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基于荧光标记的致病菌快速检测及细菌与细胞相互作用研究重庆大学硕士学位论文（专业学位）学生姓名：车玉兰指导教师：徐溢教授学位类别：工程硕士（化学工程领域）重庆大学化学化工学院二O一七年五月本研究获重庆市科技创新项目“基于新型荧光探针和微流控芯片的致病菌快速检测方法及其应用研究”资助 ResearchonRapidDetectionofPathogenandInteractionbetweenBacteriaandCellsBasedonFluorescentLabelingAThesisSubmittedtoChongqingUniversityinPartialFulfillmentoftheRequirementforProfessionalDegreeByCheYulanSupervisedbyProf.XuYiSpeicalty:ME(ChemicalEngnieeringField)CollegeofChemistryandChemicalEngineeringofChongqingUniversity,Chongqing,ChinaMay,2017 中文摘要摘要食源性致病菌易通过食品流通环节感染人群，致病菌的高效检测是食品安全重要保证。此外，细菌感染治疗中耐药菌的出现使新型抗菌药物的需求日益迫切。面对食源性致病菌检测中背景基质复杂、检测时间长、细菌含量少的特点，以及新型抗细菌感染药物研究中药物作用效果检测方法耗时、操作复杂，不能快速筛选等问题。本文基于荧光标记检测灵敏度高、选择性好等优势，提出了样本基质干扰小、不受多余标记试剂影响的结合磁分离富集与荧光标记的细菌荧光检测法和集磁捕获、荧光标记和检测一体的快速细菌微流控芯片检测法。在对细菌荧光探针和标记模式研究基础上，将荧光标记检测技术用于细菌感染细胞作用研究，实现群体感应抑制剂作用效果快速、高效检测。相关研究为复杂食品样本中低含量细菌的快速检测提供新方法，为新型抗菌药物筛选研究提供新途径和新思路，对食品安全及致病菌的监管和感染治疗有重要研究价值和应用潜力。本文的主要研究工作及结果如下：①将纳米磁珠富集和聚乙二醇（Polyethyleneglycol，PEG）凝胶层析分离结合，采用荧光标记的检测模式，建立了一种食品中致病菌的快速灵敏分析方法。采用Fe3O4@SiO2-NH2通过静电作用捕获大肠杆菌，减少食品样本带来的复杂基质干扰，对大肠杆菌进行富集；荧光产率高、标记快速的吖啶橙标记后，利用PEG凝胶层析，有效去除其中残余纳米磁珠及多余荧光试剂；通过对PEG分离管底部浓缩的-1纳米磁珠及目标细菌复合物的目视观测，即可对含菌量高于100cfu•mL的样本进行半定量初判，进一步检测分离物的荧光信号，对目标细菌含量进行定量分析。26-1-1以大肠杆菌为例，检测的线性范围10-10cfu•mL，检测限为100cfu•mL，检测时间80min。对超市取样的熟肉制品样本测试，本方法结果与传统的平板计数法结果吻合。②基于多通道微流控芯片建立了细菌磁捕获富集和原位荧光定量检测新方法。设计的芯片集成含混合区和检测区的6条微通道，磁标记的细菌在混合区与吖啶橙充分混合进行标记，检测区通过外置磁铁进行细菌的捕获富集，采用搭建的小型荧光仪对检测区捕获的细菌进行荧光强度检测。该方法对大肠杆菌的检测限为-126-1100cfu•mL，检测时间50min，荧光信号与菌液浓度在10-10cfu•mL范围有良好的线性关系，可同时进行6个样本测试。③设计制备了多功能的适配体修饰的磁性碳量子点，同时实现对沙门氏菌的特异性磁分离捕获和荧光标记检测，建立了选择性好、背景干扰小的沙门氏菌快速荧光检测方法。将碳量子点共价结合到的Fe3O4@SiO2-NH2表面制备磁性碳量子I 重庆大学硕士学位论文点Fe3O4@CQDs，在其表面修饰适配体制备Fe3O4@CQDs-Apt以实现目标菌特异性标记，Fe3O4@CQDs-Apt标记沙门氏菌后发生团聚导致荧光强度降低，荧光强度36-1的变化值与沙门氏菌在10~10cfu•mL浓度范围呈现良好的线性关系，在牛奶和3-1鸡肉的沙门氏菌合成样本中检出限为10cfu•mL，检测时间60min，可用于复杂背景基质的样本中目标菌的分离捕获及快速荧光检测。④采用碳量子点标记的细菌与细胞相互作用，建立细菌群体感应抑制剂对细菌感染细胞作用效果荧光检测方法，对药物作用进行快速判断和评估。以公认群体感应抑制剂呋喃酮C30为阳性对照物，对单宁酸、厚朴酚、山奈酚对沙门氏菌感染HT-29细胞作用效果进行荧光检测。结果显示：药物对沙门氏菌黏附HT-29细胞的抑制作用呋喃酮C30>厚朴酚>单宁酸>山奈酚，侵染抑制作用呋喃酮C30>单宁酸>厚朴酚>山奈酚。此外，对几种药物的群体感应抑制作用进行分析，几种药物均对AHL调控的群体感应有抑制。细菌运动性结果显示几种药物均能抑制沙门氏菌的Swarming，厚朴酚能抑制Swimming，表明药物通过抑制沙门氏菌群体感应及运动性抑制其对细胞的感染，建立的荧光检测方为新型细菌感染药物筛选研究提供新途径。关键词：荧光标记，磁分离富集，细菌检测，群体感应抑制剂II 英文摘要ABSTRACTFoodbornpathogenusuallycausedinfectioninhumanalongwiththedistributionoffood.Sotheefficientdetectionofpathogenicbacteriawasanimportantguaranteeforhumanhealth.Inaddition,theemergenceofantibiotic-resistantbacterialstrainscreatedatrueneedtosearchfornewantimicrobialdrugs.Tomeettheproblemsofcomplexmatrix,longerconsumingtime,fewpathogensinbacterialdetection,anddeficiencythateffectsofpotentialanti-bacterialdrugswereusuallyevaluatedthroughtimeconsumingandcomplicatedmethodswhichwereunsuitableforrapidscreening.Fluorescentdetectionwithhighsensitivityandexcellentselectivitywasinducedinthiswork.Quantitativeanalyticalmethodswhichreducedinfluencefrombackgroundandexcesslabelingreagentweredevelopedandamicrofluidicchipintegratedmagneticenrichment,fluorescentlabelinganddetectionwasdesignedtodetectpathogenicbacteria.Basedontheresearchoffluorescentprobesandlabelingforbacteria,fluorescentdetectionwasusedtoevaluateeffectsofquorumsensinginhibitorsrapidlyandefficiently.Theworkofferednewmethodsforbacteriadetectionincomplexsamplesandeffectdetectionofantimicrobialdrugs.Allabovehadessentialresearchvalueandpotentialapplicationsinfoodsafety,humanhealthandinfectioustreatment.Themainresearchworkandresultsareasfollows:①Arapidandsensitiveanalyticalmethodwasdevelopedtodetectbacteriawhichcombinedmagneticenrichment,PEGchromatographywithfluorescentlabeling.Theamino-modifiedmagneticnanoparticlescouldefficientlycaptureE.Colibyelectrostaticinteraction,whichdecreasedtheinterferencefromcomplexmatrixandenrichedE.Coliinsamples.Acridineorange(AO)withhighquantumyieldwasusedtolabelthecapturedE.Colirapidly.InordertoremovalthefreemagneticnanoparticlesandAO,thesuspensionwaspouredintoPEGseparationcolumnandseparated.Thepresenceof-1100cfu·mLE.Colicouldbedetectedforsemi-quantitativeanalysiswithnakedeye,andtheconcentrationcouldbefurtherevaluatedbyfluorescentdetection.Itwasdemonstratedthatagoodlinearrelationshipexistedbetweenthefluorescenceintensity26-1withtheconcentrationofE.colirangingfrom10to10cfu·mL,withadetectionlimit-1of100cfu·mL.Cookedmeatsamplesweredetectedbythismethodwithin80minandtheresultscoincidedwithconventionalplatecountmethod.②AmethodwasdevelopedtodetectbacteriainamicrofluidicchipwhichIII 重庆大学硕士学位论文integratedmagneticcapture,fluorescentlabelinganddetection.Thechipwasconsistedofsixserpentinestructuresanddetectionzones.AOandmagneticcapturedbacteriamixedwellandachievedlabelinginserpentinechannelsandweremagneticcapturedinthedetectionzones.FluorescencesignalsobtainedfromE.Coliindetectionzonesbyself-designedfluorescentanalyzerwereatrendoflinearcorrelationshipwiththe26-1concentrationsofE.Coliinrangeof10-10cfu·mL.Thelimitofdetectionwas100-1cfu·mLandwasfinishedwithin50min,sixsamplescouldbedetectedsimultaneously.③Multifunctionalmagneticcarbonquantumdotsweredesignedandpreparedtocaptureandlabelsalmonellasimultaneously.Furthermore,afluorescentdetectionmethodwhichhadgoodselectivityandlittlebackgroundinterferencewasproposedtodetectsalmonella.Carbondotswerelinkedwithamino-modifiedmagneticnanoparticlestoformmagneticcarbonquantumdots(Fe3O4@CQDs).Toachieveselectivelabeling，Fe3O4@CQDsweremodifiedwithAptamers.FluorescenceintensityofAptamersmodifiedmagneticcarbonquantumdotsdecreasedduetotheaggregationafterlabel.Thechangevalueswerelinearlyassociatedwiththeconcentrationsof36-13-1Salmonellawithintherangeof10-10cfu·mL.Theexistenceof10cfu·mLSalmonellainmilkandchickenbreastcouldbedetectedwithin60min,whichindicatedtheproposedmethodhadpotentialinpracticalsamples.④Theinteractionbetweenbacteriaandcellswasstudiedvialabelingbacteriawithcarbonquantumdots.Afluorescentdetectionmethodwasdevelopedtoevaluatetheeffectsofquorumsensing(QS)inhibitorstobacterialinfection.Theinhibitioneffectsoftannicacid,magnololandkaempferolinsalmonellainfectionweredetectedwhilefuranoneC30,anacknowledgedquorumsensinginhibitorwasusedasapositivecontroldrug.Theinhibitingeffectsofthosedrugsinadhesionwere:furanoneC30>magnolol>tannicacid>kaempferol,whilefuranoneC30>tannicacid>magnolol>kaempferolininvasion.Besides,thealldrugscouldinhibitQSwhichregulatedviaAHLandsuppressswarmingmotilityofsalmonella,andonlymagnololsuppressswimming.AboveresultsindicatedthosedrugsinhibitedbacterialinfectionviathesuppressionofQSandmotilityinsalmonella.Theproposedfluorescencedetectioncouldbeusedinantibacterialdrugsresearchandprovidedanewmethodtonovelantibacterialinfectiondrugscreening.Keywords:Fluorescencelabeling;Magneticseparationandenrichment;Bacteriadetection;QuorumsensinginhibitorIV 目录目录中文摘要..........................................................................................................................................I英文摘要.......................................................................................................................................III1绪论.........................................................................................................................................11.1引言.......................................................................................................................................11.2基于荧光标记的细菌检测研究现状和进展.......................................................................11.2.1有机荧光染料标记细菌.............................................................................................11.2.2量子点与碳量子点标记细菌.....................................................................................31.3磁分离技术与荧光标记结合用于细菌检测.......................................................................61.3.1纳米磁珠和荧光探针标记细菌检测.........................................................................61.3.2复合磁性荧光纳米粒子标记细菌检测.....................................................................71.4微流控芯片上细菌磁捕获及荧光检测...............................................................................81.5细菌群体感应研究进展........................................................................................................91.5.1群体感应与细菌感染................................................................................................91.5.2群体感应抑制剂.......................................................................................................111.5.3基于荧光标记的细菌感染研究...............................................................................121.6本课题的研究意义及主要研究内容..................................................................................131.6.1研究目的与意义......................................................................................................131.6.2技术路线...................................................................................................................141.6.3研究内容..................................................................................................................142基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测..........................172.1引言......................................................................................................................................172.2实验部分..............................................................................................................................172.2.1试剂与仪器...............................................................................................................172.2.2Fe3O4@SiO2-NH2的制备和表征.............................................................................182.2.3Fe3O4@SiO2-NH2富集大肠杆菌操作条件优化......................................................192.2.4Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌的AO荧光标记.......................................................192.2.5PEG凝胶柱分离Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌-AO..............................................192.2.6大肠杆菌的PEG分离及其定量检测......................................................................202.2.7基于微流控芯片的大肠杆菌定量检测...................................................................202.3结果与讨论..........................................................................................................................212.3.1Fe3O4@SiO2-NH2的制备和表征.............................................................................21V 重庆大学硕士学位论文2.3.2Fe3O4@SiO2-NH2富集大肠杆菌操作条件优化....................................................222.3.3Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌的AO荧光标记.......................................................232.3.4PEG凝胶层析分离Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌-AO..........................................242.3.5基于PEG分离的大肠杆菌可视化半定量测试和荧光定量测试..........................262.3.6基于微流控芯片的大肠杆菌荧光定量检测...........................................................282.4本章小结..............................................................................................................................303纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究..333.1引言......................................................................................................................................333.2实验部分..............................................................................................................................333.2.1试剂与仪器...............................................................................................................333.2.2Fe3O4@CQDs的制备...............................................................................................353.2.3Fe3O4@CQDs-Apt的制备.......................................................................................353.2.4Fe3O4@CQDs-Apt检测沙门氏菌用量优化............................................................353.2.5特异性实验...............................................................................................................353.2.6样本中沙门氏菌特异性检测...................................................................................353.3结果与讨论..........................................................................................................................363.3.1Fe3O4@CQDs-Apt的设计.......................................................................................363.3.2Fe3O4@CQDs-Apt的制备和表征............................................................................373.3.3Fe3O4@CQDs-Apt用量优化...................................................................................393.3.4特异性测试...............................................................................................................393.3.5样本分析...................................................................................................................403.4本章小结..............................................................................................................................424碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究.........................................................................................................................................454.1引言......................................................................................................................................454.2实验部分..............................................................................................................................454.2.1试剂与仪器...............................................................................................................454.2.2CQDs-Apt的制备.....................................................................................................474.2.3CQDs-Apt标记沙门氏菌.........................................................................................474.2.4最小抑菌浓度MIC测试.........................................................................................474.2.5紫色素杆菌QSI实验...............................................................................................474.2.6运动性实验...............................................................................................................484.2.7几种抑制剂的细胞毒性测试...................................................................................484.2.8几种抑制剂对沙门氏菌感染HT-29细胞的影响...................................................48VI 目录4.3结果与讨论..........................................................................................................................494.3.1抑制剂对沙门氏菌感染细胞影响的检测思路........................................................494.3.2CQDs-Apt的表征及其对沙门氏菌的荧光标记.....................................................494.3.3最小抑菌浓度测试结果...........................................................................................504.3.4MTT测试结果..........................................................................................................514.3.5几种抑制剂的QSI作用效果...................................................................................524.3.6几种抑制剂对沙门氏菌运动性影响.......................................................................534.3.7几种抑制剂对沙门氏菌感染HT-29细胞的抑制效果...........................................544.4本章小结..............................................................................................................................565结论与展望.........................................................................................................................575.1结论......................................................................................................................................575.2展望......................................................................................................................................58致谢.......................................................................................................................................61参考文献.......................................................................................................................................63附录.......................................................................................................................................71A.作者在攻读学位期间发表的论文目录..............................................................................71B.作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目......................................................................71VII 1绪论1绪论1.1引言致病菌对人体健康具有很大的威胁，致病菌感染会导致霍乱、炭疽热、麻疯病、腺鼠疫等疾病，甚至威胁生命。因此，致病菌的监管防范及细菌感染治疗对社会稳定和安全尤为重要。在致病菌监管和防范中，食源性致病菌由于易通过食品流通环节感染人群，对其高灵敏度的快速检测成为食品安全监管的重要保证。传统的平板计数法耗时长、操作复杂，不能满足致病菌快检要求。新发展的方法如酶联免疫吸附法和聚合酶链反应法等，虽检测时间相应缩短，但实际样本背景基质会干扰测定，且对[1]操作人员技术要求高。荧光标记检测灵敏度高、检测快速，在细菌检测方面有广泛应用。纳米磁珠由于比表面积大及外磁场下易操控的特点，在致病菌分离富集中备受关注。另外，近年来微流控芯片技术在细菌检测方面受广泛研究，利用微流控芯片对目标菌进行分离捕获、检测及生物学研究成为热点。以上技术为建立快速、高效、高灵敏度的致病菌检测方法及致病菌快速检测的便携式及一体化的系统提供基础。致病菌的快速检测是预防细菌感染的基础，但对于已感染致病菌疾病人群，如何有效治疗细菌感染成为首要问题。目前，细菌感染治疗中抗生素的大量使用造成耐药菌出现，急需探索和研究新型抗菌药物和治疗方法。近年研究发现细菌[2]的致病性与群体感应（Quorumsensing，QS）相关。因此，QS成为新型抗菌药物研究领域热点。有研究显示部分植物提取物对QS有抑制效果，由此抑制细菌对细胞的感染。但目前对药物的细菌感染抑制效果常用的平板培养检测方法不能快速、实时观察或检测。快速检测感染细胞的细菌进而评估群体感应抑制剂对细菌感染细胞作用效果，对QS抑制剂的研究及新型抗菌药物的筛选研究有重要意义。1.2基于荧光标记的细菌检测研究现状和进展1.2.1有机荧光染料标记细菌①有机染料标记细菌检测[3][4]用于荧光标记的有机染料包括荧光素类、罗丹明类、菁染料（羰花青Cy3，[5,6][7]Cy5，Cy7）、Alexa染料等。有机染料标记细菌一般分为两种模式，一种是细菌表面作用连接实现标记，另一种是与细菌核酸作用进行标记。荧光素是最初用于荧光标记的试剂，具有较高荧光产率，但在与生物分子如蛋白质连接时荧光发生淬灭，有光漂白现象。异硫氰酸荧光素（Fluoresceinisothiocyanate，FITC）使1 重庆大学硕士学位论文用最为广泛，常通过连接其他生物分子进一步修饰后再使用。罗丹明与荧光素相[8]比，不易光降解，Wang等利用罗丹明6G在中性溶液中带正电荷性质，与表面带负电荷的细菌通过静电作用进行荧光标记，实现大肠杆菌、枯草杆菌和金黄色4-1葡萄球菌的荧光检测。标记时间为10min时，其检测限为3.2×10cfu•mL；当孵-1育标记时间为12h时，2cfu•mL的大肠杆菌荧光信号能被检测到，但标记时间过长。可能是罗丹明染料水溶性不好，疏水的平面结构影响标记效率，不利于快速检测。因此，在细菌荧光标记中，研究较多的是对荧光有机染料进行修饰，或采用具有DNA标记作用的染料，提高标记细菌的效率。[8]图1.1罗丹明6G荧光标记检测大肠杆菌原理图[8]Fig.1.1PrincipleogRh6Glabelingandfluorescencedetectionbacteria[9]细菌DNA标记探针主要有菁染料（羰花青Cy3、Cy5、Cy7）、SYTO染料、[10]SYBR染料、SYTOX染料和吖啶橙（Acridineorange，AO），这些染料能与细菌的DNA作用发出荧光，从而实现定量检测。染料在水溶液中被激发出微弱的荧[11]光，但当其与细菌双链DNA作用，其荧光强度可增强几百倍或上千倍。菁染料带负电荷的磺酸基团能显著提高其水溶性，减小分子的沉降和荧光的猝灭。吖啶[12]橙是一种廉价的核酸染料，与双链DNA作用显绿色荧光，Guo等用吖啶橙标记法对溶液中的大肠杆菌进行快速荧光标记，检测时间仅需25min。DNA标记染料无选择性，能标记所有细菌，适用于菌落总数检测研究。有机荧光染料的修饰中，针对FITC的修饰研究较多，常将FITC分子中碳硫胺键与抗体等生物分子的氨基结合，以提高标记细菌的效率、水溶性和生物相容[13]性。Baskar等将修饰连接大肠杆菌抗体的FITC用于沙门氏菌的特异性荧光检测，3-1[14]其检测限可达1.2×10cfu•mL。Zheng等用溶菌酶修饰的FITC作为探针，溶菌酶能与细菌肽聚糖结合从而能实现细菌荧光标记和检测，革兰氏阳性菌的荧光强度是革兰氏阴性菌和阴性对照组的10倍。②基于有机染料的纳米粒子标记细菌检测有机荧光染料标记细菌具有荧光产率高，标记效率高等优势，但同时也存在2 1绪论荧光稳定差等问题。随着纳米材料在生化领域的发展，荧光纳米材料被广泛用于细菌检测研究。二氧化硅核壳型纳米材料能有效克服有机染料的缺点，将荧光有机染料和量子点等荧光试剂包裹于二氧化硅中，避免荧光分子与外界环境的直接接触，提高荧光试剂的光学稳定性，降低荧光试剂的毒性，减少检测体系中非特异性结合，与单个的荧光分子相比，二氧化硅纳米材料包裹大量的荧光分子，荧[15]光信号得到放大。Chen等将Cy3包裹在二氧化硅壳层内制备的纳米材料，有效减小非辐射跃迁，增大斯托克斯位移，其荧光产率为Cy3染料的7.5倍。荧光二氧化硅纳米材料一般通过Stöber法和微乳液法，将大量荧光试剂装载[16][17]于二氧化硅纳米粒子中。Jiang等通过反相微乳液法将AO包裹在二氧化硅壳层中，并表面氨基修饰制备AO@SiO2-NH2，包裹二氧化硅后荧光稳定性得到显著提高，通过戊二醛交联与细菌表面氨基连接，用于金黄色葡萄球菌的荧光标记检-1测，检测限为500cfu•mL。此外，荧光试剂外包裹二氧化硅后，二氧化硅壳层表[18][19]面具有官能团并带有负电荷，水溶性更好，且易于进一步修饰。Chen等用微乳液法将FITC包裹在二氧化硅中，将SiO2壳层氨基修饰后再连接大肠杆菌抗体，用于大肠杆菌的特异性荧光检测，与荧光染料FITC-抗体标记对比，检测的荧光信[20]号由于荧光探针稳定性提高而增强。Qi等在介孔型的二氧化硅纳米粒子里掺杂了FITC，再在二氧化硅表面修饰氨基，与万古霉素的羧基反应，制备得到万古霉素修饰的二氧化硅包裹FITC纳米粒子，与金黄色葡萄球菌孵育30min即可实现荧光标记，且对金黄色葡萄球菌进行选择性识别。AB[20]图1.2A.FITC@SiO2@Van的制备流程；B.FITC@SiO2@Van标记金黄色葡萄球菌SEM图Fig.1.2A.SyntheticprocedureofFITC@SiO2@Van;B.SEMimagesofS.auruslabeledwithand[20]withoutFITC@SiO2@Van1.2.2量子点与碳量子点标记细菌①量子点标记细菌检测量子点（Quantumdots，QDs）因激发光谱宽，发射光谱窄，耐光漂白等优势[21]近年来备受关注。量子点的激发波长和发射波长可通过粒径进行调控，其荧光稳定性是传统有机染料的1000倍，在细菌标记方面有广泛应用。量子点在真核细3 重庆大学硕士学位论文胞荧光成像中主要通过细胞内吞作用荧光标记，然而，细菌等原核生物没有内吞作用，细菌有坚硬的肽聚糖组成的细胞壁，只能通过水溶性小分子（直径<3nm），[22,23]或通过膜蛋白和特异性受体蛋白通过病毒和蛋白等更大的物质。因此，在量子点荧光标记细菌检测中，表面的修饰尤为重要。量子点具有荧光产率高、荧光性能稳定等特点，但量子点本身水溶性和毒性限制其在生化领域的应用。量子点的修饰主要包含二氧化硅包裹及与其他生物分子连接等方式，提高其标记细菌的效率。二氧化硅包裹QDs除了提高荧光稳定性，还能降低量子点的毒性，改善水溶性。通过对二氧化硅壳层修饰，提高纳米粒子[24]对细菌标记效率，从而提高检测灵敏度。Fu等用二氧化硅包埋CdSe/ZnSQDs，表面氨基修饰后通过戊二醛交联与连接到细菌表面，检测时间为80min，对大肠2-1杆菌的检测限为3×10cfu•mL，氨基修饰的二氧化硅层壳层表面能与硫醇和羧基[25]等基团连接，易于修饰抗体及核酸等生物分子。Wang等将CdSe/ZnSQDs@SiO2-NH2荧光标记和介电电泳捕获结合，实现沙门氏菌的荧光定量检测和可视化观测，荧光显微镜下可观察到捕获在电极附近的红色荧光的沙门氏菌，检测2-1限为3.3×10cfu•mL。[26]图1.3两种荧光的适配体修饰的量子点同时检测两种细菌[26]Fig.1.3TwobacteriaweredetectedsimultaneouslybyaptamermodifiedQDs量子点的另一常用修饰方法是将量子点表面修饰基团或链接生物分子，使其[27]与细菌更好作用或特异性结合。Xue等在制备CdSeQDs时用巯基乙酸修饰，形成表面含有羧基的量子点，在EDC/NHS作用下与细菌表面氨基连接，对大肠杆菌2-1和金黄色葡萄球菌进行荧光标记检测，检测限为10cfu•mL，检测时间30min，与传统平板计数法相比时间大大缩短。量子点的发射波长随粒径变化，可发出不[26]同颜色荧光。Duan等制备了羧基修饰的两种CdTeQDs，分别发射绿色荧光和红色荧光，将两种荧光的QDs通过酰胺建连接分别副溶血性弧菌适配体和沙门氏3菌适配体，与含有两种细菌的混菌样本孵育1h后流式细胞仪检测，检测限为5×10-1cfu•mL，本方法能同时实现两种细菌的特异性标记及荧光检测。适配体除了作为特异性识别分子，还能提高QDs标记细菌的效率，降低检测限。4 1绪论②碳量子点标记细菌检测量子点虽荧光性能优异，但随后研究发现量子点中的铬和硒等重金属对生物体的毒性较大，在生化领域应用中受到限制。据此，研究人员开始关注荧光效能较好、毒性更低、生物相容性更佳的荧光材料。2004年发现了一种新型发光纳米材料—碳量子点（Carbonquantumdots，CQDs），除了具有与半导体量子点具有相似光学性能外，还具有水溶性好、表面功能化、生物相容性好及碳源广泛及制备[28]成本低等优势。因此，有研究将CQDs用于细菌荧光标记检测。[29]碳量子点直接标记细菌主要通过羧基与细菌表面氨基作用，Mandal等将羧基修饰的碳量子点与细菌表面的氨基结合，30~40min内实现污水中细菌的荧光成[30]像，实现污水中细菌的快速检测。Kumud用汽车尾气与硝酸回流10h制备碳量子点，碳量子点表面含有大量羧基，浓度为10ppm的碳量子点与大肠杆菌共同孵育就能荧光标记。AB[31]图1.4A.万古霉素修饰的碳量子点标记金黄色葡萄球菌原理图;B.检测结果图Fig.1.4A.SchematicillustrationofourmethodfordetectingS.aureus;B.Fluorescencespectraof[31]CD@VaninthepresenceofvariedconcentrationsofS.aureus碳量子点表面含有羟基、氨基和羧基等基团，易与其他功能性生物分子连接，[32]实现细菌特异性标记检测。Wang等用柠檬酸制备的碳量子点表面富含羧基，连[33]接氨基修饰的适配体后，对鸡蛋壳和自来水中沙门氏菌的特异性检测。Weng等o用柠檬酸铵和甘露糖于180C反应2h制备甘露糖修饰碳量子点（Man-CQDs），通过甘露糖与大肠杆菌的特异性结合，在自来水、苹果汁和尿液实际样本中对大肠3-1杆菌的检测为10cfu•mL，与其他纳米标记试剂相比，Man-CQDs制备简便，选[31]择性好。Zhong等用表面修饰万古霉素的碳量子点选择性检测革兰氏阳性菌，当大量碳量子点连接到细菌细胞壁表面，造成大量标记试剂的团聚，导致荧光强4度下降，从而选择性检测金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和李斯特菌，检测限为9.4×10-1cfu•mL，且发现未修饰万古霉素的碳量子点本身不能与细菌作用。类似的，[34]Chandra在碳量子点表面修饰丁胺卡那霉素，对大肠杆菌选择性标记，对苹果汁、-1橙汁和菠萝汁中大肠杆菌进行检测，检测限为552cfu•mL。5 重庆大学硕士学位论文1.3磁分离技术与荧光标记结合用于细菌检测采用荧光标记模式对目标菌进行检测的方法具有灵敏度高、准确度好及检测[35]时间相对较短等显著优势，已成为细菌检测的重要途径。然而荧光标记细菌检测在实际应用中仍受到阻碍。在实际样本如食品致病菌检测中，存在背景基质复杂和细菌含量低的特点。荧光标记试剂可能会与样本背景基质反应，多余荧光标记试剂大多采用离心方法去除，但在细菌含量较少情况下容易造成细菌损失，影响测试结果。针对食品样本背景基质复杂，细菌含量少的问题，对样本中目标细菌的分离富集尤为重要。目前，离心、过滤及磁分离是样品中细菌快速分离富集的常用方[36]法，在细菌含量低的情况下，离心和过滤可能会造成细菌的损失。纳米磁珠由于外磁场下易操控、比表面积高及易功能化修饰等优点，在复杂样本中细菌的分[37]离富集方面具有明显优势。可通过在纳米磁珠表面修饰基团与细菌静电作用，[[38]或磁珠表面修饰特异性识别分子后对某种目标细菌进行特异性捕获。Zhan等用氨基修饰的纳米磁珠通过静电吸附捕获了缓冲液中的5种致病菌，且对实际样本多种致病菌显示出优异的富集捕获效果。纳米磁富集能与荧光检测很好结合，对磁捕获的细菌进一步荧光分析，在细菌检测中包含两种检测模式：一种是将修饰的纳米磁珠与荧光探针分别与细菌结合，另一种是制备集磁性和荧光一体的多功能标记试剂对细菌进行标记，以下介绍纳米磁富集和荧光标记结合在细菌检测中的应用。1.3.1纳米磁珠和荧光探针标记细菌检测纳米磁珠与荧光标记结合用于细菌快速检测的研究中，通常分别对纳米磁珠和荧光标记试剂进行修饰，使其高效标记细菌或特异性标记目标细菌。纳米磁珠目的是分离富集细菌，荧光试剂来标记磁捕获的细菌，进行后续识别或定量检测。表面修饰的纳米磁珠因其良好的分离效果，在细菌分离富集及检测中有广泛[39]应用。Su等在表面含羧基的磁珠表面连接万古霉素，选择性分离样本中的革兰氏阳性菌，最后通过测定富集后细菌裂解释放出的三磷酸腺苷的荧光信号，对磁捕获的细菌进行定量。该方法对金黄色葡萄球菌、滕黄微球菌、蜡样芽孢杆菌及-1变形链球菌四种阳性菌的检测限为33cfu•mL。[40]Wen等用抗体修饰的纳米磁珠捕获样本中沙门氏菌后，再将磁珠-沙门氏菌混合物与生物素修饰的抗体（Biotin-Ab）孵育30min，随后加入链霉亲和素修饰的量子点荧光标记检测（如图1.5）。免疫磁珠具有良好的稳定性，在牛奶、尿液[41]等样本中均能实现目标菌的有效分离，捕获率高达97%。Cheng等用适配体修饰的纳米磁珠特异性捕获金黄色葡萄球菌后，加入万古霉素修饰的金纳米簇对磁8-1分离的金黄色葡萄球菌进行标记，在大肠杆菌和分支杆菌浓度高达3×10cfu•mL6 1绪论-1混合样本中，对金黄色葡萄球菌的检测限可达70cfu•mL。适配体与抗体相比，稳定性更好，成本降低。磁珠和标记试剂两者的选择性标记使该检测方法特异性强。[40]图1.5抗体修饰的纳米磁珠与量子点标记结合用于沙门氏菌磁捕获和荧光检测[40]Fig.1.5SchematicDiagramforMagneticCaptureandFluorescenceLabelingofS.typhimurium1.3.2复合磁性荧光纳米粒子标记细菌检测纳米磁富集和荧光标记联合应用，能实现复杂背景样本或混菌样本中目标菌的检测，但需分别对磁珠和荧光试剂修饰，且过程需要多步操作，易造成损失。近年随着对纳米粒子研究深入，多功能纳米材料受到广泛关注，有研究者将兼具磁性和荧光的纳米粒子用于细菌检测中，一种标记试剂同时实现细菌的分离捕获、识别检测。复合磁性荧光探针通常为核壳结构，内核为磁性纳米粒子，在其外面包裹具[42]有荧光的壳层。荧光层可是有机染料、量子点或其它荧光试剂。Chen等在Fe3O4纳米粒子外包裹二氧化硅层，并在二氧化硅层中装载FITC并修饰万古霉素制备Fe3O4@FITC@SiO2（图1.6）。样本中存在大肠杆菌时，大量Fe3O4@FITC@SiO23-1标记到大肠杆菌表面造成荧光强度降低，检测限为10cfu•mL，检测时间需20min。[42]图1.6复合磁性荧光探针磁分离及检测大肠杆菌[42]Fig.1.6SchematicillustrationofmagneticfluorescentnanocompositesusedforE.colidetection[43]Wan等在将荧光聚合物先与纳米磁珠作用造成荧光强度降低，细菌加入后由于荧光聚合物与细菌的静电作用和疏水作用更强，荧光聚合物从纳米磁珠表面分离进而荧光恢复，通过测定上清液荧光强度即可对细菌浓度进行定量，检测时7 重庆大学硕士学位论文间为20min。该方法的优势是省去清洗步骤，避免多余标记试剂干扰。Mukesh等[44]在纳米Fe3O4表面包裹碳量子点，并用壳聚糖修饰使其表面带有氨基，由此通过表面的氨基与细菌相互作用，对尿液中金黄色葡萄球菌和大肠杆菌进行荧光定量2-12-1检测。检测限分别为3×10cfu•mL和3.5×10cfu•mL，壳聚糖的修饰使纳米粒子与阳性菌和阴性菌都有很强的相互作用。1.4微流控芯片上细菌磁捕获及荧光检测基于磁捕获及荧光标记的细菌检测过程常在离心管中进行，常需离心和清洗等步骤，操作繁琐，且易造成样本中细菌在管壁的附着和损失。微流控芯片技术由于可连续操控、功能集成化及高通量等优势，为便携化和微型化的快速细菌检测提供分析平台，在细菌检测领域受到广泛研究。纳米粒子如纳米磁珠，纳米荧[45]光探针的应用为微流控芯片上细菌的识别和信号转换等有很大发展。微流控芯片技术在细菌片上荧光标记、多个样本同时测试及多余荧光标记试剂的去除等方面提供便捷，提高检测效率。微流控芯片可连续操控的特点可将磁捕获、荧光标记及检测集成一体化。Park[46]等分别在纳米磁珠表面和二氧化硅荧光纳米粒子表面修饰副溶血性弧菌抗体，将纳米磁珠-抗体，荧光试剂-抗体和细菌通入芯片样本腔，反应45min形成磁珠-细菌-荧光试剂的复合物。外磁铁移动到检测区，将复合物磁捕获到检测区，冲洗多余的荧光试剂，检测线进行荧光检测，检测限为10cfu。该方法的灵敏度高、所[47]需时间短，特异性好。Guo等在微流控芯片分离区设置镍丝阵列，检测区设置微镍阵列，将免疫磁珠标记后的沙门氏菌和大肠杆菌混菌样本通入芯片，分离区内由于受到流体和磁场双重作用，可将免疫磁珠标记的沙门氏菌和游离的大肠杆菌进行分离，在检测区带磁性的微镍整列能将免疫磁珠标记的沙门氏菌捕获。再通入生物素和亲和素修饰的QDs，荧光标记检测区的沙门氏菌（图1.7），进而对3-1沙门氏菌进行荧光检测，检测限为5.4×10cfu•mL，两步分离特异性更好。[47]图1.7微流控芯片上磁分离及荧光标记检测沙门氏菌[47]Fig.1.7Magneitccaptureandfluorecentdetectionofsalmonellaonamicrofluidicchip8 1绪论[48]微流控芯片高通量的特异性，能对多个样本同时进行检测，Wang等设计了含3个混合区和6个样本检测区的芯片，首先在微流控芯片检测区固定沙门氏菌抗体，通入样本将沙门氏菌捕获在检测区，捕获率为70%。再在混合区内将量子点与抗体混合制备抗体修饰的量子点，对捕获的沙门氏菌进行荧光标记，对沙门-1氏菌检测限为37cfu•mL，该方法能在芯片上同时进行6个样本的同时测定，检测效率高，且多余的荧光试剂缓冲液冲洗即可除去，与传统方法荧光检测方法相比，操作简便快捷。1.5细菌群体感应研究进展1.5.1群体感应与细菌感染群体感应（Quorumsensing，QS）是一种细菌通过自体诱导物分子进行交流的机制，进而调节细菌的浓度，调控基因表达和菌群行为。最早在费氏弧菌（Vibriofischeri）中发现，可调节费氏弧菌的生物发光。进一步研究显示，群体感应与细菌生物膜形成、毒性因子产生、对宿主的侵染，免疫逃逸和耐药性产生等重要调[2]控系统有关。细菌感染会造成多种疾病，其感染细胞途径主要通过三型分泌系统，目前有研究表明AHL与沙门氏菌三型分泌系统有关，AHL存在时能增强对细胞的侵染。[49,50]沙门氏菌侵染细胞另一途径为Rck途径，群体感应能调节Rck基因表达。此外，细菌鞭毛带来的运动性在细菌侵染宿主细胞中起重要作用，通过QS可调节细[51]菌鞭毛活力，改变细菌运动性。群体感应与细菌感染有重要联系，研究群体感应对防治细菌感染有重要意义。群体感应自体诱导分子（Autoinducer，AI）是细菌分泌的具有不同化学结构及性质小分子，也称为信号分子，可自由出入细菌细胞并与受体蛋白作用，调控基因的表达。根据信号分子的性质及感应模式，将其分为AHLs、AI-2、AI-3和寡[52]肽，其中研究较多的是AHLs与AI-2型，以下主要介绍信号分子对细菌感染细胞的调控和影响。①AHLs类信号分子N-酰基-高丝氨酸内酯类化合物（N-acyl-homoserinelactones，AHLs），主要调节革兰氏阴性菌的群体感应系统。AHLs由细菌QS循环系统中的LuxI产生，能自由穿透细菌细胞壁与膜，在环境中累积达到一定浓度阈值，又与细菌内LuxR蛋白[53]及类似物识别并结合，从而调控某些基因的表达。AHLs的分子结构及其产生识别过程如图1.8所示。9 重庆大学硕士学位论文图1.8AHLs的分子结构及其产生识别过程示意图Fig.1.8MolecularstructureofAHLsandschematicfortheproductionandrecognitionofAHLs某些细菌如大肠杆菌、沙门氏菌及志贺氏杆菌等，自身不能产生AHL，但具有LuxR受体蛋白类似物—SdiA受体蛋白，能识别其他菌种产生的AHLs从而调[54]节自身基因。有研究表明AHLs调节生物膜的形成，毒性因子产生等，增加动[50]物肠道中沙门氏菌的感染。Nesse等通过HEp-2人喉癌上皮细胞模型，将沙门氏菌分别混合两种外源群感效应信号分子C6-AHL和C8-AHL后加入细胞中，在黏附和侵染实验结束后将细胞裂解，对沙门氏菌进行平板计数。结果表明两种信号分析均会导致沙门氏菌对细胞黏附和侵染的增强，沙门氏菌中SdiA可识别外源群体感应信号分子AHLs，从而激活Rck和Srg两个基因组，促进其粘附上皮细胞和细胞外基质蛋白纤连蛋白和层粘连蛋白，抵抗人血清蛋白抗体。②AI-2型信号分子AI-2是很多革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌中都存在的QS信号分子，主要由LuxS酶产生，是由4,5-二羟基-2,3-戊二酮衍生出来的，以呋喃酰硼酸二酯主的信[55]号分子。AI-2可通过运输蛋白LsrABC进入细菌内，在细菌内被同源信号激酶LsrK磷酸化，并与LsrR结合，激动相关基因的表达。AI-2最初在费氏弧菌QS系统中发现，费氏弧菌的QS系统通过识别AHLs感知自身密度，通过AI-2信号分[56,57]子感知自身或其他菌的数目，在细菌种间交流中起通用信号分子的作用。图1.9费氏弧菌和沙门氏菌的AI-2类信号分子及AI-2产生识别过程示意图Fig.1.9ThemolecularstructureofAI-2fromVibriofischeriandsalmonellatyphimuriumandschematicfortheproductionandrecognitionofAI-210 1绪论AI-2在大肠杆菌、霍乱弧菌和化脓链球菌等细菌群体感应中调节毒力基因的[52][58]表达。Lowery等发现AI-2能通过QS调节沙门氏菌将毒性因子运送到上皮细胞的过程，影响沙门氏菌毒性基因编码的蛋白，该蛋白为沙门氏菌进入细胞所需要的，导致沙门氏菌对HeLa细胞的侵染能力增强。③AI-3型信号分子及寡肽AI-3型信号分子最初在肠出血性大肠杆菌中发现，能激活细菌黏附真核细胞[52]的相关基因的表达。AI-3型信号分子是一个芳香族的化合物，不含呋喃环。目前其合成机制和完整结构还未确定。寡肽（Autoinducingpeptides，AIP）由5-17个氨基酸残基组成，一般调节革兰氏阳性菌。AI-3可参与肠杆菌的种间通讯，并且参与调解毒性基因。此外，研究发现肾上腺素和去甲肾上腺素能代替AI-3信号分子调节肠出血性大肠杆菌毒性基因的表达，通过添加肾上腺素受体拮抗剂可阻[59]断AI-3的影响，判断AI-3可能与肾上腺素或去甲肾上腺素结构相似。1.5.2群体感应抑制剂群体感应可调控细菌的致病性，因此，群体感应抑制剂（Quorumsensing[60]inhibitor，QSI）已成为新型抗菌药物研发的热点。群体感应通过信号分子发挥调控作用，因此干扰信号分子能够干扰群体感应。群体感应抑制剂对QS抑制途径[61]大致分为以下三种：抑制信号分子的合成、降解群体感应信号分子、信号分子类似物竞争性与受体结合。澳大利亚海域的海藻Deliseapulchra中发现天然的呋喃酮类化合物，能有效抑[62][63]制细菌在其表面附着。由此，研究者通过人工合成QS抑制剂。Gilles通过合成AI-2信号分子类似物噻唑烷二酮来抑制哈氏弧菌中AI-2介导的QS系统，发现[64]噻唑烷二酮能将哈氏弧菌的生物发光降低95.8%。Colin等以HeLa细胞为模型，通过平板计数法和PCR法，研究发现合成的Propyl-DPD对毒性因子表达的蛋白产生及沙门氏菌黏附HeLa细胞无影响，但其侵染细胞能力降低35-50%，表明Propyl-DPD可作为侵染抑制剂。人工合成的化合物虽然有QS抑制作用，但后续研究发现这些化合物对人体毒性较大，限制其在防治细菌感染中的应用。目前研究侧重于从水果、蔬菜及中药[65,66]等提取物中发现具有QS抑制效果的提取物，这些植物是人们平时食用的，安全性更高。因此，有QS抑制效果植物提取物及其作用机制受到越来越多研究者的关注。[67]Musthafa等对菠萝、香蕉等水提物进行QS活性研究，发现这些水提物能抑[68]制紫色杆菌紫色菌素、铜绿假单胞菌绿脓菌素和毒力因子的产量。Yang等发现槲皮素能抑制绿脓杆菌生物膜形成和绿脓菌素的产生，进一步研究表明槲皮素能[69]抑制QS相关基因的表达。Li等研究证明石榴酚能降低细菌活性，RT-PCR证明11 重庆大学硕士学位论文石榴酚能抑制沙门氏菌毒性基因表达。此外通过结肠癌细胞模型研究表明，石榴酚可降低沙门氏菌对结肠癌细胞的侵染且不影响细菌附着，且对细胞生长繁殖无[70]影响，能作为选择性或补充性防止沙门氏菌侵染的试剂。Shi等研究表明柠檬醛对阪崎肠杆菌有QS抑制作用，通过紫色菌素实验发现柠檬醛通过抑制AHL通路抑制QS。细菌活性实验发现柠檬醛能明显降低阪崎肠杆菌的运动活性，减少其对Caco-2细胞的黏附和侵染，降低在巨噬细胞中的存活和繁殖能力。植物提取物能抑制群体感应从而抑制细菌的致病性，为防止细菌的毒害作用提供新途径。对于植物提取物抑制QS作用机制普遍认为是由于理化性质与化学结构与QS信号分子相似，但是对于提取物在抑制QS的作用和产生活性的机制还需更深入研究。因此，QS抑制组分效果的快速效果检测及高通量筛选对新型QS抑制剂的研发具有重大意义。1.5.3基于荧光标记的细菌感染研究细菌感染研究中，感染模型的建立和感染情况的检测都是研究的基础和重点。单层细胞模型由于费用少、易操控和高通量常被应用。A549、16HBE和CFBE等细胞模型主要用于肺部疾病研究；HeLa、CaCo2和HT-29用于肠道疾病。细菌感染情况的检测中，目前研究大多数采用平板计数法，对感染细胞的细菌计数。但是平板计数培养法需裂解细胞，方法耗时，不能实时检测和观察，对新型药物的[71]作用效果检测和快速筛选造成阻碍。Nesse通过HEp-2人喉癌上皮细胞模型，研究两种外源群体感应信号分子C6-AHL和C8-AHL对沙门氏菌感染细胞的影响，[69]在黏附和侵染实验结束后将细胞裂解，对沙门氏菌进行平板计数。Li等人通过结肠癌单层细胞模型，同样通过黏附或侵染后细菌进行平板计数，研究提取的石榴酚对沙门氏菌黏附和侵染的影响。有研究通过荧光标记细菌的方法，对感染细胞的细菌进行荧光测试，荧光标[72]记检测法能实时反应细菌感染细胞的情况或进行荧光强度检测。Sophie等用流式细胞仪检测VBFL荧光染料标记的金黄色葡萄球菌黏附和侵染MG-63成骨细胞的[73]情况，激光共聚焦显微镜进行荧光成像观察。Mar等用SYTO9染料标记绿脓杆菌后，通过酶标仪和荧光显微镜评价绿脓杆菌对人肺泡上皮细胞的黏附情况，并[74]测定染料木黄酮对黏附的影响。Jonathan等用绿色荧光蛋白标记无乳链球菌，将[75]其与白细胞作用，研究无乳链球菌的致病机理。Jung通过检测绿色荧光蛋白标记的沙门氏菌分别在HepG2和正常肝细胞THLE-2培养部分的荧光强度，对沙门氏菌癌症定位及其作用机制进行研究。然而，荧光染料毒性高，可能会对细菌和细胞的生理活性产生影响，荧光性能不稳定等问题可能会影响测试结果。绿色荧光蛋白法对操作技术要求较高且过程复杂。12 1绪论AB[76]图1.10A.DAPI标记的树突细胞；B.荧光纳米粒子标记的大肠杆菌与细胞孵育荧光图Fig.1.10A.ImageofdendriticcellsstainedwithDAPI.B.ImagesofE.colilabeledwithfluorescent[76]nanoparticlesafterincubatedwithdendriticcells近年来随着纳米技术的发展，纳米荧光材料以其生物相容性好和表面易修饰等特点，在细菌荧光标记检测和细菌细胞成像等领域受到广泛研究。纳米荧光材[76]料标记细菌，在细菌细与细胞相互作用研究中也有巨大的应用前景。Li等用大肠杆菌抗体修饰的稀土金属纳米粒子标记大肠杆菌（图1.10），荧光显微镜下能明显看出大肠杆菌的红色荧光。将荧光标记的大肠杆菌与树突细胞孵育，研究其对细胞的感染，并与绿色荧光蛋白标记法对比。结果表明荧光纳米粒子稳定性更好，更有利于对细菌感染细胞过程的实时荧光可视化观测。荧光纳米粒子的低毒性和[29]良好的生物相容性，在细菌感染研究中尤为重要，否则会干扰结果判定。Mehtao等以苹果汁为碳源水热法于150C反应12h制备的碳量子点用于铜绿假单胞菌和-1结核杆菌荧光成像。浓度高达100mg•mL的碳量子点与铜绿假单胞菌孵育30h[30]后对细菌无明显毒性。Kumud用汽车尾气制备的碳量子点表面含有大量羧基，浓度为10ppm的碳量子点与大肠杆菌共同孵育就能荧光标记。可见纳米荧光标记试剂能在低用量对细菌标记，且标记试剂本身对细菌和细胞生物活性无影响，在细菌感染细胞研究中有很大优势。1.6本课题的研究意义及主要研究内容1.6.1研究目的与意义致病菌的预防和治疗一直是备受关注的热点。一方面，细菌感染大部分由食源性致病菌引起。因此，食源性致病菌的快速、高灵敏度检测是食品安全的重要保证。传统平板计数食源性致病菌检测法耗时长，而食品样本本身背景基质复杂及细菌含量少等特点，使许多新发展的高灵敏方法在实际应用中受到限制。另一方面，细菌感染治疗导致多种耐药菌的出现，对新型抗细菌感染药物需求日益迫切。近年研究发现群体感应抑制剂可抑制细菌感染，但目前对群体感应抑制剂的筛选检测方法较繁琐，对发展新的细菌感染抑制剂研究造成阻碍。因此，发展一种样本背景基质干扰小、灵敏度高的食品样本中低含量细菌的快速检测方法，及13 重庆大学硕士学位论文药物对细菌感染细胞作用效果的快速、高效检测方法，对食品安全、感染疾病预防及治疗有重大研究意义。本文基于灵敏度高的荧光检测方法，研究探讨细菌的不同的标记探针及标记模式，进而与分离富集效果好且易操控的纳米磁富集结合，实现对细菌的分离富集及荧光标记，建立细菌的高效检测分析方法及微流控芯片检测法，为食源性致病菌的高灵敏、高通量、快速检测提供实验基础。在细菌检测标记探针研究基础上，将生物相容性好的碳量子点用于细菌感染细胞研究中，建立快速的药物对细菌感染细胞作用效果检测方法，研究群体感应抑制剂对细菌感染细胞的影响，对新型抗细菌感染药物的筛选研究提供新思路和新途径。1.6.2技术路线基于荧光标记的致病菌快速检测及细菌与细胞相互作用研究致病菌富集分离及快速QS抑制剂对细菌感染细荧光检测胞作用效果荧光检测纳米磁荧光探分析方CQDs对细细菌感染细珠修饰针选择法建立菌标记胞测试方法学考察及样本分析药物QS抑制效果分析图1.11研究技术路线Fig.1.11Technologyroadmapforthethesis1.6.3研究内容①基于纳米磁富集的吖啶橙标记大肠杆菌的快速荧光检测本章结合纳米磁珠富集分离和荧光标记建立细菌快速荧光检测方法。拟对Fe3O4纳米粒子表面修饰制备Fe3O4@SiO2-NH2，通过红外光谱和TEM图谱对制备的Fe3O4@SiO2-NH2纳米粒子表征，对其分离捕获大肠杆菌的时间及用量优化，实现样本中大肠杆菌的有效分离和富集。将聚乙二醇凝胶层析分离技术与吖啶橙标记结合，用于磁分离后细菌的快速判别及多余荧光标记试剂的去除，对大肠杆菌荧光定量检测，并对超市熟肉制品样本进行测试。为了实现高通量快速测试，结合微流控芯片细菌检测技术优势，将磁富集的大肠杆菌在芯上进行吖啶橙标记，磁捕获及荧光测试。通过芯片上进样流速优化，得到细菌浓度与信号值定量关系，建立微流控芯片上高通量、高灵14 1绪论敏度的细菌检测方法。②基于适配体修饰的磁性碳量子点的沙门氏菌特异性检测利用碳量子点表面易修饰、荧光产率高等优势，将表面含羧基的碳量子点连接到氨基修饰的纳米磁珠表面，并用沙门氏菌适配体修饰，作为沙门氏菌特异性捕获及荧光标记探针，对样本中沙门氏菌进行特异性检测。通过紫外-可见光谱及荧光光谱等对制备的磁性碳量子点进行表征，对适配体修饰的磁性碳量子点标记沙门氏菌用量进行优化，得到菌液浓度与荧光信号值定量曲线，建立沙门氏菌快速分离富集及特异性荧光检测方法。③基于荧光检测的群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究利用碳量子点荧光稳定性高、毒性低、生物相容性好等优势，将其标记沙门氏菌后，用于药物对沙门氏菌感染细胞作用效果研究。碳量子点用适配体修饰使其生物相容性更好，标记效率更高。通过荧光检测法，对群体感应抑制剂呋喃酮C30和中药单体（单宁酸、厚朴酚、山奈酚）抑制沙门氏菌感染细胞效果进行检测，建立群体感应抑制剂对细菌感染细胞作用效果荧光检测方法。通过QS信号分子指示菌紫色杆菌紫色菌素含量检测，沙门氏菌运动性测试等，分析药物对沙门氏菌群体感应系统的影响。15 重庆大学硕士学位论文16 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测2.1引言荧光标记细菌检测具有灵敏度高、准确度好、检测时间相对较短等显著优势，[77,78]已成为细菌检测的重要途径。但细菌荧光检测也遇到高效的标记试剂和背景干扰等挑战。食品中的致病菌检测存在背景基质复杂和细菌含量低的特点，如何有效地对样本进行预处理，高效地捕获富集分离目标菌，减少背景基质对检测结[79]果的干扰，成为相关研究极为关注的问题。纳米磁珠由于易操控比、表面积高及易功能化修饰等优点，在复杂样本中细[36,80][81]菌的分离富集方面具有明显优势。Zhi等用羧基修饰的Fe3O4纳米粒子在酸[82]性条件下对培养基中大肠杆菌进行富集。Huang等在Fe3O4纳米粒子表面修饰氨基，通过静电作用对水、饮料和尿液实际样本中的中8种阳性和阴性致病菌进行了有效富集。以上研究显示羧基或氨基修饰的Fe3O4纳米磁珠对细菌有良好的静电[47,83]吸附富集效应。细菌通过荧光标记实现检测的方式能与磁富集技术很好结合，但存在标记试剂的用量不易控制，残余荧光试剂干扰等问题。此外，如何提高检测效率，对食品安全的监管和快速判断有重要意义。本章拟将Fe3O4纳米磁珠用二氧化硅包裹，并对其表面进行氨基化修饰，用于富集捕获样本中的食源性致病菌。针对致病菌荧光标记过程多余荧光探针的背景干扰问题，采用Fe3O4@SiO2-NH2纳米磁珠结合PEG凝胶层析技术，PEG具有分子排阻特性，将其应用于纳米磁珠富集细菌的体系，有望实现粒径不同磁珠@细菌、磁珠和小分子标记试剂的有效分离。用荧光产率高、标记效率高的吖啶橙对富集的大肠杆菌进行简单荧光标记。通过PEG凝胶层析分离除去多余的磁珠和荧光探针，对待测样本中大肠杆菌可视化初步判别，进而检测荧光信号实现定量检测。为了实现高通量和快速连续细菌检测，在Fe3O4@SiO2-NH2富集致病菌基础上，结合微流控芯片技术，设计制备微流控芯片。在芯片上对大肠杆菌进行AO荧光标记、磁富集和荧光检测，建立微流控芯片细菌检测方法。芯片可同时进行6个样本测试，提高检测效率。2.2实验部分2.2.1试剂与仪器大肠杆菌JM109由重庆医科大学彭教授友情馈赠。接种环挑取菌种于60mLo灭菌LB液体培养基中，于培养箱中37C培养过夜，8000rpm离心3min，去除培养基，PBS清洗3次，重悬于PBS，梯度稀释配置系列浓度大肠杆菌菌液备用。17 重庆大学硕士学位论文表2.1化学试剂Table2.1Reagentsintheexperiment名称规格型号公司及产地Fe3O410nm北京德科岛津正硅酸乙酯（TEOS）98%北京百灵威化学技术有限公司3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES）98%北京百灵威化学技术有限公司-1聚乙二醇（PEG）MW=8000g•moL成都科龙试剂厂吖啶橙（AO）—阿拉丁试剂公司LB肉汤—北京陆桥技术有限责任公司LB平板计数培养基—北京陆桥技术有限责任公司表2.2实验仪器Table2.2Experimentalapparatus名称规格型号公司及产地红外光谱仪Prestige-21日本岛津酶标仪MultiskanFC赛默飞世尔科技细菌培养箱DNP-9052上海贺德实验设备有限公司超净工作台SWCJO苏州净化公司高速离心机TGL-16巩义市英峪予华仪器厂恒温摇床LYZ-103B上海龙跃座式自动电热压力蒸汽灭菌锅ZDX-35B1上海申安医疗器械厂均质器HARVARD美国HARVARD公司荧光倒置显微镜OLYMPUSIX71日本奥林巴斯流动注射泵HARVARD美国HARVARD公司荧光/化学发光光谱仪FluoroskanAscentFL赛默飞世尔科技2.2.2Fe3O4@SiO2-NH2的制备和表征Fe3O4@SiO2的合成采用Stöber法，取90mgFe3O4纳米粒子于三颈瓶，加入40mL无水乙醇和200mL异丙醇，超声分散15min。搅拌下依次加入7mL氨水o和1.2mLTEOS（四乙氧基硅烷）于30C恒温水浴锅中搅拌反应9h。反应结束后依次用无水乙醇和去离子水清洗，真空干燥得到Fe3O4@SiO2。取0.1035g制备的Fe3O4@SiO2，加入70mL甲苯，超声分散15min，搅拌下18 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测o连续加入1mLAPTES（3-氨丙基三乙氧基硅烷），110C回流搅拌反应12h。反应结束后用无水乙醇，去离子水清洗，真空干燥得到Fe3O4@SiO2-NH2。将制备得到的Fe3O4@SiO2-NH2，采用H-7500型（日立）透射电镜和IRprestige-21型（日本岛津）傅里叶转换红外光谱表征。2.2.3Fe3O4@SiO2-NH2富集大肠杆菌操作条件优化①Fe3O4@SiO2-NH2用量优化将培养至对数生长期的大肠杆菌悬液于8000rpm离心5min，重悬于pH为7.4的PBS中，调节其OD600约为0.1，得到大肠杆菌菌液。向1mL大肠杆菌菌液(OD≈0.1)中，加入Fe3O4@SiO2-NH2使其终浓度分别为-1o10、25、50、100、150、200μg•mL。将其置于37C，150rpm摇床中振摇60min，孵育结束，磁分离架分离5min，移取上清液酶标仪测定其OD600。捕获率由磁捕获前后细菌的OD600值按公式2.1.计算，实验中设置3组平行实验。ODa-ODbcapturerate=×100%(2.1)ODa式中：ODa为捕获前大肠杆菌菌液的OD600值，ODb为Fe3O4@SiO2-NH2磁捕获后大肠杆菌菌液的OD600值。②Fe3O4@SiO2-NH2捕获时间优化向1mL大肠杆菌菌液(OD≈0.1)中，加入150μgFe3O4@SiO2-NH2。将其置于o37C，150rpm摇床中振摇孵育10、20、40、60、80min。孵育结束后磁分离架分离5min，酶标仪测定上清液OD600，按照公式2.1计算捕获率。2.2.4Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌的AO荧光标记4-1向1mL浓度为10cfu•mL大肠杆菌菌液中，加入150μgFe3O4@SiO2-NH2，o-1于37C，150rpm振摇孵育40min。再加入AO使其终浓度为10μg•mL，避光振摇30min，磁分离架分离5min，移除上清液，重悬于150μLPBS中。2.2.5PEG凝胶柱分离Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌-AO①PEG凝胶柱的制备分别取400μL质量分数为50、40、30、25、20%的PEG于分离管中，准确移取2.2.4中150μL样本置PEG凝胶柱中，将分离管竖直放置于磁分离架上，静置放置10min后观察分离结果。②PEG凝胶柱对Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌-AO的分离取400μL质量分数为25%的PEG于分离管中，准确移取2.2.3中制备样本置PEG凝胶柱中，将分离管竖直放置于磁分离架上。在磁场作用下静置放置10min后观察分离结果。将PEG的黑色沉淀重悬于200μLPBS得到Fe3O4@SiO2-NH2/细菌混悬液，移至800μLPBS中，荧光/化学发光检测仪检测设置λex为485nm，λem为538nm时的荧光强度。19 重庆大学硕士学位论文2.2.6大肠杆菌的PEG分离及其定量检测1234567-1将PBS配置的0、10、10、10、10、10、10、10cfu•mL标准大肠杆菌溶液，依照2.2.5操作，进行PEG分离柱肉眼观测和荧光强度测定，得到荧光强度（IFL）与菌液浓度的关系，绘制标准曲线。超市购买散装、真空包装的泡椒凤爪，分别称取25g，无菌剪剪碎后投入装有225mL无菌PBS的均质袋中，均质器均质2min，得到10倍稀释样本溶液。将10倍稀释熟肉制品样本溶液0.22μm微孔滤膜过滤去除样本中的细菌，分别加入标准大肠杆菌菌液得到熟肉制品合成样本，自来水合成样本采用相同方法制备。用建立的方法进行检测，计算回收率。为了验证方法的准确性，本文对不加标准菌液的实际熟肉制品进行检测，计o算熟肉制品中含菌量，并与平板计数法36C培养箱培养48h后菌落数对照。2.2.7基于微流控芯片的大肠杆菌定量检测①微流控细菌芯片的设计实验设计了集AO荧光标记及纳米磁富集一体的微流控芯片，芯片由PDMS盖片和刻有微通道的玻璃基片组成。图2.1为玻璃基片微通道结构示意图，共有6条平行通道，可同时进行1-6个样本的多通道平行检测。每条通道均有两个进样口，其中1-6为Fe3O4@SiO2@大肠杆菌样本入口，1'-6'为AO荧光试剂入口，7为废液出口。检测区设置为直径1000μm的圆形腔体，加磁铁作用下进行细菌的富集捕获，并同时作为荧光检测区。S形混合区为10个相同的边长为1mm半圆弧形组成。微通道的宽均为200μm，深均为50μm。玻璃基片上微通道的总体尺寸长为80mm、宽200mm。②微流控细菌芯片的制作o将PDMS的前聚体和固化剂以10:1混合，搅拌均匀，置于4C下排除气泡。配置好的PDMS浇注于干净的空白载玻片上，在对应设计芯片的进样和出样管道口放置12个直径为3mm的硅胶柱子，作为芯片的进出样口，载玻片放入恒温干o燥箱中90C固化45min；室温冷却后将凝固的PDMS盖片小心剥离，进出样口处打孔，得到带有进出样口的PDMS盖片，乙醇清洗吹干后，贴合在含微通道的玻璃基片上即可得到设计的微流控细菌芯片。20 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测图2.1集荧光标记及磁富集一体的细菌芯片玻璃基片示意图Fig.2.1Schemeofdesignofmicrofluidicchipintegratedfluorescentlabelingandmagneticenrichment③微流控细菌芯片上大肠杆菌的定量检测-1采用负压进样，注射泵设置为50μL•min进样流速，在芯片检测区放置磁铁，依次通入乙醇，PBS排除气泡。待小型荧光仪数据稳定记为V0时，通入50μL2.2.3-1中的Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌样本和50μLAO溶液（10μg•mL），接着PBS冲洗至小型荧光仪数据平稳，记为V1。按照上述步骤依次测定Fe3O4@SiO2-NH2，和Fe3O4@SiO2-NH2结合大肠杆菌后的梯度浓度的细菌样本溶液，计算∆V=V1-V0，得到∆V与细菌浓度的关系。2.3结果与讨论2.3.1Fe3O4@SiO2-NH2的制备和表征为了实现样本中致病菌的捕获富集同时排除背景基质的干扰，本文设计合成了Fe3O4@SiO2-NH2纳米磁性微粒。由于大部分细菌等电点在pH为1.5~4.5之间，[21]中性溶液中细菌表面带负电荷，可通过静电作用与磁珠结合（图2.2）。实验采用Stöber法，在Fe3O4表面包裹二氧化硅，SiO2层可提高纳米磁珠的稳定性及在水溶液中的分散性，通过APTES修饰在Fe3O4@SiO2表面的氨基能改变纳米粒子在水溶性中的表面电性，使其在中性条件下表面带正电荷。图2.2Fe3O4@SiO2-NH2的制备及其与细菌作用示意图Fig.2.2SchematicofpreparationofFe3O4@SiO2-NH2anditselectrostaticinteractionwithpathogenicbacteria21 重庆大学硕士学位论文采用IRprestige-21型傅里叶红外光谱仪（日本岛津）对制备的Fe3O4@SiO2,-1Fe3O4@SiO2-NH2结构进行表征(图2.3Aa)。Fe3O4@SiO2的红外图谱中3415cm硅-1羟基的伸缩振动吸收峰，1094cm处的特征Si-O-Si伸缩振动峰表明Fe3O4表面成-1功修饰包裹二氧化硅。Fe3O4@SiO2-NH2红外光谱（图2.3Ab）中，3415cm吸收-1峰相对减弱，CH2CH2CH2NH2中C-H在2922cm吸收峰增强，N-H弯曲振动-11650-1580cm表明成功在其表面修饰氨基。用H-7500型TEM（日本日立）对Fe3O4@SiO2-NH2的形貌粒径进行表征(图2.3B)，结果显示10nm的Fe3O4修饰后得到的Fe3O4@SiO2-NH2粒径为30~45nm，在水溶液中分散性良好。图2.3A.Fe3O4@SiO2-NH2的红外光谱图；B.Fe3O4@SiO2-NH2的TEM图Fig.2.3A.FT-IRspectrumofFe3O4@SiO2-NH2;B.TEMimagingofFe3O4@SiO2-NH22.3.2Fe3O4@SiO2-NH2富集大肠杆菌操作条件优化为了实现Fe3O4@SiO2-NH2对致病菌的最佳富集效果，以大肠杆菌为模板菌，对富集中操作条件Fe3O4@SiO2-NH2的用量和富集时间进行优化。向PBS重悬的大肠杆菌液（OD600≈0.1）中加入不同浓度的Fe3O4@SiO2-NH2，150rpm振摇孵育60min，磁分离后检测上清液OD值。结果如图2.4A，随着Fe3O4@SiO2-NH2的用量在10~150μg增加，其对大肠杆菌的捕获率增加。当Fe3O4@SiO2-NH2的用量大于150μg，大肠杆菌捕获率不再有明显的增加，表明150μgFe3O4@SiO2-NH2对大肠杆菌捕获作用已经达到饱和。考虑到实际样本中细菌含量较少，实验选择Fe3O4@SiO2-NH2的最佳用量为150μg。Fe3O4@SiO2-NH2与大肠杆菌的作用时间也能影响其对大肠杆菌的捕获效率，不同孵育时间对捕获效率的影响如图2.4B，结果表明孵育时间对捕获率的影响较小，捕获率随着孵育时间在10-40min范围延长稍有增加，当孵育时间大于40min，捕获率不再随着时间的延迟而变化。考虑到细菌检测时间问题，选择40min为最佳孵育时间。制备的Fe3O4@SiO2-NH2可成功用于大肠杆菌的富集捕获，对于1mL大肠杆菌菌液（OD600≈0.1），150μgFe3O4@SiO2-NH2孵育40min即可实现富集，捕获效率达到95.4%，可将其用于食品中致病菌的分离富集。22 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测100100AB808060604040Capturerate/%Capturerate/%2020000501001502001020304050607080ConcentrationofFeO@SiO/μg·mL-1t/min342图2.4A.Fe3O4@SiO2-NH2用量对捕获大肠杆菌的影响；B.孵育时间对捕获大肠杆菌的影响（n=3）Fig.2.4A.EffectoftheamountofFe3O4@SiO2-NH2tocapturerate;B.Effectofincubationperiodtocapturerate(n=3)2.3.3Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌的AO荧光标记吖啶橙由于价廉且能激发出强荧光被广泛用于细胞或细菌荧光标记中，能与DNA结合可发出黄绿色或绿色荧光，对不同种类致病菌均能高效快速标记。实验将其用于磁富集的大肠杆菌荧光标记，磁富集的大肠杆菌AO孵育30min后，用PBS清洗多余AO。AO标记的大肠杆菌发出绿色荧光（图2.5插图），且纳米磁珠发生聚集。荧光强度测定结果如图2.5，大肠杆菌菌液本身有一定的荧光背景，不加细菌的纳米磁珠与AO孵育后没有荧光，磁富集的大肠杆菌AO标记后荧光值显著提高，表明AO能有效标记磁捕获的大肠杆菌且纳米磁珠不产生干扰。1.51.0IFL0.50.0Fe3O4@SiO2-NH2/AOE.coliFe3O4@SiO2-NH2/E.coli/AO图2.5AO标记Fe3O4@SiO2-NH2、大肠杆菌及Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌的荧光值（n=3）插图为Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌显微图Fig.2.5FluorescenceintensityofFe3O4@SiO2-NH2,Fe3O4@SiO2-NH2@E.colilabeledwithAO(InsetwastheimagingofFe3O4@SiO2-NH2@E.coli-AO)23 重庆大学硕士学位论文2.3.4PEG凝胶层析分离Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌-AO磁捕获富集样本中的大肠杆菌用AO标记后可进行荧光定量检测，但较大的荧光背景常干扰检测结果，且在样本细菌含量较低时，反复清洗会造成细菌的损失。PEG具有一定粘度和较高比表面积，可减慢磁性颗粒的沉降速度。纳米磁珠与吸附纳米磁珠的细菌的粒径差异大，在外磁场作用下二者沉降速度不同，粒径较大的细菌沉降较快。此外，PEG还可将多余的AO截留在PEG界面上。因此，将磁富集后的大肠杆菌进行AO荧光标记后，通过PEG分离去除残余的磁性纳米粒子和荧光试剂（图2.6）。可直接对样本细菌含量进行可视化快速识别，并通过荧光检测进一步定量分析，避免了离心洗涤过程及残余磁珠等因素带来的干扰。图2.6PEG凝胶层析分离Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌-AO示意图Fig.2.6SchemaofPEGmagnetophoreticchromatographyforFe3O4@SiO2-NH2@E.coli-AO①PEG质量分数优化PEG的浓度会影响其粘度从而影响分离效果，PEG质量分数过大，残余纳米磁珠及磁捕获的大肠杆菌均被截留在液体界面；PEG质量分数过小，二者均会被分离到分离管底部。因此对不同PEG质量分数下分离效果进行考察，将1mL浓4-1度为10cfu•mL大肠杆菌磁富集后，分离物重悬于150μLPBS，移取至PEG分离柱中分离。为了排除磁珠自身聚集对结果的影响，以相同浓度不加菌液的纳米磁珠作为对照。结果如图2.7，PEG质量分数为50-30%范围内，由于粘度及表面张力较大，残余纳米磁珠及磁捕获的大肠杆菌均截留在PEG与样本溶液界面；质量分数25%时，磁捕获细菌组分离管底部有黑色沉淀，空白对照组的磁珠均没有沉降到底部；质量分数为20%时，有细菌组分离管底部有黑色沉淀，但不加细菌空白对照组磁珠有少量沉降到底部，因此选择PEG质量分数25%为最佳分离条件。24 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测图2.7不同PEG质量分数对分离效果影响Fig.2.7EffectofconcentrationofPEGsolutiontotheseparation②PEG凝胶层析分离效果观测将磁捕获富集的大肠杆菌用AO标记后，PEG分离能去除多余的磁珠及AO。纳米磁珠富集及PEG技术的结合，能避免普通荧光标记细菌检测中反复离心清洗过程造成的细菌损失。待分离的Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌-AO悬液如图2.8C，纳米磁珠捕获的大肠杆菌为绿色，但此时的荧光背景较大。PEG分离柱实物图（图2.8A），PEG能有效将AO截留于界面上，并将Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌分离到b部分。将分离管a，b部分分离物重悬于PBS中显微镜观察，a部分悬液（图2.8B）则仅有分散的磁珠没有绿色大肠杆菌，b部分悬液（图2.8D）多余AO试剂得到有效去除，能更明显看到大肠杆菌的绿色荧光，表明本方法能有有效去除多余的纳米磁珠及AO，去除荧光背景并分离出Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌。AaBbCD图2.8PEG凝胶层析分离前后显微观测结果（A.实物图;B.a方框分离物悬液;C.待分离的Fe3O4@SiO2-NH2@细菌-AO;D.b方框分离物悬液.荧光场为蓝色波段激发光）Fig.2.8A.PictureofPEGmagnetophoreticchromatography;B.Imagesofsolutionsinboxa;C.Imagesofsolutionsbeforeseparation;D.Imagesofsolutionsinboxb(amplificationwas40×40)25 重庆大学硕士学位论文2.3.5基于PEG分离的大肠杆菌可视化半定量测试和荧光定量测试①标准曲线制作在最优条件下，首先对系列浓度的标准大肠杆菌溶液进行分析，考察方法灵27-1敏度。标准大肠杆菌菌液PEG分离结果图2.9，随着大肠杆菌浓度10~10cfu•mL1-1范围增加，分离管底部黑色沉淀增加，而浓度为10cfu•mL菌液和空白对照组分离管底部没有磁珠的沉降，且所有浓度样本中AO的橙色均只出现在PEG上层。2-1表明本方法能可视化快速识别含菌量大于10cfu•mL的大肠杆菌，并有效分离多余的纳米磁珠和AO。将PEG凝胶分离得到的Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌重悬后检测其荧光值，标26-1准曲线如图2.10，荧光值与大肠杆菌菌液浓度的Log(c)在10-10cfu•mL范围内2-1有良好的线性关系，检测限为10cfu·mL，据此可以根据样本溶液荧光值计算其含菌量。图2.9不同浓度大肠杆菌菌液PEG凝胶分离可视化测试结果Fig.2.9OpticalimagesofstandardE.colisuspensionafterseparationofPEGmagnetophoreticchromatography2.0I=0.210Log(c)+0.588FL2R=0.9741.5IFL1.00.523456Log(c)图2.10荧光值与大肠杆菌菌液浓度的线性关系图（n=5）Fig.2.10LinearrelationbetweenthefluorescenceintensityandconcentrationsofE.coliinPBS.Theerrorbarsrepresentstandarddeviationsforn=526 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测②实际样本分析为了验证此方法在实际样本中应用的可行性，用本文方法分别对来自超市散装熟肉制品（cookedmeat3-4）和真空包装熟肉制品（cookedmeat5-6）进行检测。首先通过磁富集及PEG凝胶层析分离可视化能对样本含菌量半定量分析，实际样本的PEG分离结果如图2.11，将其与标准大肠杆菌菌液分离结果（图2.9）对照，34-1散装熟肉制品含菌量范围为10~10cfu·mL，真空包装熟肉制品中未检出。进而对细菌进行荧光定量检测，同时以国标法的平板计数法作为对照，结果如表2.3。本方法与平板计数法结果吻合，且检测时间为80min，远小于平板计数所需48h。表2.3方法和平板计数法在熟肉制品实际样本中检测结果对照Table.2.3ResultsofproposedmethodandplatecountmethodforactualsamplesActualsamplesPlatecountmethodProposedmethodRSD(n=5)-1-1(cfu•mL)(cfu•mL)(%)44cookedmeat31.5×101.46×105.8644cookedmeat41.4×101.42×106.53cookedmeat51Notfound—cookedmeat60Notfound—③方法学验证对熟肉制品合成样本和自来水合成样本进行分析，计算回收率，考察方法的重复性。首先对合成样本和实际样本用PEG层析分离进行快速分离判定，PEG分离检测结果如图2.11。自来水合成样本和熟肉制品合成样本中大肠杆菌浓度分别3-15-1为5.0×10cfu•mL和1.0×10cfu•mL，与图2.9中相应标准大肠杆菌菌液PEG凝胶柱底部分离物吻合。PEG凝胶分离仅需10min，可用于食品样本含菌量快速可视化半定量分析。进而对样本进行定量分析，根据检测荧光值用建立的标准曲线计算出合成样本大肠杆菌的浓度，加标回收率计算结果如表2.4，该方法对于加标样本的回收率在93.6%~102.0%之间，RSD小于7%（n=5），表明该方法具有良好的准确性和可靠性。27 重庆大学硕士学位论文图2.11不同大肠杆菌合成样本与熟肉制品实际样本PEG分离的可视化结果Fig.2.11OpticalimagesofsyntheticsamplesandpracticalcookedmeatsamplesafterseparationbyPEGmagnetophoreticchromatography表2.4自来水合成样本和熟肉制品合成样本检测回收率Table.2.4RecoveryrateforsyntheticsamplesdetectionSyntheticsamplesAddedFoundRecoveryRSD(n=5)-1-1(cfu•mL)(cfu•mL)(%)(%)55tapwater11.0×101.02×10102.0%4.9433tapwater25.0×104.80×1096.0%4.0454cookedmeat11.0×109.69×1096.9%6.5133cookedmeat25.0×104.68×1093.6%6.472.3.6基于微流控芯片的大肠杆菌荧光定量检测①微流控芯片分析系统与进样流速优化本文设计制备了集细菌荧光标记、磁捕获及荧光检测于一体的微流控芯片，并与搭建的小型荧光仪组成芯片荧光检测系统（图2.12）。Fe3O4@SiO2@大肠杆菌在蛇形通道内能与AO充分混合，实现荧光标记。通过在芯片检测区放置磁铁，能将荧光标记后的Fe3O4@SiO2@大肠杆菌捕获在检测区，PBS冲洗能充走多余的标记试剂，用搭建的小型荧光仪进行荧光检测。6条通道能同时进行平行样本或多个样本检测，缩短检测时间，提高测试效率。ABC图2.12A.细菌芯片荧光可视化荧光系统；B.芯片实物图；C.细菌芯片荧光定量检测系统Fig.2.12A.Photographofvisualanalyticalsystem;B.Pictureofmicrofluidicchip;C.Fluorescencedetectsystemforthemicrofluidicchip28 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测芯片进样流速会影响AO对Fe3O4@SiO2@大肠杆菌的标记及检测区捕获效果，因此对不同流速下磁捕获区荧光标记情况进行观察。检测区放置外磁铁，分别设置三种流速将Fe3O4@SiO2@大肠杆菌和AO通入芯片后，PBS冲洗。显微观察芯片检测区（图2.13），三种流速下均能在检测区观察到发出绿色荧光的细菌，表明-1在此芯片上能实现细菌荧光标记。由于20μL•min时流速较低，蛇形通道中磁珠-1沉降严重，富集区捕获到的磁珠较少；80μL•min时流速较大，部分磁捕获的细-1菌被冲出捕获区，影响捕获率。因此选择50μL•min为最佳进样流速，此时检测区捕获到的磁珠较多。-1图2.13进样流速20、50、80μL·min时芯片磁捕获区显微图.荧光场为蓝色波段激发光-1Fig.2.13Imagesofthedetectionzonesunderdifferentflowratesof20,50,80μL·min②大肠杆菌的定量检测-1最优流速50μL·min条件下，将梯度浓度的大肠杆菌溶液制备成的Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌和AO溶液通入芯片，采用自制的小型荧光仪检测。其结果如图2.14A，当样本通入检测区后，荧光信号逐渐变大，这是由于AO在芯片上逐渐对磁捕获的细菌进行荧光标记，且检测区捕获的大肠杆菌逐渐增加。进样结束，PBS冲洗至电压值稳定。通入不同浓度沙门氏菌样本前后荧光信号及变化值△V如表2.5，通入不与细菌孵育的Fe3O4@SiO2-NH2和AO后，其荧光信号值几乎不变，表明Fe3O4@SiO2-NH2不影响测试结果。△V随着大肠杆菌浓度的增加而增加，将电压变化值△V为纵坐标，菌液浓度Log值为横坐标建立标准曲线，在26-110~10cfu•mL范围内成线性关系，其线性方程为△V=0.111Log(c)-0.0386，线性2-1相关系数为0.932，检出限为10cfu•mL。29 重庆大学硕士学位论文表2.5芯片荧光检测不同浓度沙门氏菌的荧光信号Table2.5FluorescencesignalsforE.Coliseriesbasedonchipanalyticalsystem-1c（cfu•mL）Log（c）V0（mV）V1（mV）△V（mV）000.1420.1480.00611.0×101.00.2250.2340.00921.0×102.00.1740.3370.16325.0×102.70.1580.4490.29131.0×103.00.1750.5020.32735.0×103.70.1730.5310.35841.0×104.00.1270.6050.47845.0×104.70.1320.5530.42151.0×105.00.1410.6150.47461.0×106.00.1930.8750.6820.80.8V=0.111Log(c)-0.0386AB2R=0.9324-110cfu·mL0.60.4V0.4VDC0.20.00.002040608010023456t/sLog(c)图2.14A.Fe3O4@SiO2-NH2@大肠杆菌在微流控芯片上荧光检测结果B.荧光信号变化值△V与大肠杆菌浓度Log值关系图4-1Fig.2.14A.FluorescencesignalforFe3O4@SiO2-NH2@E.Coli（10cfu•mL）inchip.B.linearcalibrationdataofthefluorescenceintensityvs.theconcentrationlogarithmofE.Coli2.4本章小结本章将纳米磁珠静电富集用于致病菌的分离，采用Fe3O4@SiO2-NH2对大肠杆菌进行捕获，可有效减低食品样本带来的复杂基质干扰，实现样本中目标细菌的捕获和富集。将磁富集与PEG凝胶层析分离技术有机结合，建立了食品中致病菌快速测试的高效预处理方法，实现了致病菌的快速可视化定性观测和原位荧光定量测试。将磁富集与微流控芯片结合，建立了芯片上高通量快速致病菌检测方法。30 2基于纳米磁富集和AO标记大肠杆菌的快速荧光检测研究显示：通过优化Fe3O4@SiO2-NH2捕获大肠杆菌用量150μg，时间为40min时，对大肠杆菌捕获率为95.4%。利用PEG凝胶层析的方式，通过优化PEG质量分数，25%PEG可将磁珠-细菌复合物与残余的磁珠及AO分离。与传统的离心分离清洗相比，其受荧光背景干扰更小。对大肠杆菌检测的荧光值与菌液浓度在26-1-110-10cfu•mL范围有良好的线性关系，检测限可达到100cfu•mL。本方法对熟肉制品样本中细菌检测结果与平板计数法结果一致，表明建立的方法准确性好，检测时间80min大大低于平板计数法。对建立的方法进行方法学考察，加标样本的回收率在93.6%~102.0%之间，RSD小于7%（n=5），表明该方法具有良好的准确性和可靠性。在此基础上，将磁富集结合微流控芯片技术，利用微流控芯片高通量的特点，设计制备了集荧光标记、磁捕获和荧光检测于一体的芯片对大肠杆菌进行检测。-1样本和AO进样量为50μL时，优化进样流速50μL•min，能实现对大肠杆菌的26捕获和荧光标记。用小型荧光仪进行定量检测，荧光信号值与菌液浓度在10-10-1-1cfu•mL范围有良好的线性关系，检测限为100cfu•mL。芯片上可进行6个样本的同时测试，有效地提高了检测效率。31 重庆大学硕士学位论文32 3纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究3纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究3.1引言沙门氏菌是全球分布食源性致病菌，存在熟肉、鸡肉类食品、未清洗的水果和蔬菜中，是导致人肠胃炎的主要原因。食品中沙门氏菌的检测分析通常需要[84]12-72h，包含种属选择性富集和血清型分析来鉴别细菌。因此对食品、饮料生产和消费者来而言，急需一种快速有效的沙门氏菌的检测方法。纳米材料在细菌快速检测中已有广泛应用，但由于大部分纳米材料都不能通过内吞通过细菌细胞壁，因此纳米材料表面的修饰成为研究的关键。研究显示表面修饰的磁性纳米粒子能有效从复杂样本基质中捕获目标菌，万古霉素修饰纳米[85][86]磁珠能与捕获样本中的革兰氏阳性菌，Park等在纳米磁珠表面修饰抗体对牡蛎样本中副溶血弧菌进行分离。荧光纳米材料在细菌特异性检测中也被广泛应用，目前较多研究将特异性纳米磁捕获和特异性荧光标记二者结合用于细菌检测。近来有研究提出制备兼具荧光和磁性的纳米复合材料用于细菌检测，磁性荧光纳米粒子大多是由Fe3O4纳米粒子和荧光探针组成，这种多功能标记材料可同时实现细菌的分离富集和荧光标记，但对如何提高检测选择性，解决标记试剂过量的干扰等还需进一步探索。适配体（Aptamer，Apt）具有与抗体相近或更高的亲和性，具有稳定性好、[87]尺寸适中及价格相对较低等优势，被广泛应用在生物分子的选择性识别检测中。本章将四氧化三铁纳米粒子二氧化硅包裹并氨基修饰后，在其表面连接富含羧基的荧光产率高、性能稳定的碳量子，制备得到兼具荧光和磁性的磁性碳量子点Fe3O4@CQDs。针对沙门氏菌样本，利用复合材料表面碳量子点易修饰的特点，在磁性碳量子点表面连接适配体，以实现样本中沙门氏菌的捕获和检测。通过优化磁性碳量子点的用量，得到沙门氏菌菌液浓度与荧光强度变化值之间的定量关系，建立选择性好，荧光背景干扰小的沙门氏菌荧光定量快速检测方法。3.2实验部分3.2.1试剂与仪器沙门氏菌适配体5′-NH2-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。沙门氏菌ATCC14028由重庆医科大学易教授友情馈赠，接种环挑取沙门氏菌oATCC14028菌种于60mL灭菌LB液体培养基中，在细菌培养箱中于37C培养过33 重庆大学硕士学位论文夜，8000rpm离心3min，去除培养基，重悬PBS清洗3次，PBS梯度稀释到所需菌液浓度。表3.1化学试剂Table3.1Reagentsintheexperiment名称规格型号公司及产地LB肉汤—北京陆桥技术股份有限公司LB平板计数培养基—北京陆桥技术股份有限公司沙门氏菌显色培养基—广东环凯微生物技术有限公司柠檬酸AR重庆博艺化学试剂有限公司无水乙二胺AR上海试四赫维化工有限公司碳化二亚胺(EDC)AR阿拉丁试剂厂N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)AR成都市科龙化工试剂厂Fe3O410nm北京德科岛津氨水（25%）AR重庆川东化工集团有限公司正硅酸乙酯（TEOS）98%百灵威化学技术有限公司3-氨基丙基三甲氧基硅烷(APTES)98%百灵威化学技术有限公司沙门氏菌适配体—生工生物工程股份有限公司表3.2实验仪器Table3.2Experimentalapparatus名称规格型号公司及产地荧光光谱仪RF-5301日本岛津荧光倒置显微镜OLYMPUSIX71日本奥林巴斯株式会社紫外分光光度计UV-2450日本岛津细菌培养箱MJ-160型上海贺德实验设备有限公司超净台SWCJO苏州净化公司傅里叶红外光谱仪傅里叶红外光谱仪日本岛津高速离心机TGL-16巩义市英峪予华仪器厂磁分离架BCN2016-2无锡百运纳米科技有限公司34 3纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究3.2.2Fe3O4@CQDs的制备碳量子点由改进的水热法合成。取0.42g柠檬酸、0.53mL乙二胺和10.0mLo去离子水于聚四氟乙烯高压反应釜中，将其置于200C的电热恒温鼓风干燥箱中o反应5h。反应结束后，冷却至室温，避光4C保存。40mgFe3O4溶于20mL去离子水中，加入150mL乙醇，超声分散15min。加o入1mL氨水，30C搅拌反应30min，再加入0.1mLTEOS继续搅拌反应45min。加入0.07mLAPTMS后继续反应4h。反应结束，依次用无水乙醇和去离子水清洗，冷冻干燥后得到Fe3O4@SiO2-NH2粉末。取200μLCQDs溶液加入到800μL新鲜配置的EDC和NHS水溶液中使其终浓度分别为400mM和200mM，避光振摇反应30min。加入3mLFe3O4@SiO2-NH2-1水溶液（1mg•mL），加入去离子水稀释至15mL，150rpm振摇反应1h。外磁铁作用下分离，去离子水清洗，制备得到磁性碳量子点Fe3O4@CQDs。3.2.3Fe3O4@CQDs-Apt的制备-1取2mL制备的Fe3O4@CQDs（1mg•mL），加入EDC和NHS使其终浓度分别为60mM和30mM，避光反应30min，活化Fe3O4@CQDs的羧基，最后加入o20μL适配体（10mM），于37C反应1h。反应结束，磁分离，Tris溶液封闭2h，磁分离，PBS清洗3次得到适配体修饰的磁性碳量子点Fe3O4@CQDs-Apt。由于磁珠表面的碳点含有大量羧基，在EDC/NHS作用下，能与沙门氏菌适配体5'端的氨基形成酰胺键，从而形成复合物。3.2.4Fe3O4@CQDs-Apt检测沙门氏菌用量优化1234567-1向2mLPBS配置的0、10、10、10、10、10、10、10cfu•mL沙门氏菌o标准菌液中分别加入50、150、250μgFe3O4@CQDs-Apt，摇床中37C下150rpm振摇孵育60min。反应结束后磁分离架分离，移除上清液，PBS清洗2次，重悬于2mLPBS中。采用荧光光谱仪测试荧光强度IFL，以沙门氏菌浓度对数为横坐标，荧光强度为纵坐标建立标准曲线，获得IFL~log(c)关系，将线性关系好，线性范围宽的Fe3O4@CQDs-Apt用量作为最佳用量。3.2.5特异性实验5-1用PBS分别配置2mL浓度为10cfu•mL的沙门氏菌、大肠杆菌JM109及金黄色葡萄球菌标准菌液，向三种菌液中分别加150μgFe3O4@CQDs-Apt，摇床中o37C下150rpm振摇孵育60min。反应结束后磁分离架分离，移除上清液，PBS清洗2次后重悬于2mLPBS中，荧光光谱仪检测。3.2.6样本中沙门氏菌特异性检测实验用样本商业无菌脱脂牛奶和鸡胸肉均从沃尔玛超市购买，采样后1h内立即进行检测。35 重庆大学硕士学位论文①标准曲线制作脱脂牛奶用0.22μm微孔滤膜过滤除菌，向过滤的1900μL脱脂牛奶中，加入123100μLPBS配置的标准沙门氏菌菌液并分散均匀，使其终浓度分别10、10、10、4567-110、10、10和10cfu•mL。5000×g离心10min，去除上层液，PBS清洗2次，重悬于PBS中，得到系列菌液浓度牛奶样本。25g鸡胸肉与225mL无菌PBS混合，均质3min，均质液0.22μm微孔滤膜过滤去除影响测试的大颗粒物质和细菌，依照配置系列菌液浓度牛奶样本方法，配置得到系列菌液浓度鸡肉样本。分别向2mL系列菌液浓度的牛奶样本、鸡肉样本中加入150μgoFe3O4@CQDs-Apt，摇床中37C下150rpm振摇孵育60min，按3.2.4操作，以沙门氏菌菌液浓度对数为横坐标，荧光强度的减小值为纵坐标建立标准曲线，获得IFL0-IFL1和log(c)定量关系。②样本分析购买的脱脂牛奶中，加入PBS配置的标准沙门氏菌菌液，使其终浓度分别为3-15-15×10cfu·mL和10cfu·mL，依照标准曲线测定方法对加标样本检测。25g鸡肉与225mLPBS混合，均质3min，均质液0.45μm过滤去除影响测3-15-1试的大颗粒物质，加入标准沙门氏菌菌液至终浓度为5×10cfu•mL和10cfu•mL。依照标准曲线测定方法对其进行检测，以不加标准菌液的样本作为阴性对照组，根据标准曲线对样本中沙门氏菌进行定量，并计算回收率。3.3结果与讨论3.3.1Fe3O4@CQDs-Apt的设计新型纳米复合材料磁性荧光碳量子点的设计是基于碳量子点荧光效率高、易修饰、低毒和生物相容性好等优势，以碳量子点代替毒性大且生物相容性不好的量子点。通过其表面的羧基与磁性Fe3O4纳米粒子通过共价结合，形成具有磁性特性的新型荧光探针，在表面修饰适配体后可一步实现沙门氏菌的特异性捕获及荧光检测。为了减少Fe3O4对碳量子点荧光的淬灭，同时考虑到磁性纳米Fe3O4与碳量子点的有效结合，实验首先采用Stober法，通过TEOS在碱性条件下水解形成包裹Fe3O4的二氧化硅壳层结构（Fe3O4@SiO2）。二氧化硅壳层可增加Fe3O4与碳量子点之间的距离，降低Fe3O4对碳点影响。壳层表面进一步用APTES取代TEOS上的-OH基团，在其表面修饰氨基得到Fe3O4@SiO2-NH2。碳量子点表面的羧基先与EDC/NHS作用使其活化，与Fe3O4@SiO2-NH2进一步共价连接制备得到Fe3O4@CQDs。包裹在纳米磁珠表面的碳量子点再经过EDC/NHS活化羧基后，与36 3纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究'5端修饰氨基的沙门氏菌适配体通过酰胺基连接，制备得到适配体修饰的磁性碳量子点（Fe3O4@CQDs-Apt），Fe3O4@CQDs-Apt特异性与沙门氏菌结合并发生团聚，导致磁性碳量子点荧光强度降低，通过荧光强度随细菌浓度的减小值实现对沙门氏菌的定量检测。图3.1Fe3O4@CQDs-Apt的制备及标记沙门氏菌示意图Fig.3.1SynthesisprocessofFe3O4@CQDs-AptnanocompositesandtheschematicofSalmonellafluorescentdetection3.3.2Fe3O4@CQDs-Apt的制备和表征采用红外光谱仪对制备的CQDs、Fe3O4@SiO2-NH2及Fe3O4@CQDs进行测试-1-1（结果如图3.2A）。CQDs的FTIR光谱在1650cm有C=O的吸收峰，1570cm-1有N-H弯曲振动，3430cm有C-OH的伸缩振动峰，说明CQDs表面有羟基、羧-1-1基和氨基。Fe3O4@SiO2-NH2在1094cm有Si-O-Si伸缩振动峰，在890cm和790-1-1cm的吸收峰为Si-OH伸缩振动峰和Si-O-Si弯曲振动峰，3434cmN-H伸缩振动，-11650-1580cm处N-H弯曲振动，表明在四氧化三铁表面成功包裹上二氧化硅，并-1在其表面实现了氨基化。Fe3O4@CQDs的FTIR图谱在2938cm处出现碳量子点C-H的伸缩振动峰，表明碳量子点成功连接到纳米磁珠铁表面。采用紫外-可见吸收光谱仪分别对适配体、CQDs及Fe3O4@CQDs-Apt进行紫外表征（图3.2B），Fe3O4@CQDs-Apt在255nm有适配体吸收峰，350nm处有碳量子点的吸收峰，表明碳量子点及适配体修饰成功。采用RF-5301荧光光谱仪，测试CQDs、Fe3O4@CQDs、Fe3O4@CQDs-Apt和Fe3O4@CQDs-Apt@salmonella的荧光光谱。结果如3.2C，CQDs最大激发波长为350nm，发射波长均为443nm；Fe3O4@CQDs和Fe3O4@CQDs-Apt的最大激发波长均为300nm，此时发射波长为410nm，且二者荧光强度均比碳量子点本身有所降低。可能是由于碳量子点连接到四氧化三铁纳米粒子表面后，其表面的电荷密37 重庆大学硕士学位论文度发生改变，从而影响到荧光磁性碳量子点的荧光性能，导致最大激发波长和发射波长发生改变。适配体修饰后的纳米复合材料荧光强度稍有下降，在与沙门氏菌孵育后，荧光强度明显降低，但激发波长和发射波长未发生变化。分别将高浓7-11-1度（10cfu•mL）和低浓度（10cfu•mL）沙门氏菌溶液和Fe3O4@CQDs-Apt孵育后，肉眼可观察到高菌液浓度组悬液中发生明显聚集，而低浓度组未观察到明显现象。显微图（图3.2D）显示低浓度组悬液比高浓度组分散性更好，且荧光场下能看到蓝色荧光，而高浓度组荧光猝灭，这是由于纳米复合材料与细菌孵育后发生聚集，粒子距离较近，从而导致荧光下降。因此，根据与沙门氏菌孵育后荧光强度下降值，可对沙门氏菌进行检测。图3.2A.碳量子点、Fe3O4@SiO2和Fe3O4@CQDs-Apt的红外光谱B.适配体、碳量子点和Fe3O4@CQDs-Apt紫外-可见光谱图C.碳量子点、磁性碳量子点及Fe3O4@CQDs-Apt标记沙门1-1氏菌前后荧光光谱；D.Fe3O4@CQDs-Apt标记沙门氏菌后显微图（菌液浓度a1-a2:10cfu•mL;7-1b1-b2:10cfu•mL.插图为实物图）Fig.3.2A.FTIRspectrasofCQDs,Fe3O4@SiO2andFe3O4@CQDs-Apt;B.UV-VisspectrumsofApt,CQDsandFe3O4@CQDs-Apt;C.FluorescencespectraofCQDs,Fe3O4@CQDs,Fe3O4@CQDs-Apt1-17-1D.ImagesoftheFe3O4@CQDs-Aptincubatedwithsalmonella（a1-a2:10cfu·mL,b1-b2:10cfu·mL）38 3纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究3.3.3Fe3O4@CQDs-Apt用量优化Fe3O4@CQDs-Apt与沙门氏菌孵育后，大量的标记试剂连接到沙门氏菌表面造成纳米粒子团聚，从而导致荧光强度的降低，此过程中Fe3O4@CQDs-Apt的用量对检测结果由为重要。当用量过少时，Fe3O4@CQDs-Apt与一定浓度细菌结合就饱和，更高浓度细菌加入孵育后Fe3O4@CQDs-Apt的荧光强度就不会再变化；Fe3O4@CQDs-Apt用量过高，自身易团聚和沉降造成荧光强度下降，从而干扰测试结果。因此将梯度浓度的沙门氏菌分别与50、150、250μg的Fe3O4@CQDs-Apt孵育，得到其荧光强度与菌液浓度对数关系。由图3.3可知，当Fe3O4@CQDs-Apt3-1用量为50μg时，菌液浓度高于10cfu•mL时荧光强度随细菌浓度的增加几乎不3-1再变化。可能是细菌浓度为10cfu•mL时，Fe3O4@CQDs-Apt与细菌的结合已经达到饱和。Fe3O4@CQDs-Apt用量为250μg时，由于纳米粒子浓度较高易团聚和沉降，检测结果不稳定。因此150μg为最佳用量，此时测试结果较为稳定，且线性范围较宽。25050μg150μg200250μg150IFL1005001234567Log(C)图3.3不同用量Fe3O4@CQDs-Apt与不同浓度的沙门氏菌菌液孵育1h后荧光强度变化趋势图Fig.3.3FluorescenceintensitychangeofdifferentconcentrationsalmonellasolutionafterincubatedwithvariousamountofFe3O4@CQDs-Aptfor1h.3.3.4特异性测试5−1为了验证方法的特异性，用建立的方法对相同浓度（10cfu•mL）的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌进行检测。实验结果（图3.4）显示，大肠杆菌和金葡萄球菌未获得有效的荧光信号变化值，而沙门氏菌的荧光强度变化明显。结果表明建立的纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt荧光检测细菌的方法特异性好，大肠杆菌和金葡萄球菌不会干扰对鼠伤寒沙门氏菌的检测。39 重庆大学硕士学位论文2001501FL-I0FL100I500SalmonellaE.coliS.aureus5-1图3.4Fe3O4@CQDs-Apt(150μg)与相同浓度(10cfu•mL)的沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌孵育后荧光强度降低值Fig.3.4RelativefluorescenceintensitychangesoftheFe3O4@CQDs-Apt(150μg)towarddifferenttargets.Errorbarsindicatestandarddeviation(n=3)3.3.5样本分析①牛奶和鸡肉样本标准曲线制作：为了考察本方法在复杂样本分析中能否避免样本背景基质干扰，本文制备了沙门氏菌合成的液体样本牛奶和固体样本鸡肉，对加入的沙门氏菌进行定量分析。样本的制备处理如3.2.6所述，用0.22μm微孔滤膜过滤去除牛奶和鸡肉样本溶液17-1中的细菌后，加入PBS配置的沙门氏菌溶液，得到10~10cfu•mL的系列浓度的沙门氏菌牛奶样本和鸡肉合成样本溶液，利用所建立的方法进行检测。结果如图3.5，在牛奶及鸡肉合成样本中，荧光强度值随样本中沙门氏菌的浓度的升高而降36-1低，荧光强度变化值与菌液浓度的对数在10~10cfu•mL范围内呈线性关系。以上结果表明Fe3O4@CQDs-Apt能对牛奶和鸡肉样本的沙门氏菌进行标记，不受样本背景基质的干扰，可用于牛奶和鸡肉复杂样本中沙门氏菌的特异性定量检测。40 3纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究Log(c)ofsalmonella350ABLog(c)ofsalmonella30013004001400225023250320044200551506Fluorescenceintensity1503006fluorescenceintensity3007FL71001234567I1234567IFLLog(c)Log(c)200200100100350400450500350400450500nm/nmCMilkD200Chickenbreast150I-I=48.84Log(c)-118.8I-I=56.23Log(c)-156.6FL0FL1FL0FL122R=0.991150R=0.9791FL-I100-IFL10IFL100IFL050500034563456Log(c)Log(c)图3.5Fe3O4@CQDs-Apt与系列浓度沙门氏菌合成样本孵育后荧光光谱图：A.牛奶，B.鸡肉荧光强度变化值与菌液浓度定量标准曲线：C.牛奶，D.鸡肉Fig.3.4EmissionspectraofFe3O4@CQDs-Aptincubatedwithmilk(A)andchickenbreast(B)samplesinseriesconcentrations;StandardcurveofFe3O4@CQDs-AptlabeledSalmonellainspikedmilk(C)andchickenbreast(D)samples(n=3)②样本分析为了考察本文分析检测方法的可靠性与准确性，在不过滤除菌的牛奶和鸡，肉样本中，分别加入PBS配置的不同浓度的沙门氏菌制备标准加入样本，使其终3-15-1浓度分别为5.0×10cfu•mL和1.0×10cfu•mL，并进行荧光检测。结果如表3.3显示，该方法对于加标样本的回收率在94.7%~110.2%之间，RSD小于10%（n=5）。此外，在不加标准菌液的样本中，本方法未检测到沙门氏菌；采用显色平板计数培养基对实际样本进行培养（图3.6），牛奶和鸡肉样本中均未发现沙门氏菌，仅在鸡肉样本中发现有大肠菌群（蓝绿色菌落），以上结果表明建立的方法具有准确性和可靠性。41 重庆大学硕士学位论文表3.3合成样本检测的回收率Table3.3RecoveryrateforsampledetectionAddedFoundRecoveryRSD（n=5）Sample-1-1（cfu•mL）（cfu•mL）（%）（%）33Chickenbreast5.0×105.51×10110.29.11%53Chickenbreast1.0×101.02×10102.06.47%Chickenbreast00——33Milk5.0×105.33×10106.65.94%54Milk1.0×109.47×1094.78.01%Milk00——图3.6沙门氏菌选择性显色培养基分别对鸡肉和牛奶实际样本培养48h结果（蓝绿色菌落为大肠菌群）Fig.3.6Thechromogenicsalmonellaagarresultsofchickencheatandmilkafterculturefor48h3.4本章小结本章制备了兼具荧光和磁性的复合纳米材料Fe3O4@CQDs，在其表面修饰适配体后，用于沙门氏菌特异性检测。采用柠檬酸和乙二胺为原料，通过水热法制备的碳量子点表面富含羧基，通过共价结合到制备的Fe3O4@SiO2-NH2表面，得到Fe3O4@CQDs，其最大激发波长为300nm，发射波长为410nm。为了实现沙门氏菌的特异性标记，将氨基修饰适配体Apt连接到表面含有羧基的Fe3O4@CQDs上，紫外-可见吸收光谱表征结果表明Fe3O4@CQDs-Apt制备成功。适配体修饰的磁性碳量子点与沙门氏菌特异性结合后，纳米粒子发生团聚导致荧光强度降低。优化Fe3O4@CQDs-Apt用量在150μg与样本孵育1h时，荧光强度的变化值与沙门氏42 3纳米复合材料Fe3O4@CQDs-Apt用于沙门氏菌特异性检测研究36-1菌在10~10cfu•mL浓度范围存在线性关系，对牛奶和鸡肉合成样本的检出限为3-110cfu•mL；将Fe3O4@CQDs-Apt分别与相同浓度的沙门氏菌、大肠杆菌及金黄色葡萄球菌检测，仅对沙门氏菌有信号，表明建立的方法具有良好的特异性，能用于背景基质复杂的食品样本中致病菌的检测。43 重庆大学硕士学位论文44 4碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究4碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究4.1引言2014年世界卫生组织发布报告称，抗生素耐药性细菌正在全球各地蔓延，因此对新型的抗菌策略的需求越来越迫切。近年研究发现细菌群体感应（Quorum[88]sensing，QS）可调节细菌致病性，因此以群体感应系统为靶点干扰感染宿主的[61]致病菌，降低致病菌的毒害作用，已成为新型抗菌药物研发的热点。群体感应抑制剂（Quorumsensinginhibitor，QSI）探索研究中，天然植物中提[89]取的无毒且具有群体感应抑制作用的物质受到越来越多研究者的关注。Zhang等对富含多酚和黄酮的玫瑰茶提取物提取物对大肠杆菌和铜绿假单胞菌的QS都具[90]有抑制作用，Li等研究石榴多酚对沙门氏菌毒力因子产生和群体感应的影响。[91]对干扰QS从而抑制细菌侵染细胞的研究，大多基于平板菌落计数法，对侵染细胞的细菌进行检测，存在耗时长、操作复杂等缺点；荧光标记检测可快速反应细[92]菌感染情况，但常用荧光染料、绿色荧光蛋白标记细菌的检测方法存在染料易光漂白，荧光蛋白标记设计复杂，技术难度高等不足，因此如何实现方法简便QSI效果检测成为亟待解决的问题。荧光纳米材料由于荧光稳定性好、毒性低等优势在生物成像中备受关注。沙门氏菌是兼性胞内寄生菌，可侵染吞噬细胞和非吞噬细胞，是人和动物致病的重要病原之一。已有研究表明单宁酸具有抑制大肠杆菌AHL信号调控的群体[93][94]感应作用，含山奈酚的提取物能抑制铜绿假单胞菌的群体感应，厚朴酚主要用作抗菌药物。本章将纳米碳量子点荧光标记用于群体感应抑制作用效果检测，将碳量子点标记的沙门氏菌感染细胞，以呋喃酮C30为阳性对照物，分别对单宁酸、厚朴酚及山奈酚抑制沙门氏菌感染HT-29细胞作用进行荧光检测，为QS抑制剂作用检测提供新途径。4.2实验部分4.2.1试剂与仪器45 重庆大学硕士学位论文表4.1：化学试剂Table4.1Reagentintheexperiment名称规格型号公司及产地柠檬酸AR重庆博艺化学试剂有限公司硫脲AR重庆化学试剂厂碳化二亚胺(EDC)AR阿拉丁试剂厂N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）AR成都市科龙化工试剂厂DMEM培养液ARHyCloneCo.,USA胎牛血清—HyCloneCo.,USA庆大霉素—生工生物工程股份有限公司LB培养基—北京陆桥技术股份有限公司沙门氏菌适配体—生工生物工程股份有限公司N-己酰高丝氨酸内酯诱导剂（AHL）—山东派克生物科技有限公司呋喃酮C30—青岛百德生物化学品有限公司沙门氏菌ATCC14028重庆医科大学易教授馈赠紫色色杆菌C.violaceumATCC12472微生物菌种资源共享网沙门氏菌适配体5′-NH2-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA-3由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。10mgN-己酰高丝氨酸内酯诱导剂AHL溶于2mLDMSO中，0.22μm有机滤o膜过滤，-20C保存，备用。呋喃酮C-30溶于2mLDMSO，同样的方法保存备用。沙门氏菌ATCC14028由重庆医科大学易教授友情馈赠。接种环挑取沙门氏菌oATCC14028菌种于60mL灭菌LB液体培养基中，在细菌培养箱中于37C培养过o夜，置于4C冰箱备用。紫色色杆菌C.violaceumATCC12472购买于微生物菌种资源共享网。将菌种冻干粉斜面活化后，接种环挑取紫色色杆菌ATCC12472菌落于60mL灭菌液体培oo养基中，在细菌培养箱中于30C培养过夜，置于4C冰箱备用。46 4碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究表4.2实验仪器Table4.2Experimentalapparatus名称规格型号公司及产地荧光倒置显微镜OLYMPUSIX71日本奥林巴斯株式会社二氧化碳培养箱HH.CP-7W上海博迅细菌培养箱DNP-9052型上海精宏实验设备有限公司超净台SWCJO苏州净化公司高速离心机TGL-16巩义市英峪予华仪器厂座式自动电热压力蒸汽灭菌锅ZDX-35B1上海申安医疗器械厂多功能酶标读数仪VarioskanFlash赛默飞世尔科技有限公司荧光倒置显微镜OLYMPUSIX71日本奥林巴斯株式会社4.2.2CQDs-Apt的制备称取柠檬酸和硫脲各0.5g，加入10mL去离子水溶解，微波炉设置中火反应7min，反应完取出冷却至室温。转移到离心管中，10000rpm离心5min，0.22μmo过滤膜过滤，4C避光保存备用。向100μLCQDs中加入100μLEDC（60mM）和100μLNHS（30mM），室温避光振摇反应30min，再加入100μL沙门氏菌适配体（10μM），继续振摇反应1h，Tris溶液封闭得适配体修饰的碳量子点CQDs-Apt。4.2.3CQDs-Apt标记沙门氏菌8-1取200μL制备好的CQDs-Apt溶液，加入到400μLPBS重悬的10cfu•mLo的沙门氏菌悬液中，PBS稀释至1mL，37C振摇孵育1h，PBS离心洗涤3次，得到碳量子点荧光标记的沙门氏菌，备用。4.2.4最小抑菌浓度MIC测试将生长对数期的沙门氏菌用新配置的LB稀释至OD600≈0.05，并每孔195μL加入无菌96孔板中。分别用去离子水溶解单宁酸，DMSO溶解厚朴酚，乙醇溶解山奈酚，以DMSO配置的呋喃酮C30作为阳性对照物，二倍稀释法配置药物。分别取5μL加入到有菌液的96孔板至不同终浓度，同体积溶剂为对照，每组设置三o个平行。将孔板于37C静置培养24h，测定OD600nm，得到药物最小抑制浓度。4.2.5紫色素杆菌QSI实验将活化培养过夜的C.violaceum用培养基稀释至OD600为0.05，参照4.2.4最小抑菌浓度测试操作流程，考察药物对紫色素杆菌生长的影响。将活化培养过夜的C.violaceum稀释至OD600为0.1，向100μL稀释后的菌液中分别加入2.9mL含有呋喃酮C30，单宁酸、厚朴酚、山奈酚的LB培养基中，使药物终浓度为1/32、1/16、1/8、1/4、1/2MIC，以不加药物组为空白对照，每组47 重庆大学硕士学位论文o3个平行，于30C培养24h。取1mL培养后细菌悬液13000rpm离心10min，沉淀出紫色杆菌素，弃上清液。加入500μLDMSO，漩涡振荡，充分溶解紫色菌素，再于13000rpm离心10min，取上清液，测试585nm吸光度，考察药物对紫色素杆菌产生紫色菌素的影响。4.2.6运动性实验-1Swimming运动：培养基为琼脂0.3%（wt/vol），25g•LLB加入不同药物配置，高压灭菌后冷却后成半固体培养基。将2μL沙门氏菌刺入半固体培养基中，o于37C静置培养7h，拍照记录。-1-1Swarming运动：培养基为琼脂0.5%（wt/vol），5g•L葡萄糖，25g•LLB加入不同药物配置，灭菌后于超净台风干15min。向培养基中央滴加2μL菌液，于o37C培养7h，拍照记录。4.2.7几种抑制剂的细胞毒性测试5-1将密度为2×10个•mL的结肠癌细胞HT-29每孔100μL接种到96孔板上，培养过夜。PBS清洗三次，分别加入100μL新鲜细胞培养基配制的呋喃酮C30，单宁酸、厚朴酚、山奈酚培养24h，设置5组平行实验。结束后加入20μLMTT试剂继续培养4h，移除上清液，加入150μLDMSO，振摇10min，多功能酶标读数仪检测490nm处的OD值，计算细胞生存力。4.2.8几种抑制剂对沙门氏菌感染HT-29细胞的影响5-1细胞培养：将2×10个•mL对数生长期的结肠癌细胞HT-29每孔100μL接种到96孔板上，在10%胎牛血清，1%双抗的DMEM培养液中培养过夜，移去培养液，PBS清洗。用含C6-AHL（终浓度1μM）的DMEM重悬4.2.3中荧光标记的沙门氏菌，7-1得浓度为1×10cfu•mL细菌悬液，加入呋喃酮C30、单宁酸、厚朴酚、山奈酚使其终浓度为1/32、1/16、1/8、1/4、1/2MIC。以不加C6-AHL和药物的细菌悬液为空白组，只加C6-AHL为对照组，每孔100μL的细菌悬液加入贴壁的HT-29细胞o中（感染复数为50:1)，37C培养1h，PBS洗三次，酶标仪检测520nm荧光强度。-1粘附实验结束后PBS清洗，加入100μL含100μg•mL大庆霉素的DMEM孵育30min，以杀灭HT-29细胞外部黏附的细菌，PBS清洗，酶标仪检测侵染的荧光强度。检测得到的荧光强度反应黏附和侵染细胞的沙门氏菌多少，通过计算感染率，即药物组感染的沙门氏菌与对照组比值，反应药物作用下沙门氏菌感染细胞情况。计算过程如公式4.1：药物组感染率=IFL药物组/IFL对照组×100%（4.1）式中：IFL药物组表示药物组荧光强度，IFL对照组表示对照组荧光强度。48 4碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究4.3结果与讨论4.3.1抑制剂对沙门氏菌感染细胞影响的检测思路致病菌对宿主细胞的致病作用一般需要毒性因子的表达，群体感应能调控毒性因子从而调节对宿主细胞的感染。沙门氏菌自身不会产生群体感应的AHL信号分子，但是具有LuxR蛋白的类似物-SdiA，能与其它细菌产生的AHL信号分子作用。激活增强沙门氏菌毒力基因的转录，促进其粘附上皮细胞和细胞外基质蛋白纤连蛋白和层粘连蛋白，抵抗人血清蛋白抗体，并与细菌感染细胞主要途径III型分泌系统有关。群体感应抑制剂通常为信号分子类似物，能竞争性与受体蛋白结合，抑制细菌QS进而减少细菌的致病性。荧光标记沙门氏菌后与细胞作用，可对细菌感染细胞的情况进行追踪和检测。碳量子点有成本低，碳源广泛等特点，在细菌荧光标记与成像，细菌检测方面有广泛研究。此外，碳量子点荧光性能稳定，生物相容性好，毒性低，可避免标记试剂本身对细菌或细胞活性造成的干扰。将制备的CQDs-Apt标记沙门氏菌，用于沙门氏菌感染细胞的荧光检测，通过荧光强度反应感染情况，从而对群体感应相关分子和药物作用进行检测。图4.1药物对沙门氏菌感染细胞作用效果荧光检测示意图Fig4.1Schemeoffluorescentdetectionforeffectofdrugonthesalmonellainfection4.3.2CQDs-Apt的表征及其对沙门氏菌的荧光标记本文采用微波加热法制备碳量子点，其表面富含羧基，通过酰胺键与氨基修饰的沙门氏菌适配体连接，制备适配体修饰的碳量子点（CQDs-Apt）。制备的碳量子点的紫外图（图4.2A），在341nm有明显的吸收峰，表明碳量子点表面含有羰基或含羰基的基团。由碳量子点的荧光光谱图（图4.2B）可知，制备的碳量子点随着激发波长在420-530nm变化时，其荧光发射峰位置往长波长移动，其最大激发波长为430nm，其发射波长为520nm，蓝色激发光下可发出绿色荧光，有利于避免细胞自发荧光的干扰。49 重庆大学硕士学位论文Excitationwavelength/nm500AB4200.4430440400450460470300AbsIFL4804900.22005005105201005300.00300350400450500550600450500550600650Wavelength/nm/nm图4.2A.CQDs紫外-可见吸收光谱图；B.CQDs不同激发波长下荧光发射光谱图Fig.4.2A.UV-visabsorbancespectraofCQDs;B.FluorescencespectraofCQDs将CQDs-Apt标记沙门后显微镜下可看到绿色荧光（图4.3A1-A2），将荧光标记的沙门氏菌加入HT-29细胞孵育60min后，能在荧光显微镜下观察到细胞部分的沙门氏菌（图4.3B1-B2），表明本方法可以实现沙门氏菌感染细胞的荧光标记，为后续荧光检测奠定基础。图4.3CQDs-Apt标记沙门氏菌荧光显微镜成像图（A1明场，A2荧光场）；CQDs-Apt标记的沙门氏菌与HT-29细胞孵育后荧光显微镜成像图（B1明场，B2荧光场）.荧光场为蓝色波段激发Fig.4.3FluoresentmicroscopeimagesofS.TyphimuriumbasedonCQDs-Aptlabeling(A1,A2);FluoresentmicroscopeimagesoflabeledS.TyphimuriumincubatedwithHT-29cells(B1,B2)4.3.3最小抑菌浓度测试结果最小抑菌浓度（Minimuminhibitoryconcentration，MIC）为在特定环境下孵育24h，可抑制某种微生物出现明显增长的最低药物浓度，用于定量测定体外抗菌活性。在细菌群体感应研究中，通过测定细菌的MIC确定后续实验浓度范围，以排除药物通过杀菌带来细菌活性的影响。分别将不同浓度的药物加入沙门氏菌培养24h后，测定其菌液OD600。结果如图4.4，呋喃酮C30、单宁酸、厚朴酚、山奈-1酚对沙门氏菌生长明显抑制的浓度分别为1、200、400、200μg•mL，该浓度即为对应药物对沙门氏菌的MIC。为了考察药物基于QS抑制对相关过程的影响，后续试验均在低于最小抑菌浓度MIC范围进行，不会对沙门氏菌产生杀菌或抑菌作用。50 4碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究0.6AB0.60.40.4600nmOD600nmOD0.20.20.00.000.120.250.501.002.004.000122550100200400-1-1ConcentrationoffuranoneC30/ug·mLConcentrationoftannicacid/ug·mLC0.6D0.6600nm0.40.4600nmODOD0.20.20.00.0050100200400800160002550100200400800-1Concentrationofmagnolol/ug·mLConcentrationofkaempferol/ug·mL-1图4.4药物对沙门氏菌的最小抑菌浓度.A呋喃酮C30，B单宁酸，C厚朴酚，D山奈酚（n=3）Fig.4.4MICsofdifferentdrugforS.Typhimurium14028.furanoneC30(A),tannicacid(B);magnolol;Dkaempferol(D)(n=3)4.3.4MTT测试结果furanoneC30tannicacidmagnololkaempferol1201008060cellviability/%4020001/32MIC1/16MIC1/8MIC1/4MIC1/2MICConcentrationofthedrug图4.5不同浓度药物对HT-29细胞毒性实验.孵育时间24h（n=5）Fig.4.5CytotoxiceffectsofdifferentdrugonHT-29cells(n=5)51 重庆大学硕士学位论文为了避免后续实验中药物对细胞的影响干扰，对小于MIC浓度的药物进行HT-29细胞毒性考察。分别将不同浓度的不同药物药物与HT-29细胞孵育24h后，MTT法进行测试。结果（图4.5）显示，在考察的小于沙门氏菌MIC浓度内，呋喃酮C30、单宁酸、厚朴酚、山奈酚均对结肠癌细胞HT-29活性几乎无影响。4.3.5几种抑制剂的QSI作用效果细菌群体感应可通过多种信号分子调节，为了验证药物能否通过抑制AHL调控抑制群体感应，采用群体感应AHL指示菌紫色杆菌进行实验。紫色杆菌中紫色菌素基因由AHL信号分子调控表达，从而影响紫色菌素的产量。将不同药物与紫色杆菌孵育后，若紫色菌素产量降低，则表明该药物具有AHL调控的群体感应抑制作用。但若药物本身抑制紫色杆菌生长，则会干扰判断。因此，首先考察药物对紫色杆菌生长影响。将小于沙门氏菌MIC的不同药物与紫色杆菌孵育24h后，紫色杆菌生长情况测试如图4.6，在考察的浓度范围内，呋喃酮C30对紫色杆菌生长几乎无影响，单宁酸、厚朴酚和山奈酚浓度为1/2MIC时，对紫色杆菌生长有较明显抑制作用。为了便于比较，均采用小于1/2MIC浓度的药物进行紫色菌素产量影响考察。图4.6不同药物对紫色杆菌生长的影响（n=3）Fig.4.6EffectofdifferentdrugonthegrowthofC.violaceum（n=3）在药物不影响紫色杆菌生长条件下，分别将1/4MIC浓度的药物与紫色杆菌孵育后提取紫色菌素，通过紫色菌素产量显示药物对AHL调控的QS的抑制作用效果。检测结果如图4.7，不同药物组中紫色菌素产量均随药物浓度的升高而减少。其中呋喃酮C30和单宁酸对紫色菌素产生的抑制效果较明显，当二者药物浓度为1/4MIC时，呋喃酮C30组及单宁酸组的紫色菌素分别分为空白组的18.2%、28.5%；厚朴酚及山奈酚组紫色菌素分别为空白组的49.2%、74.1%。以上结果表明：考察52 4碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究的阳性对照物呋喃酮C30和三种中药单体均能抑制AHL调控的紫色菌素的产生，表明几种药物均能抑制AHL调控的群体感应，抑制效果顺序为呋喃酮C30>单宁酸>厚朴酚>山奈酚。图4.7不同药物对紫色菌素产量的影响（n=3）.插图为不同浓度单宁酸与紫色杆菌孵育后提取的紫色菌素实物图Fig.4.6Inhibitionofviolaceinproductionbydifferentdrug（n=3）.InsetwasthephotographofviolaceinfromC.violaceumincubatedwithtannicacid4.3.6几种抑制剂对沙门氏菌运动性影响细菌的运动性与细菌的毒性基因有关，主要是通过鞭毛产生。研究表明部分植物组分能降低运动性，原因是细菌鞭毛的缺失或鞭毛功能的丧失。细菌运动性在致病过程中起一定作用，鞭毛使致病菌靠近目标细胞，在黏附和侵染宿主细胞过程中起到重要作用。细菌的运动性分为Swimming和Swarming，Swimming是在水环境中细菌鞭毛推动的运动，Swarming是半固体培养基上细菌由接种点向周围的分散生长。目前有研究发现细菌的运动性与群体感应相关。本文对信号分子AHL存在时，不同药物对沙门氏菌运动性的影响进行考察。结果如图4.8，Swimming运动中，AHL对沙门氏菌Swimming运动无明显作用，在考察的药物浓度下，仅厚朴酚药物组Swimming运动直径减小，表明其具有抑制作用。AHL对沙门氏菌Swarming运动有明显促进作用，加药组能对AHL激发的Swarming抑制，达到无AHL存在时水平。以上结果表明AHL对Swimming无明显作用，厚朴酚能抑制Swimming，AHL能明显增强Swarming，考察的药物均能抑制AHL对沙门氏菌Swarming的作用。53 重庆大学硕士学位论文图4.8AHL存在时不同药物对沙门氏菌运动性的影响.Fig.4.8EffectsofdifferentdrugonmotilityofS.Typhimurium14028.4.3.7几种抑制剂对沙门氏菌感染HT-29细胞的抑制效果通过荧光检测法，考察了AHL和不同药物对沙门氏菌感染HT-29细胞的影响。荧光值强弱反应感染细胞的沙门氏菌的多少，加药组与空白对照组荧光强度比值即为加药组感染细胞的沙门氏菌与空白组沙门氏菌的比值，即为药物组对空白组沙门氏菌感染率。药物组细菌感染率结果如图4.9，AHL存在时，沙门氏菌对细胞的黏附和侵染均有所提高，与文献结果一致。因为AHL激发沙门氏菌群体感应，激发相关毒性基因的产生，且运动性实验也表明AHL能促进沙门氏菌的Swarming，提高其感染细胞能力。AHL分别与呋喃酮C30、单宁酸、厚朴酚、山奈酚协同作用时，沙门氏菌对HT-29细胞的黏附和侵染均随药物浓度的升高而减弱，表明几种QS抑制剂都对沙门氏菌感染细胞具有抑制作用。当AHL存在时，呋喃酮C30和三种中药单体均对沙门氏菌感染细胞有一定的抑制作用，且随药物浓度的升高抑制效果增强。150AfuranoneC30TannicacidMagnololkaempferolBfuranoneC30TannicacidMagnololkaempferol150AHL+drugAHL+drugControlControl100100SalmonellaSalmonella50(%ofcontrol)(%ofcontrol)50000AHL1/32MIC1/16MIC1/8MIC1/4MIC1/2MIC0AHL1/32MIC1/16MIC1/8MIC1/4MIC1/2MICConcentrationConcentration图4.9不同浓度药物对沙门氏菌感染HT-29细胞作用效果检测（A黏附；B侵染)Fig.4.9Effectsofdifferentdrugonadhesion(A)andinvasion(B)ofHT-29cellsbyS.Typhimurium14028(n=5)54 4碳量子点标记用于群体感应抑制剂对沙门氏菌感染细胞作用效果研究药物浓度为1/2MIC时，加药组沙门氏菌的感染相对空白组及只加AHL组按照公式4.1.进行计算，其结果如表4.3。结果显示，阳性对照物呋喃酮C30对沙门氏菌的黏附和侵染抑制作用，该阳性对照组中沙门氏菌对细胞的黏附和侵染分别为空白组的43.4%及30.6%，为AHL组的31.9%及26.4%，表明本文建立的荧光检测法能用于细菌感染细胞药物作用效果研究。因此，对三种中药单体进行测试，单宁酸、厚朴酚和山奈酚对沙门氏菌黏附抑制效果较明显，分别为AHL组的49.1%、45.7%和61.0%；对侵染效果抑制效果不明显，分别为69.0%、74.6%和75.2%。此外，加入AHL和药物后，沙门氏菌黏附和感染的能力均低于空白对照组，可能是因为药物不仅能抑制AHL调控的群体感应，还能通过其他途径抑制其感染细胞。表4.3浓度为1/2MIC不同药物作用下沙门氏菌对HT-29细胞的感染率Table4.3Effectsofdrugs(1/2MIC)ontheinfectionofHT-29cellsbyS.Typhimurium相对空白组感染率（%）相对AHL组感染率（%）药物黏附侵染黏附侵染呋喃酮C3043.430.631.926.4单宁酸69.880.849.169.0厚朴酚60.784.445.774.6山奈酚76.881.961.075.2表4.3可知，沙门氏菌侵染实验测试中，几种抑制剂对沙门氏菌侵染细胞抑制效果顺序为呋喃酮C30>单宁酸>厚朴酚>山奈酚，侵染抑制效果强弱顺序与抑制紫色杆菌素产量顺序一致。因为沙门氏菌对HT-29细胞的侵染受AHL调控，因此药物对AHL调控的群体感染抑制效果越强，对侵染的抑制效果也越强。其中阳性对照物呋喃酮C30的抑制效果最强，因为呋喃酮C30的结构与AHL结构相似，可更好的竞争性与沙门氏菌SidA结合，抑制相关毒性基因的表达。在黏附实验测试中，AHL能促进沙门氏菌黏附细胞，表明沙门氏菌对细胞的黏附过程受到AHL调控。药物对黏附抑制效果顺序为呋喃酮C30>厚朴酚>单宁酸>山奈酚，厚朴酚对黏附抑制效果高于单宁酸，不完全与紫色菌素抑制效果一致。原因可能是细菌对细胞的黏附过程除了受AHL，还受细菌运动性的影响。因此药物对黏附的抑制有两方面的因素，细菌运动性实验结果表明，厚朴酚能有效抑制沙门氏菌Swimming运动，抑制细菌鞭毛功能从而抑制细菌游动到细胞表面，故厚朴酚对黏附的抑制作用在三种中药单体中效果最强。单宁酸和山奈酚单体无明显Swimming抑制作用，二者抑制作用主要由对AHL调控过程抑制效果决定，故二者抑制作用大小顺序与其抑制紫色菌素产量顺序一致。55 重庆大学硕士学位论文4.4本章小结本章充分利用碳量子点荧光性能稳定，毒性低，生物相容性好的优势，将制备的绿色荧光碳量子点表面修饰适配体后，荧光标记沙门氏菌后，用于药物对沙门氏菌感染细胞影响研究。碳量子点的最大激发波长430nm，发射波长520nm。适配体修饰碳量子点标记的沙门氏菌后显绿色荧光，将其与细胞作用，荧光强度可反应对细胞的感染情况。采用公认AHL调控的群体感应抑制剂呋喃酮C30，建立药物抑制细菌感染效果荧光检测方法，并对单宁酸、厚朴酚和山奈酚三种中药单体的QS抑制效果及抑制沙门氏菌感染HT-29细胞效果进行检测。结果显示：三-1种药物对沙门氏菌的最小抑菌浓度MIC依次为200、400、200μg•mL；对AHL调控的紫色杆菌的紫色菌素产量有抑制作用，抑制效果大小顺序为单宁酸>厚朴酚>山奈酚，表明三种单体均对AHL调控的群体感应有抑制。细菌运动性结果表明AHL能促进沙门氏菌Swarming，且三种药物均能抑制Swarming；AHL对Swimming无影响，但厚朴酚能抑制Swimming。药物对沙门氏菌黏附HT-29细胞的抑制作用厚朴酚>单宁酸>山奈酚，侵染抑制作用单宁酸>厚朴酚>山奈酚。以上结果表明本文建立的荧光检测方法能用于抑制QS调控的细菌感染细胞药物筛选，为新型抗菌药物研究提供新途径。56 5结论与展望5结论与展望5.1结论荧光标记检测以其灵敏度高和选择性好等优势，在细菌检测、细菌成像及细胞相互作用研究中受到广泛关注和应用。随着纳米技术的发展，标记效率高的荧光探针、多种纳米材料协同标记及多功能纳米标记试剂在细菌分析研究领域引起广泛研究。本文基于纳米荧光标记技术，开展了针对细菌样本的荧光标记和测试研究，设计并探讨了不同的细菌分离富集及荧光标记模式，建立了高效的细菌荧光定量检测方法；进而，将其应用于食源性致病菌的检测，并进一步应用于群体感应抑制剂对细菌感染细胞作用效果荧光检测。本文建立的高灵敏度和高选择性的细菌快速荧光定量检测方法，对食品样本预处理、细菌的现场快检、及便携式高通量的细菌检测系统提供参考，对食品安全监管有重要意义。药物对细菌感染细胞作用荧光检测方法对新型抗细菌感染药物筛选提供新途径。本文的主要研究内容和结果如下：①表面氨基修饰的Fe3O4@SiO2-NH2对大肠杆菌捕获率为95.4%，可有效减低食品样本带来的复杂基质干扰，实现样本中目标细菌的捕获和富集；利用PEG凝胶层析的方式，可将磁珠-细菌复合物与残余的磁珠及吖啶橙分离，与传统的离心分离清洗相比，其受荧光背景干扰更小。本文提出的细菌预处理和检测方法对大26-1肠杆菌检测荧光值与菌液浓度在10-10cfu•mL范围有良好的线性关系，检测限-1可达到100cfu·mL。对熟肉制品中总菌测定80min内即可完成，结果与平板计数法吻合，表明本方法准确性好，可实现食品样本中细菌的快速检测。②在多通道微流控分析芯片上，建立了集纳米磁捕获细菌、荧光标记和原位荧光检测于一体的分析方法，其具有灵敏度高、操作简便、可同时检测多个样本等优点。芯片的混合通道中完成吖啶橙对纳米磁捕获细菌荧光标记，在芯片检测区实现对细菌的磁捕获和富集，用搭建的小型荧光仪进行原位荧光检测。在进样-1流速50μL•min，吖啶橙和磁标记的大肠杆菌样本进样50μL条件下，荧光信号26-1-1与大肠杆菌在10-10cfu•mL浓度范围有良好的线性关系，检测限为100cfu•mL，样本整个检测流程仅需50min。可同时进行6个样本测试，提高检测效率，为实现便携化和微型化的细菌检测系统提供基础。③设计制备了多功能的适配体修饰的磁性碳量子点，同步实现了对沙门氏菌的特异性磁分离捕获和荧光标记检测，由此建立了选择性好及背景干扰小的沙门氏菌快速荧光检测方法。将荧光产率高、表面易修饰的碳量子点共价结合到的Fe3O4@SiO2-NH2表面制备得到多功能磁性碳量子点，适配体修饰制备57 重庆大学硕士学位论文Fe3O4@CQDs-Apt以实现目标菌特异性标记，其激发波长和发射波长均与磁性碳量子点相同，荧光强度稍有降低。150μg的Fe3O4@CQDs-Apt与不同浓度沙门氏菌36溶液孵育后发生团聚导致荧光强度降低，荧光强度的变化值与沙门氏菌在10~10-1cfu•mL浓度范围存在线性关系。将Fe3O4@CQDs-Apt分别与相同浓度的沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌检测，仅对沙门氏菌有信号，表明方法具有良好的特3-1异性。在牛奶和鸡肉的沙门氏菌合成样本中检出限为10cfu•mL，检测时间60min，可用于复杂背景基质的样本中目标菌的分离捕获及快速荧光检测。④采用碳量子点荧光标记的细菌，考察其与细胞相互作用，建立细菌QS抑制剂对细菌感染细胞作用效果荧光检测方法，可应用于药物与细胞相互作用的快速判断和评估。实验以公认AHL调控的群体感应抑制剂呋喃酮C30为阳性对照物，对单宁酸、厚朴酚及山奈酚三种中药单体对沙门氏菌感染HT-29细胞作用效果进行检测，建立药物抑制细菌感染效果荧光检测方法。实验显示：药物对沙门氏菌黏附HT-29细胞的抑制效果顺序为呋喃酮C30>厚朴酚>单宁酸>山奈酚，侵染抑制作用呋喃酮C30>单宁酸>厚朴酚>山奈酚。此外，对几种药物的QS抑制作用进行分析。AHL调控的紫色杆菌的紫色菌素产量测试结果表明，几种药物均对AHL调控的群体感应有抑制，抑制效果顺序为呋喃酮C30>单宁酸>厚朴酚>山奈酚。运动性结果表明几种药物均能抑制沙门氏菌的Swarming，厚朴酚能抑制Swimming，表明药物通过抑制沙门氏菌QS及运动性来抑制沙门氏菌感染，建立的荧光检测方法为新型抗菌细菌感染药物筛选研究提供新途径。本文的创新点及特色在于：①建立了一种将纳米磁富集与PEG凝胶分离结合的细菌检测样本预处理方法。可实现样本中细菌简便、快速和高效的分离和富集，尤其能有效减小背景干扰。②将集成化、微型化的微流控芯片技术用于细菌检测，建立高灵敏度和高通量的集标记、磁捕获和检测于一体的微流控细菌芯片荧光检测新方法，为便携式集成细菌快检系统提供设计思路和实验支撑。③利用荧光标记细菌检测技术，针对QS抑制剂作用过程和效果开展研究，快速获取QS抑制剂的作用效果数据，为QS抑制剂的细菌感染抑制效果检测提供新的检测方法，可望用于新型抗细菌感染药物的筛选。5.2展望本文基于荧光标记，建立了与纳米磁富集相结合的大肠杆菌荧光检测方法，并在微流控分析系统中实现6个样本的同时测定；其次，设计合成了适配体修饰的磁性碳量子点用于沙门氏菌的高效检测。最后，基于纳米荧光标记，建立了群体感应抑制剂对细菌感染细胞的荧光检测方法，并对药物QS作用效果进行分析。58 5结论与展望本文建立的荧光检测方法，为食源性细菌的分离富集和快速检测提供实验基础，为新型抗细菌感染药物的筛选及作用快速检测提供了技术支持。然而还有一些工作需要深入和改进：目前建立的方法检测限尚未达到几个菌落浓度细菌，尚不能满足食源性致病菌不得检出国标要求。后续应优化标记探针的性能，通过表面修饰提高标记效率，提高检测灵敏度。其次，微流控芯片细菌检测应用方面，在现有实验基础上，如何优化芯片设计，实现高通量、易操控的快速细菌检测，搭建研发适用于芯片分析的稳定性好的便携式检测系统，是微流控芯片在细菌现场快检中待解决的问题。最后，在对几种QS抑制剂对细菌感染细胞影响研究中，本文发现几种单宁酸、厚朴酚、山奈酚均可抑制AHL调控的群体感应，但具体是抑制AHL的合成、运输还是识别过程还需进一步确定，其抑制的相关毒性基因的表达也需进一步研究。59 重庆大学硕士学位论文60 致谢致谢时光荏苒，三年的硕士生涯已接近尾声，毕业论文在导师徐溢教授的指导下即将画上句点。这几年的时光充满了酸甜苦辣，更多的是收获和成长。值此论文即将完成之际，向所有帮助和关心我的人表示衷心的感谢！首先感谢导师徐溢教授，无论在科学研究还是做人做事方面都为我做了很好的引路人。在科学研究中，徐老师的指引让我逐步进入课题，研究过程遇到困难时，徐老师帮助我开拓思路，让我学会解决问题；徐老师平日的谆谆教诲，培养了我独立工作的能力。在生活中，徐老师给了我很多指点，她平日极高的工作效率，提前预见做好准备的态度，将时刻影响着我并让我受益终身。感谢实验室各位成员的帮助，鼓励和陪伴。正是大家的协助和平日组会提出的宝贵建议和意见，使我克服科研中各种难题。感谢苏喜师姐，在初期实验操作技能的指导，让我了解科研过程；感谢王人杰师姐，在课题设定中给了我很大启发，分享的文献让我在研究过程中受益良多；感谢崔飞云师兄和蒋艳师姐，在实验过程中给与帮助，我不懂的地方耐心指导；感谢刘芝旭师妹在实验中给予的帮助；感谢牟秀霓、赵斌和廖鑫在日常学习中资料的分享和各种事宜的督促和提醒。感谢实验室所有成员的支持，祝愿他们在自己的领域取得更好的成绩。感谢我的家人和朋友，他们的支持和鼓励是我努力工作的坚实后盾，让我的论文工作得以顺利完成。此外，感谢百忙之中评阅论文及参加毕业答辩的各位专家、教授！车玉兰二O一七年五月于重庆61 重庆大学硕士学位论文62 参考文献参考文献[1]LongY,ZhouX,XingD.Anisothermalandsensitivenucleicacidsassaybytargetsequencerecycledrollingcircleamplification[J].Biosensors&Bioelectronics.2013,46(16):102-107.[2]Goo,Eunhye,An,HyungJ,Kang,Yongsung,etal.Controlofbacterialmetabolismbyquorumsensing[J].TrendsinMicrobiology.2015,23(9):567-576.[3]TriantafilouM,TriantafilouK,FernandezN.Roughandsmoothformsoffluorescein‐labelledbacterialendotoxinexhibitCD14/LBPdependentandindependentbindingthatisinfluencedbyendotoxinconcentration[J].FebsJournal.2000,267(8):2218-2226.[4]MatsuyamaT.Stainingoflivingbacteriawithrhodamine123[J].FemsMicrobiologyLetters.2010,21(2):153-157.[5]González-PérezM,FernandesR,VieiraR,PereiraA,CandeiasA,CaldeiraAT.DevelopmentofaFluorescenceInSituHybridizationprotocolforanalysisofGram-positiveandGram-negativebacteria[J].NewBiotechnology.2016,33(3):434.[6]WhiteAG,GrayBD,PakKY,SmithBD.Deep-redfluorescentimagingprobeforbacteria[J].Bioorganic&MedicinalChemistryLetters.2012,22(8):2833-2836.[7]LiB,YuQ,DuanY.Fluorescentlabelsinbiosensorsforpathogendetection[J].Criticalreviewsinbiotechnology.2015,35(1):82-93.[8]WangY,JiangC,WenG,ZhangX,LuoY,QinA,etal.AsensitivefluorescencemethodfordetectionofE.Coliusingrhodamine6Gdyeing[J].Luminescence:thejournalofbiologicalandchemicalluminescence.2016,31(4):972-977.[9]HildebrandtP,SurmannK,SalazarMG,NormannN,VolkerU,SchmidtF.Alternativefluorescentlabelingstrategiesforcharacterizinggram-positivepathogenicbacteria:Flowcytometrysupportedcounting,sorting,andproteomeanalysisofStaphylococcusaureusretrievedfrominfectedhostcells[J].CytometryPartA:thejournaloftheInternationalSocietyforAnalyticalCytology.2016,89(10):932-940.[10]SchmalzG,TsigarasS,RinkeS,KottmannT,HaakR,ZiebolzD.Detectionoffivepotentiallyperiodontalpathogenicbacteriainperi-implantdisease:AcomparisonofPCRandreal-timePCR[J].DiagnosticMicrobiologyandInfectiousDisease.2016,85(3):289-294.[11]WuL,WangS,SongY,WangX,YanX.Applicationsandchallengesforsingle-bacteriaanalysisbyflowcytometry[J].ScienceChinaChemistry.2015,59(1):30-39.[12]GuoR,McGoverinC,SwiftS,VanholsbeeckF.Arapidandlow-costestimationofbacteriacountsinsolutionusingfluorescencespectroscopy[J].Analyticalandbioanalyticalchemistry.63 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