急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究

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報代码：１０２８５方，夺ＳＯＯＣＨＯＷＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＩＩＨＨ．＾’；３＾！？＾＾急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究．＇．？Ｓｔｈｅｃｎｔｔｕｄｙｏｎｌｉｉｃａｌａｎｄｅｎｅｉｃｆｅａｔｕｒｅｓｏｆａｃｕｔｅｇ＾ｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋｅｍｉａ（ＡＰＬ）ｐ研究生姓名田长玉指导細船陈苏宁：专业名称内科学（血液病学）研究方向白血病的基础与临床巧在院部苏州大学附属第一医院论文提交日期２０１６年５月起Ｊ－ 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究中文摘要I 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究中文摘要I 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究中文摘要急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究中文摘要目的1.系统分析2003年1月至2015年1月在苏大附属第一医院就诊的1208例初治急性早幼粒细胞白血病(APL)患者的临床实验室特征及相关基因的突变情况,总结本中心APL患者的临床特点。2.对有完整临床资料的470例初治急性早幼粒细胞白血病患者，探讨附加染色体异常对APL临床预后的影响3.运用FISH和RT-PCR等技术寻找STAT5B-RARα阳性的APL患者，总结其临床预后特征，并克隆STAT5B-RARα融合基因，采用体内外实验研究STAT5B-RARα融合基因的生物学功能及致白血病机制。方法1.选取2003年1月至2015年1月在苏大附一院就诊的1208例初治APL患者，收集基本临床资料及实验室MICM资料，分析这些APL患者的核型特点、融合基因类型，伴随突变等临床特点及相关基因突变对临床预后的影响，总结我中心APL患者基本特征。2.对临床资料完整的470例初治APL患者，根据染色体核型将其分为单纯t（15；17）组、伴附加染色体异常组等，利用SPSS21.0软件，采用Kaplan-Meier法、卡方检验和秩和检验统计方法分析比较各组的实验室及临床特征，根据附加染色体的结构及数量异常将进一步分组，分析各组附加染色体异常与单纯t(15;17)组临床预后的差别。3.采用FISH和RT-PCR等技术发现STAT5B-RARα阳性的APL患者，总结其临床实验室特征。拟通过RT-PCR技术克隆STAT5B-RARα融合基因，以LV5慢病毒为载体，携带STAT5B-RARα在U937细胞中表达，采用CCK-8法绘制细胞生长曲线、集落生成实验等检测STAT5B-RARα对U937细胞增殖能力的影响。结果1、本中心1208例初治APL患者的临床及遗传学特征1208例初诊APL患者中男性633例，女性575例，男女之比：1.10:1，中位年龄39岁（4-78岁）。APL患者主要集中于30-49岁。依据细胞及分子遗传学特征，I 中文摘要急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究将1208例初诊的APL患者分别为1175例典型APL患者，17例RARα变异型APL患者，和16例染色体及融合基因均阴性，但骨髓形态，白血病免疫分型及临床特征均支持该诊断的APL患者。17例RARα变异型APL患者，男性患者比例显著高于典型APL患者(P=0.005)。染阴融阴组(P=0.002)及变异型组患者(P=0.005)初诊白细胞均明显高于典型组APL患者。染阴融阴组(P=P=0.041)及RARα变异型APL患者(P<0.001)的高危组所占比例均明显高于典型APL患者。对核型资料完整的1142例APL患者进行核型分析，发现816例APL患者有单纯t(15;17)，占71.45%；208例患者伴附加染色体异常，占18.21%；78例APL患者为正常核型。17例RARα重排变异的APL患者，比例为1.49%。另外，有15例APL患者有包含15/17号染色体在内的3条或3条以上的染色体复杂易位。+8染色体是最常见的附加染色体异常，共有47例，比例为22.60%；9q-,7q-,+21所占比例较高，分别有15例，12例，11例，比例分别为7.21%，5.77%，5.29%。对APL患者突变分析发现，FLT3-ITD突变率最高，达32.67%。71例APL患者进行突变分析，其中46例检测到基因突变，比例为64.79%，包括32例患者有一种突变，比例为69.57%；11例患者有2种突变，比例为23.91%；3例患者检测到3种突变，比例为6.52%。本研究分析突变对APL患者临床预后影响时发现，相比于FLT3-ITD突变阴性患者，FLT3-ITD突变阳性患者的初诊白细胞计数（P<0.001），PML-RARα融合基因S型比例（P<0.05），及高危组患者比例（P<0.001），均显著增高，5年总体生存明显降低（P=0.014）；5年无复发生存率在两组之间无明显差异（P=0.055）。另外，FLT3-TKD，TET2，WT1，NRAS突变对APL患者的临床预后则无明显影响。2、附加染色体异常对APL患者临床特征及预后的影响附加染色体异常组比单纯t(15;17)组男性患者明显增多（50.4%vs.66.7%,P=0.004），两组患者在年龄，初诊白细胞，血红蛋白，血小板计数，融合基因类型，及总体生存时间及无复发时间无明显差别。从附加染色体结构异常分析，+8组，9q-组,，-7/7q-组，+21组，分别与典型t(15;17）组比较，总体生存率及无复发生存率均无明显差异；从附加染色体数量异常分析，伴1种附加染色体异常，2种附加染色体异常，>=3种附加染色体异常组，分别与典型t(15;17)组比较，总体生存率及无复发生存率也无明显差异。3、STAT5B-RARα融合基因的克隆及初步功能研究结果II 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究中文摘要运用FISH和RT-PCR等技术检测到6例STAT5B-RARα阳性的APL患者，该组患者对维甲酸/亚砷酸治疗不敏感，预后不佳。以STAT5B-RARα阳性的APL患者cDNA为模板，利用PCR技术扩增出STAT5B-RARα融合基因，构建慢病毒载体质粒LV5-GFP-STAT5B-RARα，采用磷酸钙沉淀法转染U937细胞系，成功建立了稳转细胞株。体外实验结果显示，STAT5B-RARα能够在一定程度上促进U937细胞的增殖。结论1.本中心1208例APL患者主要集中于中青年，男女发病率基本相等。依据遗传学特征，分为1175例典型APL患者，17例RARα变异型APL患者，和16例染色体及融合基因均阴性，但骨髓形态，白血病免疫分型及临床特征均支持该诊断的APL患者。RARα变异型APL患者中，男性患者比例显著高于典型APL患者。染阴融阴组及变异型组患者初诊白细胞均明显高于典型组APL患者。染阴融阴组及RARα变异型APL患者的高危组所占比例均明显高于典型APL患者。APL患者核型分析发现，71.45%的APL患者有单纯t(15;17)；18.21%的患者有附加染色体异常。在附加染色体中，其中+8比例为22.60%染色体是最常见的附加染色体异常，其次9q-,7q-,+21也较常见，比例分别为7.21%，5.77%，5.29%。APL患者突变分析发现，FLT3-ITD突变率最高，达32.67%，在APL患者中是预后不良的因素。WT1，FLT3-TKD突变率较高，分别为14.46%，11.11%。FLT3-TKD，TET2，WT1，NRAS突变对APL患者的临床预后则无明显影响。2.伴附加染色体异常对急性早幼粒细胞白血病患者的临床特征及预后无明显影响。3.我们成功构建STAT5B-RARα融合基因慢病毒载体，建立U937稳转细胞株。体外实验结果表明，STAT5B-RARα在一定程度上能够促进U937细胞的增殖。我们将在建立STAT5B-RARα稳转细胞株的基础上，进一步对其致病机制进行深入研究。关键词：急性早幼粒细胞白血病，附加染色体，STAT5B-RARα融合基因作者：田长玉导师：陈苏宁III 英文摘要急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究Studyontheclinicalandgeneticfeaturesofacutepromyelocyticleukemia(APL)AbstractObjectives:1.Toanalysesystematicallytheclinicalandlaboratorialcharacteristicsof1208newlydiagnosedAPLpatientsintheFirstAffiliatedHospitalofSoochowUniversityfromJanuary2003toJanuary2015,summarizethebasicfeaturesofAPLpatientsinourcenter.2.Toanalyse470APLpatientswithcompleteclinicaldata,exploreadditionalchromosomalabnormalitieseffectsonclinicalcharacteristicsandprognosis.3.WeaimtofnidAPLpatientswithpositiveSTAT5B-RARαusingFISHandRT-PCRtechnology,summarizeitsclinicalcharacteristicsandprognosis,cloneSTAT5B-RARαfusiongene,andstudythebiologicalfunctionofSTAT5B-RARαfusiongene.Methods:1.1208newlydiagnosedAPLpatientsinourcenterwerestudied,throughcollectingandanalyzingbasiclaboratorydataofMICM,clinicaldata,relatedgenemutationinformationbySPSS21.0softwareandGraphpad5.0software.2.470newlydiagnosedAPLcaseswithcompleteclinicaldatawillbeclassifiedassimplet(15;17)group,additionalchromosomalabnormalities(ACAs)group,basedonthekaryotypeanalysis.WeusetheKaplan-Meiermethod,chi-squaretestandMann-WhitneyUtesttocomparethedifferencesofclinicalandlaboratorialcharacteristicsamongdifferentgroups.TheACAsgroupwillbefurthergroupedaccordingtothestructureandquantityofACAs,andweanalyzetheprognosticdifferencesbetweeneachadditionalchromosomalabnormalitiesandsimplet(15;17)group.3.WescreenedAPLpatientswithSTAT5B-RARαbyFISHandRT-PCR,andsummarizetheirclinicalfeaturesandprognosis.TheSTAT5B-RARαfusiongenewasclonedandligatedtotheretroviralvectorplasmid—LV5-GFP.Thentheretroviruswaspreparedbytransfectedtargetandpackageplasimidsinto293TcellsbyDNA-caluciumphosphatemethod.ThetransfectefficiencyonU937cellswasdetectedbymeasuringtheexpressionofGFPthroughflowcytometry(FCM).TheexpressionlevelofSTAT5B-RARαin293TcellswasmeasuredbyRT-PCR.CCK-8testandcellcolonyIV 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究英文摘要formationassays（CFCs）wereusedtoanalyzetheinfluenceofSTAT5B-RARαfusiongeneontheproliferationofU937cells.Results:1.Theclinicalandgeneticfeaturesof1208newlydiagnosedAPLcases1208APLpatients(633males/575females,1.10/1),andthemedianagewas39years(4-78yearsold),mainlyin30-49years.Amongthe1028APLpatients,therewere1175classicAPLcases,17RARαrearrangementvariantAPLcases,and16APLcaseswithnegativet(15;17)andnegativePML-RARαfusiongene.Amongthreegroups.,these16APLpatientshavemorewhitebloodcellcountsandhigherriskgroupratio,and17RARαrearrangementvariantAPLcasesmoretendtobemaleamongKaryotypeanalysiswasperformedon1142APLpatientswithcompleteclinicaldata,thereare71.45%(816/1142)APLpatientswitht(15;17)alone,18.21%(208/1142)APLpatientswithACAs,6.83%(78/1142)APLcaseswithnormalkaryotype.Trisomy8isthemostcommonadditionalchromosomalabnormality,accountingfor22.60%;Inaddition,thereare15caseswith9q-,12caseswith7q-,11caseswith+21,andtheproportionwas7.21%,5.77%,5.29%respectively.ThemutationanalysisofAPLpatientsshowedthatthemutationrateofFLT3-ITDwasthehighestamonggenesdetected,reaching32.67%.Weanalyzed71APLpatientswithcompletemutationinformation,andfoundthat64.79%(46/71)casescarryinggenemutation,andofthose69.57%(32/46)APLcasescarryingonemutation,23.91%(11/46)patientscarryingtwomutations.Only3casesweredetectedthreemutations.Weanalyzetheeffectofthemutationsonclinicalprognosisandfoundthat,comparedtoAPLpatientswithnegativeFLT3-ITDmutation,theAPLcaseswithpositiveFLT3-ITDmutationhavesignificantlymorewhitebloodcellcount(P<0.001),Stypefusiongene(P<0.05),andmorepatientsinthehigh-riskgroup(P<0.001),5yearsoverallsurvivaldecreasedsignificantly(P=0.014);5yearrelapsefreesurvivalwasnodifferencebetweenthetwogroups(P=0.055).Inaddition,FLT3-TKD,TET2,WT1,andNRASmutationshadnoeffectontheclinicaloutcomeofAPLpatients.2.Theeffectofadditionalchromosomalabnormalities（ACAs)ontheclinicalcharacteristicsandprognosisiofAPLpatientsComparedwitht(15;17)alonegroup,ACAsgrouptendtobemale(50.4%vs.66.7%,P=0.004).InitialWBC,hemoglobin,plateletcount,fusiongenetypes,andoverallsurvivalandrelapse-freesurvivaltimeetalshownosignificantdifferencesbetweentwoV 英文摘要急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究groups.FromanalysisofstructureofACAs,+8groups,9q-group,-7/7q-group,+21group,respectivelywerecomparedwitht(15;17)alonegroup,theoverallsurvivaltimeandrelapse-freesurvivaltimehadnosignificantdifference;fromanalysisofnumberofACAs,oneACA,twoACAs,threeormoreACAsgroup,respectivelywitht(15;17)alonegroup,theoverallsurvivaltime,andrelapse-freesurvivaltimeshownoobviousdifferences.3.MolecularcloningandfunctionstudyofSTAT5B-RARαfusiongeneWeuseFISHandRT-PCRtechniquetofind6APLcaseswithpositiveSTAT5B-RARα,andall6patientsundergoATRA/ATOtherapy,4casesshownoresponsetotherapy,1caserelapsedsoonafterachievingcompleteremission.ThenweusedcDNAofAPLpatientswithpositiveSTAT5B-RARαastemplate,usingPCRamplifiedSTAT5B-RARαfusiongeneandconstructedlentiviralvectorplasmidLV5-GFP-STAT5B-RARα.ThelentiviralvectorplasmidwastransfectedintoU937celllinebyacalciumphosphateprecipitation,andwesuccessfullyestablishastablecellstrain.ItshowedthatSTAT5B-RARαcouldpromotetheproliferationofNU937cellstoacertainextentinvitroexperiment.Conclusions:1.1208APLcasesmainlyfocusontheyoung,andmaleandfemaleincidencerateisbasicallythesame.Amongthe1028APLpatients,therewere1175classicAPLcases,17RARαrearrangementvariantAPLcases,and16APLcaseswithnegativet(15;17)andnegativePML-RARαfusiongene.Karyotypeanalysisshowedthat71.45%ofAPLpatientshadsimplet(15;17);18.21%ofthepatientshadACAs.Trisomy8,accountingfor22.60%,isthemostcommonACAs,followedby9q-(7.21%),7q-(5.77%),+21(5.29%).ThemutationanalysisofAPLpatientsshowedthatFLT3-ITDmutationratewasthehighest,reaching32.67%,whichisafactorofpoorprognosisinAPLpatients.WT1,FLT3-TKDmutationrateishigher,respectively,11.11%,14.46%.FLT3-TKD,TET2,WT1,andNRASmutationshadnosignificanteffectontheclinicaloutcomeofpatientswithAPL.Keywords:Acutepromyelocyticleukemia,additionalchromosomalabnormalities,STAT5B-RARαfusiongeneWrittenby：TianChangyuSupervisedby：ChenSuningVI 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究目录引言....................................................................................................................................1第一部分回顾性分析单中心1208例APL患者的临床及实验室特征........................5病例与方法.....................................................................................................................5结果.............................................................................................................................6讨论...........................................................................................................................15参考文献.......................................................................................................................17第二部分附加染色体异常对APL患者的临床特征及预后的影响............................18病例资料.......................................................................................................................18材料和方法...................................................................................................................18结果...........................................................................................................................20讨论...........................................................................................................................24参考文献.......................................................................................................................24第三部分STAT5B-RARα融合基因的克隆及初步功能研究......................................26实验方法.......................................................................................................................26结果...........................................................................................................................35讨论...........................................................................................................................39参考文献.......................................................................................................................40结论..................................................................................................................................42综述..................................................................................................................................43攻读学位期间公开发表的论文..........................................................................................56中英文缩略词汇表..............................................................................................................57致谢..................................................................................................................................58 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究引言引言急性早幼粒细胞白血病（acutepromyelocyticleukemia,APL）是急性髓细胞白血病（acutemyeloidleukemia,AML）的一种特殊亚型，约占AML的15%。1957年，[1]Hillestad首次提出急性早幼粒细胞白血病的概念，1976年FAB（法、美、英）协作[2]组根据细胞形态学和组织化学特征将其定义为AML-M3型。15号染色体和17号染[3-4]色体易位形成的t(15;17)(q22;q21)和PML-RARα融合基因存在于98%APL患者，是APL特异型遗传学标志。APL患者的PML-RARα融合基因编码的融合蛋白可抑制正常髓细胞分化，阻碍正常早幼粒细胞分化成熟，造成大量异常早幼粒细胞在骨髓中堆积，促使急性早幼粒[5-7][8]白血病的发生。有研究提出，除外PML-RARα融合基因，其他伴随的细胞遗传学和分子遗传学因素也参与了急性早幼粒细胞白血病的发生。除典型t(15;17)外，23%-43%的APL患者有附加染色体异常。附加染色体对APL患者临床预后影响尚存[9-11]争议。一些学者认为附加染色体异常是预后不良的因素。另一部分研究支持附加[12-13]染色体对临床预后无影响。近年有报道提出在PML-RARα融合基因阳性的APL患者中，可检测到NRAS,KRAS,FLT3-ITD,FLT3-TKD等分子突变。2015年有学者在回顾性分析临床资料基础上提出表观遗传学修饰基因(EpigeneticModifierGenes,[14]EMGs)突变是APL的预后不良因素，尚需充分的体内外实验及扩大样本验证。在APL患者中，对生物学特征和致病机制尚不完全明确的再现性附加染色体异常和分子突变进行深入研究，对于揭示APL的发病机理、建立更可靠的诊断方法、寻找新的治疗靶点、实现个体化治疗均有着极为重要的价值。急性早幼粒细胞白血病有明显的出血倾向及较高的早期死亡率，一度被认为是最凶险的急性白血病。随着全反式维甲酸（ATRA)及亚砷酸（ATO)的联合应用，APL的完全缓解率（CR)可达90%以上。但少数病人因存在基因突变，或存在变异型RARα融合基因，对ATRA/ATO联合治疗不敏感，疗效不佳，成为当前APL治疗的难题。目前研究发现RARα有12个对手基因，STAT5B是其中之一。STAT5B（signaltransducerandactivatoroftranscription5B）,即信号传导与转录活化因子5B。其位于染[16]色体17q11.2，由19个外显子组成，共有6个保守的结构域，包括氨基端结构域、1 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究卷曲螺旋结构域、DNA结合结构域、连接结构域、SH2/酪氨酸活化结构域和羧基端[17]的转录活化结构域。STAT5B是JAK-STAT信号通路的组分之一，可被催乳激素、生长激素促红细胞生成素、血小板生成素等多种细胞因子激活，启动JAK-STAT信号通路，调节相关基因的表达，在造血细胞的生长、增殖、分化和凋亡过程中发挥重要[18-19][15]作用。1999年，Arnould等首次提出STAT5b是RARα基因的一种新的对手基因，并验证了STAT5B-RARα融合基因。STAT5B-RARα融合基因是由STAT5B15外显子和RARα3号外显子融合，保留了STAT5b的部分SH2/酪氨酸活化结构域及RARα的部分反式激活域，形成异常的转录因子调控造血系统。文献报道，STAT5B-RARα融合基因阳性的APL患者表现为维甲酸及亚砷酸耐药，ATRA/ATO联合治疗效果不佳。但对STAT5B-RARα在APL中的致病机制及耐药机制尚未明确，亟待进一步研究，为变异型APL患者寻找更有效的治疗策略。本研究课题选取2003年1月至2015年1月在苏州大学附属第一人民医院诊断的1208例初诊APL患者，分析总结临床特征及其分子生物学特点，并对其中的附加的再现性染色体易位及分子突变进行临床及预后相关分析。另外通过RT-PCR等技术克隆STAT5B-RARα融合基因，从体内外两方面揭示STAT5B-RARα融合蛋白致白血病的分子机理，为变异型APL患者靶向治疗奠定基础。参考文献1.HillestadLK.Acutepromyelocyticleukemia.ActaMedScand1957;159:189-194.2.BennettJM,CatovskyD,DanielMT,FlandrinG,GaltonDA,GralnickHR,etal.Proposalsfortheclassificationoftheacuteleukaemias.French-American-British(FAB)co-operativegroup.BrJHaematol.1976Aug;33(4):451-83.RowleyJD,GolombHM,DoughertyC.15/17translocation,aconsistentchromosomalchangeinacutepromyelocyticleukaemia.Lancet1977;1:549-50.4.DethéH,ChomienneC,LanotteM,DegosL,DejeanA.Thet(15;17)translocationofacutepromyelocyticleukaemiafusestheretinoicacidreceptorαgenetoanoveltranscribedlocus.Nature1990;347:558-615.DeTheH,LavauC,MarchioA,ChomienneC,DegosL,DejeanA.ThePML-RARalphafusionmRNAgeneratedbythet(15;17)translocationinacutepromyelocyticleukemiaencodesafunctionallyalteredRAR.Cell1991;66:675–84.2 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究引言6.PerezA,KastnerP,SethiS,LutzY,ReibelC,ChambonP.PML/RARhomodimers:distinctDNAbindingpropertiesandheteromericinteractionswithRXR.EMBOJ1993;12:3171–3182.7.HeLZ,TribioliC,RiviR,PeruzziD,PelicciPG,SoaresV,CattorettiG,PandolfiPP.AcuteleukemiawithpromyelocyticfeaturesinPML/RARalphatransgenicmice.ProcNatlAcadSciUSA1997;94:5302–5307.8.LeBeauMM,DavisEM,PatelB,etal.RecurringchromosomalabnormalitiesinleukemiainPML-RARαtransgenicmiceidentifycooperatingeventsandgeneticpathwaystoacutepromyelocyticleukemia.Blood2003;102:1072–4.9.HiorsLR,SwansburyGJ,MinT,DaintonMG,TreleavenJ,etal.Additionalchromosomeabnormalitiesconferworseprognosisinacutepromyelocyticleukemia.BrJHaematol1997;96:314-21.10.WiernikPH,SunZ,GundackerH,DewaldG,SlovakML,PaiettaE,etal.Prognosticimplicationsofchromosomeabnormalitiesamongpatientswithdenovoacutepromyelocyticleukemiawitht(15;17).MedOncol2012;29;2095-101.11.XuL,ZhaoWL,XiongSM,SuXY,ZhaoM,WangC,etal.Molecularcytogeneticclinicalrelevanceofadditional,complexand/orvariantchromosomeabnormalitiesinacutepromyelocyticleukemia.Leukemia2001;15:1359-68.12.HernandezJM,MartinG,GutierrezNC,CerveraJ,FerroMT,CalasanzMJ,etal.AdditionalcytogeneticchangesdonotinfluencetheoutcomeofpatientswithnewlydiagnosedacutepromyelocyticleukemiatreatedwithanATRAplusanthracyclinbasedprotocol.AreportoftheSpanishgroupPethema.Haematologica2001;86:807-13.13.OnoT,TakeshitaA,IwanagaM,AsouN,NaoeT,OhnoR,etal.Impactofadditionalchromosomalabnormalitiesinpatientswithacutepromyelocyticleukemia:10-yearresultsofJapanadultleukemiastudygroupAPL97study.Haematologica2011;96:174-6.14.ShenY,FuYK,ZhuYM,etal.MutationsofEpigeneticModifierGenesasaPoorPrognosticFactorinAcutePromyelocyticLeukemiaUnderTreatmentWithAll-TransRetinoicAcidandArsenicTrioxide.EBioMedicine.2015Apr12;2(6):563-71.15.ArnouldC,PhilippeC,BourdonV,etal.ThesignaltransducerandactivatoroftranscriptionSTAT5bgeneisanewpartnerofretinoicacidreceptoralphainacute3 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究promyelocytic-likeleukaemia.HumMolGenet.1999;8:1741–9.16.CrispiS,SanzariE,MonfregolaJ,etal.CharacterizationofthehumanSTAT5AandSTAT5Bpromoters:evidenceofapositiveandnegativemechanismoftranscriptionalregulation.FEBSLett2004,562(1-3):27-34.17.HwaV,NadeauK,WitJM,etal.STAT5bdeficiency:lessonsfromSTAT5bgenemutations.BestPractResClinEndocrinolMetab,2011,25(1):61-75.18.RaneSG,ReddyEP.JAKs,STATsandSrckinasesinhematopoiesis[J].Oncogene,2002,21(21):3334～3358.19.NosakaT，KawashimaT，MisawaK，etal．STAT5asamolecularregulatorofproliferation，differentiationandapoptosisinhematopoieticcells．EMBOJ，1999;18(17):4754－4765.4 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第一部分第一部分回顾性分析单中心1208例APL患者的临床及实验室特征急性早幼粒细胞白血病（APL)是一种以异常的早幼粒细胞在骨髓中增多为特征的急性髓细胞白血病（AML)，发病率在AML中占15%-23%，发病年龄以青壮年为主,病程经过较为凶险,有较高的出血倾向及早期死亡率。约95%的APL患者有特征性的染色体易位t(15;17)及由此形成的融合基因PML-RARα。由于维甲酸及亚砷酸的联合应用，APL患者完全缓解率(CR)达到90%左右，成为治愈率最高的AML。我们系统性分析了本中心2003年1月至2015年1月1208例初诊的APL患者的临床和实验室特点及部分患者的基因突变情况，现将分析结果总结如下：病例与方法1.病例资料分析我们中心自2003年1月至2015年1月的1208例初诊急性早幼粒细胞白血病患者，其中男性患者632例，女性患者576例，男女比例为1.10:1，中位年龄为39（4-78）岁，所有患者的临床治疗均按照AML中国指南进行。对其中1142例核型资料较全的APL患者进行具体的核型分析，明确大致核型分布；同时对初诊时行突变检测的APL患者进行突变预后相关分析。2.分析染色体的核型取4-6ml患者骨髓液，以常规方法制备染色体悬液，依次经低渗，固定收取处理后的细胞进行R显带，及姬姆萨染色，然后对染色体核型进行分析，按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》对染色体核型进行描述。最后将剩余的细胞悬液置于-40℃冰箱保存备用。（具体实施步骤参照第二部分的材料与方法）3.基因组DNA的提取取患者骨髓液，用常规Ficoll淋巴细胞分离液来分离骨髓细胞，以获得单个核细6胞约5*10/L。按照QiagenDNA提纯试剂盒步骤抽提DNA，同时检测吸光度A260NM/A280nm值来确定DNA纯度及浓度，同时用去离子水将DNA样本稀释到50ng/ul浓度左右。5 第一部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究4.PCR扩增条件及体系本次研究涉及到的基因，即FLT3-ITD,FLT3-TKD,WT1，TET2，ASXL1，NRAS,CEBPA,EZH2，C-KIT,MLL-PTD,IDH1，IDH2，CBL,NPM1，RUNX1，DNMT3，以[1-3]上基因引物序列参照我们之前的报道。由上海生工生物公司合成引物。另外，PCR[1-3]扩增体系及条件也参照我们之前的报道。PCR产物经纯化后送上海裕晶生物科技有限公司进行突变检测。5.统计学分析本研究采用Kaplan-Meier法、Long-rank检验、卡方检验和秩和检验方法等统计学方法，所有统计学方法均采用SPSS21.0或Graphpad5.0软件。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果一、病例临床特征我院自2003年1月至2015年1月经MICM确诊的1208例初诊APL患者，其临床及实验室特征详见表1-1。其中男性633例，女性575例，男女之比：1.10/1，中位年龄39岁（4-78岁）。从年龄分布来看，APL患者主要集中于30-49岁，4-49岁的APL患者随着年龄的增长数目逐渐增加，而50岁后则随年龄的增长逐渐减少。依据细胞细胞遗传学特征，将1208例APL患者分成三组，分别为具有t(15;17)/PML-RARα的典型APL患者、RARα与其它伙伴基因融合形成融合蛋白的变异型APL患者，以及核型正常和融合基因未检测到RARα相关异常和42种白血病相关融合基因均为阴性，但骨髓形态，白血病免疫分型及临床特征均支持APL诊断的患者（简称为染阴融阴APL患者）。从表1-1中可以看到，RARα变异型APL患者中，男性患者比例为88.24%,显著高于典型APL患者(P=0.005)。从白细胞数值来看，染阴融阴组(P=0.002)及变异型组患者(P=0.005)初诊白细胞均明显高于典型组APL患者。从Sanz危险度分层来看，染阴融阴组(P=P=0.041)及RARα变异型APL患者(P<0.001)的高危组所占比例均明显高于典型APL患者。6 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第一部分表1-11208例初诊APL患者临床与实验室特征12全部患者典型患者P值变异型P值染阴融阴型总例数120811751716中位年龄（岁）39393531.50.9520.23（范围）(4-78)(4-78)（15-70）(11-66)＜60岁,（例数）107610461515（%）(89.07%)(89.02%)（88.24%）(93.75%)≥60岁,(例数)13221129(10.98%)(%)(10.93%)（11.76%）(6.25%)性别0.0050.246男性（例数）633156612(52.09%)(%)(52.40%)（88.24%）(37.50%)女性（例数）575210563(47.91%)(%)(47.60%)（11.76%）(62.50%)中位白细胞计数2.62.513.850.0020.00525.85(2.3-43.7)（*10E9/L）(0.31-200)(0.31-200)（1.34-72.7）中位血小板计数26257847P<0.0010.062（*10E9/L）（1-282）(1-212)（17-282）(20-76)83.5847766中位血红蛋白（g/L）0.7340.142（27-162）(24-162)（45-125）(53-119)PML/RARα类型--bcr1/bcr2例数-841(71.57%)--(%)bcr3例数-267(22.72%)--(%)Sanz危险度分层0.041P<0.001低危组例数29952292(24.85%)(%)(24.75%)(29.41%)(12.50%)中危组例数59412591(50.30%)(%)(49.17%)(5.88%)(12.50%)高危组例数3151112292(24.85%)(%)(26.08%)(64.71%)(75.00%)12P值是比较APL典型组与变异组。P值是比较APL典型组与染阴融阴组。Sanz危险度分层根据初始白血病及血小板数量，即高危组：白细胞>10*109/L,不管血小板数量;低危组：白细胞<10*109/l且血小板>40*109/L;中危组：除外高危组和低危组的剩余APL患者。二、核型分析我们对核型资料完整的1142例APL患者进行了核型分析，详见表1-2。我们发7 第一部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究现816例APL患者有单纯t(15;17)，占71.45%；208例患者除t(15;17)外，还伴有附加染色体异常，占18.21%；78例APL患者为正常核型。17例RARα重排变异的APL患者，比例为1.49%。另外，有15例APL患者包含15/17号染色体在内的3条或3条以上的染色体复杂易位。对208例伴附加染色体异常的APL患者分析其核型，详见图1-1。+8染色体是最常见的附加染色体异常，共有47例，比例为22.60%；9q-,7q-,+21所占比例较高，分别有15例，12例，11例，比例分别为7.21%，5.77%，5.29%。15例APL患者包含15和17号染色体在内的3条或3条以上染色体复杂易位，详见表1-4。我们发现，复杂染色体易位除涉及到15,17号染色体外，还可涉及到1,2,3,4,7,8,9,10,14，19号染色体。另外，我们列出了8例其他染色体异常的APL患者的核型，详见表1-3。表1-21142例APL患者核型分布核型例数单纯t(15;17)816（71.45%）附加染色体208（18.21%）正常核型78（6.83%）RARα重排变异17（1.49%）涉及15、17号染色体的3条或以上染色体复杂易位15（1.31%）其他异常8（0.70%）表1-3其他核型异常编号例数146,XY,i(17q)［7］/46,xy［3］2AL/47,XX,+21[4]/48,idem,+8[1]/46,XX[6]346，XY,i(17q)446,XX,-6,+mar[3]/46,XX[11]546,XY,inv(9)(p13q22)/46,XY,inv(9)(p11q13)645,X,-X,9q-,13q-,13p+[10]746,XY,t(9;17)[10]846,XY,DEL(7)(q22)［12]/46,XY[1]8 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第一部分表1-4包含15、17号染色体在内的3条或以上染色体复杂易位编号染色体核型147-48，XX,+8，+8，t(14;17;15)(q21;q21;q24)[8]/46,XX[2]。246,XX,t(3;15;17)[4]3AML/46,XY,t(1;17;15)[3]/46,idem,del(X)[5]/46,XY[2]448-50,XY,t(2;15;17),+10,+M1-3[CP10].546,XY,t(3;17;15;3)(p22;q12;q22;q29),18q-[5]/46,XY[5]646,XY,t(2;17;15;20)(q24;21;q22;p13)[10]746，XY,t(14;17;15)(q12;q21;q22)［10］846,XY,?t(15;19;17)［10］946,XY,?t(10;17;15)(q23;q21;q22)［4］/46,XY［8］1046，XX？t(7,17;15)(q22;q21;q22)[6]/46,XX[4]1146,XX,t[8;der(15)t(15;17);[16](q22;q22?21;p13)[8]/46,XX[2]1246,XX,t（9；15；17）（q34；q11.2；q22）[7]1346,XX,t(7;17,15)(q22;q21;q22)[6]/46,XX[4]1446,XX,?t(1;17;15;2)(q35;q21;q22;q34)[4]/46,XX[16].1547，XX,t(4;15;17),+8[4]/46,XX[6]9 第一部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究+图1-1附加染色体核型分析10 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第一部分三、突变分析本研究中对APL患者进行了白血病相关基因突变的检测，包括C-KIT,NPM1,FLT3-TKD,FLT3-ITD,MLL-PTD,RUNX1,ASXL1,IDH1,IDH2,NRAS,CBL,WT1,TET2,DNMT3,EZH2,基因共15种。该组患者突变率的发生情况详见表1-5。从表中可见，在APL患者中以FLT3-ITD,WT1，FLT3-TKD3种基因的突变率发生较高，位于前3位。其中FLT3-ITD基因的突变率最高，达32.67%；WT1基因突变率达14.46%；FLT3-TKD突变率为11.11%。另外，TET2，ASXL1，NRAS,CEBPA,EZH2，C-KIT,MLL-PTD,IDH1，CBL基因均检测到突变存在，而NPM1,RUNX1,IDH2、DNMT3这4种基因未检测到突变。我们进一步分析了突变资料较全的71例APL患者的临床及实验室特征。将71例患者按上述基因有无突变发生，分为基因突变组及未突变组，比较了两组的临床及实验室特征，详见表1-6。从表中可看出，46例APL患者检测到相关基因突变，比例为64.79%；25例APL患者未检测到相关基因突变，比例为35.21%。突变组的初诊白细胞计数显著高于未突变组（P=0.021<0.05)，但年龄，性别，血小板，血红蛋白，骨髓原始幼稚细胞比例，危险度分层，及早期死亡率，完全缓解率在两组之间并无明显统计学差异。同时比较了两组患者的5年总体生存率（P=0.448),及5年无复发生存率（P=0.310),统计学分析也无明显差异。表1-5.APL患者中相关基因的突变分析GeneCasesGenemutation(+/-)mutationrate(%)FLT3-ITD20266/13632.67%WT18312/7114.46%FLT3-TKD19822/17611.11%TET2828/749.76%ASXL1825/776.10%NRAS825/776.10%CEBPA934/894.30%EZH2843/813.57%C-KIT1953/1921.50%MLL-PTD871/861.15%IDH1821/811.15%CBL821/811.15%11 第一部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究表1-6相关基因突变对APL患者临床及实验室特征的影响GenemutationGenemutationCharacteristicTotalP值(+)(-)总例数714625中位年龄（岁）373637.50.861(范围）(14-69)(14-69)(15-57)<60岁(例数)694425(%)（97.2%）（95.7%）（100.0%）≥60岁(例数)220(%)（2.8%）（4.3%）（0.0%）性别0.172男性例数392811(%)（54.9%）(60.9%)(44%)女性例数321814(%)（45.1%)(39.1%)(56%)中位白细胞计数6.97(0.47-194.7)12.7(0.8-195)3.9(0.47-60.2)0.021（*10E9/L）中位血小板计数25.5(5-116)27(5-116)23(8-105)0.947（*10E9/L）中位血红蛋白（g/L）83.5(27-132)83.5(50-132)88.5(27-127)0.556骨髓原始幼稚细胞（%）88.8%(56.0-98.0%)88.4%(56-98%)88.8%(74-97.4%)0.909PML/RARα类型0.847bcr1/bcr2例数533419(%)(74.6%)(73.9%)(76%)bcr3例数18126(%)(25.4%)(26.1%)(24%)Sanz危险度分层0.068低危组例数954(%)(12.6%)(10.9%)(16.0%)中危组例数311714(%)(43.7%)(37.0%)(56.0%)高危组例数31247(%)(43.7%)(52.1%)(28.0%)早期死亡率（%）9.90%10.70%8.00%1.000完全缓解率（%）96.9%%95.10%100%0.532在46例检测到基因突变的患者中，32例患者仅检测到一种突变，比例为69.57%；11例患者检测到2种突变，比例为23.91%；3例患者检测到3种突变，比例为6.52%。根据在APL患者中突变数目，将46例突变（+）的APL患者分为3组，因为携带312 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第一部分种突变的APL患者3例中有2例临床资料缺乏，所以只比较了携带1种突变及携带2种突变的APL患者的临床及实验室特征。分析发现，两组之间的白细胞计数，年龄，性别，Sanz危险度分层，完全缓解率等无明显差别。详见表1-7。表1-7不同突变数目对APL患者临床及实验室特征的影响PML-RAR性别中位年龄WBC中位值Sanz危险度分层完全组别α缓解率男女（岁）（*109/L)S型L型低危组中危组高危组one3219.827/28181472511318mutation（14-65）（0.95-192)(96.4%)two377.510/118338425mutations（25-69）（0.8-194.7)(90.91%)另外，我们分别分析了突变率较高的FLT3-ITD，FLT3-TKD，TET2，WT1，NRAS这5种基因突变对APL患者临床预后和实验室特的影响。从表1-8可以看出，相比于FLT3-ITD突变阴性患者，FLT3-ITD突变阳性患者的初诊白细胞计数（P<0.001），PML-RARα融合基因S型比例（P<0.05），及高危患者比例（P<0.001），均显著增高。同时比较两组患者临床预后发现，FLT3-ITD突变阳性患者组，5年总体生存率明显低于FLT3-ITD突变阴性患者组（P=0.014）；而5年无复发生存率在两组之间则无明显差异（P=0.055）。同时我们发现，对于FLT3-TKD，TET2，WT1，NRAS这4种基因，其突变阳性患者与阴性患者在年龄，性别，白细胞计数，血红蛋白计数，血小板计数，融合基因类型，危险度分层等方面统计均无明显差异。在预后分析时发现，突变阳性患者与突变阴性患者的5年总体生存率及5年无复发生存率也无明显差异。13 第一部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究表1-8FLT3-ITD基因突变对APL患者临床及实验室特征的影响WildtypeMutatedCharacteristicP值FLT3-ITDFLT3-ITD总例数11148中位年龄（岁）3936.50.734（范围）（13-74）(17-60)＜60岁（例数）10546(%)（94.59%）(95.83%)≥60岁（例数）62(%)（5.41%）(4.17%)性别0.772男性（例数）6228(%)（55.86%）(58.33%)女性（例数）4920(%)（44.14%）(41.67%)中位白细胞计数（*10E9/L）3.25（0.47-112）15.75(0.7-195)<0.001中位血小板计数（*10E9/L）25.5（5-265）21.5(7-98)0.388中位血红蛋白（g/L）84（27-162）90(50-150)0.179骨髓原始幼稚细胞（%）86.7%（61.0-99.0%）87.30%(56.0-96.4%)0.783PML/RARα类型0.020bcr1/bcr2（例数）7925(%)(71.17%)（52.08%）bcr3（例数）3223(%)(28.83%)（47.92%）Sanz危险度分层<0.001低危组(例数)275(%)(24.32%)（10.42%）中危组(例数)5715(%)(51.35%)(31.25%)高危组(例数)2728(%)(24.32%)(58.33%)86早期死亡率（%）0.438(7.21%)(12.5%)完全缓解率（%）102/104(98.08%)40/42(95.24%)0.69614 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第一部分图1-2FLT3-ITD突变组与未突变组生存分析比较讨论急性早幼粒细胞白血病(APL)是一种具有特征性融合基因及染色体易位的急性髓细胞白血病，在维甲酸及亚砷酸靶向治疗下，已成为可治愈的白血病之一。LogAngeles肿瘤登记处的一项研究表明，APL常见于20岁以上的年轻患者，男女发病率相等，APL发病率占同期白血病的5%-23%，拉丁美洲国家APL的发病率更高（占AML的37.5%）[4]。我国流行病学资料证实，APL在中青年中发病率较高，APL发病率占同期白血病的3.3-21.2%。我们系统性分析了本中心的1208例初诊APL患者的临床资料，发现APL多见于中青年，年龄集中于30-49岁，男女比例为1.10/1，与国内其他学者的报道一致。APL主要的细胞遗传学特征为t(15;17)(q22;q21)，易位使得15q22的早幼粒白血病基因PML和17q21的RARα基因发生融合形成特征的PML-RARα融合基因。90%左右的APL患者有典型的15、17号染色体易位，尚有不到5%的患者有RARα重排易位。在本研究中，我们发现17例RARα重排变异的APL患者，比例为1.4%，涉及del(17)(q21.2q21.2）的APL患者6例及t(11;17)(q23;q21)11例。另外，我们发现16例APL患者，t(15;17)及PML-RARα均阴性，但骨髓形态学，白血病免疫分型，及临床特征均符合APL诊断。通过对以上16例染色体及融合基因均阴性的APL患者的进行深入遗传学研究，可能会发现APL新的发病机理，以补充APL现有的致病机制，更有针对性指导APL患者的临床治疗。此外我们发现有15例患者除有15和15 第一部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究17号染色体受累外，还有第三条或更多染色体受累，涉及到1,2,3,4,7,8,9,10,14，19号染色体。有研究表明，23-43%的APL患者有附加染色体异常，其中+8是最常[5-6]见的附加染色体异常。在我们中心APL患者中，附加染色体异常APL患者比例为18.21%。附加染色体异常以+8、9q-、7q-、+21、i(17q)、-Y多见，其中+8为47例最多见，占22.60%；其次9q-有15例，占7.21%；7q-有12例，占6.1%。目前已知急性髓细胞白血病的预后与多种分子遗传学标志相关。在本研究中，我们探讨了不同突变等分子遗传学因素对APL预后的影响。一项来自欧洲APL工作组[7]的研究显示，FLT3-ITD基因在APL中突变发生率为35%，RAS基因突变率为3.36%。[8]Florian等研究提出，FLT3-ITD基因在APL中的突变率为31.2%，FLT3-TKD基因突变率为6.4%，而N-RAS的突变率仅为2%，对于MLL-PTD,C-KIT基因，APL中[9]未检测到突变。Oki等报道在IDH1和IDH2基因突变在儿童AML中很少见。另外[10]有研究报道WT1在儿童AML中的突变率为8.3%，TET2基因在AML中的突变率[11]为13.2%。本研究发现，在APL中，FL3-ITD突变率为32.67%，WT1突变率为14.46%，FLT3-TKD突变率为11.11%，TET2突变率为9.76%，NRAS突变率为6.10%等，NPM1,RUNX1,IDH2、DNMT3这4种基因未检测到突变存在。以上相关基因的突变率与国外报道存在差异，这可能是因为我们突变研究中纳入的病例数较少，但不排除APL患者不同年龄及种族之间存在差异的可能，尚需进一步验证。[7-8]既往有研究报道，FLT3-ITD是APL预后不良的因素。Chou等报道，相比于TET2突变阴性患者，TET2突变阳性患者有较短的总体生存时间，但无明显统计学[11]意义。Phoenix等研究发现WT1基因突变对儿童AML患者预后无影响。对于FLT3-TKD，NRAS等基因突变对临床预后影响报道较少。本研究发现，FLT3-ITD基因突变阳性相比于突变阴性患者，初诊白细胞计数，S型PML-RARα融合基因，及高危组患者的比例均明显增高；预后分析显示FLT3-ITD突变阳性的APL患者有较短的5年总体生存时间，且有统计学意义。这与之前研究报道基本一致。FLT3-TKD，TET2，WT1，NRAS这4种基因，其突变阳性患者与阴性患者在白细胞计数，血红蛋白计数，血小板计数，融合基因类型，危险度分层，5年总体生存时间等方面统计无明显差异，因以上基因突变阳性病例数较少，需要进一步扩大样本验证其作用。总之，我们中心的APL患者数据显示，中位发病年龄为39岁，男女发病率基本相等，与欧美国家，及我国其它中心报道基本相同；核型异常分布，融合基因类型，16 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第一部分突变情况与国外报道大体一致。相关结果有待多中心大规模研究进一步证实。参考文献1、尹佳，孙爱宁，田孝鹏，等，急性早幼粒细胞白血病中常见白血病基因突变的检测及其临床意义[J].中国实验血液学杂志，2013,21(1):39-44.2、华海应，孙爱宁，何军，等，WT1基因及CD34在急性白血病中的表达及意义[J].山东医药，2009，49(13)：8-103、魏计锋，陈广华，仇惠英，等，急性髓系白血病患者TET2基因突变发生率及其临床意义[J].2011,32(5):304-3074、DouerD.Theepidemiologyofacutepromyelocyticleukaemia.BestPractResClinHaematol.2003Sep;16(3):357-675、WiernikPH,SunZ,GundackerH,etal.Prognosticimplicationsofchromosomeabnormalitiesamongpatientswithdenovoacutepromyelocyticleukemiawitht(15;17).MedOncol2012;29;2095-101.6、XuL,ZhaoWL,XiongSM,etal.Molecularcytogeneticclinicalrelevanceofadditional,complexand/orvariantchromosomeabnormalitiesinacutepromyelocyticleukemia.Leukemia2001;15:1359-68.7、CallensC,ChevretS,CayuelaJM,etal.PrognosticimplicationofFLT3andRasgenemutationsinpatientswithacutepromyelocyticleukemia(APL):aretrospectivestudyfromtheEuropeanAPLGroup.Leukemia.2005;19(7):1153-11608、FlorianK,ClaudiaS,WolfgangK,etal.ImpactofFLT3mutationsandpromyelocyticleukaemia-breakpointonclinicalcharacteristicsandprognosisinacutepromyelocyticleukemia.BrJHaematol,2005;130(2);196-2029、OkiK,TakitalJ,HiwatariM,etal.IDH1andIDH2mutationsarerareinpediatricmyeloidmalignancies.Leukemia,2011,25(2):382-38410、PhoenixA,Ho,RongZ，etal.PrevalenceandprognosticimplicationsofWT1mutationsinpediatricacutemyeloidleukemia(AML):areportfromtheChildren’sOncologyGroup,Blood,2010;116(5):702-71011、ChouWC,ChouSC,LiuCY,etal.TET2mutationisanunfavorableprognosticfactorinacutemyeloidleukemiapatientswithintermediate-riskcytogenetics.Blood,2011;118(14):3803-3810.17 第二部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第二部分附加染色体异常对APL患者的临床特征及预后的影响白血病是造血干细胞的恶性克隆性疾病，常伴有克隆性的染色体异常。近年来，随着白血病细胞和分子遗传学研究的进展，一些再现性染色体异常的生物学特征和致白血病机制相继被阐明，为白血病的个体化治疗提供了新的靶点，显著改善了部分特殊细胞遗传学类型患者的疗效。急性早幼粒细胞白血病有特征性的t(15;17)(q22;q21)和由此形成的PML-RARα融合基因，随着PML-RARα分子靶向药物全反式维甲酸[1](ATRA)及三氧化二砷(ATO)的应用，使得APL的治愈率达到90%以上。但在急性早幼粒细胞白血病患者中，附加染色体异常对预后影响尚存在争论。我们系统分析了在我院就诊的470例APL患者的临床和实验室特征，并探讨了其附加染色体异常对预后的影响，现将分析结果总结如下：病例资料共收集初治APL患者470例，均为2003年1月至2015年1月苏州大学附属第一医院门诊或住院病例，其中男性250例，女性220例，中位年龄38（13-77）岁。所有的APL患者均根据临床表现，血常规检查，骨髓细胞形态学，白血病免疫分型，[2]融合基因及染色体核型等检查明确诊断。诊断标准符合《白血病诊断及疗效标准》。所有患者均按照中国急性早幼粒细胞白血病诊疗指南进行，根据危险度分层,即2ATO0.16mg/(kgˑd),至血液学完全缓解，联合ATRA20mg/(mˑd)至血液学完全缓2解，及IDA8-12mg/(mˑd),第2,4,6,8天，或单用ATRA、ATO或IDA诱导化疗，完全缓解后予以化疗巩固治疗及ATRA和（或）ATO维持治疗。材料和方法一、主要材料1培养液RPMI-1640的配制及保存：RPMI-1640粉剂10.4g，谷氨酰胺0.6g，链霉素0.08g，青霉素0.1g，肝素0.04g，小牛血清200ml及三蒸水800ml，充分混匀，用1mmol/L的NaOH试剂调整pH至7.0-7.3，后定容至1000ml，最后过滤除菌，分装，置于4℃保存。18 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第二部分2秋水仙酰胺：浓度5µg/ml，置4℃避光保存备用，来自Sigma公司产品，。3氯化钾溶液浓度0.075mol/L。4甲醇:冰醋酸固定液为3:1。5Earle’s溶液的配制：氯化钠6.8g，氯化钾0.4g，氯化钙0.2g，硫酸镁0.2g，磷酸二氢钠0.164g，磷酸氢二钠0.2g，酚红0.01g，葡萄糖1.0g，三蒸水800ml，用1mmol/L的HCl调pH至6.5，定容到1000ml，过滤，除菌，置4℃保存备用。610%Giemsa染色液。二、分析染色体核型[3]所有病例均按本实验室常规方法制备染色体标本，及R显带，并进行细胞遗传学分析。1制备染色体1.1采集标本：用少许肝素湿润10ml的针筒，抽取不少于2ml骨髓，迅速注入到含1640培养基的培养瓶中。61.2接种细胞：对骨髓标本行有核细胞计数，并按1~2×10/ml的接种密度接种于培养瓶中。1.3培养骨髓细胞：将骨髓标本混匀，放于37℃温箱培养24小时，早晚各混匀骨髓标本一次。1.4阻留骨髓细胞至中期分裂相：在终止培养骨髓细胞前1小时，将秋水酰胺加入到标本中，秋水酰胺终浓度为0.05ug/ml。1.5收获骨髓细胞：取一尖底离心管，将培养物吸至其底部，以1000转/min的转速，离心10min。1.6氯化钾低渗处理骨髓细胞：弃上清液，将0.075mol/L的KCL溶液6~8ml置于37℃预温，后沿管壁将预温的KCL溶液缓缓加入到骨髓标本中，并吹打混匀，置于37℃温箱30min。1.7预固定骨髓细胞：将1ml的3：1甲醇、冰醋酸固定液加入到骨髓标本中，并充分吹打混匀。以1000转/min的转速离心10min。1.8固定骨髓标本：吸除上清液，新鲜配制3:1甲醇、冰醋酸固定液6~8ml，将固定液加入到骨髓标本中，并充分吹打混匀。以1000转/min的转速离心10min。1.9将1.7、1.8步骤重复2遍，共使细胞经三次固定，第1次固定时间不少于30min，后2次固定，15min或30min/次。19 第二部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究1.10制备骨髓细胞悬液：吸除上清液，加入适量的新鲜固定液，制成合适浓度的骨髓细胞悬液。1.11制片：用冰水或20％乙醇浸泡玻片，玻片洁净无脂备用，后用吸管将骨髓细胞悬液轻轻打匀，吸取少量细胞悬液，在10cm高度处滴至倾斜15度左右的玻片上，每张玻片滴2－3滴，过火数次使其干燥。2R显带分析染色体核型2.1将Earle’s溶液预温至87.5℃，后将干燥的玻片置入87.5℃的Earle’s溶液中，温浴1~2h。2.2染色：新鲜配制10%Giemsa染色液,用其染色8~10min，后将玻片取出水洗，待干燥。[4]2.3镜下观察：按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN2013）》的规定对染色体核型进行描述。正常核型者应分析不少于20个分裂相，异常核型者应分析不少于10个分裂相，2个或以上有相同的异常核型定为异常克隆。三、统计学处理临床资料的统计学分析采用Kaplan-Meier法、Long-rank检验、卡方检验和秩和检验方法，所有统计学方法均采用SPSS21.0或Graphpad5.0软件。P<0.05认为差异具有统计学意义。结果一、病例特征本研究中的470例初治APL患者临床及实验室特征详见表2-1。其中男性250例，女性220例，男女之比：1.14/1，中位年龄38岁（13-77岁）。中位血红蛋白88g/L（范围，30-162g/L），中位白细胞计数3.0*10E9/L(范围，0.2-200*10E9/L)，中位血小板计数26*10E9/L(范围，2-265*10E9/L)。其中单纯t（15；17）363例(77.2%)、伴有附加染色体异常99(21.1%)例、其他核型异常8(1.7%)例。从性别上看，男性患者更容易伴附加染色体异常（66.7%vs.50.4%,P=0.004）。单纯t(15;17)组与伴附加染色体异常组相比，中位血红蛋白、中位白细胞计数和中位血小板计数、融合基因类型及危险度分层等均无明显差异，P值无统计学意义；从治疗反应上，两组的早期死亡率，完全缓解率，复发率及中枢神经系统白血病发生率均无明显差异。20 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第二部分表2-1.470例初治APL患者临床实验室特征及治疗反应ab全部APL患者P值单纯t(15;17)P值伴附加染色体异常总例数47036399中位年龄（岁）3837380.8380.700（范围））(13-77)（13-77）（14-70）<60岁（例数）44434493(%)(94.5%)（94.8%）（93.9%）≥60岁（例数）26196(%)(5.5%)（5.2%）（6.1%）性别0.4260.004男性（例数）25018366(%)(53.2%)（50.4%）（66.7%）女性（例数）22018033(%)(46.8%)（49.6%）（33.3%）中位白细胞计数3.0(0.2-200)0.9543.0（0.2-194.7）0.9492.8（0.6-200）（*10E9/L）≤10（例数）346(73.6%)263（72.5%）76（76.7%）(%)>10（例数）124(26.4%)100（27.5%）23（23.2%）(%)中位血小板计数26(2-265)0.93026（2-212）0.46226(5-265)（*10E9/L）≤40，（例数）32725368(%)(69.6%)（69.7%）(68.7%)>40（例数）14311031(%)(30.4%)（30.3%）(31.3%)888690中位血红蛋白（g/L）0.9710.879(30-162)（30-162）(42-152)PML/RARα类型0.9500.815bcr1/bcr2（例数）33726170(%)(71.7%)（71.9%）（70.7%）bcr3（例数）13310229(%)(28.3%)（28.1%）（29.3%）Sanz危险度分层0.6650.389低危组（例数）1209127(%)（25.5%）（25.1%）（27.3%）中危组（例数）22617049(%)（48.1%）（46.8%）（49.5%）高危组（例数）12410223(%)(26.4%)（28.1%）（23.2%）治疗反应早期死亡（例数）302360.9780.920(%)（6.4%）（6.3%）(6.1%)21 第二部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究ab全部APL患者P值单纯t(15;17)P值伴附加染色体异常完全缓解（例数）438339920.9100.871(%)（93.2%）（93.4%）(92.9%)复发（例数）6348150.9290.805(%)（14.4%）（14.2%）(16.3%)中枢神经系统白血病1394（例数）0.7980.624（2.8%）（2.5%）(4.0%)(%)abP值是比较全部APL患者组与单纯t(15;17)组。P值是比较单纯t(15;17)组与伴附加染色体异常组。Sanz危险度分层根据初始白血病及血小板数量，即高危组：白细胞>10*109/L,不管血小板数量;低危组：白细胞<10*109/l且血小板>40*109/L;中危组：除外高危组和低危组的剩余APL患者。二、附加染色体核型分析本研究470例初治APL患者中，伴附加染色体异常患者99例，占21.1%。从附加染色体结构异常分析，其中+8有22例，是最常见的附加染色体结构异常（22.2%）。另外，9q-有9例（9.1%），-7/7q-有7例（7.1%），+21有6例（6.1%）等；从附加染色体数量异常分析，伴1种附加染色体异常有57例，是最常见的附加染色体数量异常（57.6%），伴2种附加染色体异常有26例（26.3%），伴3种或3种以上附加染色体异常有16例（16.2%）。另外，伴+8异常的患者与单纯t(15;17)患者相比，中位白细胞，血小板，血红蛋白等临床特征无明显差别。三、生存分析应用SPSS软件及GraphPad软件对470例初治APL患者分组进行Kaplan-Meier生存分析，详见表2-2，图2-1。单纯t(15;17)组和附加染色体异常组的5年总体生存率（5-yearOS)及5年无复发生存率(5-yearRFS)无明显差异异,P值无统计学意义。附加染色体从结构异常及数量异常分组，与典型t(15;17)组相比，5年总体生存率及5年无复发生存率均无明显差异异,P值无统计学意义。22 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第二部分表2-2.各核型组5-yearOS及5-yearRFS的比较12Analysisofkaryotype例数5-yearOSPvalue5-yearRFSPvalue单纯t(15;17)36392.00%82.80%伴附加染色体异常9991.70%0.85379.30%0.4461种附加染色体异常5793.00%0.88975.30%0.151附加染色体数量异2种附加染色体异常2691.80%0.98387.20%0.401常>=3种附加染色体异常1687.10%0.44083.10%0.729+822100.00%0.19172.70%0.1239q-988.90%0.70387.50%0.711附加染色体结构异-7/7q-7100.00%0.461100.00%0.753常+216100.00%0.50080.00%0.670其他异常6388.40%0.34079.90%0.88811.5-yearOS：5年总生存；5-yearRFS:5年无复发生存；2.P值是比较单纯t(15;17)组和其他相应附加染色体异常2组5年总体生存；P值是比较单纯t(15;17)组和其他相应附加染色体异常组5年无复发生存。图2-1单纯t(15;17)组与附加染色体异常组生存分析比较23 第二部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究讨论既往文献报道，经全反式维甲酸及亚砷酸联合治疗，急性早幼粒细胞白血病患者[1]可获得高达90%的完全缓解率及80%左右的治愈率。但仍有一些患者因对维甲酸及亚砷酸耐药等因素，反复复发，疗效不佳，成为目前APL治疗难题。附加染色体异常作为急性早幼粒细胞白血病可能的潜在致病因素，近年来受到较多关注。附加染色体异常对急性早幼粒细胞临床特征及预后有无影响，这一问题尚存在争论。有些学者认为附加染色体是一个预后不良因素，有些则认为其与急性早幼粒细胞白血病的临床[5-9]预后无明显联系。迄今很少文献从附加染色体数量异常及结构异常角度具体分析其对临床预后的影响,本研究做了这方面的工作。在我们的研究中，附加染色体发生率为21.1%；+8是最常见的结构性附加染色[8-11]异常（22.2%），此结果与既往报道一致。其他结构性附加染色体异常分别为9q-(9.1%),-7/7q-(7.1%),+21(6.1%).我们从附加染色体数量异常方面分析，伴1种、2种、3种或3种以上附加染色体异常分别占59.6%,26.6%,16.5%.随着附加染色体数目的增加，其发生率呈下降趋势。我们从附加染色体结构性异常或数量异常方面具体其分析对急性早幼粒细胞白血病临床特征及预后影响，发现附加染色体对APL的临床预后均无明显影响。总之，在维甲酸联合亚砷酸联合治疗下，我们发现附加染色体异常对急性早幼粒细胞白血病患者临床特征及预后无影响。这提示我们附加染色体异常可能不是急性早幼粒细胞白血病的主要致病机制，需要我们从遗传学其他方面继续探索急性早幼粒细胞白血病发病机制，以补充现有的致病机制，寻求更有效的靶向治疗，应对复发难治性APL患者，以改善急性早幼粒细胞总体治疗情况。参考文献1、CoombsCC,TavakkoliM,TallmanMS.Acutepromyelocyticleukemia:wheredidwestart,wherearewenow,andthefuture.BloodCancerJ.2015Apr17;5:e304.doi:10.1038/bcj.2015.25.Review2、张之南，沈悌，血液病诊断及疗效标准，3版，北京：科学出版社，2007:106-11624 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第二部分3、薛永权，过宇，介绍一种改良的骨髓细胞染色体热变性姬姆萨R显带法。中华医学检验杂志，1986,9:247。4、ShafferLG,McGowan-JordanJ,SchmidM.ISCN(2013):AnInternationalSystemforHumanCytogeneticNomenclature.Base2013,Switzerland:S.Karger,2013.5.WiernikPH,SunZ,GundackerH,etal.Prognosticimplicationsofchromosomeabnormalitiesamongpatientswithdenovoacutepromyelocyticleukemiawitht(15;17).MedOncol2012;29;2095-101.6.XuL,ZhaoWL,XiongSM,etal.Molecularcytogeneticclinicalrelevanceofadditional,complexand/orvariantchromosomeabnormalitiesinacutepromyelocyticleukemia.Leukemia2001;15:1359-68.7.HiorsLR,SwansburyGJ,MinT,etal.Additionalchromosomeabnormalitiesconferworseprognosisinacutepromyelocyticleukemia.BrJHaematol1997;96:314-21.8.HernandezJM,MartinG,GutierrezNC,etal.AdditionalcytogeneticchangesdonotinfluencetheoutcomeofpatientswithnewlydiagnosedacutepromyelocyticleukemiatreatedwithanATRAplusanthracyclinbasedprotocol.AreportoftheSpanishgroupPethema.Haematologica2001;86:807-13.9.OnoT,TakeshitaA,IwanagaM,etal.Impactofadditionalchromosomalabnormalitiesinpatientswithacutepromyelocyticleukemia:10-yearresultsofJapanadultleukemiastudygroupAPL97study.Haematologica2011;96:174-6.10.LouY-J,SuoS-S,TongH-Y,etal.Characteristicsandprognosisanalysisofadditionalchromosomeabnormalitiesinnewlydiagnosedacutepromyelocyticleukemiatreatedwitharsenictrioxideasthefront-linetherapy.LeukemiaResearch,2013;37(11):1451-145611.JoseCervera,PauMontesinos,JesusM.Hernandez-Rivas,MariaJ.Calasanz.etal.Additionalchromosomeabnormalitiesinpatientswithacutepromyelocyticleukemiatreatedwithall-transretinoicacidandchemotherapy.Haematologia.2010;95(3):424-43125 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分STAT5B-RARα融合基因的克隆及初步功能研究既往文献报道包括PML基因在内，目前共发现12种RARα对手基因。STAT5B[1]是RARα对手基因之一，由Arnould等在1999年首次提出。之后多篇文献相继报道STAT5B-RARα阳性的APL患者，提出STAT5B-RARα阳性的患者对维甲酸及亚[2-4]砷酸不敏感，疗效不佳且容易复发。对STAT5B-RARα融合基因致病机制研究较少，有学者提出STAT5B-RARα可通过与SMRT共遏复合物相互作用，或干扰STAT3[5,6]信号通路，抑制细胞的转录和分化。鉴于STAT5B-RARα阳性APL患者尚无有效的治疗策略，需继续深入探索其致病机制以寻求有针对性的靶向治疗，改善该类APL患者的治疗效果。本研究中，我们运用FISH、RT-PCR等技术发现6例STAT5B-RARα阳性的APL患者，通过分析其实验室特征及治疗预后特点总结该类APL患者临床特征。同时拟采用基因转染、体内试验、体外试验等来深入研究STAT5B-RARα的生物学功能和致白血病机制，为STAT5B-RARα致病机制进行补充，为靶向治疗奠定基础。实验方法一、基本的试验方法1.荧光原位杂交技术(fluorescenceinsituhybridization，FISH)：对怀疑为RARα重排变异的APL患者，取其染色体悬液进行荧光原位杂交检测，对RARα基因重排进行验证。具体步骤如下：1.1从-40℃冰箱中取出患者的染色体悬液，用3:1新鲜的甲醇/冰醋酸固定液重新固定，滴片，置于室温环境下晾干，用砂轮在玻片背面划痕，以标记滴片区域；置于37℃的2×SSC30min后取出，将处理后的玻片依次放入70%，85%，100%的乙醇中各2min进行梯度脱水。1.2避光环境下，取出已标记好VysisLSIRARα双色基因探针，震荡离心，用移液器吸取5μl探针加于玻片杂交区域，然后盖上盖玻片，并用封片胶封片。1.3将上述制备的玻片放入杂交仪，置于75℃环境下，变性5min，后置于37℃26 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分环境下杂交过夜。1.4从杂交仪中取出玻片，揭去盖玻片，后置于72℃预热的0.4×SSC中，洗涤2min，再移入室温放置的2×SSC中，洗涤2min，最后在室温环境下将玻片晾干。1.5用移液器吸取7μlDAPI复染液，直接加于玻片杂交区域，然后复染30min。1.6在荧光显微镜下观察杂交信号应用OlympusBX60荧光显微镜，经DAPI/FITC/ＲHOD滤光片激发，观察红、绿、黄荧光杂交信号。在不计重叠细胞的情况下，每例分析不少于300个间期细胞，计算阳性细胞的百分比率。RARα双色探针判断标准：黄色信号代表一个完整的RARα基因；红色信号代表5’端RARα基因；[7]绿色信号缺失代表3’端RARα基因的缺失。最后应用图像分析系统VideoTestFISH2.0进行图像采集和保存。2.逆转录聚合酶链反应技术（reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR）2.1Trizol法从STAT5B-RARα阳性的患者骨髓细胞中提取总RNAa.从-80℃冰箱取出患者冻存的骨髓细胞，迅速复苏，1000r/min离心，弃上清,留取细胞沉淀。b.向细胞沉淀中加入1ml的Trizol试剂，充分吹打混匀至澄清无细胞团块，上下颠倒混匀10次，室温放置5min。c.加入氯仿200ul(占总体积的1/5),颠倒混匀10下，置于室温环境5min。d.4℃，12000g,离心15min,后转上层水相（约400ul）至另一个1.5ml的Ep管中。e.加入等体积的异丙醇(400ul),室温放置10min,后4℃，12000g,离心15min。f.弃上清，加入冰预冷的75%的乙醇（DEPC水配制）1ml,4℃，7500g,离心5min。g.弃上清，将沉淀溶于DEPC水中。置于-40℃备用。2.2将RNA逆转为cDNA,具体步骤如下：①无菌EP管1六随机引物2μlRNA4μl0.1％的DEPC水9μl反应条件为：70℃5min，后立刻降至4℃。②无菌EP管227 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究5×M-MLV缓冲液8μl25mmol/L的dNTP1μlRNAsin0.5μlM-MLV1μlDEPC水14.5μl③将管2的液体加入到反应好的管1中，总共40μl反应体系反应条件为：37℃60min，95℃5min，后立刻降至4℃。将逆转后的cDNA冻存于-40℃冰箱备用。2.3PCR反应体系及步骤如下：1）KODFXNeobuffer25ul浓度2×dNTP10ul浓度2mM上游引物1ul浓度10pmol下游引物1ul浓度10pmol总反应体系50ul,混匀，混匀cDNA模板XulddH2O50-XKODFxne酶1ul浓度2.5U/ul2）上述50ul反应体系，反应条件如下：94℃2min预变性98℃10s变性58℃30s退火32—35个循环68℃96s延伸68℃7min终末延伸3）反应完全后4℃保存备用。4)取上述PCR产物2μl，在1%浓度的琼脂糖凝胶上跑电泳，扫描并且分析电泳结果。若目的条带清晰，则将剩余PCR产物送测序，测序引物为PCR引物，测序公司为上海裕晶生物科技有限公司。3.构建LV5-GFP-STAT5B-RARα逆病毒载体及稳转细胞株3.1主要材料(1)主要试剂及试剂盒来源28 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分KODFXNeoPCR酶TOYOBO公司T4DNALigasePromega公司SphI和BamHI限制性内切酶Takara公司感受态细胞实验室自制DNA回收试剂盒QIAGEN公司质粒小抽试剂盒碧云天公司质粒大抽试剂盒invitrogen公司胰蛋白酶BIOTECH公司高糖DMEM培养基Hyclone公司胰蛋白胨OXOID公司氨苄青霉素Sigma公司酵母提取物OXOID公司琼脂糖上海生化所西巴斯公司胎牛血清Gibco公司RPMI-1640培养基Hyclone公司DNAMarkerFermentas公司M-MLV酶Promega公司RNAsinPromega公司PCR反应的引物上海生工生物工程有限公司（2）主要设备与仪器流式细胞仪（CYTOMICSFC500）BECKMANCOULTER公司荧光显微镜EXFO公司电子酸度计Beckman公司磁力搅拌器Eppendorf公司凝胶成像分析仪BIO-RAD公司微孔滤膜滤器BD公司产品紫外线分光光度计Eppendorf公司CO2培养箱Thermo公司倒置相差显微镜OLYMPUS公司29 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究PAC3000蛋白电泳仪BIO-RAD公司摇床江苏兴化分析仪器厂酶标仪(550型)BIO-RAD公司PCR基因扩增仪（9700型）PE公司BD202电子天平METTLERTOLEDO公司（3）主要试剂的配制①1000mlLB液体培养基的配制酵母提取物5g胰蛋白胨10gNaCL10g去离子水1000ml经高压蒸汽灭菌后，置于4℃保存。根据质粒的抗性在使用时，加入氨苄青霉素，最终浓度为100µg/mL。②制作LB琼脂培养板在配制好LB培养基的基础上，向LB培养基中中加入琼脂粉1.5g/100ml，经高压灭菌，待温度降至50℃时，可根据质粒抗性加入终浓度为100µg/mL的氨苄青霉素。然后在无菌状态下铺平板，平板凝固后将其倒置，置于4℃保存备用。③配制1000mlPH7.4的PBS溶液氯化钠8.00g磷酸氢二钠1.44g磷酸氢二钾0.24g氯化钾0.20g加去离子水，定容至1000ml，经高压蒸汽灭菌，室温冷却后置于4℃保存备用。④2×HBS的配制NaCl40gHEPES25gDxtrose5gKCl1.85gNa2HPO40.497g30 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分加去离子水，定容至500ml，即配制成10×HBS，保存于-20℃冰箱备用。向10ml10×HBS中加入25ml去离子水，用NaOH调PH为7.05~7.10，后定容至50ml，最后用0.2µM膜过滤。⑤2MCaCl2溶液配制:称取CaCl2为221.98g，将其溶解于1000ml的去离子水中，用0.2µM膜过滤后，放置4℃备用。⑥配制50×TAE电泳缓冲液:Tri碱242g冰乙酸57.1ml0.5mmol/L的EDTA(PH8.0)100ml加去离子水至1000ml。⑦配制1%的琼脂糖胶（g/mL）称取琼脂糖1g，将其加入到100mL电泳缓冲液TAE中，用微波加热到完全溶解。待冷却至50℃时，加入5µlGel-red，并轻轻混匀。（4）细胞株与载体U937细胞本实验室提供293T细胞本实验室提供大肠杆菌TOP10本实验室提供LV5-GFP本实验室提供病毒包装质粒本实验室提供3.2主要实验方法（1）细胞培养293T细胞培养于含10%FBS的高糖DMEM中，在温度为37℃，C02浓度为5%的培养箱中培养，每2天换一次液，当293T细胞达到70%-80%融合时，用0.25%的胰蛋白酶-EDTA进行消化传代。（高糖DMEM和FBS为biowest公司的。）（2）构建及鉴定LV5-STAT5B-RARα慢病毒表达质粒①引物设计：使用软件Premier6.1设计引物，由上海生物工程技术服务有限公司合成，STAT5B-RARα扩增产物自170bp-3361bp,共3096bp,使STAT5B-RARα融合基因加上酶切位点及荧光标记。31 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究STAT5B-RARα上游引物序列为：5’-CATGCATGCGCCACC(SPH1酶切位点+保护碱基）ATGGATTACAAGGATGACGACGATAAG（HIS标签）ATGGCTGTGTGGATACAAGCT-3'STAT5B-RARα下游引物序列为：5’-ATAAGAATGCGGCCGC(NotI酶切位点)GGGTCACATGGTCGGTAGAAA-3'②以STAT5B-RARα阳性的APL患者的cDNA为模板PCR扩增STAT5B-RARα全长序列PCR扩增反应体系2×PCR反应缓冲液25μl2mmol/L的dNTP混合液10μl10μmol/L的上游引物1μl10μmol/L的下游引物1μlKODFxneo酶1μl质粒2μlddH2O10μl总体系50μl反应条件:94℃2min98℃10s32cycles58℃30s68℃96s4℃forever上述PCR反应扩增的产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳分析及凝胶显像仪显像，辨认阳性电泳带并割胶回收目的基因片段，达到纯化PCR产物的目的。（凝胶回收试剂盒购自QIAGEN公司）。③PCR产物(纯化后的目的基因片段）与LV5-GFP载体的连接目的基因酶切体系：SPH1酶1ulBamH1酶1ul10×Kbuffer2ulSTAT5B-RARα3ul(<1ug)ddH2O11ul32 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分总体系20ul,酶切条件为：30℃1.5-2h,然后37℃15-2h,最后割胶回收得纯化产物LV5-GFP酶切体系：SPH1酶1ulBamH1酶1ul10×Kbuffer2ulLV5-GFP3ul(<1ug)ddH2O11ul总体系20ul,酶切条件同上。连接体系：纯化后的目的基因酶切产物4μl纯化后LV5-GFP酶切产物1μlSolutionI5μl总反应体系为10ul,反应条件：16℃，过夜。④转化连接的产物a向25μl感受态细胞悬液中加入10μl连接产物，并轻轻混匀，冰浴30min。b将混合液放置于42℃水浴90s，然后立即转移至冰浴中，使细胞迅速冷却2min。c将500μlLB培养基(不含抗生素)加入至上述混合液中，轻轻混匀。d准备已加入氨苄青霉素的LB平板，将上述混合液转移至准备好的LB平板上，并用玻璃棒涂匀。e将平板倒置，置于37℃温箱中，培养过夜。⑤挑选阳性克隆同时鉴定测序将培养过夜后的LB平板取出，仔细观察平板中细菌生长情况，然后采用无菌枪尖从平板上挑取5个白色单菌落，分别接种于4mlLB培养液（含氨苄青霉素）中，置于37℃摇床中，震荡过夜；从过夜培养的菌液中取出2ml，按质粒小抽试剂盒提供的步骤提取质粒；同时行菌液PCR鉴定阳性克隆。选择有目的片段条带的阳性克隆送测序公司测序鉴定，注意排除引入突变。重组质粒序列送上海裕晶公司完成测序鉴定。⑥质粒大抽按照invitrogen大抽试剂盒提供的说明书操作，完成LV5-GFP、LV5-GFP-STAT5B-RARα质粒的抽提。33 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究（4）LV5慢病毒的包装①37℃温水浴迅速复苏293T包装细胞系，传1-2代，将细胞状态调至最佳。包6装病毒前18-24小时，将293T细胞消化并行细胞计数，然后按1.0×10/dish密度接种至100mm培养皿中，每种重组质粒接种2皿，置于37℃孵箱，培养过夜。②包装病毒前将2×HBS溶液、细胞培养液置于37℃预热。包装前5分钟，予细胞换液（培养液为含10%FBS的高糖DMEM培养液），7ml/皿。③转染体系的配制在15ml无菌离心管中依次加入下列成分：ddH2O450l2mMCaCl250l质粒DNA10g＋包装质粒（ΔR6.5ug+VSVG3.5ug+Rev2.5ug)向上述离心管中逐滴加入500l2×HBS，边加边摇匀。静置>5min,可观察到混合液变浑浊。然后将离心管中混合液体逐滴加入到培养皿中，把皿于前后左右方向倾斜几次，促使转染体系在皿中均匀分布。最后将皿置37℃孵箱，转染8-10小时，然后予以细胞换液（培养液为含10%FBS的高糖DMEM培养基），并置于37℃孵箱继续培养。④在转染后48小时后收获病毒上清，以2500rpm转速离心5分钟，然后用0.2μM滤器过滤，最后分装标记。取适量感染U937细胞系，余冻存于-80℃冰箱中备用。⑤侵染48小时，运用流式细胞术测U937细胞GFP阳性率，再经0.7ug/ml嘌呤霉素筛选3天后，再次测GFP阳性率。4.LV5-GFP-STAT5B-RARα细胞株的鉴定为验证LV5-GFP-STAT5B-RARα是否成功整合到细胞基因组DNA中，我们提取病毒转染后细胞的DNA，进行PCR及测序鉴定。5.采用CCK8法检测STAT5B-RARα对细胞生长的影响取处于对数生长期的LV5-GFP-STAT5B-RARα、LV5-GFP细胞株进行试验，选择96孔板，细胞接种密度为每孔1000个/100ul,每组细胞设三个复孔，在0d，1d，2d，3d，4d同样时间点，分别取出一板检测。测量时向每孔加入10µlCCK8试剂，并继续培养3小时，然后利用酶标仪测各孔OD450nm值，根据细胞生时间及OD值绘制生长曲线。试验重复3次。34 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分6.软琼脂集落形成实验取LV5-GFP-STAT5B-RARα、LV5-GFP细胞株处于对数生长期的细胞，细胞浓度为200个/皿，接种于3.5mm培养皿中，每皿放甲基纤维素1ml，将培养皿置于37℃，5%C02培养箱培养一周，显微镜下观察细胞增殖情况。结果1.病例资料在研究中，我们共发现6例STAT5B-RARα阳性的APL患者，其基本临床特征，详见下表3-1。这6例变异型APL患者均为男性，中位年龄为33.5岁（24-49岁），中位白细胞计数15.09*10E9/L(范围，3.8-32.3*10E9/L)，中位血红蛋白75.5g/L（范围，45-123g/L），中位血小板计数83.5*10E9/L(范围，24-282*10E9/L)。全部6例患者骨髓染色体核型分析发现，4例患者为正常核型，另外2例患者染色体核型中均有-Y异常。6例患者均有经过ATRA/ATO联合治疗，4例患者治疗无反应，1例患者获完全缓解，1例患者获部分缓解。这些患者的平均随访时间为20.92个月（1-69），其中3例患者死亡，2例患者因出血而死，1例患者因严重感染死亡；2例患者失访（1例患者同胞全相合移植术后14个月后失访；一例患者首次复发后失访），1例患者存活。表3-1.STAT5B-RARα阳性的APL患者的临床及实验室特征123456性别/年龄(years)M/24M/26M/32M/49M/35M/4645,X,-Y[6]/46,XY[8染色体核型46,XY46,XY46，XY46，XY45，X,-Y,1q-,11q+]融合基因STAT5B-RARαSTAT5B-RARαSTAT5B-RARαSTAT5B-RARαSTAT5B-RARαSTAT5B-RARαFAB分型M3bM3M3bM3M3M3白细胞(×10E9/L)32.36.63.819.71317.18血红蛋白(g/L)1237383744577血小板(×10E9/L)8994282244378骨髓原始细胞(%)89.35590.2NANA48.5ATAT/ATONRNRNRCRNRPR是否存活（0=存活；1=死110010亡）总生存时间6917191514.5是否复发（0-=无复发；1=0-01--复发）35 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究无复发生存时间67-1714--NR：noresponse;CR：completeremission;PR：partialremission2.PCR扩增STAT5B-RARα融合基因全长我们以STAT5B-RARα阳性的APL患者的cDNA为模板，以带有SphI和BamHI双酶切位点的STAT5B-RARα全长引物，利用KOD高保真酶扩增出STAT5B-RARα融合基因后，取50ul的PCR产物在1%琼脂糖凝胶上跑电泳，用成像仪观察可见大小3100bp左右的片段，与目的基因STAT5B-RARα大小一致。STAT5B-RARα的融合模式图(见下图3-1)。图3-1STAT5B-RARα融合模式图3、LV5-GFP-STAT5B-RARα重组质粒的构建用SphI和BamHI对STAT5B-RARα全长及带有绿色荧光标记的慢病毒载体LV5进行酶切，电泳，用DNA凝胶回收试剂盒回收STAT5B-RARα融合基因和慢病毒载体LV5。用T4DNAligase连接双酶切得到的STAT5B-RARα融合基因和线性化的载体，30℃、37℃分别连接2小时，连接产物转化感受态细胞后，平板挑取单克隆，小抽质粒并做鉴定筛选出阳性克隆，重组质粒测序鉴定后大量抽提。36 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分图3-2慢病毒载体图谱A:LV5质粒图谱B:LV5-STAT5B-RARα慢病毒重组质粒4、逆病毒的包装及细胞侵染将LV5-GFP-STAT5B-RARα重组病毒质粒与Rev，VSVG,ΔR这3种包装质粒采用磷酸钙沉淀法转染293T细胞，48小时收集病毒液来侵染U937细胞，经培养48小时后，运用流式细胞技术测GFP荧光感染效率，然后用浓度为0.7ug/ml的嘌呤霉素对转染后的U937细胞进行药筛，并用流式细胞仪对药筛后的U937细胞进行分选。（流式分选结果见下图3-3）图3-3.FCM分选后检测U937细胞感染效率。A：亲本细胞株U937；B：感染LV5空载体病毒的U937细胞株；C：感染LV5-GFP-STAT5B-RARα的细胞株；37 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究5、细胞株的鉴定（PCR鉴定）以流式细胞仪分选后的U937细胞基因组DNA为模板，PCR体系扩增结果显示STAT5B-RARα融合基因已经整合到U937细胞基因组DNA中，见图3-4。图3-4.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图及测序图。左侧图为琼脂糖凝胶电泳图。左图1列：1kbDNAmarker；左图2列：STAT5B-RARα转染细胞，左图3列：U937亲本株细胞。右图为转染后U937细胞的测序图。6、CCK8法测细胞增殖如图3-5显示，表达STAT5B-RARα的U937细胞较LV5空载体细胞及U937亲本株细胞生长快。图3-5.U937细胞生长曲线图38 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分7、细胞集落形成试验在3.5mm培养皿中以200个细胞/每皿的密度接种细胞，培养一周，然后在普通光学显微镜下观察集落形成情况：LV5-GFP、LV5-GFP-STAT5B-RARα细胞均在软琼脂内呈现克隆性生长，两组细胞形成的集落情况详见图3-6-1及图3-6-2。由图可看出，与LV5-GFP细胞相比，LV5-GFP-STAT5B-RARα细胞集落生成数目明显增多。图3-6-1图3-6-2图3-6-1为LV5-GFP-STAT5B-RARα细胞集落形成图。图3-6-2为LV5-GFP细胞集落形成图。讨论15号染色体上的早幼粒白血病基因PML和17号染色体上的维甲酸受体基因RARa融合形成的PML-RARα是APL患者特征性的分子遗传学标志。全反式维甲酸及亚砷酸分别作用于RARα段及PML段，两种药物协同作用且无交叉耐药，促使APL患者的临床完全缓解率达到90%以上，成为可治愈的急性髓细胞白血病。目前研究已经发现除外PML基因，RARα尚有11个对手基因，它们与RARα融合形成不同的X-RARα，对维甲酸及亚砷酸表现出不同的敏感性。信号传导与转录活化因子（signaltransducerandactivatoroftranscription，STAT）是一种非常重要的转录调控因子，其蛋白家族包含STAT1,STAT2,STAT3,STAT4,[7]STAT5,STAT6,7个成员，其中STAT5包括STAT5A和STAT5B。既往文献报道，STAT5B是RARα的对手基因之一，STAT5B的15号外显子与RARα的3号外显子发生融合形成STAT5B-RARα融合基因。自1999年首次发现STAT5B-RARα融合基因到现在，有关STAT5B-RARα阳性APL患者的研究仍较少。相关临床研究发现39 第三部分急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究[8]STAT5B-RARα阳性的APL患者对维甲酸及亚砷酸不敏感，预后较差。本研究发现了6例STAT5B-RARα阳性的APL患者，他们均经过ATRA/ATO联合治疗，其中4例患者对治疗无反应，1例患者获完全缓解后复发，1例患者获部分缓解。从我们的临床研究发现，STAT5B-RARα阳性APL患者总体对维甲酸及亚砷酸不敏感，预后不良，补充了现有的STAT5B-RARα阳性APL患者的病例数，进一步从临床治疗方面证实了STAT5B-RARα是APL预后不良的因素。然而目前对STAT5B-RARα的致病机理尚未完全明确，亟待进一步研究，。Arnould等研究证实，野生型Stat5b蛋白位于细胞质中，但STAT5B-RARα融合蛋[9]白则定位在细胞核中。STAT5b蛋白是JAK-STAT信号通路的组分之一，经JAK激酶磷酸化的STAT蛋白可产生同源二聚体，同时由胞浆向胞核转移，在细胞核内发[10]挥转录因子作用。STAT5B基因的转录异常可能是STAT5B-RARα致病机理之一。本研究成功构建STAT5B-RARα融合基因慢病毒载体，建立U937稳转细胞株。体外实验结果表明，STAT5B-RARα在一定程度上能够促进U937细胞的增殖。我们将在建立STAT5B-RARα稳转细胞株的基础上，进一步对其致病机制进行深入研究，希望可以为该类预后不良的APL患者提供更有效的治疗指导策略。参考文献1.ArnouldC,PhilippeC,BourdonV,etal.ThesignaltransducerandactivatoroftranscriptionSTAT5bgeneisanewpartnerofretinoicacidreceptoralphainacutepromyelocytic-likeleukaemia.HumMolGenet1999;8:1741–1749.1.StrehlS,KönigM,BoztugH,etal.All-transretinoicacidandarsenictrioxideresistanceofacutepromyelocyticleukemiawiththevariantSTAT5B-RARαfusiongene.Leukemia.2013Jul;27(7):1606-10.2.KusakabeM,SuzukawaK,NanmokuT,etal.DetectionoftheSTAT5B-RARαfusiontranscriptinacutepromyelocyticleukemiawiththenormalchromosome17onG-banding.EurJHaematol.2008May;80(5):444-7.3.IwanagaE,NakamuraM,NanriT,etal.AcutepromyelocyticleukemiaharboringaSTAT5B-RARαfusiongeneandaG596VmissensemutationintheSTAT5BSH2domainoftheSTAT5B-RARα.EurJHaematol.2009Nov;83(5):499-501.4.MaurerAB,WichmannC,GrossA,etal.TheStat5-RARalphafusionprotein40 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究第三部分repressestranscriptionanddifferentiationthroughinteractionwithacorepressorcomplex.Blood.2002Apr15;99(8):2647-525.DongS,TweardyDJ.InteractionsofSTAT5b-RARalpha,anovelacutepromyelocyticleukemiafusionprotein,withretinoicacidreceptorandSTAT3signalingpathways.Blood.2002Apr15;99(8):2637-466.ChenH,PanJ,YaoL,etal.AcutepromyelocyticleukemiawithaSTAT5b-RARαfusiontranscriptdefinedbyarray-CGH,FISH,andRT-PCR.CancerGenet.2012Jun;205(6):327-31.7.FurqanM,MukhiN,LeeB,LiuD:DysregulationofJAK-STATpathwayinhematologicalmalignanciesandJAKinhibitorsforclinicalapplication.BiomarkRes2013,1(1):5.8.StrehlS,KonigM,BoztugH,etal.All-transretinoicacidandarsenictrioxideresistanceofacutepromyelocyticleukemiawiththevariantSTAT5B-RARαfusiongene.Leukemia2013;27:1606-109.ArnouldC,PhilippeC,BourdonV,GrgoireMJ,BergerR,JonveauxP.ThesignaltransducerandactivatoroftranscriptionSTAT5bgeneisanewpartnerofretinoicacidreceptoralphainacutepromyelocytic-likeleukaemia.HumMolGenet.1999;8:1741–9.10.LaFaveLM,LevineRL.JAK2thefuture:therapeuticstrategiesforJAK-dependentmalignancies.TrendsPharmacolSci.2012;33:574–82.41 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究结论1.本中心回顾性分析了1208例APL患者的临床和实验室资料，该组病例主要集中于中青年患者，男女发病率基本相等。根据不同的遗传学特征分组后发现，RARα变异型APL患者中，男性患者比例显著高于典型APL患者。染阴融阴组及变异型组患者初诊白细胞均明显高于典型组APL患者。染阴融阴组及RARα变异型APL患者的高危组所占比例均明显高于典型APL患者。核型分析发现，18.21%的患者有附加染色体异常，其中+8染色体异常占22.60%，为最常见的附加染色体异常，其次9q-,7q-,+21也较常见，比例分别为7.21%，5.77%，5.29%。突变分析发现，FLT3-ITD突变率最高，达32.67%，在APL患者中是预后不良的因素。WT1，FLT3-TKD突变率较高，分别为14.46%，11.11%。FLT3-TKD，TET2，WT1，NRAS突变对APL患者的临床预后则无明显影响。2.附加染色体异常对急性早幼粒细胞白血病患者的临床特征及预后无明显影响。3.我们成功构建STAT5B-RARα融合基因慢病毒载体，建立U937稳转细胞株。体外实验结果表明，STAT5B-RARα在一定程度上能够促进U937细胞的增殖。我们将在建立STAT5B-RARα稳转细胞株的基础上，进一步对其致病机制进行深入研究。42 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究综述综述急性早幼粒白血病的耐药机制及治疗进展田长玉综述陈苏宁审校【摘要】急性早幼粒白血病(acutepromyelocyticleukemia，APL)是急性髓细胞白血病的一种极为特殊的亚型。近20年来，伴随全反式维甲酸(ATRA)和亚砷酸(ATO)的联合应用，其成为预后最好的一种白血病。但是仍有5%-20%的APL患者存在难治复发风险，这是目前临床亟待解决的问题。本文从APL的耐药机制及治疗进展做一综述。【关键词】急性早幼粒细胞白血病耐药机制治疗进展急性早幼粒白血病(APL)是急性髓细胞白血病的一种亚型，根据形态学FAB分型为M3亚型，占急性髓细胞白血病的15%。约98%的APL患者有t(15;17)(q22;q21)特异性染色体易位,及15号染色体上的PML基因和17号染色体上的维A酸受体［1］a(RARa)基因融合形成的PML/RARa融合基因。随着1985年ATRA及1997年［2］ATO的临床效应的相继发现，及目前ATRA/ATO联合应用，APL患者获得了高达［3］90%的完全缓解率（CR)和80%的治愈率。然而仍有5%-20%的APL患者存在难治复发风险，大多患者对ATRA或ATO治疗耐药，是目前临床治疗APL的关键难题之一。ATO是治疗复发难治性APL一线药［4］物，单药诱导可使86%的复发APL患者获得2次缓解。但是ATO有心脏损害、肝脏损害等潜在的急慢性毒副作用。故对APL耐药机制的进一步探索和治疗方法的继续优化是必要且急需的。本文对APL的耐药机制及治疗进展做一综述。1.难治复发性急性早幼粒白血病（APL)［5-6］难治性急性早幼粒白血病(APL)是一个统筹概念，根据以往报道，可以定义为以下几方面：绝对耐药即诱导缓解治疗第一疗程的第28天骨髓中幼稚细胞比例仍超过诊断时的50%；低增生性耐药即化疗后骨髓抑制，但恢复后骨髓原始细胞细胞比例超过诊断时50%；诱导缓解治疗两疗程不缓解；髓外白血病持续存在；第一次完全缓解(CR1)持续时间小于6个月；第一次完全缓解（CR1）6-12个月后复发，原诱导方案治疗无效；2次以上的复发，再诱导治疗无效；造血干细胞移植术后复发，再诱43 综述急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究导治疗无效。急性早幼粒细胞的血液学（形态学）复发指CR后外周血中再现原始细［7］胞或骨髓原始细胞比例超过5%。分子学复发即CRm后RT-PCR检测PML-RARα［8］融合基因阳性，相隔至少2周，再次检测仍为阳性。另外急性早幼粒白血病患者［7］CR后髓外遗传学异常出现或再现均视为复发。2.分子靶向药物ATRA及ATO在急性早幼粒白血病(APL)中的作用机制2.1全反式维甲酸（ATRA）在APL中的作用机制［9］RARα基因总长度为7.5Kb,位于17q21,包括9个外显子。野生型RARα蛋白是一种核激素受体，可与视黄醛类X受体（retinoidXreceptor，RXR）形成异源二[10-12]聚体(RAR-RXR)，然后结合至许多基因的启动子中的维甲酸作用元件（retinoicacidresponseelements，RAREs），从而调控这些基因的表达。维甲酸类药物属于维生素A的天然或合成衍生物，在生长发育，细胞增殖等方面发挥重要作用。该类药[13]物可通过调节特定基因的表达来影响正常细胞和肿瘤细胞的分化。维甲酸可通过激活两类核受体蛋白——类固醇核受体蛋白及甲状腺激素超家族核受体蛋白，调节基因转录活性。在缺乏维甲酸或9-顺-视黄酸等配体情况下，RAR-RXR异源二聚体招募转录共轭抑制因子，如N-CoR/SMRT复合体等，这些转录共轭因子包含组蛋白脱乙酰[14-16]基，通过重塑染色体结构诱导转录抑制作用。当维甲酸等配体的生理浓度低于10-7M时，转录共轭因子便从RAR-RXR异源二聚体游离出来，转录抑制作用消失，[14-17]激活转录作用加强。PML-RARα融合蛋白与靶基因启动子区域的维甲酸作用元件（retinoicacidresponseelements，RAREs）结合，可竞争性抑制RARα与RAREs的结合，不能启动靶基因的转录。PML-RARα与N-CoR/SMRT复合体和抑制性Polycomb蛋白复合体高亲和力结合，生理水平的ATRA难以使其解离，使得靶基因处于转录抑制状态，[18-20]APL细胞分化受阻。2.2亚砷酸（ATO）在APL中的作用机制[21]1996年Chen等人首次以NB4细胞为模型探索亚砷酸作用机制，提出亚砷酸药物浓度在0.5–2lM/L较高水平时，对NB4细胞有明显促凋亡作用；亚砷酸药物浓度在0.1–0.5lM/L水平时，对NB4细胞有一定促分化作用。正常情况下，PML蛋白位于细胞核小体中，发挥肿瘤抑制作用。在APL细胞中，PML-RARα融合蛋白阻碍细胞内分化基因的表达，裂解核小体，导致PML蛋白散布在小细胞器内，使PML44 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究综述[22-23]基因失去正常生理定位，失去抑制细胞生长的功能。近年有研究发现，亚砷酸可直接与PML蛋白或PML-RARα融合蛋白中RBCC区域中的B盒结构结合，增强位于PML蛋白锌指结构处的泛素样蛋白修饰结合酶UBC9作用，通过泛素-蛋白酶体[24-25]途径降解PML-RARα融合蛋白，达到治疗目的。另有研究发现，Caspases是一种半胱氨酸蛋白酶，位于细胞内，也是经典凋亡途径的关键组分。亚砷酸可通过激活[26]Caspases,激活相关凋亡因子的级联反应，诱导APL细胞的凋亡。亚砷酸也可通过诱导ROS(活性氧)生成，促使PML蛋白分子内部形成二硫键与亚砷酸直接结合；含二硫键的PML蛋白或PML-RARα蛋白可以形成核基质相关的核小体，通过泛素化[23][27]修饰作用降解。Kapahi等提出亚砷酸可通过与IκB特异性激酶结合，抑制该酶磷酸化过程，保护IκB不被降解，从而阻止NF-κB进入核内发挥功能，从而发挥诱导凋亡的作用。亚砷酸还可以通过诱导线粒体膜电位的下降及下调bcl-2的表达，发挥凋亡作用。2014年等最新研究报道称，亚砷酸靶向硫氧还蛋白系统在细胞内氧[28-29]化还原反应中起重要作用，似乎是砷诱导凋亡中的关键。3.急性早幼粒白血病（APL）耐药机制早期的研究报道表明，全反式维甲酸耐药主要是因为APL患者对高浓度全反式[30]维甲酸产生了适应性高代谢反应。Gallagher在2002年从RARα蛋白的配体结合域（LigandbindingdomainLBD）突变等分子学角度推测APL患者耐药机制。现在，我们概述近几年的全反式维甲酸及亚砷酸的分子学耐药机制进展，对APL临床诊疗有深刻意义。3.1多种RARα融合基因发现[31]目前研究发现,除外PML基因，RARα有11个对手基因，分别是PLZF,[32][33][34][35][36][37][38]NuMA,NPM,STAT5b,FIP1L1,PRKAR1A,andBCOR，GTF2I，[39][40][41][42]OBFC2A,IRF2BP2,TBLR1基因。Martens等在2010年提出PML-RARα融合基因可诱导形成同源二聚体RAR-RAR,该同源二聚体无法结合靶基因RAREs，从而抑制靶基因转录，是APL较为重要的发病机制之一。Sternsdor启动子中的维A酸[43]反应元件，f等证实向小鼠体内注射RARa同源二聚体，会诱发小鼠患急性早幼粒样白血病。而且同源二聚体已经证实存在于几乎所有的X-RARα融合蛋白中。以上研究均提示RARα融合蛋白的同源二聚体结构是X-RARα融合蛋白诱导白血病关键。但是在PML-RARa,PRKAR1A-RARa,andBCOR-RARa融合蛋白中,这些融合基45 综述急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究因蛋白可与RXR形成的异源二聚体(RAR-RXR)，这些异源二聚体(RAR-RXR)可也可[43-44]与许多基因启动子中的维甲酸反应元件结合，激活这些基因的转录活性。尽管目前发现的X-RARα融合蛋白都含有RARa基因的DNA结合域和配体结合域，但是携带不同的X-RARα融合基因的APL患者对维甲酸敏感性也不同。研究已证实，APL患者携带PLZF-RARa,STAT5b-RARa,GTF2I-RARα融合基因，对全反式[46][47]维甲酸耐药。1998年HeLZ和Grignani指出N-CoR/SMRT共阻遏复合体与PLZF相互作用发挥抑制转录作用，此过程不受全反式维甲酸药物浓度影响。因此在维甲酸靶基因启动子区域不会发生转录去抑制作用。目前研究对于STAT5b-RARa的维甲酸耐药机制未完全阐述清楚。野生型Stat5b蛋白位于细胞质中，但[48]STAT5b-RARa融合蛋白则定位在细胞核中。STAT5b蛋白是JAK-STAT信号通路的组分之一，经JAK激酶磷酸化的STAT蛋白可促使产生同源二聚体，并诱导自身由胞浆向胞核转移，在细胞核内发挥转录因子作用，STAT5B-RARα改变了STAT5B[49]正确的生理位置，使其无法发挥转录活性，可能是STAT5B-RARα致病机制之一。[50][38]GTF2I是一种转录调节因子，通过招募共轭复合体抑制转录。2014年John和Sons发现新的RARα融合基因—GTF2I-RARα，及该融合基因维甲酸耐药的临床特性，提出GTF2I-RARα通过GTF2I蛋白招募共轭因子抑制转录从而发生维甲酸耐药。另外，有报道PLZF-RARα,ATATSb-RARα,BCoR-RARα融合基因阳性的APL患者对亚砷酸也表现出耐药性。PML蛋白B盒结构中有卷曲螺旋结构（C-Cmotif），该螺旋结构是亚砷酸结合位点。亚砷酸正确结合到PML蛋白B盒结构是其发挥降解[23,25]PML-RARa融合蛋白的关键步骤。迄今尚无报道证实亚砷酸可以直接作用于RARa蛋白。除PML-RARα融合蛋白外，RARα其他融合蛋白缺乏亚砷酸结合位点可能是亚砷酸耐药机制之一。3.2全反式维甲酸（ATRA）耐药机制迄今已有许多研究报道探讨典型APL患者的维甲酸耐药机制，提出RARa蛋白配体结合域（Ligandbindingdomain，LBD）发生基因突变导致相关氨基酸的改变是维甲酸耐药机制之一，此过程会增加体内维甲酸代谢水平，导致细胞质视黄酸结合蛋白(CRABP)出现，同时影响维甲酸向细胞核的转移，从而抑制维甲酸发挥作用。目前报道仅证实PML-RARa融合蛋白配体结合区域的基因突变是维甲酸耐药机制之一[51-55]。维甲酸耐药的APL患者体内或APL耐药细胞株内可检测到PML-RARa融合46 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究综述蛋白配体结合区域的相关突变（错义突变，同义突变，缺失突变等），突变集中在[55]PML-RARα融合基因的LBD的3个分区域内。2012年Gallagher等报道，45例ATRA联合化疗后复发APL患者中，18例（40%）检测到PML-RARa融合基因LBD突变。体外实验中，以对维甲酸耐药的NB4细胞及表达突变型PML-RARα融合蛋白（突变位于LBD处）的Cos-1细胞为模型，证实维甲酸与突变型PML-RARα融合蛋白亲和力明显低于野生型PML-RARα融合蛋白。而且，配体依赖性的N-CoR/SMRT共阻遏复合体的释放及ACTR组蛋白乙酰转移酶等共激活刺激因子的招募,是维甲酸靶基因RARE区域的转录激活及促进细胞分化的重要途径。但是对于突变型PML-RARα融合蛋白，在维甲酸治疗剂量下其释放共阻遏复合体及招募共激活刺激[54,56]因子的能力减弱，表现对维甲酸耐药。3.3亚砷酸（ATO）耐药机制目前关于亚砷酸耐药的报道较少，我们对亚砷酸耐药机制的认识是比较有限的。[57-59]2011年，日本科学家Goto和Gallagher等报道了2例亚砷酸耐药的复发难治性APL患者，这2例患者均为PML-RARα融合基因阳性，且亚砷酸治疗之前均经历了维甲酸及化疗联合治疗。对2例患者进行突变检测发现，两患者PML基因B盒结构发生错义突变的导致氨基酸的改变。其中一患者为变异型PML-RARα融合基因阳性，在PML-B2区域检测到突变(A216V),在RARa-LBD区域检测到突变(G391E),另一位APL患者为长型PML-RARα融合基因阳性，仅在PML--B2区域检测到突变(L218P)。在体外实验中，以分别表达野生型PML-RARa融合蛋白，含PML-B2突变的PML-RARα-mut1蛋白,及含RARα-LBD突变的PML-RARα-mut2蛋白的HeLa和HL60细胞2种细胞为模型，发现在无亚砷酸作用时，表达野生型PML-RARα蛋白的细胞内，可见PML小体在细胞质内呈点状分布，经亚砷酸处理后，点状分布消失，变为颗粒状分布。分别表达2种突变体PML-RARα融合蛋白的细胞内，无论是否经亚砷酸处理，PML小体在胞质及胞核内的都呈弥散性分布。Jeanne等推测PML基因的B盒结构中的卷曲螺旋结构(C-Cmotif)是亚砷酸直接结合位点。从以上分析，亚砷酸耐药的APL患者可能通过发生相关基因突变，改变氨基酸，进一步导致亚砷酸结合蛋白的构象改变，从而破坏亚砷酸直接结合位点，产生亚砷酸耐药。现在，我们需要分析更多的亚砷酸耐药病人基因突变，以证实PML基因B盒结构域突变的临床意义。47 综述急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究[61]2014年，北京科学家通过对13例亚砷酸耐药的APL患者进行直接测序，9例患者检测到PML基因突变，他们中的7例同时被检测到RARα基因突变。2016[60]年，北京科学家对9例亚砷酸耐药的APL患者进行突变分析，这9例患者PML-RARα融合基因均阳性，且之前都经历了维甲酸联合化疗的诱导治疗等。他们发现PML基因上的5个点突变，分别是A216V,S214L,A216T和L217F，S220G；通过体外实验证实A216V,S214L,A216T这3种突变会影响亚砷酸发挥作用，显示亚砷酸耐药特性。L217F，S220G这2种突变则对亚砷酸治疗无明显影响，未表现出亚砷酸耐药特性。同时，研究还指出，通过提高亚砷酸的药物浓度或亚砷酸联合维甲酸治疗，均可改善PML-RARα基因突变诱发的亚砷酸耐药。4.难治复发性急性早幼粒白血病（APL)治疗进展现在因维甲酸和亚砷酸联合治疗方案的应用，高达90%的APL患者获得完全缓解，80%的患者甚至得到一定的治愈。但是仍有一部分患者表现为复发难治，是当前急性早幼粒白血病治疗的主要瓶颈之一。这部分难治复发性APL患者，主要表现为对维甲酸或亚砷酸耐药，因而无法达到理想治疗效果。随着对维甲酸及亚砷酸耐药机制的不断探索，复发难治性APL患者治疗也取得一定进展。早期一些研究证实亚砷酸可以克服维甲酸耐药，对经历维甲酸及化疗联合治疗后[62]失败或复发的APL患者有良好治疗效果。Lengfelder等分析了14项从1997到2011年以亚砷酸治疗复发难治性APL患者的临床研究，发现亚砷酸单药诱导可以使86%的复发APL患者获得2次缓解（CR2），2年OS率高达50%-81%。现在亚砷酸用于治疗标准诱导失败的APL患者。AM80是一种合成类视黄醇，与维甲酸相比，与[63]PML-RARα有更高亲和力，已应用到临床。另外，体外实验证实Am80促进NB4细胞和HL60细胞分化的能力是维甲酸的10倍左右，且比维甲酸化学结构更稳定。组蛋白乙酰化酶（HDAC）抑制剂，如丁酸钠（NaF），丙戊酸（VPA）和曲古抑菌素A（TSA）与维甲酸联合应用，可以转录激活PML-RARα融合基因，抑制其结合含[64,65]HDACs的共轭因子复合物.另外，还可以通过其它分子靶向药物，例如抗CD33[66,67][60]单抗—GO。最近，北京科学家提出提高亚砷酸的药物浓度或亚砷酸联合维甲酸治疗，均可改善PML-RARα基因突变诱发的亚砷酸耐药。此改善亚砷酸耐药的方法目前仅限于体外实验，尚需临床研究证实。综上所述，随着ATRA/ATO的联合应用，急性早幼粒白血病患者总体生存率已48 急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究综述高达90%，但仍存在一部分因对维甲酸或亚砷酸耐药而产生的难治复发患者。这部分难治复发患者是目前APL治疗的棘手问题。附加基因突变，如PML-RARα突变，[55，68]FLT3-ITDorTP53突变等可能会促进APL患者疾病进展及导致耐药。对临床APL患者进行详细的基因组分析，将有助于预测预后，选择更有效的靶向治疗，及理解分子作用机制，设计更好的治疗方案。参考文献[1]WangZY,ChenZ.Acutepromyelocyticleukemia:fromhighlyfataltohighlycurable.Blood2008;111:2505–2515.[2]ShenZX,ChenGQ,NiJH,etal.Useofarsenictrioxide(As2O3)inthetreatmentofacutepromyelocyticleukemia(APL):Ⅱ.Clinicalefficacyandpharmacokineticsinrelapsedpatients[J].Blood,1997,89(9):3354-3360.[3]CoombsCC,TavakkoliM,TallmanMS.Acutepromyelocyticleukemia:wheredidwestart,wherearewenow,andthefuture.BloodCancerJ.2015Apr17;5:e304.doi:10.1038/bcj.2015.25.Review[4]LengfelderE,HofmannWK,NowakD.Impactofarsenictrioxideinthetreatmentofacutepromyelocyticleukemia[J].Leukemia,2012,26(3):433-442.[5]SchmidC,SchleuningM,SchwerdtfegerR,etal.Long-termsurvivalinrefractoryacutemyeloidleukemiaaftersequentialtreatmentwithchemotherapyandreduced-intensityconditioningforallogeneicstemcelltransplantation.Blood.2006;108:1092–1099.[6]EsteyE.TreatmentofrefractoryAML.Leukemia.1996;10:932–936[7]CreutzigU,KaspersGJ.RevisedrecommendationsoftheInternationalWorkingGroupfordiagnosis,standardizationofresponsecriteria,treatmentoutcomes,andreportingstandardsfortherapeutictrialsinacutemyeloidleukemia.JClinOncol.2004Aug15;22(16):3432-3.[8]LouY,SuoS,TongH,etal.Characteristicsandprognosisanalysisofadditionalchromosomeabnormalitiesinnewlydiagnosedacutepromyelocyticleukemiatreatedwitharsenictrioxideasthefront-linetherapy.LeukRes.2013Nov;37(11):1451-6.doi:10.1016/j.leukres.2013.07.030.Epub2013Aug16[9]HjaltTA,MurrayJC.Genomicstructureofthehumanretinoicacidreceptor-alpha1gene.MammGenome1999;10:528-949 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急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究中英文缩略词汇表中英文缩略词汇表英文缩写英文全称中文全称AMLacutemyeloidleukemia急性髓细胞白血病APLacutepromyelocyticleukemia急性早幼粒细胞白血病RFSrelapesfreesurvival无复发生存InternationalSystemforHuman人类细胞遗传学命名国际体ISCNCytogeneticNomenclature制OSoverallsurvival总体生存PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链反应RT-PCRreversetranscriptionpolymerasechainreaction逆转录聚合酶链式反应STAT5Bsignaltransducerandactivatoroftranscription5B信号传导与转录活化因子5BEMGsEpigeneticModifierGenes表观遗传学修饰基因FISHfluorescenceinsituhybridization荧光原位杂交技术RXRretinoidXreceptor视黄醛类X受体RAREsretinoicacidresponseelements维甲酸作用元件LBDLigandbindingdomain配体结合域ACAsadditionalchromosomalabnormalities附加染色体异常57 致谢急性早幼粒细胞白血病临床及遗传学因素研究致谢岁月如白驹过隙，转眼间三年的硕士生学习生涯即将结束，在毕业来临之际，我要向给予我帮助与支持的老师、同学、亲人及朋友们表达我最诚挚的问候与感激。感谢我的恩师陈苏宁教授，能有幸成为您的一名学生，感谢您把我带入血液病学的科学领域，激励我不断学习与进取。三年来您对我谆谆教诲，工作生活上给予了无私的帮助。您深厚的学术造诣，执着钻研、吃苦耐劳的工作精神，严谨求实的治学态度，对学生的博大情怀与精心培养，都是我今后学习与工作中不断学习的榜样。感谢我的指导老师姚利老师，您是我的良师益友，三年来您对我细心指导，从课题设计，实验试剂筹备，实验方法指导，直至撰写论文，都给予了我莫大的支持与帮助。感谢您一直以来在学习与生活上给予的无微不至的关怀。感谢阮长耿院士、王兆钺教授、吴德沛教授、陈子兴教授等血研所的各位学者与前辈，你们渊博的知识不断启发着我的科研思维，培养着我的科学精神。感谢细胞遗传学实验室潘金兰老师、王勇老师、张俊老师为我答疑解惑和提供的诸多帮助，并教会我细胞遗传学知识。感谢白血病研究室岑建农，陈燕老师在实验中给予我无私帮助，感谢沈宏杰老师等给予的热情帮助。感谢血栓室朱明清老师、沈文红老师、戴兰老师在流式细胞分析资料查阅的大力支持和帮助。感谢骨髓形态室刘丹丹老师、粱建英老师等在细胞形态学上的悉心指导。感谢门诊刘虹老师在收集标本上给予的大力支持和帮助。感谢血液科金正明、韩悦、何雪峰、吴小津、吴倩、张剑、颜灵芝、徐婷、金松，石森森等老师在临床工作上的悉心指导和帮助。感谢王谦、姚红、文丽君、平娜娜、尹佳、谢君丹、岳延华、马晓霖等各位师兄师姐给我的诸多支持和帮助；感谢蔡文治、季诗梦、郑佳佳、植立亭等同窗好友给予的支持和帮助。感谢我的同门郦梦云同学，跟你在一起的三年时光让我终生难忘。最后谨以此文献给我的父母，你们在背后默默给予的支持与帮助是我求学道路上最大的动力！58 ■、就Ｎ大学Ｈ硕壬学位论文ｍ（学术学位）Ｉ■ＩＩＩＩ苏州大学研究生院统－印制ＨＩ