皮肤脱屑，这些蛋白酶还会引起细菌的传播(KozielandPotempa,2013)。温和气单胞菌分泌的丝氨酸蛋白酶可以裂解血浆蛋白质（如纤维蛋白原），引起败血症并发症，如休克和血液凝固紊乱(Murakamietal.,2012)。肠致病性大肠杆菌可以分泌丝氨酸蛋白酶肠毒素。这些蛋白酶能够改变宿主肌动蛋白细胞骨架并损害其稳定性(Navarro-Garciaetal.,2010)。此外，其他革兰氏阴性细菌如奈瑟氏菌属、志贺氏菌属、沙门氏菌属、爱德华氏菌属能够分泌自转运丝氨酸蛋白酶充当粘附素，附着到宿主上皮和内皮细胞，诱导宿主发病(Ruiz-PerezandNataro,2014；Hilletal.,2010)。结核分枝杆菌的丝氨酸蛋白酶通过免疫逃逸发挥毒力机制，因此只有药物异烟肼能够靶向它(Upadhyeetal.,2009)。密西根棒状杆菌中的丝氨酸蛋白酶负责宿主-病原相互作用(Storketal.,2008)。艾滋病毒、埃博拉、肝炎病毒、登革热、寨卡病毒、乳头瘤病毒和巨细胞病5 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究毒等在世界上已经引发了高发病率和高死亡率。除了它们的核酸和核衣壳具有不同差异，它们都具有一种非结构性肽酶的多聚蛋白，这个蛋白属于丝氨酸蛋白酶(Rautetal.,2015；ReiserandTimm,2009)。在某些病毒中，丝氨酸蛋白酶的亲核丝氨酸被半胱氨酸巯基置换，如小核糖核酸病毒，但序列构型仍保持同源(PatickandPotts,1998)。例如登革热病毒的这种酶中含有独特的几丁质结合结构域（一种碳水化合物结合结构域）(Rautetal.,2015)，表明它们具有入侵昆虫媒介的能力。丝氨酸蛋白酶与宿主甘露糖结合凝集素的相互作用表明了模式识别分子早已经出现。在丙型肝炎病毒和流感病毒中，有报道称甘露糖结合凝集素相关的1型丝氨酸蛋白酶（MASP-1）、2型（MASP-2）或3型（MASP-3）通过对C4的作用介导补体激活(Drentinetal.,2015；Saeedetal.,2013)。寡聚凝集素Ficolins（含有胶原样的长伸展结构和具有凝集素活性的纤维蛋白样球形结构域）也是这些补体活化复合物的一部分(Matsushita,2009)。图1.2展示了甘露糖结合凝集素和病原丝氨酸蛋白酶介导的补体激活途径。图1.2丝氨酸蛋白酶被识别后的补体激活途径。(Patel,2017)Figure1.2Complementactivationfollowingrecognitionofserineprotease.1.2.3血红素加氧酶1.2.3.1细菌利用血红素摄取铁细菌利用血红素的机制与利用铁的机制是相似的，并且获取它们的方式都可以大致分为两种：（1）膜受体与底物的直接相互作用；（2）分泌铁或血红素高亲6 第一章绪论和性螯合剂，释放到细菌胞外环境中以获得铁或血红素。目前报道的细菌胞外血红素螯合蛋白只有革兰氏阴性菌可以分泌，统称为Hemophores(Letoffeetal.,1994)。Hemophores可以从血液结合素和血红蛋白中获得血红素，并转运到特异性外膜受体上(WandersmanandDelepelaire,2004)。血红素主要存在于血红蛋白中和含有血红蛋白摄取系统的革兰氏阴性菌中，包括耶尔森菌属(Rossietal.,2001)、奈瑟氏菌属(Turneretal.,1998)、志贺氏菌属(Wyckoffetal.,1998)和弧菌属(O’Malleyetal.,1999)等。发生溶血后，结合血红蛋白的血清糖蛋白触珠蛋白，可以为一些细菌包括流感嗜血杆菌(Whitbyetal.,2006)和脑膜炎奈瑟氏球菌提供用于生存的铁(Lewisetal.,1998)。迄今为止，Hemophores只存在于革兰氏阴性致病菌中，并且目前Hemophores系统在流感嗜血杆菌(Copeetal.,1995)、铜绿假单胞菌(Létofféetal.,1998)、鼠疫菌(Rossietal.,2001)和粘质沙雷氏菌(Letoffeetal.,1994)中研究比较透彻。图1.3革兰氏阴性菌（A）和革兰氏阳性菌（B）的血红素吸收系统。(WilksandBurkhard,2007)Figure1.3HemeuptakesystemofGram-negative(A)andGram-positiveorganisms(B).在革兰氏阳性菌中，血红素摄取系统研究的不多，但公认与革兰氏阴性菌的内膜系统有极大同源性（图1.3）。代表性菌株有金黄色葡萄球菌(Macketal.,2004)、肺炎链球菌和白喉棒状杆菌(Bibbetal.,2005；Schmitt,1997)。在金黄色葡萄球菌7 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究中，isd操纵子编码9种起作用的蛋白以从血红蛋白中捕获血红素，同时也可以促进细菌的粘附(Mazmanianetal.,2003)。1.2.3.2血红素加氧酶的反应过程血红素加氧酶（HO）是一种在胞质中存在的酶，功能是催化血红素降解为胆绿素，随后在胆绿素还原酶的作用下转化为胆红素(图1.4)。整个反应需要三个氧分子和七个电子，才能将一个血红素分子转化为胆绿素、一氧化碳（CO）和铁(LiuanddeMontellano,2000)。哺乳动物中电子从NADPH传递到HOs是由细胞色素P450还原酶介导的(Yoshidaetal.,1980)。18O2标记法和质谱分析已经确定胆绿素中的两个氧原子都源自分子氧(Tenhunenetal.,1972)。进一步研究确定了有三个不同的氧分子分别参与反应，第一个参与血红素转化为内消旋羟基化，第二个参与形成胆绿蛋白红素，第三个参与了从胆绿蛋白红素到胆绿素。血红素加氧酶是一种很少见的酶，因为它使用血红素作为反应底物和辅因子，而不是细胞色素P450、过氧化物酶或过氧化氢酶这种经典分子。然而，从反应的性质和进化方面，血红素加氧酶与介导氧激活的血红素蛋白支架十分相似。血红素加氧酶机制的阐明不仅会推进对血红素分解的理解，而且将促进对其他血红蛋白的结构和功能之间关系的了解。1.2.3.3血红素加氧酶家族的序列保守性人类血红素加氧酶HO-1和HO-2的氨基酸序列有42%的一致性，而人和大鼠的HO-2同种型有80%的一致性(Mccoubreyetal.,1992)（图1.5）。HO-3与HO-1或HO-2具有低得多的同源性，但相比较而言，与HO-2的相关性更大(McCoubreyetal.,1997)。在HO-1对应于125-150和11-40的氨基酸残基中发现了序列高度一致性的区域。后者中的组氨酸（His-25）序列已被鉴定为近端组氨酸血红素。8 第一章绪论图1.4血红素加氧酶和胆绿素还原酶联合将血红素酶转化为胆红素。(Wilks,2002)Figure1.4EnzymaticconversionofhemetobilirubinbythecombinedactionofHOandBVR.有趣的是，序列高度一致性的区域，HO-1中的125-150残基和HO-2中的144-169残基，对应于位于血红素上方的远端螺旋的序列。该区域被认为是血红素加氧酶蛋白的指纹基序(Maines,1992)，对蓝细菌和高等植物中的血红素加氧酶的进一步研究表明，其在远端螺旋内具有的高度保守性也支持这一理论(Davisetal.,1999)。对利用血红素的细菌病原体白喉棒状杆菌的血红素加氧酶HmuO的研究表明，其具有与人类HO-133%的序列一致性和70%的同源性，并且再次在残基122-145中表现出高度一致性，对应于HO-1中的125-150残基（图1.5）。来自脑膜炎奈瑟菌的铁调节基因hemO(Zhuetal.,2000)和铜绿假单胞菌的pigA(Ratliffetal.,2001)属于血红素加氧酶。这些病原菌已经进化为利用宿主的血红素作为铁源，释放铁以供依赖于血红素加氧酶的病原菌生存代谢(Zhuetal.,2000；Ratliffetal.,2001)。与白喉杆菌酶相反，假单胞菌和奈瑟氏菌的氨基酸序列显示出与先前鉴定的血红素加氧酶低得多的序列一致性。低序列一致性（19%-22%）的特征是在已经被鉴定出的的血红素加氧酶的保守区内有明显缺失和氨基9 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究酸替换，特别是在对应于远端螺旋的区域中。该区域内唯一明显的保守序列是G-X-X-X-G基序，对应于血红素加氧酶-1的甘氨酸残基139和143（血红素中的Gly-116和Gly-120）和Leu-141（血红素中的Leu-119）和Ser-142（血红素中的Ser-117）在序列内保守。从序列比对中可以清楚地看出，除了前面提到的基序和近端组氨酸之外，催化活性和区域特异性所需的关键活性位点残基是有限的。1.2.3.4血红素加氧酶与细菌毒力虽然已有研究表明突变血红素摄取系统可以影响细菌的毒力(Skaaretal.,2004)，但目前还没有研究血红素加氧酶基因的直接作用。Skaaretal.(2006)发现炭疽芽孢杆菌的血红素加氧酶IsdG对于A/J小鼠的毒力不是必需的(Skaaretal.,2006)，而Murrayetal.(2009)突变了肾脏钩端螺旋体的血红素加氧酶基因hemO后，对照突变株（基因间转座子插入）注射的仓鼠存活率为33%，相比之下，用hemO突变株注射的仓鼠存活率提高到83%。肺部病理研究与存活率研究一致，表明HemO对细菌毒力发挥重要作用，也表明了在宿主体内，血红素是肾脏钩端螺旋体的主要铁源(Murrayetal.,2009)。这是第一次表明细菌血红素加氧酶与毒力有直接联系。后来有研究表明，血红素加氧酶通过其降解血红素并释放游离铁，从而有助于细菌毒力发挥（Silva-Gomes等，2013）。图1.5人和细菌血红素加氧酶的序列比对。(Wilks,2002)Figure1.5SequencealignmentofthehumanandbacterialHOs.10 第一章绪论1.2.4TonB依赖型外膜受体1.2.4.1TonB依赖型外膜受体的分布及种类TonB是将细胞质膜的质子动势转导到外膜所必需的，其最早发现于摄取铁、维生素B12、镍、碳水化合物（如麦芽糖糊精和蔗糖）、噬菌体和大肠杆菌素的革兰氏阴性菌中(Blanvillainetal.,2007；Schaueretal.,2007)。革兰氏阴性菌的外膜是一层渗透屏障，可以保护细菌免受有害毒素、表面活性剂和降解酶的作用。外膜中的三聚体β-barrel蛋白允许分子量小于600Da的亲水性代谢物进行被动扩散(Nikaido,2003)。由于铁载体分子量大于600Da，它们的摄取必须通过外膜，周质空间和细胞质膜的协同作用进入细胞质。这种主动转运涉及到外膜受体、周质结合蛋白和内膜ATP结合盒（ABC）转运蛋白。外膜上既没有确定的电化学梯度，也没有周质中存在的核苷三磷酸；因此，细胞质膜利用质子动力（pmf）以促进外膜转运(Senetal.,1988)。外膜与细胞质膜的这种物理分离需要一种机制将细胞质膜的pmf转导到外膜，以用于底物转运。这种机制由蛋白TonB、ExbB和ExbD发挥，它们在革兰氏阴性菌的细胞质膜中一起形成复合物。革兰氏阳性菌没有外膜，并且它们似乎缺乏编码TonB、ExbB和ExbD的基因(Chuetal.,2007)。迄今为止，在文献中已鉴定出98个TonB依赖性受体。筛选可用的基因组序列后，鉴定出了347种物种中的4600种假定受体，并且基于序列相似性分为195个簇(Mirusetal.,2009)。对于TonB依赖型转运机制的研究，集中在分子遗传、生物化学和生物学方面。1.2.4.2TonB依赖型外膜受体的结构TonB有3个功能结构域。第一个结构域是N末端结构域（残基1至32），其含有促进TonB进入细胞质膜的疏水信号序列。这33个残基被模拟为α-螺旋。第二个功能结构域是富含脯氨酸的间隔区（残基66-102），位于周质中，由一系列脯氨酸和谷氨酸残基组成，然后是几个Pro-Lys重复。超出脯氨酸富集区域是残基103至149的另一个延伸区域。该区域赋予TonB灵活性，允许其跨过周质空间进行延伸。自旋标记电子顺磁共振和圆二色谱分析研究表明，富含脯氨酸的结构域存在于可以跨越周质的聚脯氨酸螺旋H（PPH）构象中(DomingoKöhleret11 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究al.,2010)。第三个功能结构域是C末端结构域（残基150-239），与外膜转运蛋白相互作用。目前为止，从大肠杆菌TonB和鳗弧菌TonB2中分离的C末端结构域的结构已经通过X射线晶体学(Koeddingetal.,2004)和NMR光谱学(Lópezetal.,2009)解析。1.2.4.2TonB依赖型外膜受体与毒力TonB依赖型外膜受体是一个大家族，包括许多不同功能的蛋白。据报道，在杜克雷嗜血杆菌中，属于TonB依赖型外膜受体的血红蛋白受体HgbA，作为疫苗有明显的保护效应(Leducetal.,2011)。TonB外膜受体与嗜冷黄杆菌、大肠杆菌、不动杆菌、脑膜炎奈瑟氏菌等细菌的毒力有关(Tauseefetal.,2011；HaganandMobley,2009)。在荧光假单胞菌中，一些TonB依赖型外膜受体也可以在鱼类中发挥免疫保护效应(Zhangetal.,2014b)。1.2.5丝状血凝素丝状血凝素是博德特氏菌重要的粘附素，主要有两种存在形式，分泌型和膜锚定形式(Jacob-Dubuissonetal.,2000；WeissandHewlett,1986)。百日咳博德特氏菌中的FHA已经研究得很透彻。其以Sec-依赖型方式由双配体分泌系统（TPS）分泌，TPS包括与FHA的N端分泌结构域相互作用的外膜相关辅助蛋白。在功能上，它具有促凋亡活性并促进血管生成(Romeroetal.,2014)。在地毯草黄单胞菌中，FHA样蛋白在组织定殖、表面附着、细胞-细胞聚集和生物膜形成中发挥重要作用(Gottigetal.,2009)。鲍曼不动杆菌中的FHA样蛋白在小鼠致死感染模型中发挥毒力作用，促进生物膜形成和介导鲍氏不动杆菌对上皮细胞的粘附(Astanehetal.,2014)。除了其作为粘附素的作用，百日咳博德特氏菌和支气管炎博德特氏菌的FHA也具有免疫调节特性，这可能用来破坏宿主先天和适应性免疫(Romeroetal.,2014；Julioetal.,2009)。1.2.5.1丝状血凝素的结构及生物合成电子显微镜和结构分析表明，FHA既可以分泌到培养上清液中，同时也可以被锚定在细胞膜上，它是一个~4×40nm的β螺旋，一端具有球状结构域，分子量为~240kDa(Kajavaetal.,2001)。FHA是通过双组分分泌（TPS）途径被运输到细胞表面的。TPS是革兰氏阴性菌一种常见的机制，通过其外膜通道β-桶蛋白12 第一章绪论FHA及其同源外膜转运蛋白FhaC，将大的β-螺旋外蛋白输送到细胞表面(Jacob-Dubuissonetal.,2013；MazarandCotter,2007)。FHA最初是被合成为375kDa前蛋白原FhaB（图1.6），并利用其N-末端含有延伸信号肽区（ESPR）的序列通过Sec系统穿过细胞质膜(Chevalieretal.,2005)。ESPR存在于许多TPS外蛋白和自转运蛋白上，尽管它们对于控制分泌这些大蛋白很重要，但它们的确切功能尚不清楚(Desvauxetal.,2007)。在去除含ESPR的信号序列后，通过与FhaC周质的多肽转运相关结构域（POTRA）相互作用，FhaB-N末端的TPS结构域开始启动输送到外膜的过程(Baudetal.,2014)。FhaB的输出以N端至C端方向进行，其中N端保持与FhaC相关联，使得发夹结构在细胞表面上形成并延长(MazarandCotter,2006)。TPS外蛋白预测包含大的β-螺旋区域，特别是它们的N末端附近，并且假定稳定的β-螺旋折叠通过形成布朗棘轮机制而帮助运输(Jacob-Dubuissonetal.,2013)。一旦具有2500aa的FhaB被输出到膜表面，称为前结构域N末端（PNT）的区域会停止进一步移动，因此FhaB-C末端的1200aa（前结构域）会保留在细胞周质中(Noëletal.,2012)。前结构域内的特异性亚结构域可以防止未知蛋白酶的降解，促进细胞表面上成熟FHA-C端结构域（MCD）的折叠，并且以某种方式抵抗吞噬细胞的清理作用(Melvinetal.,2014；Noëletal.,2012)。周质中前结构域的降解和定位于表面的自转运蛋白SphB1在前结构域N末端的切割后最终形成成熟的240kDa的FHA分子(MazarandCotter,2006)，最终大量的FHA被释放到胞外。1.2.5.2丝状血凝素功能FHA首次报道是在1983年，发现于不能凝集绵羊红细胞的百日咳博德特氏菌Tn5转座子位点突变体中(Weissetal.,1983)。分别比较该菌株或fhaB缺失突变株与野生型百日咳博德特氏菌粘附纤毛上皮(Prasadetal.,1993)、非纤毛上皮细胞(vandenBergetal.,1999)、单核细胞(Ishibashietal.,1994)和嗜中性粒细胞的能力(Mobberley-SchumanandWeiss,2005)，发现FHA在介导细菌对宿主细胞的粘附中起重要作用。类似地，分别对缺失大部分fhaB基因的菌株或表达fhaB和fhaC基因的ΔbvgS突变体的研究表明，FHA对于支气管炎博德特氏菌在体外粘附多种细胞系的功能是非常重要的(Mattooetal.,2000)。百日咳博德特氏菌表面的FHA可以引起宿主呼吸道免疫反应(图1.7)。尽管早期制备的抗FHA抗体通13 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究常含有抗博德特氏菌其他因子的抗体，阻断实验还是表明了FHA是一种体外重要的粘附素(vandenBergetal.,1999)。图1.6丝状血凝素的结构域和假设的丝状血凝素生物合成模型。(Romeroetal.,2014)Figure1.6Structuraldomainsoffiamentoushemagglutininandproposedmodelsoffiamentoushemagglutininbiogenesis.对FHA介导与宿主细胞互作的结构域的研究也包括了FHA的N末端附近的区域（肝素结合结构域，HBD），此区域可以结合硫酸化碳水化合物（例如肝素和硫酸乙酰肝素）和凝集绵羊红细胞。该区域包含纤维连接蛋白的共有肝素结合位点(Busbyetal.,1995)，并且纯化自培养物上清液的FHA能够与肝素琼脂糖相互作用(Menozzietal.,1994)。此外，与肝素的孵育可以降低百日咳博德特氏菌粘附到HeLa细胞的能力(Menozzietal.,1994)。然而，目前的FHA分泌模型将HBD放置在细菌表面，其中宿主细胞分子可能无法进入(Noëletal.,2012；MazarandCotter,2006)，因此怀疑这些相互作用是否在体内发生。1141-1279残基被命名为碳水化合物识别结构域，是因为识别该区域的抗原决定簇单克隆抗体阻断14 第一章绪论FHA与糖脂的结合后，降低了百日咳博德特氏菌与兔纤毛上皮细胞的结合(Tuomanenetal.,1988)。然而，抗含有该区域多肽的多克隆抗体并不阻断百日咳博德特氏菌或支气管炎博德特氏菌与大鼠肺上皮细胞（L2）或J774A.1巨噬细胞样细胞的结合(Julioetal.,2009)。FHA还含有以氨基酸残基1098为中心的RGD三联体，通过与白细胞应答整合素-整合素相关蛋白（LRI-IAP）复合物相互作用，影响对单核细胞的粘附并诱导CR3（akaCD11b/CD18）进行表面呈递(Ishibashietal.,1994；Aricoetal.,1993)。然而，不产生RGD的FHA的支气管炎博德特氏菌株，其持续感染大鼠和小鼠的能力与野生型细菌没有显著差异(Julioetal.,2009)。分泌和拓扑研究表明N末端锚定在细胞表面，成熟FHA的C末端（MCD）位于远端，将其置于与宿主细胞相互作用的最佳位置(MazarandCotter,2006)。抗体阻断研究和突变分析证明了MCD在体外结合上皮细胞和巨噬细胞以及体内影响FHA功能的重要性(Julioetal.,2009)。因此FHA主要通过MCD介导与宿主细胞的相互作用，尽管FHA其他结构域的作用没有被明确鉴定出。鉴定FHA与宿主体内相互作用的分子仍然是重要而艰巨的任务。图1.7丝状血凝素对呼吸道粘膜的免疫调节作用。(Romeroetal.,2014)Figure1.7Immunomodulatoryeffctsoffiamentoushemagglutininonairwaymucosa.15 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究1.3杀菌/通透性增加蛋白BPI1.3.1鱼类天然免疫及研究现状在对抗外界入侵的病原微生物时，鱼类的天然免疫系统发挥着非常巨大的作用，加上鱼类在进化学中的地位，研究鱼类天然免疫相关基因不仅可以增加对宿主抗感染机制的了解，并且可以提高对免疫系统演变的认知。目前在鱼类中已经有非常多的天然免疫相关基因被发掘和研究，主要包括模式识别受体、细胞因子、补体系统分子、抗菌肽和凝集素等。模式识别受体（PRR）可以感知病原体的保守分子结构，并通过多种信号途径诱导宿主免疫系统来根除病原体(JanewayandMedzhitov,2002)。迄今为止，在硬骨鱼类中，PRR已鉴定出许多种类，如Toll样受体，RIG-1样受体，NOD样受体和C型凝集素受体(Rajendranetal.,2012)。作为胞内PRR家族成员，肽聚糖识别蛋白（PGRP）也已在斑马鱼中发现。这些PGRP可以结合/水解细菌细胞壁的肽聚糖，并参与硬骨鱼中TLR信号通路的调控(Changetal.,2009)。细胞因子通过自分泌或旁分泌的方式结合相应受体，从而调节免疫应答。细胞因子来自巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞、DC、肥大细胞和上皮细胞，分为干扰素（IFNs）、白介素（ILs）、肿瘤坏死因子（TNFs）、集落刺激因子和趋化因子(SavanandSakai,2006)。这些细胞因子都已经在硬骨鱼中发现，其功能和信号传导通路的研究也有重要进展（图1.8）。硬骨鱼中的补体系统是研究的一大热点，很多补体分子已经在鱼类中鉴定出。经典途径第一个分子C1q最早发现于斑点叉尾鮰中(DoddsandPetry,1993)。旁路途径中的血浆B因子和血浆组织蛋白酶D因子都在鱼类中存在(Sunyeretal.,1998；Gonzalezetal.,2007b)。在鲤鱼中发现了甘露糖结合凝集素的同源物(Vitvedetal.,2000)。抗菌肽在硬骨鱼中的研究十分广泛，主要包括防御素、天然抗性相关巨噬细胞蛋白（Nramp）、NK-lysin和铁调素。在斑点叉尾鮰中克隆出了三种不同的NK-lysin转录本(Wangetal.,2006)。在鲤鱼、大菱鲆和牙鲆中鉴定出了Nramp基因(Chenetal.,2007;Saeijetal.,1999)。铁调素通过穿透病原体的质膜来增加其渗透性并导致其死亡。迄今为止，已经在多种硬骨鱼中发现了铁调素同源物，其中包括青鳉(Boetal.,2011)、香鱼(Mei-Zhenetal.,2011)、大黄鱼(Wangetal.,2009b)，16 第一章绪论大菱鲆(Chenetal.,2007)等。图1.8调节鱼类炎症细胞的细胞因子网络示意图。(Zhuetal.,2013)Fig1.8Schematicrepresentationofthecytokinenetworkregulatinginflammatorycellsfunctionsinfish.1.3.2BPI的结构杀菌/通透性增加蛋白（Bactericidal/permeability-increasingprotein,BPI）是抗菌肽家族的主要成员之一，大小55-60kDa，首次报道于1975年。BPI和脂多糖结合蛋白LBP是两种结构和功能都密切相关的糖蛋白，最初分别从兔的粒细胞和血清中分离(Tobiasetal.,1986；Weissetal.,1975)。BPI与LBP有两个共同的结构域：N末端BPI/LBP/胆固醇酯转移蛋白（CETP）结构域BPI1和C末端BPI/LBP/CETP结构域BPI2(Beameretal.,1998；Zaremberetal.,1997)。通常，BPI1结合LPS的脂质A组分，而BPI2用于运输LPS(Beameretal.,1998)。详细来说，BPI是具有回旋镖形结构的456-残基蛋白，由具有相同长度的两个结构域组成，结构域中间由富含脯氨酸的序列隔开(Beameretal.,1997)，氨基和羧基末端区都具有脂质结合口袋。BPI与LBP的序列一致性约为50%(Weiss,2003；17 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究ElsbachandWeiss,1998)，BPI的氨基末端区域与LBP的氨基末端区域相当，但带正电荷的氨基酸更多，这可能是与LPS相互作用的关键(Weiss,2003)。BPI的氨基末端对其杀菌和抗炎性质十分重要(Ooietal.,1991)。BPI氨基末端结构域与LPS的亲和力高于LBP。被BPI包被的细菌刺激后，氨基末端结构域可以激活吞噬细胞的脱颗粒功能(Iovineetal.,1997)。LBP的羧基末端结构域帮助LPS递送至CD14，并且促进LPS介导的信号传导，而BPI的羧基末端结构域在吞噬细胞和被BPI调理的细菌之间相互作用中起重要作用。1.3.3BPI的功能BPI是抗微生物肽家族中比较有意思的分子，因为它的功能不仅仅限于杀菌。目前已知BPI具有各种不同的生物学功能，比如抗细菌、抗炎症、调理作用和抗血管生成（图1.9）。LBP是BPI的功能性拮抗剂，分散LPS聚集体并将单体LPS递送至CD14分子(Tobiasetal.,1997)。而BPI正好相反，通过稳定聚集物从而抑制LBP介导的LPS递送至CD14分子(Tobiasetal.,1997)。革兰氏阴性菌的LPS是炎症和内毒素性休克/败血症的主要决定因子，而BPI可以中和LPS引起的不良反应(Marraetal.,1992)。BPI可以减少由LPS介导的嗜中性粒细胞刺激、发热，以及减少LPS诱导产生的TNF-α(Marraetal.,1992)。BPI是通过结合LPS中的脂质A来中和LPS的作用(Heumannetal.,1993),它的这种性质也可以用来抗微生物活性。在与外膜的LPS结合时，BPI以时间依赖性方式渗入细菌内膜，破坏膜完整性，导致膜损伤，清除电化学梯度，并最终导致细菌死亡(Mannionetal.,1990)。重组BPI与单核细胞孵育后可以抑制由LBP介导的向单核细胞递送LPS(Heumannetal.,1993)。对rBPI的体外研究表明，BPI与LBP的摩尔比大于3的时候可以抑制LPS刺激单核细胞(Heumannetal.,1993)，但是大于10倍会完全掩盖LBP的作用。BPI的调理作用也已经在实验中得到证实(Iovineetal.,1997)。BPI能够增强水泡从革兰氏阴性菌外膜到树突细胞（DC）的递送(Schultzetal.,2007)，这可以帮助DC摄取LPS和呈递来自外膜的抗原，同时BPI还可以阻断DC的成熟(Eckertetal.,2006)。18 第一章绪论图1.9杀菌/通透性增加蛋白（BPI）的功能。(BalakrishnanandMarathe,2013)Figure1.9Modeofactionofbactericidal/permeabilityincreasingprotein(BPI).1.3.4BPI与疾病最近的研究表明BPI是一种抗血管生成因子(vanderSchaftetal.,2000)。体外和体内实验表明，低剂量的BPI会抑制内皮细胞的生长，导致其从细胞外基质脱离并诱导细胞凋亡(vanderSchaftetal.,2000)，没有内皮细胞迁移的血管就会被抑制生成。通过其在视网膜内皮细胞上的氨基末端结构域，BPI与血管内皮生长因子（VEGF）结合，从而抑制血管生成(Yamagataetal.,2006)。这些疾病里，血管生成起重要作用，因此BPI可能是治疗病理性疾病如癌症和动脉粥样硬化的潜在候选因子(Kahlonetal.,1991)。BPI的抗血管生成功能据推测是由于BPI与血小板因子4具有化学相似性(vanderSchaftetal.,2000)。与其影响视网膜内皮细胞的血管生成不同，BPI在视网膜周细胞和上皮细胞中发挥促有丝分裂作用(Yamagataetal.,2006)。促有丝分裂功能归因于BPI通过ERK和Akt通路传递信号的能力，促进视网膜色素上皮细胞和周细胞，而不是视网膜内皮细胞的合成(Yamagataetal.,2006)，这是第一个关于BPI具有信号传导功能的报道。后来发19 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究现BPI可能结合磷脂酰肌醇蛋白聚糖4（GPC4），一种具有促有丝分裂作用的细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(Geraldesetal.,2007)。然而，通过GPC4活化ERK和Akt的确切机制尚未明了。1.3.5鱼类BPI研究现状BPI/LBP的大多数研究已在哺乳动物中完成，但在硬骨鱼中，BPI/LBP的功能是未知的。Inagawaetal.(2002)克隆了虹鳟的第一个鱼LBP/BPI同源物(Inagawaetal.,2002)；随后，在大西洋鳕鱼(Stenviketal.,2004)、斑点叉尾鱼(Xuetal.,2005)、香鱼(Suzukietal.,2009)和橄榄鲽(Nametal.,2010)中鉴定了LBP/BPI相关基因。然而，这些蛋白的生物学功能尚未可知，需要进一步探索。1.4凝集素1.4.1凝集素的分布与结构凝集素（lectin）是先天免疫应答的关键因子。凝集素是一类氨基酸序列高度可变的糖结合蛋白，首先发现于植物中，并且可以凝集细胞以发挥其生物功能。凝集素是一个巨大的超家族，广泛分布在包括病毒，细菌，真菌，原生生物，植物和动物在内的生物体中(VastaandAhmed,2008)。虽然植物和动物凝集素没有同源的一级结构，但它们的糖结合特性非常相似(Ghazarianetal.,2011)。与抗体或酶相比，凝集素既不是免疫原也不是催化剂，但能够通过糖识别结构域（CRD）识别或结合复杂的糖类(Andersonetal.,2008)。每种动物凝集素都有自己的CRD，都具有115-130个氨基酸残基的相同序列基序和四个完全保守并形成两个二硫键的半胱氨酸(Andersonetal.,2008)。1.4.2凝集素的分类动物凝集素根据结构或功能可以分为十几种，常见的分为四类，分别是C型（需钙）凝集素，P型（甘露糖-6-磷酸结合）凝集素，S型（galectins）凝集素和I型（免疫球蛋白样）凝集素(Andersonetal.,2008)，它们具有相似的序列和结构特性。鱼类凝集素根据凝集血液功能的特性，如糖结合特异性和钙依赖性，可分为C型凝集素、半乳糖凝集素、F型凝集素和鼠李糖结合凝集素等(Ogawaetal.,2011)。其中的C型凝集素是一个大型家族，其基本的特征是通过C型碳水化合20 第一章绪论物识别结构域（CRD）或C型凝集素结构域与糖蛋白中的碳水化合物残基相互作用。近年来，越来越多的凝集素类型被发现，包括M型，L型，几丁质酶样和F型凝集素等等（图1.10）。图1.10代表性凝集素的结构。(Andersonetal.,2008)(A)C型凝集素；(B)半乳糖凝集素；(C)P型凝集素；(D)I型凝集素；(E)F型凝集素；(F)钙连蛋白；(G)M型凝集素；(H)L型凝集素；(I)R型凝集素；(J)F盒型凝集素；(K)无花果酶；(L)几丁质酶样凝集素；(M)穿透素。Figure1.10Structureofrepresentativelectins.(A)C-typelectin；(B)galectin；(C)P-typelectin；(D)I-typelectin；(E)F-typelectin；(F)calnexin；(G)M-typelectin；(H)L-typelectin；(I)R-typelectin；(J)F-boxlectin；(K)ficolin；(L)chitinase-likelectin；(M)pentraxin.1.4.3凝集素的功能凝集素在不同的生物体内的功能是多种多样的。微生物病原利用凝集素识别宿主细胞表面聚糖并入侵，而宿主凝集素作为诱导因子，通过固定和补体介导的调理作用杀死病原(Mandliketal.,2008；Vastaetal.,2004)。动物凝集素的活性与一级结构的多样性相关(Kilpatrick,2002)。图1.11展示了动物凝集素的结构和在细胞表面的分布。已知至少12个结构家族通过蛋白质-蛋白质，蛋白质-脂质或蛋白-核酸相互作用结合糖以外的结构(Kilpatrick,2002)。它们在乙二醇识别系统21 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究中的功能包括补体激活，细胞识别，细胞粘附，细胞迁移，细胞信号转导和形态发生。此外，动物凝集素能够参与防御机制，主要通过识别病原体的碳水化合物(Andersonetal.,2008)，其通过细胞表面糖的不同类型粘附到各种细胞或病毒上。动物凝集素对细胞表面的识别或与细胞相互作用的功能有助于对宿主病原的第一道防御(Kilpatrick,2002)。例如，呈现在巨噬细胞表面的甘露糖特异性受体，可以结合其表面含有甘露糖聚糖的感染性病原，从而帮助巨噬细胞摄取和杀死外来病原(DambuzaandBrown,2015)。动物凝集素还可以参与细胞运输，免疫调节和自身免疫预防(Kilpatrick,2002)。此外，在脊椎动物中，凝集素作为适应性免疫应答的稳态调节剂并调节胚胎发育，细胞分化和活化淋巴细胞(RabinovichandToscano,2009)。图1.11动物凝集素的结构和细胞分布。（Lohetal.,2017）Figure1.11Thestructure,cellulardistributionofanimallectins.1.4.4鱼类凝集素研究现状鱼类凝集素作为防御性蛋白，作用类似于真菌，植物，其他动物和人类中的凝集素(Diasetal.,2015；Singhetal.,2014；NgandWong,2013)。鱼类中C型凝集素的研究最为广泛。除了补体系中的甘露聚糖结合凝集素外，在虹鳟(Zhangetal.,2000)、鲤鱼(Savanetal.,2004)、日本鳗(Tasumietal.,2002)、22 第一章绪论鳙鱼(Panetal.,2010)、大菱鲆(Zhangetal.,2010)中发现了C型凝集素家族的其他几个成员。这些C型凝集素都可以被细菌入侵诱导表达上调，并且对不同的病原体发挥不同的凝集和抑制功能。例如，纯化的鳙鱼C型凝集素具有抗哈氏弧菌活性，但不具有抗真菌活性，而重组大菱鲆C型凝集素可以凝集革兰氏阴性菌痢疾杆菌，但不能凝集革兰氏阳性菌海豚链球菌。许多种鱼类凝集素被病原刺激后被上调。被新加坡石斑鱼虹彩病毒刺激后，橙色斑点石斑鱼C型凝集素的mRNA表达显著上调(Weietal.,2010)。细菌或病毒刺激后，舌鳎的C型凝集素免疫防御增强(ZhouandSun,2015)。鲶鱼血清中凝集素的存在为先天免疫中的C型凝集素补体通路提供了依据(Ourthetal.,2007)。日本牛角鲨皮肤凝集素HjCL是与蛇毒凝集素进化相关的C型凝集素，凝集迟缓爱德华氏菌并促进血液瞬时凝固，帮助皮肤对病原的防御(Tsutsuietal.,2014)。其他类型的凝集素，近年来在硬骨鱼中的研究也越来越多。条石鲷的F型凝集素在被病毒和细菌刺激后表达上调(Parketal.,2012)。海鳗腹腔内的Galectins参与了寄生线虫的胞内固定(Nakamuraetal.,2012)。来自鲑鱼的鼠李糖凝集素刺激了促炎细胞因子的产生，包括肿瘤坏死因子和白细胞介素(Watanabeetal.,2009)。来自草鱼的鼠李糖结合凝集素提高了巨噬细胞的吞噬活性(Ngetal.,2003；Watanabeetal.,2009)。从纹鳢cDNA文库中鉴定的lily型凝集素mRNA主要在鳃中表达，并在嗜水气单胞菌和丝囊霉菌感染后上调，表明它与病原体识别和消灭有关(Arasuetal.,2013)。罗非鱼岩藻糖结合凝集素可以凝集嗜水气单胞菌、粪肠球菌以及人类O型新鲜血细胞(ArgayosaandLee,2009)。海鲡鱼甘露糖结合凝集素的凝血活性在40℃和pH4至pH10之间稳定，在60℃和pH1或pH13完全丧失。存在于0.1μM的FeCl3中时，凝血活性显著增强。该凝集素对大肠杆菌有抗菌活性，但对真菌没有抗性，并且可以促进鼠脾细胞的有丝分裂(NgaiandNg,2007)。除病原体外，限制和应激也影响鱼体中凝集素的产生(Andrichetal.,2015)。了解凝集素在鱼体中的表达模式有助于维持鱼类的健康。鱼类凝集素是一个需要进一步探索研究的领域。1.5本论文研究的目的及意义随着工厂化养殖密度的增加和养殖环境的恶化，海水养殖鱼类病害日益严重，23 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究每年给水产养殖业造成巨大经济损失，因此，养殖病害是困扰我国养殖业的一大问题。目前海水养殖鱼类仍然没有安全、有效的防治方法，对鱼类细菌病的防治主要倚赖抗生素，但是大量使用抗生素会威胁食品安全以及造成环境污染。而单独研究病原菌或单独研究鱼类免疫都不足以解决这一问题，因此从两方面同时着手，同时研究病原菌的致病机制和鱼类抗感染机制，对鱼类细菌病的防治具有切实意义。荧光假单胞菌是水产养殖业中一种常见的海水鱼类病原菌，本文旨在研究鱼类病原荧光假单胞菌的致病机制和鱼类宿主半滑舌鳎的抗病原感染机制。利用蛋白质组学技术，在缺铁胁迫条件下，筛选荧光假单胞菌的毒力因子，研究其感染鱼类宿主的作用方式，并且寻找具有作为亚单位疫苗的潜力分子。同时选取了半滑舌鳎的两种天然免疫相关基因，研究其生物学功能及抗荧光假单胞菌感染的作用机理。本研究为阐明海水鱼类致病菌荧光假单胞菌的致病机制及为海水鱼类细菌病的防治措施提供坚实的理论基础和依据。24 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究2.1材料、方法及仪器设备2.1.1伦理规范本实验涉及的动物活体实验均按照国务院颁布的“实验动物管理条例”和中国科学院海洋研究所伦理委员会等有关规定进行。2.1.2实验材料及仪器设备2.1.2.1实验动物健康的大菱鲆购自青岛胶南养殖场，放入养殖室内充氧暂养两周，每天换水喂食。实验前一天停止喂食，同时确保大菱鲆肾脏、脾脏和肝脏等器官无病原菌侵染。组织取样前，大菱鲆先用100mg/L的甲磺酸三苯酯（Sigma，St.Louis，USA）麻醉。2.1.2.2实验菌株荧光假单胞菌TSS由本实验室从致病鱼类中分离并保存(Wangetal.,2009a)。TSS的16SrDNA序列已存入GenBank数据库（登录号KP663368）。大肠杆菌DH5α、BL21、S17-1λpir感受态细胞购买于TransGen生物科技有限公司。生长温度是28℃（荧光假单胞菌）或37℃（大肠杆菌），在Luria-Bertani培养基（LB）中生长。培养TSS的培养基加入氯霉素防止污染。2,2'-联吡啶、四环素和氯霉素的工作浓度分别是600μM、20μg/ml和50μg/ml。2.1.2.3实验仪器表2.1实验主要仪器Table2.1Theexperimentalapparatus实验仪器生产厂商仪器型号PCR仪ThermoScientificLS-P24电泳仪北京六一仪器厂DYY-8C25 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究续表实验仪器生产厂商仪器型号水平电泳槽北京六一仪器厂DYCP-31DN凝胶成像仪上海培清公司JS-680B高压灭菌锅施都凯仪器设备有限公司MJ-54A冷冻离心机Eppendorf5804R恒温金属浴ThermoScientificLS-D202台式高速离心机湘仪仪器公司H1650-W超声细胞破碎仪宁波新芝生物公司JY92-II全波长读数仪ThermoScientificMultisrnago恒温振荡器上海一恒科学仪器公司HZQ-X300C电动组织研磨器北京全式金有限公司OSE-Y20双向电泳仪GEHealthcareEttanTMDALTsixsystem制冰机常熟市雪科电器有限公司IMS-30分析天平SartoriusCP224S转移脱色摇床其林贝尔公司TS-8电热恒温水浴锅上海一恒科学仪器公司HWS12荧光定量PCR仪EppendorfEppendorfMastercycler透射电子显微镜日本电子株式会社(JEOL)JEM-1200扫描电子显微镜日本日立S-3400N等点聚焦仪GEHealthcareEttanIPGphor3system凝胶扫描仪GEHealthcarePiscataway2.1.2.4实验试剂表2.2实验主要试剂Table2.2Theexperimentreagents实验试剂生产厂家限制性核酸内切酶Takara公司TaqDNA聚合酶Takara公司T4DNA连接酶Takara公司26 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究续表实验试剂生产厂家DNAMarkerTakara公司蛋白预染MarkerTakara公司蛋白非预染MarkerTakara公司商品化抗体北京康为世纪生物技术有限公司质粒小提取试剂盒OMEGA生物技术有限公司DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒OMEGA生物技术有限公司TotalRNA提取试剂盒OMEGA生物技术有限公司Westernblot显色试剂盒天根生物技术公司细胞实验常规试剂Life生物技术公司双向电泳相关试剂GEhealthcare公司反转录试剂加拿大MBIFermentas公司BCA非干扰型蛋白定量试剂盒上海生工生物工程技术有限公司荧光定量相关试剂美国Axygen公司SDS-PAGE相关、常用抗生素、IPTG北京索莱宝公司2,2'-联吡啶（DP）美国Sigma公司2.1.3细菌全蛋白样品制备准备两份含200mlLB培养基的1,000ml烧瓶，一份加入600μM的2,2'-联吡啶（DP），另一份不加，分别接种等量TSS于两份培养基中。28℃有氧条件下过夜振荡180rpm培养细菌。在OD600到达0.8时，4℃下离心4,000g×15min获取细菌。用PBS洗涤三次，并重悬于萃取溶液（7M尿素，2M硫脲，4%CHAPS，40mMDTT，2%IPG缓冲液）中。在冰上超声破碎细菌，间隔30s，破碎15min。离心20,000g×60min，除去未破裂的细菌和碎片。参照实验室之前的方法(Zhangetal.,2013)，将上清液中的可溶性蛋白质用2DClean-UpKit纯化，并用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白质浓度，并将其浓度调整到4.5mg/ml。27 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究2.1.4双向电泳2.1.4.1蛋白电泳第一向电泳：将蛋白样品加入IEF胶槽中，覆盖上IPG胶条（21cm,pH4-7NL,GEHealthcare）后用石蜡油封闭。第二向电泳：将胶条用平衡缓冲液平衡15min，进行SDS-PAGE电泳，最后用考马斯亮蓝G250进行染色。2.1.4.2图像的获得和分析实验独立进行三次，每次三次重复，之后使用凝胶扫描仪对脱色后的胶进行扫描，获得图像，并用ImageMaster2DPlatinum6.0软件进行比较分析。利用每个胶点亮度百分率（%vol）对实验组和对照组对应的差异点进行相互比较。最后，设定ratio≥2（或≤0.5）并且方差分析（ANOVA）P<0.05为蛋白表达产生显著差异的阈值。2.1.4.3凝胶酶切消化与MALDI-TOF质谱分析按本实验室之前的方法(Zhangetal.,2013)，对差异表达的蛋白点切胶和胶内酶解。使用ultrafleXtreme（Bruker,Germany）进行MALDI-TOFmassspectrometry（MS）分析。使用NCBI数据库对序列进行比对。2.1.5实时荧光定量PCR分析TSS在含DP的LB培养基中或纯LB培养基中培养至OD600≈0.8。用EZNATotalRNAKit提取总RNA并用RNasefreeDNaseI处理RNA。用SuperscriptII逆转录酶进行cDNA合成。使用SYBRExScript试剂盒进行qRT-PCR。结束时分析扩增产物的溶解曲线，确认仅扩增到一个PCR产物。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，采用2−ΔΔCT分析基因的表达水平。2.1.6敲除株TSShemO、TSSΔpspB、TSSΔsod和TSSΔtfeR的构建2.1.6.1设计敲除引物以构建TSShemO为例，根据hemO基因的上下游序列分别设计敲除引物，其中5’端序列的HemOF2引物位于目的基因上游，HemOR2引物位于目的基因内部，3’端序列引物HemOF3位于目的基因内部，HemOR3位于目的基因下游。引物28 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究HemOR2和HemOF3中包含一段反向互补序列（引物序列见表2.3）。表2.3本章所用引物序列Table2.3PrimersusedinthischapterPrimerSequences(5’3’)HemOF1ATGACCGCTTCTTCCACCHemOF2GATATCTCGACAGCACGACCTTCCA(EcoRV)HemOF3CTTCCACCAAGCTCGACCTGGCAGACHemOR1TTACGCCAGTTCTGGGGCHemOR2TCGAGCTTGGTGGAAGAAGCGGTCATHemOR3GATATCGAAGCGCACAAACGCATCA(EcoRV)PspBF1GTGAAAAAACGCAAGTCAGGPspBF2GATATCGCATCTGAACAGCGAGTCCTT(EcoRV)PspBF3CGGTGTACTTCCGTATCGACGGTGCCTAPspBF4GATATCATGTGGGGCCTGGGCGCCGTGC(EcoRV)PspBR1TTAGAACGCCCAGTCCAGGPspBR2ATACGGAAGTACACCGGCTGGTCGAAGAPspBR3GATATCACACTGGCGAAGCTGTTGGT(EcoRV)PspBR4GATATCGCCCCAGCCGTACAGCGAGT(EcoRV)SodF1ATGACCTATACCTTGCCGGCSodF2GATATCGGCCAATCGCTGCTTTATGGCG(EcoRV)SodF3ACATTGATCACTCACTCCATAACAAGATCTAAGGCCSodR1TCAGGCCAAAGCGGCCTGATAGCSodR2AGTGAGTGATCAATGTGCTCCATAGTGGGACGSodR3GATATCGTGACAGCCCCAGGCTTTCAGC(EcoRV)TfeRF1TCGTCTCAATTCAGGCTCAGCTfeRF2GATATCTCTCAATTCAGGCTCAGCCA(EcoRV)TfeRF3GCAAGCCGCGCGATGATCTGGACTTGAACTfeRF4GATATCATGAGCCCCAGCTTCAACGCCT(EcoRV)TfeRR1GAACGATGTAGTCACCGACGC29 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究续表PrimerSequences(5’3’)TfeRR2TCATCGCGCGGCTTGCCATCGATCAGTATfeRR3GATATCTGTAGTCACCGACGCGAAGT(EcoRV)TfeRR4GATATCCGATGTAGTCACCGACGCGAA(EcoRV)下划线：酶切位点2.1.6.2获得hemO基因缺失片段通过重叠延伸PCR法获得含缺失hemO231bp（位置19-249）的片段：（1）以TSS基因组DNA为模版，用引物HemOF2/HemOR2和HemOF3/HemOR3分别扩增，完成第一步PCR。PCR反应体系如下：表2.4PCR反应体系（25μl）Table2.4PCRreactionsystem(25μl)组分用量/μlddH2O1910×TaqBuffer2.5dNTP2引物F/R各0.25DNA模板0.5Taq酶0.5表2.5PCR程序Table2.5TheprogrammeofPCR温度时间94℃5min94℃30sec58℃40sec25个循环72℃1min/1kb72℃10min30 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究（2）上一步的两段PCR产物1：1混合，20倍稀释作为模版，以HemOF2/HemOR作为引物，进行第二步PCR，扩增出不含有缺失片段的序列hemOm。用OGEMA胶回收试剂盒对PCR产物通过进行切胶回收，胶回收产物连接pEASY-T1Simple载体，体系如下：表2.6目的片段与pEASY-T1Simple载体连接体系Table2.6TheligationoffragmentandpEASY-T1Simplevector组分用量/μl胶回收产物3pEASY-T1SimpleVector1室温连接15min，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，菌落PCR筛选阳性克隆并用测序引物M13F/M13R送擎科生物科技有限公司测序。2.1.6.3hemO片段连接到自杀质粒p7TS（1）使用OGEMA公司的质粒小提试剂盒提取质粒，EcoRV酶切提取的质粒，酶切体系如下：表2.7限制性内切酶酶切体系Table2.7Theenzymaticsystem组分用量10×Buffer3μl质粒1ugEcoRV1μlddH2Oupto30μl（2）37℃酶切2h并电泳检测，切胶回收备用。（3）提取p7TS质粒，SmaI酶切，37℃水浴2h，加入1μlCIAP去磷酸化水浴1h，胶回收备用。（4）将（3）切胶回收的片段与切好的质粒进行连接，16℃连接过夜。体系如下：31 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究表2.8p7TS与hemOm片段连接体系Table2.8Theligationofp7TSandhemOm组分用量10×T4DNA连接酶Buffer1μlT4DNA连接酶0.5μlp7TS载体1.5μlhemOm片段6μlddH2O1μl（5）连接产物转化E.coliS17λπ感受态细胞，涂在含有四环素的LB固体培养基上，37℃过夜。（6）菌落PCR检测转化结果，筛选重组成功的阳性菌落，将转化子命名为p7TShemO。2.1.6.4利用两次同源重组获得缺失突变体TSShemO。第一次同源重组：分别接种荧光假单胞菌TSS和含有p7TShemO质粒的S17-λπ菌株，培养至OD8600≈0.6时，离心收集菌体并用LB培养基重悬至10CFU/ml，体积比S17λπ:TSS=3:1将二者混匀，离心收集菌体并清洗菌体3次。用液体LB培养基重悬，轻轻滴至LB固体平板上，28℃正置培养48h。用无菌液体LB将固体平板上的细菌冲洗下来，稀释到适当的浓度，涂布到含有四环素和氯霉素的LB平板上，28℃培养48h。菌落PCR检测，用hemOF2/hemOR3做引物，选取PCR产物有977bp和746bp两条带的单克隆菌落。将单菌落接种于含四环素和氯霉素的液体LB培养基中，28℃培养保种。第二次同源重组将上一步保种的菌液培养后涂布在含12%蔗糖和氯霉素的固体LB平板上，28℃培养48h。菌落PCR检测，以hemOF2/hemOR3为引物，选取PCR产物条带仅有746bp的菌落作为阳性子。送擎科生物技术公司测序验证后，将正确的单克隆培养并保种，命名为TSShemO。2.1.6.5构建敲除株TSSΔpspB，TSSΔsod和TSSΔtfeR敲除株TSSΔpspB，TSSΔsod和TSSΔtfeR的构建方法与TSShemO的构建32 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究方法相同。为了构建TSSΔpspB，TSSΔsod和TSSΔtfeR，pspB的1035bp片段（位置292-1326），sod的612bp片段（位置1-612）和1437bp片段（位置403-1839）分别通过重叠延伸PCR进行扩增，第一次重叠PCR的引物分别为PspBF2/PspBR2，SodF2/SodR2和TfeRF2/TfeRR2，第二次重叠PCR的引物为PspBF3/PspBR3，SodF3/SodR3和TfeRF3/TfeRR3，融合PCR的引物对分别为PspBF2/PspBR3，SodF2/SodR3和TfeRF2/TfeRR3。将融合后的PCR产物插入自杀质粒p7TS中，并将重组质粒导入S17-λπ感受态细胞中。将转化体与TSS接合，按照上述过程进行同源重组。如上所述，通过PCR和测序结果验证TSSΔpspB、TSSΔsod和TSSΔtfeR中pspB、sod和tfeR的缺失。2.1.7生长曲线测定为了检测TSSΔpspB，TSSΔsod，TSSΔtfeR和TSShemO基因缺失后是否会影响生长情况，将四个敲除株和野生型菌株TSS以5×105CFU/ml的初始浓度分别接种于30ml的含氯霉素的LB液体培养基中，28℃，160rpm培养，每隔一个小时各取100μl测定OD600的吸光值，测定28h直至数值变化不大（进入平台期）后停止。实验重复三次。2.1.8细菌抗宿主血清杀菌能力测定（1）用10ml无菌注射器抽取健康大菱鲆（500g）血液，于4℃静置5h，6,000rpm×10min，4℃离心，用无菌枪头缓慢吸取上层血清备用。（2）TSSΔpspB、TSSΔsod、TSSΔtfeR、TSShemO和TSS培养至OD600≈0.8,6,000rpm×5min离心收集菌体，用无菌PBS清洗3次并重悬至终浓度为2×105CFU/ml。（3）TSSΔpspB、TSSΔsod、TSSΔtfeR、TSShemO和TSS重悬菌液各取50μl，分别再各加入50μl血清，混匀，每组三个平行，室温孵育1h。（4）稀释40倍，涂于LB固体平板上，28℃培养过夜，菌落计数。（5）细菌存活率计算：33 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究2.1.9细菌组织侵染能力检测（1）TSSΔpspB、TSSΔsod、TSSΔtfeR、TSShemO和TSS培养至OD600≈0.8,离心收集菌体，用无菌PBS清洗3次并重悬至终浓度为108CFU/ml。（2）健康大菱鲆（13.6g）随机分为6组，每组15条，每组分别肌肉注射50μlTSSΔpspB、TSSΔsod、TSSΔtfeR、TSShemO、TSS和PBS，注射剂量为5×106/条。同时控制水温在22℃。（3）注射细菌24h、48h、60h和70h后，每个时间点取5条鱼，解剖并取出部分脾和肾，称重后加无菌PBS匀浆，稀释后涂布于LB固体培养基上，28℃培养过夜。（4）待平板长出菌落后，随机选取几个PCR验证其为荧光假单胞菌，之后对平板进行菌落计数。实验重复三次。2.1.10细菌对宿主致死率的测定（1）TSSΔpspB、TSSΔtfeR、TSShemO和TSS培养至OD600≈0.8,6,000rpm×5min离心收集菌体，用无菌PBS清洗3次并重悬至终浓度为108CFU/ml。（2）健康大菱鲆（13.6g）随机分为4组，每组15条鱼，肌肉分别注射50μlTSSΔpspB、TSSΔtfeR、TSShemO和TSS，注射剂量为5×106/条。同时控制水温在22℃。（3）连续20天每天统计这4组大菱鲆的死亡情况，存活率=（存活鱼数/总鱼数）×100%。实验重复三次。2.1.11重组蛋白原核表达纯化2.1.11.1获得编码蛋白的目的基因片段以TSS基因组DNA为模板，利用引物对PspBF4/PspBR4和TfeRF4/TfeRR4（表2.4）进行PCR扩增，分别获得PspB的蛋白酶结构域编码序列（氨基酸67至419）和TonB依赖型受体结构域的编码序列（氨基酸479至751），按照2.1.6进行连接转化测序。测序正确的菌株转接培养保种。2.1.11.2构建表达载体和表达菌株（1）上一步保种的菌株接种培养并提取质粒，EcoRV酶切质粒，切胶回收备用。34 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究（2）接种实验室保存的含pET32a或pET259（二者均带有His标签蛋白）质粒的菌株至5mlLB液体培养基中，提取质粒。EcoRV酶切pET32a，37℃水浴2h，加入1μlCIAP去磷酸化水浴1h，胶回收备用。SwaI酶切pET259，30℃水浴2h，加入1μlCIAP去磷酸化37℃水浴1h，胶回收备用。（3）将（1）切胶回收的片段与切好的质粒进行连接，将含有pspB的片段连接pET32a，将含有tfeR的片段插入到pET259中，16℃连接过夜。（4）连接产物转化至BL21（DE3）感受态细胞中。（5）菌落PCR检测转化结果，筛选重组成功的阳性菌落并扩大培养保种，命名为BL21/pEtPspB和BL21/pEtTfeR。2.1.11.3pEtPspB和pEtTfeR在大肠杆菌中的诱导表达纯化按实验室已发表文章将蛋白重组表达纯化（Lietal.2015）。将表达菌株BL21/pEtPspB和BL21/pEtTfeR分别接种至LB液体培养基中，37℃扩大培养。待OD600≈0.4时，取出5ml菌液作为对照组。在剩余菌液中加入终浓度为1mMIPTG，16℃培养12h诱导表达。离心收集菌体沉淀，用4ml裂解缓冲液（LysisBuffer）重悬菌体，液氮速冻，利用超声波破碎仪在冰浴环境中进行超声破碎，将破碎液分装于2ml离心管中，4℃离心保存上清液。沉淀用2mlBufferB裂解液重悬，室温离心，保存上层液体。最后将样品进行SDS-PAGE电泳分析。SDS-PAGE检测到重组蛋白存在于包涵体，利用Ni柱对重组蛋白进行提纯（WangandSun，2016）。用PEG20,000浓缩，并且根据BSA标准曲线估算浓度，分装后置于-80℃冰箱备用。2.1.12疫苗保护效应按实验室已发表文章制备疫苗（Liuetal.2015）。rPspB和rTfeR用PBS稀释至200g/ml，加入等体积的氢氧化铝佐剂混合，对照组PBS与氢氧化铝混合。健康大菱鲆分成两组，每组50条，腹腔注射50l混合液。一个月后，每个组选取35条鱼，肌肉注射50l浓度为5×106CFU/ml的TSS。连续观察20天，记录大菱鲆死亡情况。随机挑选几条死鱼，检测肝脾肾的细菌侵染情况。实验重复两次。计算相对死亡率（RPS）：35 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究2.1.13ELISA检测血清效价（1）大菱鲆免疫30天后，实验组对照组各选10条，抽血制备血清。（2）用包被液稀释纯化后的重组蛋白，至浓度10g/ml，吸取100l加至赖氨酸处理过的96孔板，4℃过夜。（3）去掉包被液，用PBST（PBS,0.1%Tween-20）洗涤液洗3次。（4）加入300l封闭液，37℃静置2h，PBST洗涤液洗3次。（5）加100l不同稀释倍数的大菱鲆血清，37℃静置2h，PBST洗涤液洗3次。（6）加100l二抗（鼠抗大菱鲆IgM），37℃静置2h，PBST洗涤液洗3次。（7）加100l三抗（羊抗鼠HRP），37℃放置1h，PBST洗涤液洗3次。（8）加100l显色液TMB，37℃静置5min。（9）加50l2M的H2SO4，显色后立即测量液体在450nm处的吸光值。2.1.14rTfeR多克隆抗体制备取500µlrTfeR蛋白溶液（含有50µgrTfeR）和500µl弗氏完全佐剂混匀乳化，皮下多点注射SPF级小鼠。免疫21天后，同样的蛋白量加500µl弗氏不完全佐剂乳化加强免疫，再过7天后，同样的蛋白量加500µl弗氏不完全佐剂乳化再次加强免疫。再过一周，小鼠麻醉后眼球取血，制备血清，分装后-80℃保存。2.1.15荧光显微实验（1）TSS培养至OD7600≈0.8，用PBS稀释至2×10CFU/ml，滴在玻片上。（2）小鼠抗rTfeR的血清和空白血清分别稀释500倍，100µl菌液分别与等体积的抗rTfeR的血清、空白血清、PBS在37℃孵育1h，PBS洗3次。（3）加入100µlFITC标记的羊抗小鼠IgG抗体（1/1000），37℃孵育1h，PBS洗3次。（4）DAPI稀释1,000倍，滴在液滴上，5min后，吸掉多余的液体，PBS洗三次，盖上盖玻片，放置在荧光显微镜下观察拍照。2.1.16抗体封闭细菌粘附细胞实验（1）取100µl牙鲆腮细胞系FG-9307细胞悬液，加在96孔细胞培养板中。（2）TSS培养至OD7600≈0.8，用L-15培养液稀释至10CFU/ml。36 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究（3）抗rTfeR的小鼠血清和空白血清分别稀释1,000倍，TSS菌液分别与抗rTfeR的血清、空白血清混匀。（4）100µl混合液加入96孔板的细胞中，28℃孵育1h、2h、4h之后，PBS洗3次。（5）加入100µl1%TritonX-100裂解细胞，取50µl涂布于LB固体培养基上，28℃培养过夜，平板经PCR验证菌落为TSS后计数。实验重复三次。2.2实验结果2.2.1蛋白质组学分析鉴定铁胁迫下TSS全蛋白表达变化图2.1在不同培养条件下荧光假单胞菌TSS的蛋白质谱图。在正常(A)和缺铁(B)条件下培养TSS，制备全菌蛋白，并进行2-DE分析。数字表示具有差异表达的蛋白质点。Figure2.1Representative2-DEmapsoftheproteinprofilesofPseudomonasfluorescensTSSunderdifferentcultureconditions.WholecellproteinswerepreparedfromTSSculturedinLBmediumsupplementedwith(B)orwithout(A)2,2’-dipyridyl(DP)andsubjectedto2-DEanalysis.Numbersindicateproteinspotswithdifferentialexpression.双向电泳分析结果表明，与普通LB培养基中培养的TSS的蛋白质表达谱相比，在添加DP的LB培养基中培养的TSS有24个差异表达的蛋白，其中15个37 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究显著上调（ratio≥2，P≤0.05），9个点显著下调（ratio≤2，P≤0.05）（图2.1）。随后的MALDI-TOF/TOF分析鉴定出了其中22个蛋白质。在22个确定的蛋白中，有2个是假定蛋白，剩余20个分为4个不同的功能家族（表2.9）。经过预测，15个蛋白质参与细胞代谢，其中包括丝氨酸蛋白酶B（PspB），ATP合成酶F1亚单位β，血红素加氧酶（HemO），S-腺苷-L-高半胱氨酸水解酶，丝氨酸羟甲基转移酶，尿黑酸盐1，2-双加氧酶，2-氧代异戊酸脱氢酶E1组分亚单位α，二烯内酯水解酶，超氧化物歧化酶（Sod），3-羟基异丁酸脱氢酶，蝶呤-4-α-甲醇胺脱水酶，F0F1ATP合酶亚基α，L-鸟氨酸5-单加氧酶腺苷甲硫氨酸合成酶和5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶。另外3种蛋白质，即EvpB家族VI型分泌蛋白，发色团成熟蛋白PvdO和TonB依赖性外膜肠菌素受体（TfeR）都与运输有关。剩余的两种蛋白质，即外膜孔蛋白OprF和触发因子分别是外膜蛋白和分子伴侣。38 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究表2.9TSS全菌差异表达蛋白汇总Table2.9SummaryofthedifferentiallyexpressedproteinsofTSSwholeproteins.FoldratioaMASCOTTheoreticalCoverageTSS+DP/TSSdSpotno.NCBIno.ProteinnameAbrr.scorebpI/Mr(kD)(%)c(mean±SD)eChaperones17gi|567818576triggerfactor5744.77/48.39262.1±0.24[PseudomonasfluorescensFH5]Metabolism1gi|387893805serineproteaseBPspB1555.26/107.073-∞[PseudomonasfluorescensA506]2gi|387896505ATPsynthaseF1subunitbetaAtpD1,3704.92/49.44550.22±0.03[PseudomonasfluorescensA506]3gi|387895399HemeoxygenaseHemO5385.12/21.8727∞[PseudomonasfluorescensA506]5gi|567649469S-adenosyl-L-homocysteinehydrolase1,2405.41/51.80284.4±1.08[Pseudomonassp.FH1]6gi|567817013serinehydroxymethyltransferaseGlyA_17725.75/45.26325±1.11[PseudomonasfluorescensFH5]7gi|387892228homogentisate1,2-dioxygenaseHmgA5295.73/47.5220.19±0.003[PseudomonasfluorescensA506]8gi|3878944992-oxoisovaleratedehydrogenaseE1BkdA11675.96/45.30290.19±0.03componentsubunitalpha[PseudomonasfluorescensA506]9gi|387893058dienelactonehydrolasefamilyprotein2375.66/25.85220.17±0.002[PseudomonasfluorescensA506]39 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究续表FoldratioaMASCOTTheoreticalCoverageTSS+DP/TSSdSpotno.NCBIno.ProteinnameAbrr.scorebpI/Mr(kD)(%)c(mean±SD)e10gi|387892089superoxidedismutaseSod1205.59/22.33630±6.03[PseudomonasfluorescensA506]11gi|3878956103-hydroxyisobutyratedehydrogenaseMmsB4065.71/30.55370.19±0.02[PseudomonasfluorescensA506]12gi|387894910pterin-4-alpha-carbinolaminedehydratasePhhB3485.69/13.46460.28±0.06[PseudomonasfluorescensA506]16gi|567645588F0F1ATPsynthasesubunitalpha7325.38/55.41272±0.03[Pseudomonassp.FH4]18gi|387894514L-ornithine5-monooxygenasePvdAPvdA6775.77/49.593355±8.87[PseudomonasfluorescensA506]19gi|387896095S-adenosylmethioninesynthetaseMetK7565.04/42.83412.6±0.94[PseudomonasfluorescensA506]23gi|3878961115,10-methylenetetrahydrofolatereductaseMetF2635.9/31.49295.5±1.98[PseudomonasfluorescensA506]Transport14gi|568143113EvpBfamilytypeVIsecretionprotein3655.27/55.95252.43±0.25[Pseudomonassp.TKP]15gi|387894258chromophorematurationproteinPvdOPvdO3725.82/32.19376.15±0.87[PseudomonasfluorescensA506]24gi|387892034TonB-dependentoutermembraneferricTfeR6255.26/81.373617.1±3.73enterobactinreceptor[PseudomonasfluorescensA506]Membraneproteins40 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究续表FoldratioaMASCOTTheoreticalCoverageTSS+DP/TSSdSpotno.NCBIno.ProteinnameAbrr.scorebpI/Mr(kD)(%)c(mean±SD)e20gi|387895056outermembraneporinOprFOprF3195.73/34.51512.1±0.32[PseudomonasfluorescensA506]Unknownfunctionandhypotheticalprotein4gi|387892131hypotheticalproteinPflA506_09068525.62/66.9310.14±0.03[PseudomonasfluorescensA506]21gi|387895299hypotheticalproteinPflA506_41756825.99/35.4449-∞[PseudomonasfluorescensA506]13NAfNANANANANA2.79±0.6622NANANANANANA4.45±1.32aSpotIDrepresentsthenumberonthe2-DEgels.bMOWSEscoreis−10log(p),wherepistheprobabilitythattheobservedmatchisarandomevent.BasedontheNCBInrdatabaseusingtheMASCOTsearchingprogramasMS/MSdata.Scoresgreaterthan65aresignificant(p<0.05).cNumberofaminoacidsspannedbytheassignedpeptidesdividedbytheproteinsequencelength.dTSS+DP/TSS,inthepresenceandabsenceof2,2’-dipyridyl.eMean,theaverageproteinabundanceratioforthreepairedsamples.SDmeansthestandarddeviationofproteinabundanceratiosofonecertainspotofthreepairedsamples.fNotanalyzed.41 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究2.2.2mRNA水平验证基因差异表达用qRT-PCR方法验证上述22种差异表达蛋白的mRNA表达谱。结果表明，3-羟基异丁酸脱氢酶和两种假定蛋白在蛋白质水平下调，但在mRNA水平表达上调（表2.10）。除了这三个基因外，其他19个基因表现出与相应蛋白质相似的表达模式。表2.10在缺铁或正常培养条件下，TSSmRNA的表达Table2.10SummaryofTSSmRNAexpressioninthepresenceof2,2’-dipyridyl(DP)comparedwiththatintheabsenceofDPmRNAlevelSpotProteinlevelDescription(byqRT-no.(by2-DE)PCR)1serineproteaseBDownDown[PseudomonasfluorescensA506](-∞)(0.3±0.02)2ATPsynthaseF1subunitbetaDownDown[PseudomonasfluorescensA506](0.22±0.03)(0.2±0.08)3HemeoxygenaseUpUp[PseudomonasfluorescensA506](∞)(29.84±5.29)4hypotheticalproteinPflA506_0906DownUp[PseudomonasfluorescensA506](0.14±0.03)(2.07±0.18)5S-adenosyl-L-homocysteinehydrolaseUpUp[Pseudomonassp.FH1](4.4±1.08)(10.5±2.00)6serinehydroxymethyltransferaseUpUp[PseudomonasfluorescensFH5](5±1.11)(8.58±2.10)7homogentisate1,2-dioxygenaseDownDown[PseudomonasfluorescensA506](0.19±0.003)(0.36±0.06)82-oxoisovaleratedehydrogenaseE1componentDownDownsubunitalpha[PseudomonasfluorescensA506](0.19±0.03)(0.13±0.02)9dienelactonehydrolasefamilyproteinDownDown[PseudomonasfluorescensA506](0.17±0.002)(0.64±0.07)10superoxidedismutaseMnUpUp[PseudomonasfluorescensA506](30±6.03)(22.89±6.06)113-hydroxyisobutyratedehydrogenaseDownUp[PseudomonasfluorescensA506](0.19±0.02)(2.82±0.23)12pterin-4-alpha-carbinolaminedehydrataseDownDown[PseudomonasfluorescensA506](0.28±0.06)(0.54±0.07)14EvpBfamilytypeVIsecretionproteinUpUp[Pseudomonassp.TKP](2.43±0.25)(24.85±8.04)42 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究续表mRNAlevelSpotProteinlevelDescription(byqRT-no.(by2-DE)PCR)15chromophorematurationproteinPvdOUpUp[PseudomonasfluorescensA506](6.15±0.87)(8.77±0.01)16F0F1ATPsynthasesubunitalphaUpUp[Pseudomonassp.FH4](2±0.03)(21.63±5.11)17triggerfactorUpUp[PseudomonasfluorescensFH5](2.1±0.24)(33.63±7.18)18L-ornithine5-monooxygenasePvdAUpUp[PseudomonasfluorescensA506](55±8.87)(22.86±4.24)19S-adenosylmethioninesynthetaseUpUp[PseudomonasfluorescensA506](2.6±0.94)(3.79±0.17)20outermembraneporinOprFUpUp[PseudomonasfluorescensA506](2.1±0.32)(30.36±6.29)21hypotheticalproteinPflA506_4175DownUp[PseudomonasfluorescensA506](-∞)(1.81±0.25)235,10-methylenetetrahydrofolatereductaseUpUp[PseudomonasfluorescensA506](5.5±1.98)(2.00±0.20)24TonB-dependentoutermembraneferricenterobactinUpUpreceptor[PseudomonasfluorescensA506](17.1±3.73)(14.27±3.32)2.2.3分析并突变编码四种差异表达蛋白的基因我们对上述已鉴定的差异表达的四种蛋白，即HemO、PspB、Sod和TfeR，进行进一步分析。序列分析表明，这四个蛋白分别与荧光假单胞菌A506中相应的同系物具有100%、99.9%、99.5%和98.8%的一致性（GenBank登录号AFJ57384.1、AFJ55747.1、AFJ54997.1和AFJ59752）。HemO由202个氨基酸残基组成，并具有保守的血红素结合域。Sod有203个氨基酸残基，具有铁/锰超氧化物歧化酶的保守结构域。预测PspB是跨膜蛋白，它由1035个氨基酸残基组成，其含有丝氨酸蛋白酶结构域（位置83-405）和自转运结构域（位置758-1016）。TfeR具有752个残基并含有TonB依赖型受体结构域（位置479-751），并且是外膜蛋白。通过in-frame基因敲除法对TSS中这四个基因（hemO、pspB、sod和tfeR）分别进行突变，所得到的突变株分别命名为TSSΔhemO、TSSΔpspB、TSSΔsod和TSSΔtfeR。2.2.4TSSΔhemO、TSSΔpspB、TSSΔsod和TSSΔtfeR的生物学功能2.2.4.1对生长的影响43 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究我们检测了TSS和突变株在LB培养基中的生长情况。结果表明，与TSS相比，TSSΔhemO、TSSΔpspB、TSSΔsod的生长模式与TSS的生长模式基本一致，而TSSΔtfeR的生长状态在对数期后期和稳定期略有延缓（图2.2）。图2.2野生型和突变型荧光假单胞菌的生长状况。荧光假单胞菌TSS、TSShemO、TSSpspB、TSSsod和TSStfeR在LB培养基中培养，并在不同时间点测量OD600处的吸光度。数据为三次实验的结果，以平均值±SEM表示。Figure2.2GrowthofwildtypeandmutantPseudomonasfluorescens.P.fluorescensTSS,TSShemO,TSSpspB,TSSsod,andTSStfeRwereculturedinLBmedium,andcelldensitywasdeterminedatvarioustimepointsbymeasuringabsorbanceatOD600.Dataarethemeansofthreeindependentassaysandpresentedasmeans±SEM.2.2.4.2对抵抗宿主血清杀菌活力的影响为了检测细菌抵抗宿主血清杀伤的能力，将TSS、TSSΔhemO、TSSΔpspB、TSSΔsod和TSSΔtfeR与大菱鲆血清一起孵育，随后测定细菌存活率。结果表明，与TSS相比，TSSΔhemO、TSSΔpspB和TSSΔtfeR表现出较低的存活率，而TSSΔsod的存活率与TSS相当（图2.3）。44图2.3野生型和突变型荧光假单胞菌在鱼血清中的存活率。 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究荧光假单胞菌TSShemO、TSSpspB、TSSsod和TSStfeR与大菱鲆血清孵育1h，通过平板计数确定存活的细菌数。数据为三次实验的结果，以平均值±SEM表示。TSS和突变体存活率之间的显著性差异用星号表示。**P<0.01；*P<0.05。Figure2.3SurvivalofwildtypeandmutantPseudomonasfluorescensinfishserum.P.fluorescensTSS,TSShemO,TSSpspB,TSSsod,andTSStfeRwereincubatedwithturbotserumfor1h,andthenumberofsurvivedbacterialcellswasdeterminedbyplatecount.Dataarethemeansofthreeindependentexperimentsandarepresentedasmeans±SEM.SignificancesbetweenthesurvivalratesofTSSandthemutantsareindicatedwithasterisk.**P<0.01；*P<0.05.2.2.4.3对侵染宿主组织的影响为了检测敲除hemO、pspB、sod和tfeR后对TSS侵染宿主组织有无影响，将野生型和突变型注射到大菱鲆中，分别在感染后24h、48h、60h和70h测定扩散到肾脏和脾脏的细菌数。结果表明，与被野生型TSS感染后的鱼相比，被TSSΔhemO感染的鱼脾脏肾脏中的细菌数在所有时间点中均显著降低；对于被TSSΔpspB感染的鱼，组织在48h、60h和70h的细菌数均显著降低；对于被TSSΔtfeR感染的鱼，在脾脏的所有检测时间点中和肾脏的48h、60h和70h中，细菌存活率显著降低（图2.4）。而被TSSΔsod感染的鱼两种组织中的细菌数与被TSS感染鱼的细菌数差不多（数据未显示）。图2.4野生型和突变型荧光假单胞菌对鱼组织的侵染。45 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究大菱鲆接种荧光假单胞菌TSShemO、TSSpspB、TSSsod、和TSStfeR。感染后不同时间点肾脏（A）和脾脏（B）中的细菌量。数据为三次实验的结果，以平均值±SEM表示。**P<0.01；*P<0.05。Figure2.4InvasionofwildtypeandmutantPseudomonasfluorescensinfishtissues.TurbotwereinoculatedwithPseudomonasfluorescensTSS,TSShemO,TSSpspB,andTSStfeR.Atdifferenthourspost-infection,bacterialloadsinkidney(A)andspleen(B)weredeterminedbyplatecount.Theresultsarethemeansofthreeindependentexperimentsandpresentedasmeans±SEM.**P<0.01;*P<0.05.2.2.4.4对宿主致死率的影响之后对毒力显著性降低的三株敲除株TSSΔhemO、TSSΔpspB和TSSΔtfeR进行下一步研究。为了检测野生株和突变株对宿主的致死力，大菱鲆注射相同剂量TSS、TSSΔhemO、TSSΔpspB和TSSΔtfeR，并监测宿主的死亡率。结果表明，被TSS，TSSΔtfeR和TSSΔpspB感染的鱼，第3天开始死亡，被TSSΔhemO感染的鱼，第4天开始死亡（图2.5）。在感染第7天之后，所有的鱼都不再死亡。最终，被TSSΔhemO、TSSΔpspB和TSSΔtfeR感染的鱼的存活率分别为73.3%，46.7%和53.3%，明显高于被TSS感染的鱼（13.3%）。图2.5野生型和突变型荧光假单胞菌对宿主的致死率。大菱鲆感染荧光假单胞菌TSS，TSSΔhemO，TSSΔpspB和TSSΔtfeR，每天监测鱼的死亡数。**P<0.01；*P<0.05。Figure2.5HostmortalityinducedbywildtypeandmutantPseudomonasfluorescens.46 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究TurbotwereinfectedwithP.fluorescensTSS,TSShemO,TSSpspB,andTSStfeR.Thefishweremonitoreddailyformortalityandsurvival.**P<0.01；*P<0.05.2.2.5重组蛋白rTfeR和rPspB作为疫苗的潜力由于TfeR和PspB是外膜或外分泌蛋白，因此我们研究了它们诱导宿主产生针对TSS感染的免疫保护潜力。为此，原核表达纯化了重组蛋白rTfeR和rPspB。rTfeR和rPspB纯化后，SDS-PAGE图如下：图2.6SDS-PAGE分析纯化后的重组蛋白。通过SDS-PAGE分析纯化的rTfeR（泳道1）和rPspB（泳道2），M：蛋白质标准分子量。Figure2.6SDS-PAGEanalysisofpurifiedrecombinantproteins.PurifiedrTfeR(lane1)andrPspB(lane2)wereanalyzedbySDS-PAGE.M:proteinmarkers.之后对大菱鲆注射纯化后的蛋白，并在接种一个月后用TSS攻毒。宿主生存率监测显示，被rTfeR和rPspB接种的鱼，存活率分别为57%和37%，显著高于对照鱼的存活率（14%）（图2.7）。rTfeR和rPspB的RPS保护率分别为50%和27%。实验重复三次，保护率基本一致。ELISA分析显示，在接种后1个月，分别检测被rTfeR和rPspB接种的鱼中针对rTfeR和rPspB的特异性血清抗体效价，分别为27和26。图2.7接种疫苗的鱼的存活率。47Figure2.7Survivalofvaccinatedfish. 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究用荧光假单胞菌TSS感染接种rTfeR和rPspB的大菱鲆并每天监测死亡数。**P<0.01；*P<0.05。2.2.6rTfeR抗体与TSS的相互作用为了检测rTfeR抗体是否能识别TSS、TfeR是否位于细菌表面，将细菌与抗rTfeR的血清或对照血清一起孵育，用FITC标记的二抗检测结合的抗体，进行免疫荧光观察。在用抗rTfeR血清处理的细胞中检测到荧光，但在用对照血清处理的细胞中没有检测到荧光（图2.8），表明rTfeR抗体能够结合到TSS表面。图2.8rTfeR抗体与荧光假单胞菌的相互作用。荧光假单胞菌TSS与小鼠抗rTfeR血清（A至C）或免疫前血清（D至F）孵育；对照细胞没有血清（G至I）。放大倍数，40×10。Figure2.8InteractionofrTfeRantibodieswithPseudomonasfluorescens.48 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究P.fluorescensTSSwasincubatedwithmouseanti-rTfeRserum(AtoC)orpreimmuneserum(DtoF)；thecontrolcellswereincubatedwithoutserum(GtoI).Magnification,40×10.2.2.7抗rTfeR的血清对细菌感染的影响上述实验表明，TfeR参与细菌致病并且作用于细菌的表面，我们想知道抗体阻断这种蛋白是否会对细菌感染有影响。为了研究这个问题，将FG细胞（牙鲆腮细胞系）与用抗rTfeR的血清或用对照血清预处理的TSS一起孵育，并在1h、2h和4h后测定细胞中的细菌数量。结果表明，在感染后2h和4h，用抗rTfeR血清预处理的TSS感染细胞的细菌数明显低于用对照血清预处理的TSS的细菌数（图2.9）。图2.9抗rTfeR的血清对细菌感染的影响。用抗rTfeR的血清或用普通血清处理的荧光假单胞菌TSS感染FG细胞。感染后不同时间点测定细菌数量。数据是三次重复实验的结果，以平均值±SEM表示。**P<0.01。Figure2.9EffectofrTfeRantiserumonbacterialinfection.FGcellswereinfectedwithPseudomonasfluorescensTSSthathadbeentreatedwithorwithout(control)rTfeRantiserumorpreimmuneserum.Bacterialrecoveryfromthecellswasdeterminedatdifferenthourspost-infection.Theresultsarethemeansofthreeindependentexperimentsandpresentedasmeans±SEM.**P<0.01.2.3讨论在本章中，我们分析了在正常和铁缺乏条件下培养的病原性荧光假单胞菌的全蛋白表达谱。文献报道，通过微阵列和蛋白质组学等方法手段，细菌病原体如49 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究牙龈卟啉单胞菌、鲑鱼气单胞菌沙门氏菌和亚硝化单胞菌中铁的缺乏会改变大量基因/蛋白质的表达(Anaya‐Bergmanetal.,2015；Menanteau-Ledoubleetal.,2014)。在根际荧光假单胞菌Pf-5中，铁胁迫会上调铁稳态和次生代谢物的生物合成相关的基因的表达(Limetal.,2012)。本章通过双向电泳技术鉴定出了铁缺乏条件下差异表达的22种蛋白质，并且经预测这些蛋白质大多参与代谢过程。之前的研究表明铁影响代谢相关基因的表达水平，例如VI型分泌系统(Sanaetal.,2012)，pyoverdine相关的铁载体(SchalkandGuillon,2013；Yeterianetal.,2010)和TonB依赖型外膜受体(Limetal.,2012；Hartneyetal.,2011)受铁调节。同样地，在我们的研究中，也发现了具有相似功能的蛋白质，即EvpB家族VI型分泌蛋白，发色团成熟蛋白PvdO和TfeR，分别在正常和缺铁的情况下表现出不同的表达模式。此外，在我们的研究中，已知是铁调节蛋白的外膜孔蛋白OprF(Duchesneetal.,2013)在缺铁时表达上调。这些结果表明，在致病性荧光假单胞菌中，铁参与调节不同生物过程的蛋白表达。qRT-PCR分析显示，有19个编码差异表达蛋白基因的mRNA谱与其在双向电泳中显示的各自的蛋白质谱一致，表明这些基因在转录水平被铁调节。其他3个基因表现出不同于其蛋白质表达谱的mRNA表达谱，可能是转录后才被铁调控的结果。有研究报道许多铁调节基因也参与了细菌致病性(SheldonandHeinrichs,2012；Arafahetal.,2009；Visaietal.,2009)。在我们的研究中，检测了四种差异表达蛋白对细菌毒力的潜在影响。之前的报道表明丝氨酸蛋白酶与细菌感染有关(Farrandetal.,2013；Kwonetal.,2004)，本研究的毒力实验显示，与TSS相比，pspB敲除株在宿主血清中的存活率显著降低，侵染宿主后，组织中细菌数量显著降低，表明PspB是细菌抵抗宿主血清和在宿主组织中传播所必需的。以前的研究表明，血红素加氧酶通过降解血红素来释放游离铁供细菌使用，从而有助于细菌侵染(Silva-Gomesetal.,2013)。在我们的研究中，发现hemO缺失突变株TSSΔhemO抵抗宿主血清杀伤的能力和侵染宿主组织的能力都有所减弱，这表明HemO是细菌感染宿主所必需的。与血红素加氧酶一样，报道表明TonB依赖型外膜受体参与许多病原体的感染(Llamasetal.,2014)。在我们的研究中，tfeR缺失后，细菌在血清中存活和感染宿主的能力显著减弱。与这些观察结果一致的是，在细菌对宿主的致死率实验中，与野生型TSS相比，TSSΔhemO、TSSΔpspB和50 第二章缺铁胁迫下荧光假单胞菌全菌蛋白表达变化及毒力基因的功能研究TSSΔtfeR对宿主的致死率明显降低。综上所述，这些结果表明，TfeR、HemO和PspB对TSS的毒力至关重要。TonB依赖型外膜受体是一类具有多种功能的大家族蛋白。据报道，在嗜血杆菌中，TonB依赖型外膜受体—血红蛋白受体HgbA作为疫苗有明显的保护效应(Leducetal.,2011)。最近的研究表明在荧光假单胞菌中，一些TonB依赖型外膜受体也可诱导鱼类产生保护性免疫(Zhangetal.,2014b；Huetal.,2012)。本研究发现，当作为亚单位疫苗时，rTfeR以及rPspB能够对免疫的鱼类产生显著的保护效应并且在免疫的鱼中产生特异性血清抗体。这表明，rTfeR和rPspB的保护作用至少部分来自于B细胞活化。该结论也得到抗体阻断实验结果的支持，即抗rTfeR的血清在很大程度上降低了TSS对细胞的侵袭。当TSS与抗rTfeR的血清一起孵育时，由TSS产生的天然TfeR可被抗TfeR的抗体识别并结合，并且该结合很可能干扰TfeR的正常功能，从而导致对宿主细胞感染率降低。综上，在本研究中，我们首次对致病性荧光假单胞菌中铁相关蛋白进行了全局性的分析。我们发现缺铁胁迫条件能够影响大量蛋白质的表达，其中的一些蛋白质与细菌毒力有关，并且能够以重组蛋白的形式诱导宿主产生保护性免疫。这些结果为以后研究铁在致病性荧光假单胞菌中的具体调节作用提供了依据。51 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究3.1材料、方法及仪器设备3.1.1实验材料及仪器设备同2.1.1。3.1.2制备荧光假单胞菌胞外蛋白（1）荧光假单胞菌TSS在LB培养基中28℃培养至OD600为0.8，无菌PBS洗三遍并重悬至107CFU/ml。（2）将无菌玻璃纸分别平铺在含有600µM的2,2'-联吡啶的LB固体平板或正常LB固体平板上，取TSS菌液200µl涂布。（3）28℃培养48h，用无菌PBS将玻璃纸上的细菌清洗下来并收集。（4）菌液于4℃离心5,000g×30min，收集上清液。（5）上清液用0.22μm的过滤器除菌后用PEG20,000浓缩。（6）上清液加入预冷的10%TCA-丙酮，4℃放置12h后，在4℃离心15,000g×1h。（7）沉淀下来的蛋白质用冷丙酮清洗后，溶于UTCD溶液（7M尿素、2M硫脲、2%CHAPS和40mMDTT）中。（8）蛋白用2D-Clean-UpKit纯化，并用BCA蛋白测定试剂盒测定浓度。3.1.3双向电泳、质谱分析鉴定方法步骤同2.1.4。3.1.4构建突变株TSSfha突变株TSSfha的构建：（1）用引物F1（5'-AGATCTGTGGTGTTGAACAACGCCT-3'，下划线序列，BglII酶切位点）和R1（5'-AGATCTATCGGCCGCCTGGCCGAA-3'，下划线序列，BglII酶切位点）对TSS基因组DNA进行PCR扩增，获得需要进行突变的Pffha（TSS的FHA）的内部片段（氨基酸241〜408）。52 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究（2）片段连接到自杀质粒p705T，转入S17-1λpir感受态细胞，阳性克隆菌株与TSS接合转移，之后涂布在含有四环素和氯霉素的LB固体平板上进行同源重组，挑选阳性单克隆进行测序验证。只需要一次同源重组，方法步骤同2.1.6.4。（3）筛选出的突变株命名为TSSfha。3.1.5细菌粘附FG细胞能力的检测（1）取100µl牙鲆腮细胞系FG-9307细胞悬液，加在96孔细胞培养板中。（2）TSS和TSSfha在LB液体培养基中培养至OD600≈0.8，用L-15培养液稀释至107CFU/ml。（3）100µlTSS和TSSfha菌液分别加入96孔板内的细胞中，28℃孵育1h、2h、4h之后，PBS洗3次。（4）加入100µl1%TritonX-100裂解细胞，取50µl涂布于LB固体培养基上，28℃培养过夜，平板经PCR验证菌落为荧光假单胞菌后计数。实验重复三次。3.1.6细菌自凝集效应和胞外基质的产生（1）TSS和TSSfha在LB液体培养基中培养至OD600≈0.8。（2）各取出100µl菌液，加入无菌的96孔培养板中并28℃孵育24h左右，观察小孔内菌液表层变化。（3）另各取100µl菌液，加入铺好无菌细胞爬片的12孔板中，分两组放置于28℃培养箱，第一组在8h左右用扫描电子显微镜观察其菌体凝集状态，第二组在20h左右用扫描电子显微镜观察其胞外基质产生情况。（4）剩余菌液静置在试管内，使其自然沉淀48h左右，观察试管内菌体表层以及试管底部菌体沉降状态。（5）实验重复三次，选出具有代表性的图片。3.1.7细菌运动性能力检测（1）TSS和TSSfha在LB液体培养基中培养至OD600≈1.0。（2）取5μl细菌悬液，轻轻点至含有0.3%琼脂（w/v）的新鲜LB培养基平板的中心。53 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究（3）28℃正置培养，48h后，通过测量平板上细菌圈的直径来评估细菌的运动性。（4）实验重复三次，选出具有代表性的图片。3.1.8细菌鞭毛检测TSS和TSSfha在LB固体培养平板上28℃培养20h。将细菌用无菌PBS轻轻吹打下来，按照之前的处理（Zhangetal.,2014a）利用透射电子显微镜观察细菌鞭毛情况。实验重复三次，选出具有代表性的图片。3.1.9细菌生物膜形成能力检测（1）TSS和TSSfha在LB液体培养基中培养至OD600≈0.8。（2）PBS清洗菌体后稀释至108CFU/ml，取200μl菌液加入96孔培养板中，28℃孵育24h，空白LB液体培养基作为阴性对照。（3）吸出液体，PBS清洗三遍，室温晾干。（4）加入200μl1%结晶紫染色液，室温染色20min，吸出染色液。（5）加入200μl30%乙酸后，室温15min溶解结晶紫，在OD=570nm处测各孔吸光光度值。实验重复三次，统计分析数据。3.1.10细菌凝血实验（1）TSS和TSSfha在LB液体培养基中培养至OD600≈0.8。（2）PBS清洗并重悬至浓度为2×109CFU/ml、2×108CFU/ml、2×107CFU/ml和2×106CFU/ml。（3）抽取新鲜健康大菱鲆血液，无菌PBS洗涤三次，重悬至终浓度为2%（v/v）。（4）96孔V型板中加入50μl菌液或PBS与50μl大菱鲆红细胞，室温孵育1h。（5）1h后，按照文献中报道的方法检测血细胞是否凝集（Astanehetal.,2014）。3.1.11抗宿主血清杀菌功能TSS和TSSfha在LB液体培养基中培养至OD600≈0.8。其余步骤同2.1.8。3.1.12组织侵染和对宿主致死率分析TSS和TSSfha在LB液体培养基中培养至OD600≈0.8。其余步骤同2.1.9-54 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究2.1.10。3.1.13蛋白原核表达纯化及抗体制备利用引物F(5’-GATATCATGCCGACTACTCCACACAG-3’,下划线为EcoRV酶切位点)和R(5’-GATATCGAAGTCGACCTGATTGCGG-3’,下划线为EcoRV酶切位点)对TSS基因组DNA进行PCR扩增，获得含有凝血活性结构域的片段PfFha(氨基酸1-684)。将此片段连至pET259表达载体并诱导表达，同时使用pET32a载体表达标签蛋白rTrx，作为实验对照蛋白。方法步骤同2.1.11，蛋白纯化后命名为rFha，对照蛋白同样方法纯化，命名为rTrx并用PBS调节至与rFha相同浓度。制备小鼠多克隆抗体的步骤同2.1.14。3.1.14免疫荧光显微观察TSS表面PfFhaTSS在含DP的LB液体培养基中培养至OD600≈0.8。其余步骤同2.1.15。3.1.15免疫荧光显微观察rFha与FG细胞之间的作用（1）将复苏好的FG细胞平铺于12孔细胞培养板中，加入100μg/ml的rFha或rTrx，对照组加入等体积PBS，22℃下孵育2h。（2）吸掉液体，用多聚甲醛处理30min，PBS洗三次。（3）加入1%牛血清白蛋白，4℃过夜处理细胞。（4）加入1,000倍稀释的小鼠抗His抗体，37℃孵育1h。（5）PBST洗涤细胞三次，加入1,000倍稀释带FITC的山羊抗小鼠IgG，37℃孵育1h。（6）用PBST洗涤3次后，用1,000倍稀释的DAPI染色5min，用荧光显微镜观察。（7）实验重复三次，选取代表性图片。3.1.16抗体血清封闭TSS侵染宿主实验（1）TSS在LB液体培养基中培养至OD8600≈0.8，无菌PBS冲洗并重悬至10CFU/ml。（2）1ml菌悬液分别与5l抗rFha的血清、对照血清和PBS混合均匀，28℃水浴1h。（3）健康大菱鲆分成3组，每组15条，分别肌肉注射50l上一步的混合液。55 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究（4）12h、24h和48h分别取5条鱼，解剖取部分脾脏和肾脏，称重，加入100μl无菌PBS，用电动组织研磨器匀浆，然后梯度稀释，取100μl涂布于LB固体培养基上，28℃培养过夜。（5）平板长出菌落后，PCR检测其为荧光假单胞菌，之后计数。实验重复三次。3.1.17疫苗保护效应方法步骤同2.1.12。3.2实验结果3.2.1双向电泳分析双向电泳结果表明，与普通LB培养基中培养的TSS的外分泌蛋白质表达谱相比，缺铁条件下培养的TSS外分泌蛋白中有15个表达差异的蛋白点，其中6个显著上调（ratio≥2，P≤0.05），9个点显著下调（ratio≤2，P≤0.05）（图3.1）。MALDI-TOF/TOF分析鉴定出了其中的12个蛋白质点。其中2个是假定蛋白，剩余10个分为3个不同的功能家族（表3.1）。经过预测，5个蛋白质参与细胞代谢，其中包括ATP合成酶F1亚单位β、丝氨酸蛋白酶B、超氧化物歧化酶、二氢硫辛酸脱氢酶和丝氨酸羟甲基转移酶。鞭毛蛋白、血凝素、脂蛋白属于膜表面蛋白。血红素获取蛋白HasAp、外膜转运蛋白属于运输类蛋白。图3.1在不同条件下培养的荧光假单胞菌TSS细胞外蛋白质谱图。56 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究在含有（B）和不含2,2'-联吡啶（DP）（A）的条件下培养荧光假单胞菌TSS，提取细胞外蛋白进行2-DE分析。数字表示具有差异表达的蛋白质点。PfFha是6号点。Figure3.1Representative2-DEmapsoftheextracellularproteinprofilesofPseudomonasfluorescensTSSculturedunderdifferentconditions.ExtracellularproteinsofP.fluorescensTSSculturedinthepresence(B)andabsenceof2,2’-dipyridyl(DP)(A)weresubjectedto2-DEanalysis.Numbersindicateproteinspotswithdifferentialexpression.ThespotofPfFha(number6)isindicated.57 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究表3.1TSS胞外差异表达蛋白汇总Table3.1SummaryofthedifferentiallyexpressedproteinsofTSSsecretedproteinsFoldratioaMASCOTTheoreticalCoverageTSS+DP/TSSdSpotno.NCBIno.ProteinnameAbrr.bescorepI/Mr(kD)(%)c(mean±SD)Metabolism2gi|387896505ATPsynthaseF1subunitbetaatpD9724.92/49.4477[PseudomonasfluorescensA506]3gi|387893805serineproteaseBpspB4205.38/107.07210.09±0.01[PseudomonasfluorescensA506]7gi|387892089superoxidedismutaseMnSodA11115.59/22.331226.6±6.03[PseudomonasfluorescensA506]11gi|387893049dihydrolipoyldehydrogenase2215.93/50.1311∞[PseudomonasfluorescensA506]12gi|387895731serinehydroxymethyltransferaseglyA_1805.75/45.2614∞[PseudomonasfluorescensA506]Surfacestructures5gi|387894899flagellindomain-containingprotein3025.06/57.24350.27±0.05[PseudomonasfluorescensA506]6gi|387895327adhesin/hemagglutinin,HecAfamily4386.23/171.08132.97±0.43[PseudomonasfluorescensA506]9gi|387894537Lipoprotein3845.75/51.72190.38±0.08[PseudomonasfluorescensA506]Transport58 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究续表FoldratioaMASCOTTheoreticalCoverageTSS+DP/TSSdSpotno.NCBIno.ProteinnameAbrr.bescorepI/Mr(kD)(%)c(mean±SD)4gi|387894927outermembraneproteintransportprotein,1,1406/45.60700.41±0.11OMPP1/FadL/TodXfamily[PseudomonasfluorescensA506]10gi|489286780hemeacquisitionproteinHasAp1344.26/21.0610∞[Pseudomonasfluorescens]Unknownfunctionandhypotheticalprotein1gi|387894385HypotheticalproteinPflA506_32154245.23/27.5138-∞[PseudomonasfluorescensA506]8gi|388006393hypotheticalproteinPseBG33_13673985.26/34.77382.53±0.45[PseudomonassynxanthaBG33R]13NAfNANANANANA0.36±0.1214NANANANANANA0.22±0.0415NANANANANANA0.28±0.06aSpotIDrepresentsthenumberonthe2-DEgels.bMOWSEscoreis-10log(p),wherepistheprobabilitythattheobservedmatchisarandomevent.BasedontheNCBInrdatabaseusingtheMASCOTsearchingprogramasMS/MSdata.Scoresgreaterthan65aresignificant(p<0.05).cNumberofaminoacidsspannedbytheassignedpeptidesdividedbytheproteinsequencelength.dTSS+DP/TSS,inthepresenceandtheabsenceof2,20-dipyridyl.eMean,theaverageproteinabundanceratioforthreepairedsamples.SDmeansthestandarddeviationofproteinabundanceratiosofonecertainspotofthreepairedsamples.fNotanalyzed.59 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究3.2.2mRNA水平验证基因差异表达用qRT-PCR方法验证上述12种差异表达蛋白的mRNA表达谱。结果表明，脂蛋白和外膜转运蛋白在蛋白质水平表达下调，但在mRNA水平表达上调（表3.2）。除了这两个基因外，其他10个基因表现出与相应蛋白质相似的表达模式。表3.2在缺铁或正常培养条件下，TSSmRNA的表达Table3.2SummaryofTSSmRNAexpressioninthepresenceof2,2’-dipyridyl(DP)comparedwiththatintheabsenceofDP.ProteinlevelmRNAlevelSpotno.Description(by2-DE)(byqRT-PCR)1HypotheticalproteinPflA506_3215Down(-∞)Down(0.25±0.03)[PseudomonasfluorescensA506]2ATPsynthaseF1subunitbetaDown(0.28±0.07)Down(0.57±0.17)[PseudomonasfluorescensA506]3serineproteaseBDown(0.09±0.01)Down(0.07)[PseudomonasfluorescensA506]4outermembraneproteintransportDown(0.41±0.11)up(1.46±0.25)protein,OMPP1/FadL/TodXfamily[PseudomonasfluorescensA506]5flagellindomain-containingproteinDown(0.27±0.05)Down(0.73±0.25)[PseudomonasfluorescensA506]6adhesin/hemagglutinin,HecAUp(2.97±0.43)Up(3.97±0.32)family[PseudomonasfluorescensA506]7superoxidedismutaseMnUp(26.6±6.03)Up(15.1±3.22)[PseudomonasfluorescensA506]8hypotheticalproteinUp(2.53±0.45)Up(3.53±0.33)PseBG33_1367[PseudomonassynxanthaBG33R]9lipoproteinDown(0.38±0.08)Up(2.64±0.21)[PseudomonasfluorescensA506]10hemeacquisitionproteinHasApUp(∞)Up(26.8±3.58)[Pseudomonasfluorescens]11dihydrolipoyldehydrogenaseUp(∞)Up(6.21±1.47)[PseudomonasfluorescensA506]12serinehydroxymethyltransferaseUp(∞)Up(2.82±0.42)[PseudomonasfluorescensA506]60 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究3.2.3分析鉴定PfFha荧光假单胞TSS丝状血凝素PfFha是上调的蛋白之一。序列分析显示PfFha的N末端含有信号肽（1至32氨基酸残基）和凝血活性结构域（50至170氨基酸残基）（图3.2）。图3.2PfFha结构域的示意图。结构域以不同的颜色显示：绿色，信号肽；红色，血细胞凝集活性域。Figure3.2SchematicrepresentationsofthestructuraldomainsofPfFha.Thedomainsareshownindifferentcolors:green,signalpeptide;red,haemagglutinationactivitydomain.3.2.4细菌运动性、鞭毛形成和自凝集效应为了检测PfFha的功能，利用插入突变技术构建了PfFha表达缺陷的TSS突变株，命名为TSSfha。与TSS相比，TSSfha在LB软琼脂平板中的几乎不运动（图3.3A）。使用透射电子显微镜观察到，TSS菌体一端具有极性鞭毛，但TSSfha菌体的鞭毛明显受损（图3.3B）。震荡培养的TSS菌体静置时，能够在试管中或96孔板中自凝集，而TSSfha不能自凝集（图3.4A）。相同地，在扫描电子显微镜下可以观察到TSS菌体的明显聚集，而TSSfha则没有这个现象（图3.4B）。图3.3荧光假单胞菌TSS和TSSfha的运动和鞭毛形态。61 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究（A）TSS（左）和TSSfha（右）在0.3%琼脂LB平板上的运动性。（B）TSS（左）和TSSfha（右）用透射电子显微镜观察。刻度标尺为1μm。结果是三个独立实验的代表之一。Figure3.3MotilityandflagellaofPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.(A)MotilityofTSS(left)andTSSfha(right)inLBmediumplus0.3%(w/v)agar.(B)TSS(left)andTSSfha(right)examinedwithatransmissionelectronmicroscope.Scalebar,1μm.Theresultsrepresentoneofthreeindependentexperiments.图3.4荧光假单胞菌TSS和TSSfha的自聚集。（A）TSS（左）和TSSfha（右）在96孔微量培养板（上），或者在试管中的自凝集（下）。（B）通过扫描电子显微镜（SEM）观察到的自聚集。图片代表三个独立实验之一。Figure3.4AutoaggregationofPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.(A)AutoaggregationofTSS(left)andTSSfha(right)ina96-wellmicroplates(Top),orinatube(Bottom).(B)Autoaggregationobservedbyscanningelectronmicroscope(SEM).Thepicturesrepresentoneofthreeindependentexperiments.3.2.5生长曲线、生物膜和细胞外基质产生生长曲线表明，当在LB培养基中或含有DP的LB培养基中培养时，TSSfha与TSS生长状态基本一致（图3.5）。62 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究图3.5荧光假单胞菌TSS和TSSfha的生长曲线。将细菌在正常(A)或缺铁(B)的LB培养基中培养，并在不同时间点测定细菌浓度。数据为三次实验结果，以平均值±SEM表示。Figure3.5GrowthprofilesofPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.ThebacteriawereculturedinLBmediumsupplementedwith(B)orwithout(A)2,2’-dipyridyl(DP),andcelldensitywasdeterminedatvarioustimepoints.Dataarethemeansofthreeindependentassaysandpresentedasmeans±SEM.生物膜形成实验显示，与野生株TSS相比，TSSfha形成生物膜的能力显著降低（图3.6）。扫描电子显微镜显示，当培养的TSS菌体在盖玻片上静置20h后，在菌体周围观察到大量由纤维状结构形成的网络基质，而TSSfha形成的网络结构非常少（图3.7）。图3.6荧光假单胞菌TSS和TSSfha的生物膜形成。Figure3.6BiofilmformationofPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.63 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究图3.7荧光假单胞菌TSS和TSSfha细胞外基质。TSS（A，B）和TSSfha（C，D）在室温下孵育20h后通过扫描电子显微镜观察。结果是三个独立实验的代表。Figure3.7ProductionofextracellularmatrixstructurebyPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.TSS(A,B)andTSSfha(C,D)wereobservedbyascanningelectronmicroscopeafterincubationfor20hatroomtemperature.Theresultsrepresentoneofthreeindependentexperiments.3.2.6免疫荧光和粘附宿主细胞实验免疫荧光实验表明PfFha位于细菌表面（图3.8）。图3.8TSS表面PfFha的表达。64 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究将荧光假单胞菌TSS与抗rFha抗体（A和B）或对照抗体（D和E）一起孵育。用FITC标记的二抗检测结合的抗体。用DAPI染色并在荧光显微镜下观察。C，A和B的叠加；F，D和E的叠加。放大倍率：40×10，标尺：10μm。Figure3.8ExpressionofPfFhaonbacterialsurface.PseudomonasfluorescensTSSwasincubatedwithanti-rFhaantibody(AandB)orcontrolantibody(DandE).TheboundantibodywasdetectedwithFITC-labeledsecondaryantibody.ThecellswerestainedwithDAPIandobservedunderamicroscopewithfluorescence.C,amergeofAandB;F,amergeofDandE.Magnification:40×10,scalebars:10µm.之后我们检测了PfFha在细菌粘附宿主细胞中的作用。结果表明，当与牙鲆FG细胞孵育时，与宿主细胞粘附的TSS数量随时间增长而增加；不同的是，宿主细胞粘附的TSSfha数量却几乎没有变化，在孵育1h、2h和4h后，比粘附宿主细胞的TSS数量低10.8倍，17.2倍和60.8倍（图3.9）。这些结果表明PfFha在TSS与宿主的相互作用中发挥作用。图3.9荧光假单胞菌TSS和TSSfha与宿主细胞的粘附。将TSS和TSSfha与FG细胞孵育，通过平板计数确定细胞结合细菌的数量。数据为三次实验的结果，以平均值±SEM表示。**P<0.01。Figure3.9AdhesionofPseudomonasfluorescensTSSandTSSfhatohostcells.TSSandTSSfhawereincubatedwithFGcellsforvarioushours,andthenumberofcell-boundbacteriawasdeterminedbyplatecount.Dataarethemeansofthreeindependentexperiments65andarepresentedasmeans±SEM.**P<0.01. 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究3.2.7PfFha结合宿主细胞根据这个结果，我们进一步检测PfFha是否可以直接结合宿主细胞。为此，我们表达纯化了重组蛋白rFha（图3.10）。图3.10SDS-PAGE分析纯化的重组蛋白。通过SDS-PAGE分析纯化的rFha（泳道2）。泳道1，标准分子量。Figure3.10SDS-PAGEanalysisofpurifiedrecombinantproteins.PurifiedrFha(lane2)wasanalyzedbySDS-PAGE.Lane1,proteinmarkers.将FG细胞与rFha一起孵育，并用免疫荧光显微观测细胞结合的rFha。结果在FG细胞上检测到了rFha（图3.11B）。我们在相同的条件下表达纯化出对照蛋白rTrx，当FG细胞与rTrx同样条件孵育时，显微镜下没有检测到与细胞结合的蛋白（图3.11E）。66图3.11rFha与FG-9307细胞的结合。 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究将FG细胞与rFha（A和B）或对照蛋白rTrx（D和E）孵育，并用FITC标记的抗体检测被细胞结合的蛋白。细胞用DAPI染色后用荧光显微镜观察。放大倍数：20×10，标尺：50μm。Figure3.11BindingofrFhatoFG-9307cells.FGcellswereincubatedwithrFha(AandB)orthecontrolproteinrTrx(DandE),andthecell-boundproteinwasdetectedwithFITC-labeledantibody.ThecellswerestainedwithDAPIandobservedwithafluorescencemicroscope.Magnifications:20×10,scalebars:50µm.3.2.8凝集血细胞和在宿主血清中存活能力血细胞凝集实验表明，TSS以浓度依赖的方式凝集大菱鲆红细胞；而即使细菌浓度达到较高浓度，TSSfha也没有引起明显的血细胞凝集（图3.12）。血清存活实验显示，与大菱鲆血清孵育1h后，TSS和TSSfha的存活率分别为53.8±10.3%和30.1±3.9%，后者显著低于前者（P<0.05）。图3.13荧光假单胞菌TSS和TSSfha的血细胞凝集。将大菱鲆红细胞与PBS或不同浓度的TSS和TSSfha在室温下孵育1h，观察血细胞凝集。图片是三次重复实验的代表。Figure3.13HemagglutinationofPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.TurbotredbloodcellswereincubatedwithPBS(control)orwithTSSandTSSfhainvariousconcentrationsfor1hatroomtemperature,andhemagglutinationwasobserved.Theresultsrepresentoneofthreeindependentexperiments.67 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究3.2.9突变株的体内实验宿主体内感染实验表明，TSS感染大菱鲆后，随着时间的推移肾脏和脾脏中的TSS数量迅速增加。与之不同的是，TSSfha感染大菱鲆后12h、24h和48h，肾脏和脾脏中细菌的数量明显低于TSS的细菌数（图3.13）。与这些结果一致的是，被TSSfha感染的鱼存活率（66.7%）明显高于被TSS感染的鱼的存活率（6.7%）（图3.14）。图3.13荧光假单胞菌TSS和TSSfha感染宿主。TSS和TSSfha感染大菱鲆，在不同时间点测定肾脏（A）和脾脏（B）中的细菌数量。独立实验重复三次，以平均值±SEM表示。*P<0.05,**P<0.01。Figure3.13InvivoinfectivityofPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.TSSandTSSfhawereinoculatedintoturbot,andbacterialrecoveryfromkidney(A)andspleen(B)wasdeterminedatdifferenttimes.Theresultsarethemeansofthreeindependentexperimentsandpresentedasmeans±SEM.*P<0.05,**P<0.01图3.14荧光假单胞菌TSS和TSSfha对宿主的死亡率。68 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究TSS和TSSfha感染大菱鲆，每天记录鱼的死亡数量。实验重复三次。存活率之间的显著性差异用logrank检验分析，**P<0.01。Figure3.14HostmortalityinducedbyPseudomonasfluorescensTSSandTSSfha.TurbotwereinfectedwithTSSandTSSfha,andthefishweremonitoreddailyformortalityandsurvivalfor20days(only12daysareshowninthefigure).Theresultsarethemeansofthreeindependentexperiments.Significancebetweenthesurvivalsofwildtype-andmutant-infectedfishwasdeterminedwithlogranktest.**P<0.01.为了进一步研究PfFha在感染宿主中的重要性，在抗rFha抗体的存在下，用TSS感染大菱鲆，随后测定细菌在肾脏和脾脏中的数量。结果表明，在感染12h、24h和48h后，加rFha抗体的TSS在鱼体内的数量显著低于单独用TSS或TSS加对照抗体在鱼体内的细菌数量（图3.15）。图3.15rFha抗体对荧光假单胞菌感染宿主的影响。大菱鲆感染TSS加rFha抗体，对照抗体或PBS。在感染后不同时间点测定肾脏（A）和脾脏（B）的细菌数量。独立实验重复三次，以平均值±SEM表示。**P<0.01。Figure3.15EffectofrFhaantibodyonPseudomonasfluorescensinfection.TurbotwereinfectedwithTSSinthepresenceorabsenceofrFhaantibody,controlantibody,orPBS(control).Bacterialrecoveryfromkidney(A)andspleen(B)wasdeterminedatdifferenthourspost-infection.Theresultsarethemeansofthreeindependentexperimentsandpresentedasmeans±SEM.**P<0.01.69 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究3.2.10rFha的免疫保护效应上述实验表明，PfFha是感染宿主所必需的外分泌蛋白，我们检测了重组蛋白rFha在大菱鲆中的免疫保护潜力。为此，我们用rFha作为疫苗接种大菱鲆，并在接种一个月后注射TSS，随后监测鱼的死亡数。结果表明，接种rFha的鱼存活率为45.7%，显著高于对照组的存活率（14.3%）（图3.16）。接种rFha的鱼的RPS为36.7%。图3.16rFha作为疫苗对大菱鲆的保护作用。用rFha注射大菱鲆，并在接种后一个月注射荧光假单胞菌TSS。每天记录鱼的死亡数。用logrank检验显著性差异。**P<0.01。Figure3.16ProtectiveeffectofrFhaasavaccine.Turbotwerevaccinatedwithorwithout(control)rFhaandchallengedwithPseudomonasfluorescensTSSatonemonthpost-vaccination.Thefishweremonitoreddailyforsurvival.Significancesbetweenthesurvivalsofthevaccinatedfishandthecontrolfishweredeterminedwithlogranktest.**P<0.01.3.3讨论上一章的研究表明，培养环境中铁的缺乏能够改变荧光假单胞菌TSS大量胞质和膜相关蛋白的表达(SunandSun,2015)。在本章中，我们发现铁缺乏改变了TSS一系列外分泌蛋白的表达模式，丝状血凝素PfFha是其中之一，并且在铁缺乏条件下表达上调。之前的研究表明，FHA既是外膜蛋白，也能分泌到胞外(WeissandHewlett,1986)。经过软件分析，PfFha含有N末端信号肽，且被预测为70 第三章缺铁胁迫下荧光假单胞菌外分泌蛋白表达变化及fha基因的功能研究细胞外蛋白。PfFha还含有凝血活性结构域，这种结构域通常存在于FHA和血红素/血红蛋白结合蛋白的N末端(Rueretal.,2008)。研究报道，在黄单胞菌属中，fha突变会显著降低细菌运动性(Choietal.,2013)，而在柑橘溃疡病菌中，fha的突变会导致细菌更快的凝集(Gottigetal.,2009)；但这些现象都与鞭毛没有直接关系。在我们的研究中，突变株与野生型相比显示出较差的运动性，而且鞭毛明显受损。据我们所知，这是首次表明FHA和鞭毛之间有联系。这些结果意味着PfFha可能参与鞭毛的正常合成或转运。在大肠杆菌和叶缘焦枯病菌中已经报道，细菌自身凝集受细菌表面结构如I型菌毛和IV型菌毛的影响，所以鞭毛受损在一定程度上解释了TSSfha的自凝集效应减弱(LaFuenteetal.,2008；Ulettetal.,2006)。对于许多病原，运动性通常由复杂的网络调节并且与致病性密切相关(JosenhansandSuerbaum,2002)。在类鼻疽伯克氏菌中，鞭毛是小鼠鼻内和腹膜内感染所必需的毒力因子(Chuaetal.,2003)。在珊瑚病原溶珊瑚弧菌中，鞭毛突变减弱了其附着珊瑚的能力，趋化性和感染宿主的能力(Meronetal.,2009)。根据上述实验结果，推测突变株的运动/鞭毛缺陷可能会影响该突变株的毒力。许多研究表明细菌生物膜与致病性之间存在密切关系。在铜绿假单胞菌中，生物膜形成可以显著促进细菌感染(Bjarnsholtetal.,2010)；在野油菜黄单胞菌中，生物膜是侵染宿主是必需的(Dowetal.,2003)；耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的生物膜形成能力对细胞内持续性和慢性感染至关重要(Oyamaetal.,2016)。在柑橘溃疡病菌、百日咳杆菌和鲍曼不动杆菌中，已知fha突变可以降低生物膜的形成(Astanehetal.,2014；Serraetal.,2011；Gottigetal.,2009)。同样，我们观察到fha突变株产生的生物膜显著减少。一些报道表明细菌的运动性在生物膜形成中起着重要作用(Meshcheryakovetal.,2013；Woodetal.,2006)。例如，缺乏鞭毛或鞭毛失去作用的大肠杆菌形成生物膜的能力是有缺陷的(Houryetal.,2010；Woodetal.,2006)，鞭毛受损的迟缓爱德华氏菌生物膜减少(Xuetal.,2014)。生物膜是由细菌胞外聚合物结合的大量细菌形成的多菌体聚集体(MondsandO’Toole,2009；Brandaetal.,2006)。它不仅使细菌之间相互粘合，而且可以使细菌粘附到固体表面(FlemmingandWingender,2010)。我们研究发现，野生型TSS能够在覆盖物的固体表面上形成纤维状结构的基质，但TSSfha丧失了这种能力。推测由纤维结71 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究构形成的基质可能将细菌菌体粘附到一起，并且帮助细菌粘附到物体上，从而促进生物膜生长。FHA通过粘附到宿主表面和凝血功能，在细菌与宿主相互作用中起关键作用(Serraetal.,2011；Rojasetal.,2002)。以前的研究表明，在菊花欧文氏菌中，hecA（fha的同系物）的突变降低了细菌附着在叶上并形成聚集体的能力(Rojasetal.,2002)。在我们的研究中，TSSfha粘附FG细胞的能力显著降低，表明PfFha对细菌与宿主细胞的结合至关重要。与预测的结构域功能一致，TSS表现出明显的血细胞凝集活性，而TSSfha的凝血能力显著减弱，这正如先前在百日咳杆菌中所报道的，FHA作为一种血凝素发挥毒力作用(Colombietal.,2004)。在植物和动物病原菌中，FHA是一种重要的毒力因子，包括菊花欧文氏菌，百日咳杆菌和鲍曼不动杆菌(Astanehetal.,2014；Romeroetal.,2014；Rojasetal.,2002)。我们的研究发现，与野生型相比，突变株在血清中的存活率显著降低，这是首次观察到细菌FHA和抗宿主血清之间的关联。鉴于PfFha是细菌的表面蛋白，能够与宿主因子直接接触，就像其他细菌的表面分子一样(Bernhardetal.,2014；Hallströmetal.,2013)，PfFha可能是与补体系统运作必不可少的血清成分相互作用，并因此阻断或灭活一部分补体分子。体内实验表明，突变株侵染宿主组织和使宿主致死的能力明显减弱。同样地，抗rFha抗体的存在，有可能与天然PfFha相互作用并因此阻断天然PfFha的功能，因此显著地削弱了TSS在大菱鲆组织中的扩散。综上，PfFha是TSS在感染宿主的过程中发挥毒力所必需的因子。在百日咳杆菌中，FHA是最重要的免疫原之一，因为它是主要的外分泌蛋白并介导宿主与病原的相互作用(Balderetal.,2007)。类似地，纯化的FHA蛋白增强了小鼠抵抗支气管炎博德特氏菌的能力(Goebeletal.,2009)。我们研究发现，当用作亚单位疫苗时，rFha能够保护大菱鲆抵抗TSS的感染，这表明在水产养殖业中，rFha可以作为一个候选疫苗，从而控制荧光假单胞菌对鱼类的伤害。综上所述，本章系统分析了荧光假单胞菌FHA与致病相关的生物学特性。首次发现细菌FHA的突变能够影响鞭毛形成、细胞外基质产生和在宿主血清中存活的能力。与其他细菌的FHA一样，PfFha是粘附宿主细胞、凝集血细胞、形成生物膜、使宿主致病和死亡所必需的。此外，以重组蛋白形式存在的PfFha能诱导鱼类产生保护性免疫力。这些结果增加了我们对细菌FHA功能的新认知。72 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究4.1材料、方法及仪器设备4.1.1实验材料及仪器4.1.1.1实验动物健康的半滑舌鳎购自山东省青岛市胶南鱼类养殖场，鱼在实验室内养殖箱中暂养一周，保持水温20℃并充气。在实验前，随机取几条鱼，确保其肝脏，肾脏和脾脏中没有细菌。取样前，先用100mg/L的甲磺酸三苯酯麻醉。4.1.1.2实验菌株和病毒迟缓爱德华氏菌TX01、荧光假单胞菌TSS、哈氏弧菌T4D和鳗弧菌C312以及细胞肿大病毒RBIV-C1为本实验室分离并保存。大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）从TransGen生物科技有限公司购买。嗜水气单胞菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌、海豚链球菌从中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）购买。大肠杆菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌在37℃LB培养基中培养；迟缓爱德华氏菌TX01、嗜水气单胞菌、海豚链球菌、荧光假单胞菌TSS、哈氏弧菌T4D和鳗弧菌C312在28℃LB培养基中培养。4.1.1.3实验仪器及试剂同2.1.2。4.1.2序列分析半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白（CsBPI）的cDNA序列在NCBI数据库中（GenBank登录号：XP_008316264）(Chenetal.,2014)。使用BLAST程序比对分析氨基酸序列的同源性，使用NCBI的保守结构域搜索程序进行结构域分析。用DNAMANVersion6.0对序列进行多重比对分析。利用ExPASyProteomicsServer程序（http://ca.expasy.org）预测蛋白分子量大小和理论等电点（pI）等。4.1.3组织分布特异性取5条健康的半滑舌鳎，解剖并分别取出肾脏、脾脏、肝脏、血液、小肠、73 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究鳃、脑、肌肉和心脏的部分组织。提取组织总RNA，反转为cDNA后进行qRT--△△CtPCR，用β-actin（ACTB）作为内参(Longetal.,2014)，采用2法分析基因表达水平变化。该实验重复三次。4.1.4基因在病原刺激后的组织中表达荧光假单胞菌TSS在LB液体培养基中28℃培养至OD600≈0.8，重悬至1×107CFU/ml。细胞肿大病毒RBIV-C1重悬于PBS中至浓度为5×105copies/ml。半滑舌鳎分成三组，腹腔注射50l荧光假单胞菌TSS、细胞肿大病毒或PBS。感染TSS后6h、12h、24h和48h，或者感染RBIV-C1后1d、3d、5d和7d后，分别取5条鱼，解剖取肾脏和脾脏，提取总RNA，反转录合成cDNA，qRT-PCR分析CsBPI在组织中的表达变化。TSS感染肾脏和脾脏的内参基因分别是ACTB和核糖体蛋白L18（RPL18），病毒感染的肾脏、脾脏内参基因是ACTB。4.1.5蛋白原核表达纯化蛋白CsBPI的编码序列通过引物F1(5’–GATATCATGGTAGAAAACCCCGGGATTGAAA–3’,下划线，EcoRV酶切位点)和R1(5’–GATATCGAAAAACTCATGTGTGTGTTTGGGT–3’,下划线，EcoRV酶切位点)PCR扩增得到，模板为半滑舌鳎组织cDNA。构建表达载体pEtCsBPI的方法同2.1.11.2，将表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达，方法步骤同2.1.11。使用pET32a载体表达标签蛋白rTrx，作为实验对照蛋白。rCsBPI表达在细菌包涵体中，是变性蛋白，纯化同2.1.11.3。将纯化的重组蛋白装入透析袋，参照实验室已有方法进行复性（WangandSun,2016），之后用PEG20,000浓缩蛋白，进行SDS-PAGE电泳鉴定蛋白纯度，并且根据BSA标准曲线估算浓度，分装后置于-80℃冰箱备用。4.1.6抗体制备rCsBPI的小鼠多克隆抗体制备方法同2.1.14。4.1.7提取舌鳎外周血白细胞（1）配制61%Percoll分离液：首先以纯Percoll:15×PBS=9:1的比例配制100%Percoll分离液，再以100%Percoll分离液:1×PBS=61:39的比例配制61%Percoll分离液。74 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究（2）取500g左右的半滑舌鳎麻醉，用装有肝素钠的无菌注射器取血，用PBS稀释一倍。（3）按照血液:61%Percoll分离液=4:9的比例加入离心管，离心400g×10min，此时离心管中由上至下分为四层：血浆层、白细胞层、Percoll分离液层、红细胞层。（4）枪头小心吸取白细胞层，放入等体积的PBS中，混匀后，离心400g×10min，弃上清，重复一次。（5）细胞沉淀用L-15培养液重悬备用。以上步骤皆需无菌操作。4.1.8CsBPI细胞定位PBL在含有10%胎牛血清的L-15培养液重悬，血球计数板计数。加入等量的重悬于L-15培养液中的荧光假单胞菌，22ºC孵育2h。之后离心400g×10min，上清和沉淀留样做Westernblot：将上清和沉淀样品进行蛋白电泳，预染蛋白marker作为分子标准量。电泳结束后，切胶，按照从负极到正极的顺序，依次放入滤纸、胶、膜、滤纸，赶出气泡，100V转膜1h。转膜结束后：（1）取出膜，PBST洗3次。每次5min。（2）加入5%PBST-BSA4℃过夜封闭。之后PBST洗3次。（3）分别加入100倍稀释的小鼠抗rCsBPI抗体、抗rTrx抗体和1,000倍稀释的抗β-actin抗体37℃孵育1h。PBST洗3次。（4）加入2,000倍稀释的HRP标记羊抗小鼠二抗，37℃孵育1h。PBST洗5次。（5）Westernblot显色试剂盒（TianGen，北京）显色10min。蒸馏水洗5次后拍照。4.1.9蛋白结合细菌实验ELISA法测定同2.1.13，免疫荧光显微观察法步骤同2.1.15。4.1.10蛋白杀菌实验（1）迟缓爱德华氏菌、海豚链球菌、荧光假单胞菌TSS和金黄色葡萄球菌在LB培养基中培养至OD4600≈0.8。细菌经PBS洗涤并重悬至10CFU/ml。（2）rCsBPI加入到100μl细菌中，至终浓度为200μg/ml，对照组加等量rTrx75 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究或等体积PBS。（3）室温孵育1h、2h和4h，涂LB平板并计数。实验重复三次。4.1.11rCsBPI破坏荧光假单胞菌TSS膜完整性（1）碘化丙啶（PI）染色法：TSS按上述方法培养，在PBS中重悬至106CFU/ml。加入终浓度为200μg/ml的rCsBPI或rTrx，或相同体积的PBS，室温孵育1h、2h和4h。之后加入10μM的PI，4ºC避光孵育15min，离心6,000g×5min并用PBS洗三次。用流式细胞仪检测PI阳性细胞比例。（2）电镜观察法：按照上述方法孵育TSS，利用扫描电子显微镜观察细菌细胞膜的变化。4.1.12rCsBPI促进PBL吞噬荧光假单胞菌TSSTSS按上述方法培养，PBS洗3次。FITC溶解在二甲亚砜（DMSO）溶液中，配制浓度为100µg/ml，加入TSS，37ºC孵育2h。离心收集菌体，PBS清洗至上清无色澄清，菌体用L-15培养液重悬至109CFU/ml。菌液分别与rCsBPI或rTrx，或等体积L-15培养液混合，室温避光孵育1h。半滑舌鳎PBL分装至离心管中，每管细胞数107个/ml，加入孵育后的体系，阴性对照加入孵育前的TSS。避光孵育2h。离心收集细胞，加入台盼蓝（Solarbio，北京）溶液重悬，室温静置5min，淬灭胞外荧光。PBS清洗直至上清无色澄清，最后加入PBS重悬细胞，用流式细胞仪检测FITC荧光强度，实验数据用WinMDI2.9软件进行分析（WangandSun，2016）。实验重复三次。4.1.13rCsBPI调节半滑舌鳎体内免疫基因表达为了测定免疫基因白细胞介素（IL）-1β、IL-6、IL-8、组织坏死因子（TNF）、趋化因子CsCCK1和CsCXCe1、Myd88、CsISG15、高迁移组蛋白CsHMG和三个IRF（IRF7、8和9）的表达，半滑舌鳎分为三组，每组5条鱼，腹腔注射50μlPBS或rCsBPI或rTrx（200μg/ml）。12h后，通过上述qRT-PCR方法测定头肾中上述免疫基因的表达。实验进行三次。4.1.14rCsBPI促进鱼体抵抗微生物侵染TSS在LB液体培养基中28℃培养至OD7600≈0.8，PBS洗后重悬至1×10CFU/ml。细胞肿大病毒RBIV-C1重悬于PBS中至浓度为5×105copies/ml。将76 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究rCsBPI或rTrx加入细菌或病毒中至终浓度为200μg/ml或加入等体积的PBS，细菌组和病毒组的鱼各分为三组，分别腹腔注射50μl上述处理组。感染细菌12h、24h和48h后，或感染病毒1d、3d和5d后，每个时间点取5条鱼，解剖取部分肾脏和脾脏，细菌组涂LB平板计数，病毒组用qRT-PCR方法计算病毒数。实验重复三次。4.2实验结果4.2.1CsBPI的序列特征CsBPI的序列含有486个氨基酸残基，理论分子量为53.6kDa，pI为5.8。CsBPI具有N-末端信号肽（残基1至16），N-末端BPI/LBP/CETP结构域BPI1（残基26-248）和C-末端BPI/LBP/CETP结构域BPI2（残基263-465）。CsBPI与条石鲷、大黄鱼、西洋鲑、红鳍东方鲀、大黄蜂、墨西哥丽脂鲤和香鱼已知的BPI/LBP具有30.1%至53.7%的序列一致性（图4.1）。4.2.2CsBPI在鱼组织中的表达模式qRT-PCR分析显示，在正常情况下，CsBPI在半滑舌鳎的肠、肌肉、脑、血液、心脏、肝脏、肾脏、鳃和脾脏中表达量逐渐升高，在脾脏中的表达水平为在肠中的30.7倍（图4.2）。在TSS感染宿主的情况下，CsBPI在感染12h、24h和48h的肾脏中以及6h、12h和24h的脾脏中的表达均显著上调（图4.3）。在细胞肿大病毒感染宿主后，CsBPI在感染1d、3d和5d后的肾脏中以及感染3d和5d后的脾脏中的表达均显著上调（图4.3）。77 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究图4.1CsBPI同源序列比对。78 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究括号中的数字表示序列之间的整体同一性。相同的残基为黑色；序列中≥75%的氨基酸残基是蓝色。序列的GenBank号：条石鲷，BAM21037.1；大黄鱼，KKF08800.1；大黄鱼，ABO32254.1；西洋鲑，NP_001135199.1；红鳍东方鲀，XP_003976395.2；大黄蜂，ACO08980.1；墨西哥丽脂鲤，XP_007237045.1；香鱼，BAG49475.1。Figure4.1AlignmentofthesequencesofCsBPIhomologues.Dotsdenotegapsintroducedformaximummatching.NumbersinbracketsindicateoverallsequenceidentitiesbetweenCsBPIandthecomparedsequences.Theconsensusresiduesareinblack；theresiduesthatare≥75%identicalamongthealignedsequencesareinblue.TheGenBankaccessionnumbersofthealignedsequencesareasfollows:Oplegnathusfasciatus,BAM21037.1；Larimichthyscrocea,KKF08800.1；Larimichthyscrocea,ABO32254.1；Salmosalar,NP_001135199.1；Takifugurubripes,XP_003976395.2；Osmerusmordax,ACO08980.1；Astyanaxmexicanus,XP_007237045.1；Plecoglossusaltivelisaltivelis,BAG49475.1.图4.2CsBPI的组织特异性表达。通过qRT-PCR测定半滑舌鳎肠、肌肉、脑、血液、心脏、肝脏、肾脏、鳃和脾脏中的CsBPI表达。为便于比较，将肠表达水平设定为1。数据代表平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数。Figure4.2TissuespecificexpressionofCsBPI.CsBPIexpressionintheintestine,muscle,brain,blood,heart,liver,kidney,gill,andspleenoftonguesolewasdeterminedbyquantitativerealtimeRT-PCR.Forconvenienceofcomparison,79 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究theexpressionlevelinintestinewassetas1.Verticalbarsrepresentmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.图4.3细菌和病毒感染后CsBPI的表达。用荧光假单胞菌（A和B），细胞肿大病毒（C和D）或PBS（对照）感染半滑舌鳎，并通过qRT-PCR测定肾脏（A和C）和脾脏（B和D）中的CsBPI表达。为了方便比较，将对照鱼的表达水平设定为1。数值表示为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数，**P<0.01。Figure4.3CsBPIexpressioninresponsetobacterialandviralinfection.TonguesolewereinfectedwithPseudomonasfluorescens(AandB),megalocytivirus(CandD),orPBS(control),andCsBPIexpressioninkidney(AandC)andspleen(BandD)wasdeterminedbyquantitativerealtimeRT-PCRatvarioustimepoints.Forconvenienceofcomparison,theexpressionlevelofthecontrolfishwassetas1.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.**P<0.01.4.2.3检测PBL中CsBPI的产生对CsBPI进行原核重组表达纯化（图4.4）。检测PBL中CsBPI产生的实验结果表明，细胞外环境和细胞全组分中均有CsBPI的存在（图4.5）。80 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究图4.4纯化后的重组蛋白的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE分析纯化的rCsBPI和rTrx（泳道1和2），并用考马斯亮蓝R-250染色后观察。M，蛋白质标准分子量。Figure4.4SDS-PAGEanalysisofpurifiedrecombinantproteins.PurifiedrCsBPIandrTrx(lanes1and2,respectively)wereanalyzedbySDS-PAGEandviewedafterstainingwithCoomassiebrilliantblueR-250.M,proteinmarkers.图4.5外周血白细胞（PBL）中CsBPI的产生。通过免疫印迹法分析细胞外和全细胞（分别为第2和第3泳道）制备的蛋白，用抗rCsBPI（A）、rTrx（B）或β-肌动蛋白（C）的抗体进行免疫印迹分析。泳道1：蛋白质标准分子量Figure4.5ProductionofCsBPIinperipheralbloodleukocytes(PBL).Proteinspreparedfromtheextracellularandwhole-cell(lanes2and3respectively)factionsoftonguesolePBLwereanalyzedbyimmunoblotwithantibodyagainstrCsBPI(A),rTrx(B),orβ-actin(C).Lane1:proteinmarkers81 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究4.2.4rCsBPI与病原菌的相互作用当rCsBPI与革兰氏阴性菌（迟缓爱德华氏菌、TSS、鳗弧菌和哈氏弧菌）或革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌）一起孵育时，发现rCsBPI以剂量依赖型方式结合所有的革兰氏阴性细菌，其中结合率最高的是TSS（图4.6A）。相比之下，在革兰氏阳性菌中没有观察到明显的结合。在与rCsBPI相同的条件下纯化了对照蛋白rTrx，荧光显微镜下观察到，rCsBPI可以结合TSS，而rTrx没有这个功能（图4.6B）。图4.6通过ELISA（A）和显微镜（B）检测rCsBPI与细菌的结合。（A）迟缓爱德华氏菌、荧光假单胞菌TSS、鳗弧菌、哈氏弧菌、海豚链球菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌与不同浓度的rCsBPI孵育，通过ELISA测定蛋白与细菌细胞的结合。数值为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数。（B）荧光假单胞菌与rCsBPI（B1和B3）或rTrx（B2和B4）一起孵育，用抗His抗体和FITC标记的二抗孵育。然后在荧光显微镜下（B3和B4）或光镜（B1和B2）观察细胞。标尺：4μm。Figure4.6BindingofrCsBPItobacteriadetectedbyELISA(A)andmicroscopy(B).(A)Edwardsiellatarda,PseudomonasfluorescensTSS,Vibrioanguillarum,Vibrioharveyi,Streptococcusiniae,Micrococcusluteus,andStaphylococcusaureusbindwithrCsBPI.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.(B)P.fluorescenswasincubatedwithrCsBPI(B1andB3)orrTrx(B2andB4),andthecellsweretreatedwithanti-HisantibodyandFITC-labeledsecondaryantibody.Thecellswerethenexaminedunderafluorescencemicroscopewith(B3andB4)orwithout(B1andB2)fluorescencelight.Bar:4μm.82 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究4.2.5rCsBPI的杀菌活性为了研究rCsBPI是否具有杀菌活性，以及这种功能是否需要和细菌直接作用，将两种与rCsBPI相互作用的细菌（迟缓爱德华氏菌和TSS）和两种与rCsBPI没有相互作用的细菌（海豚链球菌和金黄色葡萄球菌）分别与rCsBPI孵育1h、2h或4h，细菌存活率通过平板计数确定。结果表明，对于迟缓爱德华氏菌和TSS，用rCsBPI进行处理之后，检测的所有时间点，活细菌数量显著减少。相比之下，用rCsBPI处理的海豚链球菌和金黄色葡萄球菌的存活率没有显著变化（图4.7）。图4.7rCsBPI的杀菌活性。迟缓爱德华氏菌、TSS、海豚链球菌和金黄色葡萄球菌与rCsBPI或rTrx孵育不同时间。孵育后，通过平板计数确定存活的细菌数。数据为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数，**P<0.01,*P<0.05。Figure4.7BactericidalactivityofrCsBPI.Edwardsiellatarda,TSS,Streptococcusiniae,andStaphylococcusaureuswereincubatedwithorwithout(control)rCsBPIorrTrxfordifferenthours.Afterincubation,thenumberofsurvivedbacterialcells(shownasColonyFormingUnit,CFU)wasdeterminedbyplatecount.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.**P<0.01,*P<0.05.83 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究4.2.6rCsBPI改变细菌膜结构完整性为了研究上述观察到的细菌杀伤是否是rCsBPI破坏细菌结构的结果，通过PI染色检测了rCsBPI对TSS膜透性的影响。结果表明，随着孵育时间的增加，与未处理的TSS相比，经rCsBPI处理的细菌显示出更多的PI阳性率（图4.8A）。电子显微镜观察到，经过rCsBPI处理2h的TSS出现明显的结构改变，随着孵育时间从2h增加到4h，细菌结构破坏的更加严重。相比之下，rTrx处理的TSS在PI阳性细胞数和细胞形态方面与空白对照细胞的结果相似（图4.8B）。图4.8rCsBPI对细菌膜通透性（A）和细胞结构（B）的影响。（A）TSS与rCsBPI或rTrx孵育不同时间。孵育后，用PI染色，测定PI阳性细胞。数据为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数。（B）TSS用rCsBPI处理2h（B3）和4h（B4），或用rTrx处理4h（B2）；未处理对照细菌（B1）。然后进行电子显微镜观察。标尺，500nm,**P<0.01。Figure4.8EffectofrCsBPIonbacterialmembranepermeability(A)andcellularstructure(B).(A)TSSwasincubatedwithorwithout(control)rCsBPIorrTrx.Afterincubation,thecellswerestainedwithPIsolution,andPI-positivecellsweredetermined.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.(B)TSSwastreatedwithrCsBPIfor2h(B3)and4h(B4)ortreatedwithrTrxfor4h(B2)；thecontrolcells(B1)wereuntreated.Thecellswerethensubjectedtomicroscopy.Bar,500nm.**P<0.01.84 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究4.2.7rCsBPI促进PBL对TSS的吞噬为了检测rCsBPI与细菌的结合是否影响宿主免疫细胞对细菌的吞噬作用，分别用加入或不加入rCsBPI的TSS与半滑舌鳎PBL一起孵育，随后用流式细胞仪分析PBL对细菌的吞噬。结果表明，经rCsBPI处理的细菌的被吞噬率（M1=26.9%±1.63%）明显高于未处理细菌的被吞噬率（M1=13.2%±0.50%）（P<0.01）。用rTrx处理的细菌对细胞吞噬作用没有明显的影响（M1=14.7%±0.85%）（图4.9）。图4.9rCsBPI对吞噬作用的影响。在含有rCsBPI（C）或没有（B）或rTrx（D）的情况下，用FITC标记的TSS与半滑舌鳎外周血白细胞孵育；对照细胞（A）没有细菌孵育。然后通过流式细胞仪分析细胞。M1代表由于吞噬细菌而增强荧光的细胞群体。数据为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数。Figure4.9EffectofrCsBPIonphagocytosis.TonguesoleperipheralbloodlymphocyteswereincubatedwithFITC-labeledTSSintheabsence(B)orpresenceofrCsBPI(C)orrTrx(D)；thecontrolcells(A)wereincubatedwithoutbacteria.Thecellswerethenanalyzedbyfluorescenceactivatedcellsorting.M1representsthe85 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究cellularpopulationwithenhancedfluorescenceasaresultofbacterialuptake.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.4.2.8rCsBPI调节鱼体内免疫基因的表达通过上述体外实验，我们想进一步研究rCsBPI在体内的作用。之前的研究表明，一些抗菌蛋白具有免疫调节作用，可以调节免疫基因表达(Lietal.,2014；Zhangetal.,2014a)。在本研究中，我们研究了rCsBPI对鱼免疫基因表达的潜在影响，选取了一些基因如IL-1β、IL-6、IL-8、TNFα、两种趋化因子CsCCK1和CsCXCe1、Myd88、ISG15、CsHMG和三个IRF（IRF7，8和9）。结果表明，将rCsBPI注射入半滑舌鳎后，鱼头肾中IL-6、IL-8、CsCCK1、CsCXCe1、CsHMG、CsISG15和IRF8的表达水平显著升高（图4.10）。图4.10rCsBPI对半滑舌鳎免疫基因表达的影响。用rCsBPI，rTrx或PBS（对照）注射半滑舌鳎，通过qRT-PCR测定头肾中免疫基因的表达。对照鱼的表达水平设定为1。数据为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数，**P<0.01,*P<0.05。Figure4.10EffectofrCsBPIontheexpressionofimmunegenesintonguesole.TonguesolewereadministeredwithrCsBPI,rTrx,orPBS(control),andexpressionoftheimmunegenesinheadkidneywasdeterminedbyquantitativerealtimeRT-PCR.Ineachcase,theexpressionlevelofthecontrolfishwassetas1.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.**P<0.01,*P<0.05.86 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究4.2.9rCsBPI促进鱼体抵抗微生物感染我们接下来研究了rCsBPI对与宿主抵抗体内病原体侵染的影响。在rCsBPI的存在下，用TSS或细胞肿大病毒感染半滑舌鳎，随后检测病原体侵入肾脏和脾脏的数量。结果表明，与对照鱼相比，带rCsBPI的TSS感染宿主12h、24h和48h后，肾脏和脾脏的细菌数量明显降低（图4.11）。类似地，在感染带rCsBPI的细胞肿大病毒的鱼中，与对照鱼相比，两组织中的病毒数在感染后3d和5d时显著降低（图4.11）。相比之下，rTrx对鱼体免疫基因表达或鱼体抵抗病原体感染无明显影响。图4.11rCsBPI对半滑舌鳎感染细菌和病毒的影响。在含有或无rCsBPI或rTrx的情况下，舌鳎感染TSS（A和B）或细胞肿大病毒（C和D）。在感染后的各时间点，检测鱼的肾脏和脾脏中的病原体数量。数据为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数，**P<0.01,*P<0.05。Figure4.11EffectofrCsBPIonbacterialandviralinfectionintonguesole.TonguesolewereinfectedwithTSS(AandB)ormegalocytivirus(CandD)inthepresenceorabsence(control)ofrCsBPIorrTrx.Atvarioustimepointspost-infection,pathogenloadsin87 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究thekidneyandspleenofthefishweredetermined.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.**P<0.01,*P<0.05.4.3讨论在本章中，我们分析了硬骨鱼BPI样蛋白CsBPI的序列结构、表达模式和在抵抗荧光假单胞菌TSS感染中发挥的生物学功能。已知哺乳动物的BPI在嗜中性粒细胞和各种粘膜上皮细胞中表达(Levyetal.,2003)。在硬骨鱼多种组织，如鳃、肠、肾、脾脏和血液中都能检测到BPI/LBP的表达(KonoandSakai,2003；Suzukietal.,2009；Xuetal.,2005)。我们的研究中，qRT-PCR分析显示，在正常的生理条件下，CsBPI在多种组织，特别在是免疫器官中表达量较大。与以前的报道相似，即BPI/LBP的表达通过病原微生物的刺激增强(Kimetal.,2012；Stenviketal.,2004)，我们发现TSS和细胞肿大病毒的感染会引起鱼组织中CsBPI表达的显著上调。这些结果表明CsBPI参与由细菌和病毒病原体引起的免疫应答。在哺乳动物中，BPI是由多形核白细胞（PMN）分泌的胞外蛋白质，并且是一种主要的抗菌物质(Weinrauchetal.,1994)。在我们的研究中，分析发现CsBPI有信号肽序列，并被预测为细胞外蛋白。荧光假单胞菌TSS感染PBL后，在细胞的培养基中检测到CsBPI，表明和哺乳动物的BPI一致，CsBPI在病原体刺激后可以被PBL产生到细胞外环境中。作为经典的模式识别受体分子，已知BPI通过损害细菌内膜和外膜来抵御革兰氏阴性菌的侵染(Mannionetal.,1990；Weissetal.,1978；Weissetal.,1975)。BPI的N-末端结构域包含LPS结合区域和杀菌区域(Lampingetal.,1996)。在鱼类中，BPI的抗菌潜力尚未得到验证。本研究发现rCsBPI可以结合革兰氏阴性细菌包括迟缓爱德华氏菌、TSS、鳗弧菌和哈氏弧菌，这些都是鱼类的常见病原。rCsBPI对TSS的结合率最高，并且可以杀伤它，这表明TSS的LPS结构可能与其他的细菌有所不同，更容易被rCsBPI所识别并结合。类似于人类和牡蛎的BPI对细菌膜的渗透作用(Gonzalezetal.,2007a)，rCsBPI呈时间依赖性对TSS膜结构进行破坏。之前的研究表明，BPI可以调理中性粒细胞对革兰氏阴性菌的吞噬作用(Elsbach,1998；Levyetal.,2000)。在肺炎链球菌肺感染模型中，重组的人BPI21可以增强上呼吸道细胞的凋亡和巨噬细胞与细菌之间的相互作用，从而提高被感88 第四章半滑舌鳎杀菌/通透性增加蛋白BPI抗菌功能研究染小鼠的存活率(Srivastavaetal.,2007)。还有研究表明，人类BPI可以将细菌递呈到吞噬细胞，只有被BPI预处理的细菌才能被嗜中性粒细胞和单核细胞所吸收(Iovineetal.,2002)。然而，鱼BPI/LBP的免疫功能，特别是在体内的免疫功能是未知的。在我们的研究中，用rCsBPI处理的TSS更容易被PBL吞噬，表明rCsBPI促进了细胞吞噬过程。同样地，体内实验表明，TSS感染宿主后，用rCsBPI处理的鱼体内的细菌数量显著减少，表明rCsBPI可以减少细菌在宿主组织中的扩散。rCsBPI的抗感染效应可能是由于以下原因：（1）在感染实验中共同注射rCsBPI和TSS的过程中，一些细菌可能在扩散入组织之前就被rCsBPI直接杀死；（2）细菌可能被rCsBPI结合，变得更容易被吞噬细胞吸收并清除。另外，我们在注射rCsBPI的鱼中检测到，许多涉及炎症反应的免疫基因（IL-6和IL-8）、抗菌免疫基因（CsCCK1和CsCXCe1）(Lietal.,2012；Lietal.,2011)、抗病毒免疫基因（CsISG15）(Wangetal.,2012)、抗菌和抗病毒免疫基因（CsHMG和IRF8）表达上调(Longetal.,2014；Zhangetal.,2015)。这些基因的上调表达很可能有助于rCsBPI抑制细菌以及病毒感染的能力。考虑到rCsBPI作为一种蛋白质，可能会被宿主体内蛋白酶所降解，在体内存在时间不会太久，所以在后期感染阶段（如24h后），rCsBPI的抗感染作用可能主要由rCsBPI诱导表达的抗细菌/抗病毒免疫基因所介导。在动物中，BPI/LBP的抗病毒活性尚未有报道。我们的研究发现在rCsBPI的存在下，感染细胞肿大病毒的半滑舌鳎组织中的病毒量显著降低，表明rCsBPI对病毒复制有抑制作用，这是首次发现BPI与抗病毒作用相关。由于没有证据表明rCsBPI与病毒之间存在直接的相互作用，因此rCsBPI对病毒感染的抑制作用可能是由rCsBPI诱导IRF8基因（参与抗病毒免疫）表达并发挥功能的结果。总上所述，本研究表明了CsBPI是一种具有结合细菌和杀菌活性的分泌型免疫因子并且在对抗TSS感染的过程中直接发挥清除作用。同哺乳动物的BPI一致，rCsBPI可以增加被结合细菌的膜通透性，并促进宿主免疫细胞对其吞噬。rCsBPI表现出了未报道过的新特性，即免疫调节作用和在体内抑制病毒感染的能力，并且推测对病毒的作用可能是由rCsBPI诱导的体内抗病毒免疫应答所间接介导的。这些结果增加了我们对BPI生物学功能新的认知，同时也增加了我们对于宿主抵抗外来病原机制的认知。89 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖特异性凝集素抗菌功能研究5.1材料、方法及仪器设备5.1.1实验材料及仪器同4.1.15.1.2序列分析半滑舌鳎三种B型甘露糖特异性凝集素（CsBML1、CsBML2和CsBML3）的cDNA序列存在于NCBI数据库中（GenBank登录号分别为XP_008316312.1、XP_008316311.1和XP_008316314.1）(Chenetal.,2014)。序列分析同4.1.2。5.1.3组织分布特异性方法同4.1.3。5.1.4基因在病原刺激后的组织中表达迟缓爱德华氏菌和哈氏弧菌在LB液体培养基中28℃培养至OD600≈0.8，PBS洗后重悬至1×106CFU/ml。半滑舌鳎（约13.6g）随机分成三组，腹腔分别注射50l迟缓爱德华氏菌、哈氏弧菌或PBS，感染6h、12h、24h和48h后，每组分别取5条鱼，解剖取肾脏和脾脏，提取总RNA，反转录合成cDNA，qRT-PCR分析CsBML1、CsBML2和CsBML3在组织中的表达变化，肾脏和脾脏的内参基因分别是ACTB和核糖体蛋白L18（RPL18）。5.1.5蛋白原核表达纯化蛋白CsBML1、CsBML2和CsBML3的编码序列通过引物BML1F/BML1R、BML2F/BML2R和BML3F/BML3R（表5.1）PCR扩增得到，模板为半滑舌鳎组织cDNA。表5.1引物序列Table5.1Theprimers引物序列(5’3’)aBML1FGATATCATGAACCAGAACTCACTCAGC(EcoRV)90 第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖结合凝集素抗菌功能研究BML1RGATATCTTTTTTTTCAGCAGCCC(EcoRV)BML2FGATATCATGAACCGGAACTCACTCA(EcoRV)BML2RGATATCTTTTTTTTCAGCAGCCC(EcoRV)BML3FGATATCATGGGGACGGCATCAC(EcoRV)BML3RGATATCCTTTCCAACACTCCAGATCTC(EcoRV)下划线：酶切位点构建表达载体pEtCsBML1、pEtCsBML2和pEtCsBML3的方法同2.1.11.2，将表达质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）并诱导表达，方法步骤同2.1.11.3。使用pET32a载体表达标签蛋白rTrx，作为实验对照蛋白。rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3表达在上清中，是活性蛋白，纯化方法如下：（1）Ni柱中加入3mlLysisBuffer(50mMNaH2PO4·H2O,300mMNaCl,10mMImidazole)，4℃平衡30min，弃掉液体。（2）将样品过滤，加入柱子中，4℃结合1h，保留流出液。（3）加入3ml含1%TritonX-114（去除内毒素）WashBuffer(50mMNaH2PO4·H2O,300mMNaCl,20mMImidazole)，4℃洗涤30min，流出液保存，重复一次。（4）加入2mlElutionBuffer(50mMNaH2PO4·H2O,300mMNaCl,250mMImidazole)，于4℃洗脱30min，流出液保存，重复此步骤一次。（5）将纯化的蛋白放入透析袋中，于含20%甘油的PBS中透析4次，每次6h，最后保存于-20℃备用。5.1.6蛋白结合细菌实验（1）藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌接种于在LB培养基中，37℃培养至OD600≈0.8；迟缓爱德华氏菌、海豚链球菌、TSS、哈氏弧菌和鳗弧菌在LB培养基中28℃培养，至OD8600≈0.8。细菌经PBS洗涤并重悬至10CFU/ml。（2）在96孔板的小孔中加入100µl菌液，4℃孵育过夜。（3）5%脱脂奶粉用PBST配制，每孔中加入250μl，37℃孵育1h后，用PBST洗涤3次。91 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究（4）加入100µl稀释至不同浓度的蛋白、rTrx或PBS到板中，22℃孵育2h，并用PBST洗涤3次。（5）加入100µl小鼠抗His抗体（1/1000稀释），37℃孵育1h后，用PBST洗涤3次。（6）加入100µl山羊抗小鼠IgG-HRP（1/2000稀释），37℃孵育1h后，用PBST洗涤5次。（7）用TMBKit显色，测定450nm处的吸光值。实验重复三次，结果用结合指数表示：A450(蛋白)/A450(PBS)。5.1.7蛋白凝集细菌实验（1）细菌按上述方法培养至OD600≈0.8，用TBS缓冲液（50mMTris-HCl，100mMNaCl，pH7.5）洗涤细菌，并重悬于含有10mMCaCl2的TBS（TBS-Ca2+缓冲液）中至浓度为2×109CFU/ml。（2）将rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3加入到细菌中，至终浓度为25μg/ml，滴在在载坡片上，25℃孵育1h。（3）用DAPI（1/1000稀释）对细菌染色5min。吸走多余液体，TBS-Ca2+轻轻洗几次。（4）荧光显微镜观察细菌凝集结果。（5）为了检测EDTA对蛋白凝集细菌的影响，在TBS-Ca2+缓冲液中加入4mMEDTA，其余步骤一致。（6）为了检测蛋白的糖结合特异性，在TBS-Ca2+缓冲液中分别加入200mMD-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖或N-乙酰基-D-葡糖胺，其余步骤一致。实验重复三次。5.1.8蛋白杀菌实验（1）迟缓爱德华氏菌、藤黄微球菌、哈氏弧菌在LB培养基中培养，至OD600≈0.8。（2）细菌在含50%舌鳎血清的TBS-Ca2+缓冲液中重悬至5×104CFU/ml。（3）将rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3加入到1ml细菌中，至终浓度为25μg/ml，对照组加等体积PBS。（4）25ºC孵育1h，取100µl涂布LB固体平板上，过夜28ºC培养后平板计92 第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖结合凝集素抗菌功能研究数。实验重复三次。5.1.9蛋白促进鱼体内抵抗细菌侵染（1）哈氏弧菌在LB培养基中培养，至OD2+600≈0.8，在TBS-Ca缓冲液中重悬至2×106CFU/ml。（2）将rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3加入到细菌中至终浓度为25μg/ml，作为实验组。对照组加等体积PBS。（3）半滑舌鳎分为4组，分别腹腔注射50μl实验组或对照组。（4）感染12h、24h和48h后，每个时间点取5条鱼，解剖取部分肾脏和脾脏，称重研磨涂布LB平板。（5）过夜28ºC培养后平板计数，实验重复三次。5.2实验结果5.2.1序列分析图5.1CsBML1、CsBML2和CsBML3及其同源序列在硬骨鱼中的序列比对。括号中的数字表示全序列的一致性。相同的氨基酸残基标为黑色，≥75%的残基为灰色，保守的甘露糖结合位点用方框标出。序列的GenBank号：伯氏朴丽鱼，XP_005943066.1；93 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究泰国鳢，CCQ25776.1；条石鲷，ADV35591.1；点带石斑鱼，AEG78370.1；红鳍东方鲀，NP_001027736.1。Figure5.1AlignmentofthesequencesofCsBML1,CsBML2,andCsBML3andtheirhomologuesinteleost.Dotsdenotegapsintroducedformaximummatching.Numbersinbracketsindicateoverallsequenceamongthecomparedsequences.Theconsensusresiduesareinblack,theresiduesthatare≥75%identicalamongthealignedsequencesareingrey,andtheconservedmannosebindingsitesareboxed.TheGenBankaccessionnumbersofthealignedsequencesareasfollows:Haplochromisburtoni,XP_005943066.1；Channastriata,CCQ25776.1；Oplegnathusfasciatus,ADV35591.1；Epinepheluscoioides,AEG78370.1；Takifugurubripes,NP_001027736.1.我们在半滑舌鳎中克隆了三种甘露糖特异性凝集素，其中CsBML1和CsBML2由113个氨基酸残基编码，而CsBML3由132个氨基酸残基编码。CsBML1、CsBML2和CsBML3的分子量/pI分别为12.9kDa/4.7、13kDa/8.4和15kDa/5.2。结构域分析显示，三种凝集素均为Bulb型甘露糖特异性凝集素，并具有三个共有的甘露糖结合位点QXDXNXVXY（图5.1）。前两个重复序列是高度保守的，而第三个重复序列QDDGRLVLS（CsBML1和CsBML2）和QEDGRLYLY（对于CsBML3）较不保守。CsBML1和CsBML2、CsBML1和CsBML3、CsBML2和CsBML3之间的序列一致性分别为85.8%、60.9%和63.2%。序列比对显示，在硬骨鱼类中，半滑舌鳎的三种凝集素与其他的甘露糖特异性凝集素的总体序列一致性介于43.6%-53.1%，其他的鱼类包括伯氏朴丽鱼，泰国鳢，条石鲷，点带石斑鱼和红鳍东方鲀（图5.1）。5.2.2基因在舌鳎组织中的表达模式通过qRT-PCR检测不同条件下CsBML1、CsBML2和CsBML3在鱼组织中的表达模式。结果表明，在正常生理条件下，CsBML1在半滑舌鳎的脑、心脏、肠、肾、鳃、脾、肌肉、血液和肝脏中的表达依次增高（图5.2A）。CsBML2的表达模式类似（图5.2B）。对于CsBML3，其表达在肠、脑、肾、心脏、鳃、肌肉、血液、脾脏和肝脏中依次增高（图5.2C）。94 第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖结合凝集素抗菌功能研究图5.2正常生理条件下CsBML1、CsBML2和CsBML3在鱼组织中的表达。通过qRT-PCR测定半滑舌鳎脑、心、肠、肾、鳃、脾、肌肉、血液和肝脏中的CsBML1（A），CsBML2（B）和CsBML3（C）表达。为了方便比较，组织中表达水平最低的设置为1。数据为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数。Figure5.2ExpressionofCsBML1,CsBML2,andCsBML3infishtissuesundernormalphysiologicalcondition.CsBML1(A),CsBML2(B),andCsBML3(C)expressioninthebrain,heart,intestine,kidney,gill,spleen,muscle,blood,andliveroftonguesolewasdeterminedbyquantitativerealtimeRT-PCR.Forconvenienceofcomparison,foreachgenethetissuewiththelowestexpressionlevelwassetas1.Dataareshownasmeans±SEM(N=3).为了检测细菌感染期间CsBML1、CsBML2和CsBML3的表达模式，半滑舌鳎感染哈氏弧菌或迟缓爱德华氏菌，分别在感染后6h、12h、24h和48h检测，结果表明，对于CsBML1，感染哈氏弧菌后，肾脏中所有时间点表达皆上调，脾脏在6h、12h和24h表达上调；感染迟缓爱德华氏菌后，肾脏中6h、12h和24h表达上调；脾脏所有时间点都上调，最大表达量发生在12h（图3A至3D）。同样地，肾脏和脾脏中的CsBML2在所有时间点的表达都显著增加，最高表达量发生在12h或24h（图3E至3H）。对于CsBML3，肾脏感染哈氏弧菌或迟缓爱德华氏菌后，在6h、12h和24h表达均显著上调；而在脾脏中，感染哈氏弧菌后，在所有检测时间点均表达上调，感染迟缓爱德华氏菌后，12h、24h和48h表达上调（图3I至3L）。95 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究图5.3细菌感染时CsBML1、CsBML2和CsBML3在鱼组织中的表达。舌鳎感染哈氏弧菌或爱德华氏菌，通过qRT-PCR确定肾脏和脾脏中CsBML1（A至D）、CsBML2（E至H）和CsBML3（I至L）的表达。对照鱼的表达设定为1。数据表示为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数，P<0.05,P<0.01。Figure5.3ExpressionofCsBML1,CsBML2andCsBML3infishtissuesduringbacterialinfection.Tonguesolewereinfectedwithorwithout(control)VibrioharveyiorEdwardsiellatarda,andtheexpressionofCsBML1(AtoD),CsBML2(EtoH),andCsBML3(ItoL)inkidneyandspleenwasdeterminedbyquantitativerealtimeRT-PCRatvarioustimepoints.Ineachcase,theexpressionlevelofthecontrolfishwassetas1.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.P<0.05,P<0.01.5.2.3蛋白与细菌的结合为了检测CsBML1、CsBML2和CsBML3的生物学特性，利用大肠杆菌表96 第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖结合凝集素抗菌功能研究达系统制备了这三种凝集素的重组蛋白以及对照蛋白rTrx（图5.4）。图5.4rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3的SDS-PAGE分析。通过SDS-PAGE分析纯化的rCsBML1、rCsBML2、rCsBML3和rTrx（泳道2至5），并用考马斯亮蓝R-250染色后观察。泳道1，蛋白质标准分子量。Figure5.4SDS-PAGEanalysisofrCsBML1,rCsBML2,andrCsBML3.PurifiedrCsBML1,rCsBML2,rCsBML3,andrTrx(lanes2to5respectively)wereanalyzedbySDS-PAGEandviewedafterstainingwithCoomassiebrilliantblueR-250.Lane1,proteinmarkers.我们检测了rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3结合革兰氏阴性细菌（迟缓爱德华氏菌、TSS、鳗弧菌和哈氏弧菌）和革兰氏阳性菌（藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌）的活性。结果表明，在25.6μg/ml的高剂量下，所有蛋白都与被检测细菌有明显结合，但不同蛋白之间的结合指数有差异（图5.5）。rCsBML3对大肠杆菌、TSS、鳗弧菌、藤黄微球菌和金黄色葡萄球菌的结合指数均显著高于其他两种蛋白。所有蛋白的结合指数都随着蛋白剂量的降低而降低。在6.4μg/ml的浓度下，rCsBML1可以结合鳗弧菌、哈氏弧菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌；rCsBML2可以结合除了哈氏弧菌之外的所有细菌；而rCsBML3仅能结合鳗弧菌和金黄色葡萄球菌。在1.6μg/ml的浓度下，除了哈氏弧菌之外，所有细菌都能被rCsBML2结合，而rCsBML1和rCsBML3不能结合细菌。在0.4μg/ml的蛋白浓度下，只有rCsBML2可以结合藤黄微球菌和海豚链球菌。而与凝集素相同的条件下纯化的rTrx没有检测到明显的结合细菌作用。97 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究图5.5rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3与细菌的结合。将不同浓度的rCsBML1、rCsBML2、rCsBML3、rTrx或PBS（对照）与Edwardsiellatarda，假单胞菌荧光，鳗弧菌，哈氏弧菌，藤黄微球菌，金黄色葡萄球菌和链球菌孵育。孵育后，通过ELISA测定细菌结合蛋白。值显示为结合指数，其是蛋白质处理的细胞和PBS处理的细胞之间的折叠差异。数据为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数,P<0.05,P<0.01。Figure5.5BindingofrCsBML1,rCsBML2,andrCsBML3tobacteria.DifferentconcentrationsofrCsBML1,rCsBML2,rCsBML3,rTrx,orPBS(control)wereincubatedwithEdwardsiellatarda,Pseudomonasfluorescence,Vibrioanguillarum,Vibrioharveyi,Micrococcusluteus,Staphylococcusaureus,andStreptococcusiniae.Afterincubation,bacteria-boundproteinsweredeterminedbyELISA.Valuesareshownasbindingindex,whichisthefolddifferencebetweenprotein-treatedcellsandPBS-treatedcells.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.P<0.05,P<0.01.5.2.4蛋白凝集细菌的能力98 第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖结合凝集素抗菌功能研究图5.6rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3凝集细菌。99 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究rCsBML1（A）和rCsBML2（B）在TBS-Ca2+（a1〜a10），TBS（b1〜b10），TBS-Ca2+和EDTA（c1〜c10）或TBS-Ca2+和甘露糖（d1至d10）中与藤黄微球菌，哈氏弧菌或迟缓爱德华氏菌孵育1h。如上所述，将rCsBML3（C）与藤黄微球菌，鳗弧菌，哈氏弧菌或迟缓爱德华氏菌孵育。细菌用DAPI染色，用荧光显微镜观察。标尺，10μm。Figure5.6AgglutinationactivityofrCsBML1,rCsBML2,andrCsBML3.rCsBML1(A)andrCsBML2(B)wereincubatedwithMicrococcusluteus,Vibrioharveyi,orEdwardsiellatardafor1hinTBSplusCa2+(a1toa10),inTBSalone(b1tob10),inTBSplusCa2+andEDTA(c1toc10),orinTBSplusCa2+andmannose(d1tod10).rCsBML3(C)wasincubatedwithM.luteus,V.anguillarum,V.harveyi,orE.tardaasabove.ThecellswerestainedwithDAPIandobservedwithafluorescencemicroscope.Bar,10μm.由于如上所示，rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3能够结合迟缓爱德华氏菌、TSS、鳗弧菌、哈氏弧菌、藤黄微球菌、金黄色葡萄球菌和海豚链球菌，我们进一步检测了三种凝集素对这些细菌的凝集能力。结果表明，在Ca2+存在下，rCsBML1和rCsBML2对哈氏弧菌和藤黄微球菌有明显凝集，而rCsBML3则对鳗弧菌、哈氏弧菌和藤黄微球菌有明显凝集（图5.6）。当向反应体系中加入EDTA或甘露糖时，任一种凝集素都观察不到凝集效应。然而，向反应体系中加入半乳糖、葡萄糖和N-乙酰基-D-葡糖胺并不影响rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3的凝集能力。5.2.5蛋白杀菌活性为了检测凝集素与细菌的相互作用对细菌生存的影响，rCsBML1、rCsBML2或rCsBML3分别与迟缓爱德华氏菌、藤黄微球菌和哈氏弧菌一起孵育，随后测定细菌存活数。结果表明，与对照相比，加入rCsBML1和rCsBML2后哈氏弧菌的存活率显著降低，分别为19%和33%（图5.7）。与三种蛋白中的任一种的孵育对迟缓爱德华氏菌或藤黄微球菌的存活都没有显著影响。5.2.6蛋白对舌鳎抗细菌感染作用为了检测rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3的体内抗菌潜力，在凝集素的存在下，半滑舌鳎感染哈氏弧菌，并在感染后12h、24h和48h测定细菌在宿主肾脏和脾脏中的数量。结果表明，在肾脏的所有检测时间点，rCsBML1的存在100 第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖结合凝集素抗菌功能研究显著降低了细菌数量；而在24h和48h，rCsBML2的存在显著降低了的细菌数量（图5.8A）。在脾脏中，rCsBML1和rCsBML2在24h和48h时显著降低了细菌数量（图5.8B）。而rCsBML3的存在对细菌侵染没有明显的影响。图5.7rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3的杀菌活性。在TBS-Ca2+培养1h后，将迟缓爱德华氏菌（A），藤黄微球菌（B）和哈氏弧菌（C）与rCsBML1，rCsBML2或rCsBML3孵育1h，通过平板计数测定细菌存活率。数值为平均值±SEM（N=3）。N，实验的次数，P<0.05,P<0.01。Figure5.7BactericidalactivityofrCsBML1,rCsBML2,andrCsBML3.Edwardsiellatarda(A),Micrococcusluteus(B),andVibrioharveyi(C)wereincubatedwithorwithout(control)rCsBML1,rCsBML2,orrCsBML3inTBSplusCa2+for1h,andbacterialsurvivalwasdeterminedbyplatecount.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.P<0.05,P<0.01.图5.8rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3的体内抗菌作用。在有或没有（对照）rCsBML1，rCsBML2或rCsBML3的情况下，半滑舌鳎感染哈氏弧菌。在感染后的不同时间点测定鱼肾脏（A）和脾脏（B）中的细菌数量。数值为平均值±SEM101 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究（N=3）。N，实验的次数，P<0.05,P<0.01。Figure5.8InvivoantibacterialeffectofrCsBML1,rCsBML2,andrCsBML3.TonguesolewereinfectedwithVibrioharveyiinthepresenceorabsence(control)ofrCsBML1,rCsBML2,orrCsBML3.Bacterialloadsinthekidney(A)andspleen(B)ofthefishwasdeterminedatdifferenttimepointsafterinfection.Valuesareshownasmeans±SEM(N=3).N,thenumberoftimestheexperimentwasperformed.P<0.05,P<0.01.5.3讨论在本章的研究中，我们分析了半滑舌鳎的三种B型甘露糖特异性凝集素的表达模式和抗细菌生物学功能。三种凝集素均具有B型甘露糖特异性凝集素结构域和三个保守基序QXDXNXVXY序列，第三个重复序列有略微修饰。之前的研究表明，QXDXNXVXY基序是雪花莲和大蒜B型凝集素中D-甘露糖的结合位点(Chandraetal.,1999；Hesteretal.,1995)。在硬骨鱼中，Suzukietal.,(2003)基于结构和功能特征鉴定出了一种来自虎河豚的新型凝集素，并将其定义为“Lily型凝集素”，其具有两个QXDXNXVXY基序，并且与CsBML1具有43.6%的一致性(Suzukietal.,2003)。另外一种带状线鳢中的lily型凝集素，与CsBML1具有50%的一致性，并且具有三个甘露糖结合基序(Arasuetal.,2013)。之前的研究表明，不同类型的凝集素在硬骨鱼组织中表达模式不同。例如，在虹鳟鱼中，甘露糖结合凝集素MBL-1和MBL-2分别仅在肝脏和脾脏中表达(NikolakopoulouandZarkadis,2006)；在孔鳐中，鳃、胃、肠和皮肤中都能检测到乳糖特异性凝集素的表达(Tsutsuietal.,2009)。在本研究中，CsBML1、CsBML2和CsBML3在肝脏中表达量最大。以前的研究表明，凝集素的表达通过细菌病原体的刺激而增强(Arasuetal.,2013；Parketal.,2012)，我们发现病原菌哈氏弧菌和迟缓爱德华氏菌以时间依赖型诱导CsBML1、CsBML2和CsBML3表达。这些结果表明CsBML1、CsBML2和CsBML3参与半滑舌鳎在病原菌感染期间的免疫反应。一些研究表明凝集素会凝集细菌，例如来自罗非鱼的岩藻糖凝集素能够凝集嗜水气单胞菌和粪肠球菌(ArgayosaandLee,2009)；来自日本虎鲨皮肤的凝集素能够凝集迟缓爱德华氏菌(Tsutsuietal.,2014)；在半滑舌鳎中，C型凝集素对鳗弧102 第五章半滑舌鳎三种B型甘露糖结合凝集素抗菌功能研究菌和藤黄微球菌有凝集和结合活性(ZhouandSun,2015)。我们的研究发现，在高蛋白浓度下，rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3能够结合所检测的七种细菌，但结合指数明显不同，在较低浓度下，rCsBML1仍具有结合大多数细菌的能力。三种蛋白对荧光假单胞菌TSS有较强的结合力，表明CsBML1、CsBML2和CsBML3可以识别TSS的表面结构。凝集实验显示，在钙离子的存在下，rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3只能凝集一部分细菌，对TSS没有凝集功能。这表明尽管凝集素与所有细菌都能结合，但蛋白-细菌特异性相互作用模式可能在不同的凝集素中不同，只是在特定情况下能够导致细菌凝集。对TSS只结合不凝集表明宿主利用CsBMLs抵抗TSS的感染是以不依赖于凝集的方式，有可能通过结合TSS从而引起其他的免疫分子的聚集，引发下一步免疫反应。EDTA可以使rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3的凝集功能失活，表明这些凝集素可能需要钙作为辅因子来跟配体结合。CsBML1、CsBML2和CsBML3结构中有三个甘露糖结合位点，我们的实验也表明甘露糖的存在可以使三种凝集素的凝集能力失活。植物中的凝集素有抑菌和杀菌作用(Ramosetal.,2014；Gomesetal.,2013；Costaetal.,2010)。在鱼类中，来自军曹鱼的甘露糖结合凝集素对大肠杆菌有抗菌作用(NgaiandNg,2007)；在鳙鱼中，哈氏弧菌的生长受到GANL（一种鳃凝集素）的抑制(Panetal.,2010)。然而，凝集素的杀菌活性很少被报道。在我们的研究中，发现可以被rCsBML1、rCsBML2和rCsBML3凝集的三种细菌中，只有哈氏弧菌能够被rCsBML1和rCsBML2杀死，CsBML3则没有杀菌效应。这些结果表明，CsBML1和CsBML2作为杀菌剂，作用的底物范围较窄，并以不依赖凝集的方式杀死细菌。迄今为止，鱼类凝集素在体内的生物学功能在很大程度上是未知的。在本研究中，当rCsBML1和rCsBML2存在时，感染哈氏弧菌的半滑舌鳎组织中的细菌数量显著减少。这与杀菌结果一致，表明凝集素的体外杀菌能力与体内抗菌作用之间存在联系。哈氏弧菌也是一类鱼类常见病原菌，表明B型凝集素家族的成员作为鱼类免疫分子，执行了清除病原的功能。综上，本研究表明CsBML1、CsBML2和CsBML3是三种具有不同生物学特性的新型B型甘露糖结合凝集素。这三种凝集素对于病原菌TSS，只有结合作用，然而对于其他的革兰氏阳性和革兰氏阴性菌，可以Ca2+依赖的方式结合和凝103 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究集，其中两种凝集素CsBML1和CsBML2具有明显的、高度选择性的杀菌能力，并能够在体内减少细菌感染。这些结果首次表明，硬骨鱼中B型凝集素家族的不同成员在针对细菌病原体的先天免疫防御方面所扮演的角色有所不同，并有可能参与模式识别和清除病原体的过程。104 第六章结论与展望第六章结论与展望6.1结论荧光假单胞菌是一种常见的革兰氏阴性病原细菌，易感染海水鱼类包括半滑舌鳎，给水产养殖业造成了巨大的损失。本文同时从病原和宿主免疫两方面展开研究，通过一系列体内体外实验，得出了以下结论：（1）环境中的铁可以影响鱼类病原菌荧光假单胞菌TSS的毒力且铁相关基因pspB、hemO、tfeR和fha是TSS参与感染的毒力基因。在缺铁胁迫培养条件下，TSS有大量蛋白的表达产生显著性差异。突变了差异表达基因pspB、hemO、tfeR以及fha后，突变株抵抗宿主血清杀伤的能力、侵染宿主组织的能力以及对宿主的毒力显著减弱。fha基因还可以影响细菌的鞭毛形成、自凝集功能以及细菌胞外丝状物形成能力。重组蛋白rPspB、rTfeR以及rFha对鱼体有一定免疫保护效应，可以作为亚单位疫苗潜力分子。TfeR和Fha都能够影响TSS与宿主细胞的粘附能力，其中TfeR通过介导TSS与宿主之间的相互作用发挥毒力；而Fha通过与宿主细胞直接结合帮助TSS粘附宿主细胞。（2）半滑舌鳎天然免疫因子杀菌/通透性增加蛋白CsBPI是宿主抵抗荧光假单胞菌侵染的有力武器。受到荧光假单胞菌感染刺激后，半滑舌鳎体内CsBPI表达量显著上升。重组蛋白rCsBPI能够结合并杀伤荧光假单胞菌，促进宿主细胞对荧光假单胞菌的吞噬，并且可以调节鱼体内免疫相关基因的表达，帮助宿主进一步抵御细菌和病毒的侵染。（3）半滑舌鳎B型甘露糖结合凝集素是天然免疫系统中重要的抗菌因子，但对荧光假单胞菌没有直接清除作用。受到细菌感染刺激后，半滑舌鳎体内CsBML1、CsBML2和CsBML3表达量显著上升。重组蛋白rCsBMLs可以结合荧光假单胞菌TSS。rCsBMLs具有甘露糖结合特异性和Ca2+依赖性，并且能够选择性凝集鱼类病原菌。rCsBML1和rCsBML2具有杀菌活性且显著抑制了病原菌在半滑舌鳎中的侵染。而rCsBML3则不具有此功能。105 鱼类病原菌荧光假单胞菌的致病机制及宿主抗菌免疫因子的作用研究6.2创新点1.系统地构建了鱼类病原荧光假单胞菌在缺铁胁迫状态下的蛋白表达谱。2.发现了细菌fha基因与细菌鞭毛、细菌自凝集能力以及细菌胞外丝状物形成有关。3.研究了硬骨鱼BPI的生物学功能，发现BPI具有调节免疫相关基因表达的能力和增强鱼体抗病毒感染的能力。4.明确了硬骨鱼B型甘露糖结合凝集素的抗菌功能。6.3展望在未来的研究中，应以病原菌与宿主的相互作用为出发点，探究细菌毒力因子和宿主免疫分子之间的联系，找出宿主在发挥抗感染过程中的关键靶点，明确病原菌在宿主体内的感染机制。为鱼类病害防控提供理论依据，最终研发出符合生产实践的鱼类疫苗和佐剂投入到生产实践中，为我国水产养殖业的病害防治提供帮助。106 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致谢致谢本论文是在孙黎研究员的悉心指导下完成的。在五年的硕博学习生涯中，孙老师对科研满怀的热忱、一丝不苟的态度和无私奉献的精神深深地感染并激励着我。五年来，我从一个懵懵懂懂的大学生，从不知如何做实验的科研菜鸟，成长为一位合格的博士毕业生，这巨大的变化，完全依赖于孙老师的教导有方。每一次，从设计实验方案、改进实验方法、分析实验结果，到撰写论文、投稿、修回，到最终文章接收，其中的每一步都倾注了孙老师大量的心血和不厌其烦的操劳。对孙老师的感激之情，无以言表，只有在此向孙老师表达我最衷心的感谢和最诚挚的敬意。感谢课题组的胡永华老师、迟恒老师、孙铂光老师、张健老师、李墨非老师、姜帅老师和孙庆磊老师，感谢你们在实验过程中给予的悉心指导和在生活中提供的无私帮助。感谢课题组的周志侠、张宝存、龙昊、王明清、孙云、汪玮、张书仁、张璐、王晶晶、刘莉、李学鹏、王海亮、隋智海、李逸群、王婷、郝连旭、赵明丽、谷翰杰、陈晨、温丽联、金倩文和赵炎等师兄师姐、师弟师妹们，感谢你们给实验室带来欢声笑语，感谢你们的风雨同舟和相互帮助。感谢中国科学院海洋研究所生物学重点实验室仪器平台老师们的指导和帮助。感谢研究生部老师们的帮助。感谢母亲的理解和支持，感谢家人的关心和帮助，你们的笑容是我前进的动力，是我奋斗的目标，你们是我最坚实的后盾，是我最温馨的避风港。感谢室友回贞立五年的陪伴、理解和在生活上对我的帮助。感谢所有参与论文修订、评阅和答辩的各位专家老师，感谢你们的辛劳，才使得我站完最后一班岗，顺利毕业。最后，感谢我自己。如人饮水，冷暖自知。送自己一句话：祸兮福所倚，福兮祸所伏。望铭记。2017年6月130 作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果作者简历及攻读学位期间发表的学术论文与研究成果作者简历：1989年12月1日出生于河南南阳。2008年9月——2012年7月，在西北农林科技大学生命科学学院获得学士学位。2012年9月——2017年6月，在中国科学院海洋研究所攻读博士学位。已发表的学术论文：SunYY,SunL.Pseudomonasfluorescens:iron-responsiveproteinsandtheirinvolvementinhostinfection[J].Veterinarymicrobiology,2015,176(3-4):309-320.SunYY,ChiH,SunL.Pseudomonasfluorescensfilamentoushemagglutinin,aniron-regulatedprotein,isanimportantvirulencefactorthatmodulatesbacterialpathogenicity[J].FrontiersinMicrobiology,2016,7:1320.SunYY,LiuL,LiJ,etal.ThreenovelB-typemannose-specificlectinsofCynoglossussemilaevispossessvariedantibacterialactivitiesagainstGram-negativeandGram-positivebacteria[J].DevelopmentalandComparativeImmunology,2016,55:194-202.SunYY,SunL.Ateleostbactericidalpermeability-increasingproteinkillsgram-negativebacteria,modulatesinnateimmuneresponse,andenhancesresistanceagainstbacterialandviralinfection[J].PLoSOne,2016,11(4):e0154045.申请的专利：孙黎，孙园园，刘莉，等.荧光假单胞菌铁调控蛋白的应用：中国，104800839A.2015-07-29.孙黎，孙园园.一种鱼类杀菌通透性增强蛋白及其应用：中国，105254735A.2016-01-20.孙黎，孙园园.一种细菌丝状血细胞凝集素Fha重组蛋白的应用：中国，106139138A.2016-11-23131
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