《几种植物源活性物质的抑菌、抗病毒效果及其机理研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
单位代码106351学号1120143270018281硕士学位论文几种植物源活性物质的抑菌、抗病毒效果及其机理研究论文作者：张旺张旺指导教师：孙现超研究员孙现超学科专业：植物病理学研究方向：分子植物病理学提交论文日期：2017年5月22日论文答辩日期：2017年5月27日学位授予单位：西南大学中国重庆2017年5月 SouthwestUniversityM.Sc.DissertationStudyonAntifungalandAntiviralEffectsandMechanismofSeveralPlant-derivedActiveSubstancesCandidate:WangZhangWangZhangSupervisor:XianchaoSunSunXianchaoSpeciality:PhytopathologyResearchField:MolecularPathologySouthwestUniversity,Chongqing,ChinaMay,2017 独创性声明学位论文题目：几种植物源活性物质的抑菌、抗病毒效果及其机理研究本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁在文中作了明确说明并表示衷心感谢。学位论文作者：签字日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院（筹）可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：□不保密，□保密期限至年月止）。学位论文作者签名：导师签名：签字日期：年月日签字日期：年月日 目录目录摘要.........................................................................................................................................IABSTRACT............................................................................................................................III第1章文献综述......................................................................................................................11.1植物病毒病与抗病毒物质的筛选...............................................................................11.1.1植物病毒病.........................................................................................................11.1.2植物病毒病的防治现状.....................................................................................11.1.3抗病毒物质的筛选方法.....................................................................................21.2植物源抗病毒物质.......................................................................................................31.2.1植物源抗病毒物质研究进展.............................................................................31.2.2植物源抗病毒物质的作用机理.........................................................................41.3烟草赤星病与植物源抑菌物质...................................................................................61.3.1烟草赤星病及其危害特点.................................................................................61.3.2赤星病防治现状.................................................................................................61.3.3植物源抑菌物质研究现状.................................................................................71.4本文的研究目标...........................................................................................................71.4.1探索和建立抗病毒物质的快速筛选评价体系.................................................71.4.2植物源抗病毒物质的筛选及其作用机制初步探究.........................................71.4.3抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制初步探究.............................8第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系......................................................92.1材料和方法..................................................................................................................92.1.1.供试药剂.............................................................................................................92.1.2植物材料.............................................................................................................92.1.3供试毒源.............................................................................................................92.1.4含TMV-GFP侵染性克隆的农杆菌菌液制备................................................102.1.5粗提TMV-GFP病毒粒子的制备....................................................................102.1.6五点注药接种处理...........................................................................................102.1.7注药摩擦接种处理...........................................................................................112.1.8ELISA法测定烟草叶片病毒含量...................................................................112.1.9田间药效试验...................................................................................................122.2结果与分析.................................................................................................................132.2.1五点注药接种试验...........................................................................................13i 西南大学硕士学位论文2.2.2注药摩擦接种试验...........................................................................................152.2.3酶联免疫法（ELISA）测病毒含量................................................................172.2.4田间药效试验...................................................................................................172.3小结与讨论.................................................................................................................19第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究............................................213.1材料和方法.................................................................................................................213.1.1植物材料...........................................................................................................213.1.2供试毒源...........................................................................................................213.1.3供试物质...........................................................................................................213.1.4病程相关蛋白引物设计...................................................................................223.1.5病毒粒体的电镜观察.......................................................................................223.1.6粗提病毒与试剂混合后摩擦接种...................................................................233.1.7ELISA法测定烟草叶片中病毒含量...............................................................233.1.8处理方法与酶活性测定...................................................................................233.1.9烟草叶片丙二醛含量测定...............................................................................253.1.10烟草叶片超氧阴离子自由基产生速率的测定（羟胺氧化法）.................253.1.11烟草叶片过氧化物测定（DAB、NBT）.....................................................263.1.12防卫反应相关基因.........................................................................................273.1.13植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）.....................................................273.2结果与分析.................................................................................................................283.2.1几种植物源物质的抗病毒效果与初步筛选...................................................283.2.2抗病毒活性物质复筛.......................................................................................303.2.3植物源活性物质的保护作用机理...................................................................313.2.4植物源活性物质对TMV的体外作用............................................................363.3小结与讨论.................................................................................................................38第4章抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制探究............................................414.1材料与方法.................................................................................................................414.1.1供试菌株...........................................................................................................414.1.2供试植物源物质...............................................................................................414.1.3培养基...............................................................................................................414.1.4几种植物源活性物质对赤星病菌的活性测定...............................................414.1.5丁香油对赤星病菌菌丝生长速率的影响.......................................................424.1.6丁香油对赤星病菌孢子萌发的影响...............................................................424.1.7丁香油对赤星病菌菌丝生长量的影响...........................................................42ii 目录4.1.8丁香油对赤星病菌细胞膜通透性的影响.......................................................424.1.9丁香油对赤星病菌菌丝膜脂质过氧化的影响...............................................434.1.10丁香油对赤星病菌可溶性蛋白含量的影响.................................................434.2结果与分析.................................................................................................................434.2.1对赤星病菌有抑菌作用的植物源活性物质筛选...........................................434.2.2丁香油对赤星病菌孢子萌发的影响...............................................................454.2.3丁香油对赤星病菌菌丝生长速率的影响.......................................................454.2.4丁香油对赤星病菌菌丝生长量的影响...........................................................474.2.5丁香油对赤星病菌细胞膜通透性的影响.......................................................474.2.6丁香油对赤星病菌菌丝脂质过氧化的影响...................................................484.2.7丁香油对赤星病菌可溶性蛋白含量的影响...................................................494.3小结与讨论.................................................................................................................49第5章结论与展望................................................................................................................515.1结论.............................................................................................................................515.1.1探索和建立了抗TMV物质的快速筛选评价体系........................................515.1.2筛选获得2种植物源抗TMV物质并初步明确了其作用机制....................515.1.3明确丁香油可以抑制赤星病菌并初步分析了其抑菌机制...........................515.2展望.............................................................................................................................51参考文献..................................................................................................................................53致谢..........................................................................................................................................61在学期间已发表和已录用论文及参加课题..........................................................................63iii 摘要几种植物源活性物质的抑菌、抗病毒效果及其机理研究研究生：张旺张旺指导教师：孙现超孙现超摘要寻找植物源活性物质是天然产物农药研发的重要途径。本文一方面对常用的抗病毒物质筛选以及评价方法进行优化和探索，另一方面结合相关研究成果和报道，广泛搜集可能具有抗病毒或抑菌活性的植物源物质，研究其对烟草赤星病菌[Alternariaalternata(Freis)Keissler]和烟草花叶病毒(Tobaccomosaicvirus，TMV)的抑制效果，并初步探讨其作用方式和机制。得到的主要研究结果如下：1.以本氏烟和几种常用的植物病毒抑制剂为实验材料，分别将药剂注射于烟叶的五个点和整片烟叶，利用农杆菌介导法接种TMV-GFP，2d后在紫外灯下观察并统计不同处理后的荧光斑面积与斑点数量。结果显示，各处理组荧光强度均低于对照组，荧光斑的统计情况与ELISA检测结果相近，表明荧光强弱情况能够大致反映叶片内病毒含量。并且本体系对几种病毒抑制剂的室内评价结果与田间药效结果基本一致，说明本文建立的2种筛选方式可以用于抗病毒物质的活性评价和筛选。与筛选抗病毒物质常用的枯斑法和叶碟法相比，该体系不仅能够快速评价抗病毒物质的活性还能直观的反映药剂在病毒扩散和复制过程中的作用特点，具有操作简单，现象直观，周期短的优点。2.以烟草花叶病毒为靶标，对收集到的15种植物源物质进行抗病毒活性测定，经过初筛、复筛并结合防御酶活性情况，筛选出熊果酸与4-甲氧基香豆素2种能够降低病毒初侵染含量的活性物质。研究其作用方式与机制，结果显示，熊果酸与4-甲氧基香豆素能够不同程度提高烟草中SOD、PPO、POD、CAT这几种防御酶活性，降低烟叶中过氧化物含量；在病毒侵染前期可以降低植物细胞的膜脂过氧化程度，减轻细胞膜受损；并且能够上调PR1、NPR1和PR2等防卫反应相关基因表达量，促进病程相关蛋白的合成，从而降低病毒初侵染含量，具有保护和延缓病程的作用。体外作用研究发现，2种活性物质与TMV混合1h后，病毒粒体发生了明显的聚集现象，而溶剂处理后的病毒分散均匀无聚集，其中熊果酸处理后的聚集程度较4-甲氧基香豆素更为明显。将处理后的病毒摩擦接种至本氏烟，荧光的斑点数量和病毒含量都有所降低，说明2种物质能在I 西南大学硕士学位论文体外直接作用病毒粒体，降低病毒的侵染活性或体内复制水平，对病毒具有一定钝化作用。3.利用平板抑菌法，以烟草赤星病菌为靶标，测定15种植物源物质的抑菌活性，发现丁香油与丁香油酚具有较好的抑菌作用。丁香油含量为4.13%时能够强效抑制赤星病菌孢子的萌发，丁香油含量为0.52%时显著降低菌丝的生长速度，减少菌丝的生长量。进一步研究作用机理发现，丁香油的作用位点之一是细胞膜，其能破坏赤星病菌的细胞膜结构，增加质膜通透性，使细胞内含物外渗，并提高膜脂过氧化程度，增加丙二醛含量，导致菌丝细胞死亡，抑制病原菌的生长和繁殖。关键词：植物源活性物质；烟草花叶病毒；烟草赤星病菌；抗病毒作用；抑菌作用II AbstractStudyonAntifungalandAntiviralEffectsandMechanismofSeveralPlant-derivedActiveSubstancesCandidate:WangZhangWangZhangSupervisor:XianchaoSunXianchaoABSTRACTPlant-derivedactivesubstancesaremajorpartinnaturalpesticidesdevelopment.Inthisstudy,themethodsofscreeningantiviralsubstancesareexploredandoptimized,andthesuppressioneffectsofpreviouslyreportedplant-derivedsubstances,whichmayhaveantiviralorantifungalactivity,onAlternariaalternataandTobaccomosaicvirus(TMV)areinvestigated.Themainfindingsareasfollows:1.UsingNicotianabenthamiana(N.benthamiana)andseveralantiviralagentsasexperimentalmaterials,theagentswereinjectedintofivepointsofthetobaccoleaforthewholeleaf.TheTMV-GFPwastheninoculated.Theareaofthefluorescentspotandthespotsnumberofdifferentagentstreated-leaveswereobservedunderUVlampsattwodayspostinoculation(dpi).Theresultsshowedthatthefluorescenceintensityofeachtreatmentwaslowerthanthatofthecontrol.ThestatisticalresultsofthefluorescentspotweresimilartothoseoftheELISA,whichindicatedthatthefluorescenceintensitycouldreflectthevirusaccumulationlevelinleaves.Andtheevaluationsystemforseveralantiviralagentsindoorswasnearlythesamewiththatinthefields,indicatingthatthetwoscreeningmethodsestablishedinthisstudyisavailablefortheevaluationandscreeningofantiviralagents.Comparedwithlocallesionandleafdiscmethod,thesystemcannotonlyquicklyevaluatetheactivityofantiviralagents,butalsocanintuitivelyreflecttheroleofagentsintheprocessofvirusdiffusionandreplication.Ithastheadvantagesofsimpleoperation,intuitivephenomenonandshortcycle.2.TMVwasusedasthetargetfortheantiviralactivityassayof15kindsofplantmaterial.Afterscreeningcombinedwithdefense-relatedenzymeactivityassay,twokindsofIII 西南大学硕士学位论文activeagents(ursolicacidand4-methoxycoumarin),whichcouldreducetheinitialinfectionconcentrationofvirus,wereobtained.Theresultsshowedthatursolicacidand4-methoxycoumarincouldincreasetheactivityofSOD,PPO,PODandCATandreducedthecontentofperoxideinN.benthamianaleavestosomeextend;Intheearlystageofvirusinfection,ursolicacidand4–methoxycoumarincouldreducethedegreeofmembranelipidperoxidationofplantcellsandcellmembranedamage,andimprovethePR1,NPR1andPR2andotherdefenseresponse-relatedgeneexpression,promotedisease-relatedproteinsynthesis,therebyreducingtheinitialinfectioncontentofvirus,withtheroleofprotectionanddelayeddiseasedevelopment.Invitrostudiesshowedthat1hafterthetwoactivesubstancesmixedwithTMV,thevirusparticlesoccurredtobeaggregatedwithsolvent-treatedvirusdispersed,Theaccumulationofursolicacidtreatedvirusparticleswasmoreobviousthanthatof4-methoxycoumarin.Afterthetreatmentofthetwosubstances,thevirussapwasfrictionallyinoculatedtoN.benthamiana,thenumberandintensityoffluorescentspotswasdecreased,indicatingthatthetwosubstancesinvitrodirectlyaffectedthevirusparticlesandreducedthevirusinfectionactivityorinvivoreplicationlevel.Theseresultsmeanthatthevirusmaybepassivatedbyursolicacidand4-methoxycoumarin.3.Theantifungalactivitiesof15plant-derivedsubstancesweredeterminedbyplateantifungalmethod.ItwasfoundthatcloveoilandeugenolhadgoodantifungaleffectonAlternariaalternata.ThegerminationofsporesofAlternariaalternatacouldbeinhibitedwith4.13%cloveoil,andthegrowthofmyceliumwassignificantlyreducedwith0.52%cloveoil.FurtherstudieshavefoundthatcloveoilcoulddestroythecellstructureofAlternariaalternata,increaseplasmamembranepermeability,leadthecellinclusionsexosmosis,andincreasethedegreeofmembranelipidperoxidationandthecontentofmalonaldehyde,finallyresultinmycelialcelldeathandinhibitionofpathogengrowthandreproduction.Keywords:Plant-derivedactivesubstances;Tobaccomosaicvirus;Alternariaalternata;antiviraleffect;antifungaleffectIV 第1章文献综述第1章文献综述1.1植物病毒病与抗病毒物质的筛选1.1.1植物病毒病植物病毒是农作物的重要病原物，引起的病毒病对农业生产具有严重危害。由于植物病毒存在于寄主植物的细胞中，并且依赖寄主提供自身复制的物质和环境，而植物缺[1]乏完整的免疫系统，因此使得植物病毒害的发生非常普遍。植物感病后，受侵染植物细胞的代谢活动发生一系列变化，通常表现为花叶、坏死、矮化及畸形等症状，严重影[2-4]响作物的产量和品质，造成巨大的经济损失。目前已经发现900多种病毒能够侵染植物，产生危害，其中烟草花叶病毒（Tobacco[4]mosaicvirus，TMV）是世界十大植物病毒之一。其寄主范围广泛，可侵染豆科、茄科、葫芦科等30余科的260多种作物。TMV侵染植物后，将其核酸结合在植物细胞核糖体，与寄主的代谢融为一体，借助寄主产生病毒复制所需物质，破坏植物相关组织和细胞，改变植物体内的代谢平衡和相关酶的活性。烟草花叶病毒病是我国常见的烟草病害之[5]一，在我国各省的烟草产区中均有发生，严重影响烟叶的产量和烤烟的品质，给烟草[6]生产带来巨大损失。据报道，全世界每年因烟草花叶病毒病造成的损失就超1亿美元。此外，TMV也是目前为止研究最为深入的模式病毒，它可通过汁液传播，体外活性稳定，易于保存，往往作为筛选病毒抑制物的重要靶标。1.1.2植物病毒病的防治现状植物病毒病害的发生具有爆发性、间歇性以及迁移性的特点，一旦发病便难以控制。所以加强带毒苗木的检验检疫，控制病毒和带毒介体的传播和扩散是十分重要的。其次，[7]通过改变作物布局、适期播种、使用无毒繁殖材料、加强水肥、使用病毒抑制剂等措施也能减少植物病毒病的发生和传播。随着分子生物技术和基因工程的发展，开辟了许[8]多病毒病防治的新途径，比如抗病育种、弱病毒疫苗、卫星RNA及生态学的防治方法[8-10]等。但是这些方法也存在一定问题，一方面抗病育种的难度较大，周期较长，投入较大；另一方面植物在田间常常受到多种病毒的侵染，病毒株系的突变率高，难以有效长期控制；此外还可能因病毒弱毒株系或卫星RNA生物制剂与病毒混合侵染而加重病害[11]造成更大的损失。药剂防治能够有效切断传播介体或者提高植物抗病能力，使病害的发生和传播降低，延缓病程。在现代农业中，使用病毒抑制剂或杀虫剂等化学防治措施在植物病毒病的综合治理中，仍然是常用的防治手段，占有十分重要的地位。植物病毒病的化学防治其实早就被究人员所关注，1961年Quak证明某些化学物质不仅能延缓或促进嫁接叶片的病毒侵染，还能影响病毒在植物体内的复制情况，开创了化学药剂防治的[10]里程碑。1 西南大学硕士学位论文1.1.3抗病毒物质的筛选方法寻找高活性的抗病毒物质或先导化合物一直是病毒抑制剂开发的难点。目前，室内筛选和评价抗病毒物质活性的方法主要有枯斑分析法、漂浮叶碟法、原生质体法、悬浮细胞法及血清学法等。其中枯斑分析法与漂浮叶碟法是比较常用的室内筛选方法。1.1.3.4枯斑分析法对于有鉴别寄主的病毒，常采用枯斑分析法来定量或定性评价抗病毒物质的抑制能力，此种方法能够反应植物病毒的扩散情况，并以枯斑指示病毒所处的位置，简单、直观、快速。但这种方法有一定的局限性，一方面其接种对象只能是枯斑寄主，对于同一种寄主，不同的病毒株系可能会有不同的反应现象和效果，所以该方法适用范围有限。[12,13]同时其试验周期相对较长，需要大量的时间培养烟苗和收集数据。另一方面在操作过程中要严格控制温度、光照、株龄、生长势、接种叶片部位等因素的统一性，否则容易产生较大的误差，导致重复性降低。此外，针对同种病毒来说，枯斑寄主的防卫反应机理与其他品种寄主有所区别。例如，心叶烟对TMV防卫反应体系与本氏烟不同，据报道心叶烟中的N基因可以识别TMV侵入寄主细胞后产生的复制酶126-kDa蛋白，启动下游防卫反应。通过系统获得性抗性（SAR）途径，诱导植株产生整体的抗病性，这种途径主要是基于水杨酸（SA）、PR1和NPR1进行调节的。另一方面也可以启动过敏反应（HR）途径，诱导受侵染寄主细胞产生细胞程序性死亡（PCD），并且在侵染位点周围产生大量的病程相关蛋白（PRs）。而对于缺少N基因的本氏烟来说，不能识别TMV侵染植物所产生的复制酶，只能在受到侵染后启动SAR途径，且SAR的强度[14]明显低于心叶烟，很难诱导PRs的产生。所以，心叶烟和本氏烟这种防卫反应上的差异也会导致其对抗病诱导类药剂反应的差别，使药剂对心叶烟的作用效果更加显著。并且心叶烟作为TMV枯斑寄主，其经济价值不高，培养周期较长，与实际生产使用烟草品种的差异大，难以进行持续性的生理生化等动态指标的监测，不能获得丰富全面的数据。1.1.3.5漂浮叶碟法漂浮叶碟法是进行作用模式基础研究和测定病毒复制周期中抑制时期的一种方便高效的方法，能够有效反映抗病毒病物质与病毒复制之间的关系，评价不同抗病毒物质[15]对病毒复制的抑制效果。1.1.3.6原生质体法在原生质体、悬浮细胞、愈伤组织中，化学物质能够比较容易的进入其体内，与植物病毒的复制有较高的同步性，因此以原生质体、化学物质、病毒为体系，研究几者之间的相互关系，在病毒学的研究中发挥了很大作用。但是此方法也存在一定局限性，因为脱去细胞壁的原生质体处于应激状态，存活率较低，与实际生产情况相差较大，不便于抗病毒物质的筛选评价。2 第1章文献综述1.1.3.7其它方法棉线法、水培法以及血清学方法也常用于评价抗病毒物质对病毒复制的作用以及测[16]定病毒含量。其中电镜法常用于观察抑制物对病毒粒体形态的影响，以及病毒在植物[15]组织中的情况。病毒/细胞高效同步侵染体系，是在发现烟草叶片的叶绿素含量与[17]TMV侵时间存在一定关系后，提出的一种抗病毒物质活性评价方法。侯玉霞等人以此方法研究了3种植物源提取物抗TMV的活性以及对叶绿体的保护作用，并通过田间[18-20]试验与筛选验证了该体系的可行性。1997年李重九等建立了离体核酸核糖体反应[21]体系，通过病毒RNA与寄主mRNA竞争核糖体的系数来筛选抗病毒物质。1996年江山等发现，在TMV装配过程中，病毒的衣壳蛋白首先要发生一定程度的聚合，才能与病毒核酸进一步装配，形成完整的病毒粒体，因此通过比较对TMV外壳蛋白聚合程[22,23]度的影响也可以进行抗病毒病物质的筛选。各种方法和评价指标的侧重点不同，其评价结果也会有一定差异。目前在应用型试验中，通常采用与田间侵染相似的方法接种病毒，经灌根或者喷施叶片处理植物，通过发病率、病情指数或植物内病毒含量等指标[24-26]对药剂的防治效果进行评价。综上所述，抗病毒物质的活性评价指标可以是多方面的，并且随着研究的不断深入，筛选抗病毒物质的方法也不断丰富，但是许多方法在实际应用中还不够便捷，需要进一步探索和优化。1.2植物源抗病毒物质1.2.1植物源抗病毒物质研究进展伴随化学病毒抑制剂在生产和环境中安全问题的增多，天然抗病毒物质因其结构新颖、对环境友好、生物活性多样等特点，越来越受农药研发人员的重视。目前许多国内外学者已经从植物、动物、微生物和矿物质中寻找到具有抗病毒活性的天然产物。其中，自商陆中含有能够有效抑制TMV活性的物质被发现以来，人们逐渐将注意力集中于从植物中寻找天然抗病毒活性物质。杜春梅等研究发现有591种植物提取物对真菌或细菌[27]具有一定拮抗作用，173种植物提取物具有抗病毒活性。我国地大物博，植物资源丰富，为植物源农药的开发提供了良好的资源库。目前植物源抗病毒物质可以分为大分子物质与小分子物质，大分子物质主要有蛋白类、多糖类，小分子物质主要有生物碱、甾体、萘醛、脂肪酸等。现已报道香菇多糖、多糖肽、α-MMC等许多植物源物质具有抗[28]病毒作用，可以诱导寄主植物产生对TMV的系统获得性抗性。研究人员发现，PopW在温室中对烟草花叶病毒病的防效达80.9%至97.4%，大田防效达45.2%，并且可以提[29]高了烟草产量和烟叶质量；α-MMC预处理烟草后能抑制病毒RNA和蛋白的积累，[30]并且诱导防卫反应基因表达，提高相关酶活性，产生抗病毒作用；多糖肽可在体外直接破坏病毒粒体使之聚结，促使叶片产生氧化迸发现象，上调PR-1a、PR-5的基因水平，提高苯丙氨酸解氨酶（PAL）和过氧化物酶（POD）活性，诱导相关防卫反应，兼具保3 西南大学硕士学位论文[30]护、治疗、钝化作用，并且低毒、易分解、便于获取极具农药开发价值；金钟柏提取物对西瓜花叶病毒（WMV）侵染有不同程度的抑制作用，不论对健康植物还是已经侵[32]染的组织都可以减少WMV的外壳蛋白基因表达量。近年来国内科研人员也相继研发出多种植物源病毒抑制剂，例如WCT-Ⅱ，不仅对TMV粒体具有体外钝化作用，而[33]且能够诱导植物产生病程相关蛋白，提高烟草抵抗TMV侵染的能力；VFB是西北农林科技大学研制的一种植物源病毒抑制剂，其可以使普通烟内的叶绿素a、叶绿素b、[34]类胡萝卜素、总酚及类黄酮等物质含量升高，提高PAL的活性，具有良好的保护作用；山东农业大学研发出的“植毒灵”能够降低寄主体内TMV含量以及烟草叶绿体的受损程度；商陆、甘草、连翘等几种中草药植物复配的MH11-4可湿性粉剂，对TMV与CMV[35]粒体也有强烈的体外钝化作用，并抑制病毒增殖，诱导寄主产生抗病性。1.2.2植物源抗病毒物质的作用机理1.2.2.1直接作用于病毒病毒侵染寄主大致分为侵入、脱壳、复制、装配、释放等过程，只要抗病毒物质能够作用到其中某些环节就可以达到抑制病毒的作用。大多数抗病毒活性物质是直接作用于病毒粒体，在植物体外使病毒外壳蛋白变性，或与病毒形成复合体而使病毒的侵染活性降低或丧失。现已报道许多植物源活性物质能够直接作用病毒，如多糖肽（PSP）与TMV混合后可在电镜下观察到病毒粒体凝聚，这种现象可能与病毒外壳蛋白的某些结构改变有关；大蒜精油与TMV混合2h后于电镜下观察发现，大蒜精油处理后的病毒粒体发生了断裂现象，大蒜精油可能破坏了病毒衣壳蛋白亚基之间的作用力，使病毒衣[35]壳蛋白结构松散，导致病毒粒体发生断裂；此外，从某些植物中提取的黄酮类与生物[37,38]碱类化合物也能通过占据TMV染位点或钝化病毒而降低病毒侵染活性。1.2.2.2作用病毒侵染接受位点目前另一种说法认为某些抗病毒物质能够影响寄主细胞对病毒的敏感性，降低吸附病毒粒子能力，致使病毒不能成功侵染。研究显示，鸡冠花的叶提取物与TMV等病毒粒体混合后接种心叶烟，其产生的枯斑数量会明显减少，主要作用机理可能是因为其降低了寄主接受位点的吸附能力，或者占据了植物中病毒的接受位点，而使病毒侵染受阻[39,40]。1.2.2.3抑制病毒增殖和扩散核糖体失活蛋白（RIPs）是一类能抑制蛋白质合成的毒蛋白，RIPs通过N-核酸酶移除rRNA中一段特殊序列的腺嘌呤残基，从而防止延长因子1和2捆绑在rRNA上，达到抑制蛋白合成的作用。如商陆中提取的蛋白PAP，可以抑制TMV病毒衣壳蛋白合[41]成，从而影响病毒粒子的装配，达到抑制病毒复制的作用。这种机制对于大多数机械传播的病毒有效，植物抗病毒剂NS-83、VFB、WCT-II、大蒜挥发油等也是通过对TMV4 第1章文献综述[36,42-44]外壳蛋白的聚合过程产生干扰从而抑制病毒增殖。除大分子物质以外，很多植物[45,46]源小分子物质也是通过抑制病毒的增殖而发挥抗病毒作用的。例如紫草中提取的PZl是通过抑制病毒核酸与植物核糖体的结合并控制病毒蛋白质的合成来抑制病毒增殖[47]从而阻止TMV继续入侵。1.2.2.4诱导寄主对病毒产生抗性诱导植物获得系统抗性（SAR）首先是植物感受到诱导物的存在，随后抗病信号通过内源信号分子传导至整株植物，激活植物潜在的抗病基因，使植物发生一系列例如细胞壁强化、酶活性变化、积累特征性次生代谢产物等生物学和细胞学的变化，从而激活植物自身的抗病机制，抑制病原入侵。水杨酸（SA）是SAR的必须物质，但并非诱导SAR的唯一条件，其他的一些信号也能诱导SAR的产生，SA与过氧化氢酶（CAT）结合后，CAT的活性降低，导致过氧化氢（H202）的含量增加，引起一系列的基因和蛋白的表达，产生防御反应。目前研究较多的植物内源信号分子是水杨酸（SA）、茉莉酸[48]（JA）和乙烯（Et）等。1.2.2.5诱导寄主体内酶的变法植物在受到病原物侵染后，体内的超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢含量会发生不同程度的升高，而高浓度的活性氧（ROS）对寄主植物是有害的，所以需要通过植物体内的相关酶进行调控。超氧化物岐化酶（SOD）能够催化超氧阴离子歧化为O2和H2O2，降低因超氧阴离子导致不饱和脂肪酸过氧化而给寄主植物带来的伤害。POD能够提高植物抗病性，并且和多酚氧化酶（PPO）一起促进醌类和木质素的形成，产生细胞壁保卫反应，抑制病原物的侵入和扩展。此外POD还可以抑制致病相关酶的活性，[49]减少植物细胞壁降解酶的合成，从而抑制病原物的侵染。1.2.2.6诱导植物抗毒素（植保素）的产生与病程相关蛋白（PR）类似，只有在病原物侵染或者特定条件的胁迫后植保素（PA）才能大量产生，而在健康的植物体中PA的含量很低。PA一般在寄主受侵染的位置附近产生和积累，其抗病的作用通常是广谱性的，无专一性，菜豆素和豌豆素都是重要的植[50]保素。1.2.2.7病程相关蛋白（PR）与抗病毒因子（AVF）健康植物中的病程相关蛋白（PR）含量极低或不存在，只有在受到病原侵染或者一定逆境胁迫的情况下才能大量产生或积累。PR大都具有蛋白水解酶的特性，有些还具有几丁质酶和葡聚糖酶的活性，具有抗病毒潜在作用，特别是从PR中发现病毒复制抑制因子（IVF）后，更加说明PR与诱导植物抗性存在一定关系，但是目前的一些研究认为病程相关蛋白只有在多种共存时才能使诱导植物的抗病性表现明显。抗病毒因子（AVF）是一类具有抗病毒能力的含磷蛋白，能够提高PAL活性，将游离苯丙氨酸转化成香豆素、植保素、木质素、单宁等物质，主要在抗病毒后期起作用。5 西南大学硕士学位论文1.2.2.8隔离作用大多数植物病毒的传播都与自然或人为造成的植物破损有关，所以如果能在植物表面形成一层微膜就能在一定程度上减少叶片伤口的产生，从而降低病毒通过这些伤口侵入植物的可能性，植物病毒抑制剂WCT-II就兼具这种隔离作用。1.2.2.9生长促进作用长期的生产实践经验表明，提高植物的营养条件使植物生长强壮，可以在一定范围内提高病害抵抗能力。病毒侵染植物后，往往可以通过追施肥料或植物激素等物质来提高植物的耐受能力。这种措施通常没有降低植物中病毒的含量，只是延缓植物的发病程度，减轻发病症状从而达到增产的目的，例如施加赤霉素、植物激动素、乙烯利等物质。此外，矿质元素在植物生长的调节中同样扮演重要角色，甚至诱导植物的抗病能力。周冀衡等研究显示钾元素的含量能够提高烟草叶片细胞膜的稳定性，降低病毒对植物细胞膜的伤害，提高植物防卫反应的相关酶的活性，如SOD、POD、CAT、PPO，从而激活[51]一系列防卫反应的发生，抑制TMV的侵染程度。1.3烟草赤星病与植物源抑菌物质1.3.1烟草赤星病及其危害特点烟草赤星病[Alternariaalternata(Freis)Keissler]是一种烟叶成熟后期的真菌病害，具有弱寄生的特点。该病具有潜育期短、流行速度快的特点，在湿度、温度适宜的条件下，短时间内即可造成大面积传播和发生。该病不仅会损伤烟叶降低产量，还会使烟叶[52]内的糖类、蛋白质等成份发生变化，降低烟叶品质和工业使用价值。1916年在我国北京首次报道烟草赤星病发生，1964年在山东烟区大面积流行，随后在我国各大烟草产区均有一定发生，其中以云南、贵州、湖北等省发生较为严重，目前已发展成我国烟[53]草生产上威胁最大的病害之一。1.3.2赤星病防治现状烟草赤星病的发生受寄主、病原和环境条件相互作用的影响，是典型的真菌流行性[54]病害，通常使用单一的防治措施不能有效控制病害的发生。目前主要的防治措施有，选用抗病品种，大田卫生管理，减少初侵染来源，适时早栽，合理施肥及时采收，避开病害高发期，并且根据具体病情适时进行药剂防治，以控制病害蔓延流行，达到减损增[55]收的目的。其中使用化学药剂防治烟草赤星病具有非常重要的作用，但由于烟草是叶用经济作物，不仅对烟叶的外观有特殊的要求，还要对其农药残留和化学成份进行检测，并且化学农药使用导致的环境污染与非靶标生物毒害等问题日益突出，这些原因极大限制了烟草赤星病综合治理中化学农药的大规模使用。而植物源农药能够较好的解决以上问题，被认为是新型、无残留、无公害的“绿色农药”。开发活性多样、无污染的植物源6 第1章文献综述活性物质或先导化合物，研发更加安全高效的烟草赤星病及其他真菌病害的抑菌药剂具[56]有现实意义，符合当今环保、持续、健康、发展的理念。1.3.3植物源抑菌物质研究现状据报道，许多植物提取物具有抑菌活性，并多集中在中草药植物中。现已发现藿香、黄连、丁香、山苍籽、甘草、乌梅、艾叶、肉桂、黄柏等植物具有不同程度的抑菌作用[57-59]。张焱珍等研究发现，华山姜和毗黎勒对赤星病菌的孢子萌发及菌丝生长具有抑制作用，团花树和金钮扣对孢子萌发有抑制活性。目前已经有部分植物源活性物质可用于[60]真菌病害防治，如大蒜素、细辛油、麻黄油、银秦等，现已研发出的植物源农用产品[61]如0.6％苦小檗碱杀菌水剂等。1.4本文的研究目标1.4.1探索和建立抗病毒物质的快速筛选评价体系[62]目前我国植物源农药的种类主要有杀虫剂、杀菌剂、除草剂及病毒抑制剂，但植物病毒抑制剂远没有杀虫剂、杀菌剂和除草剂的开发速度快，其中一个重要原因是目前还没有建立科学、完善、直观、快捷的抗病毒物质筛选评价体系，许多抗病毒物质的筛[63]选过程存在较大的盲目性和重复性。如何从成千上万的植物、微生物中筛选出高活性抗病毒物质就成了制约植物病毒抑制剂开发的关键问题。目前通常用生物学方法筛选抗病毒物质，但是筛选方法和评价体系还存在一定缺点，例如枯斑寄主法对环境要求严格，一般难以排除操作、温度的干扰；漂浮叶碟法只能反映药剂与病毒的直接作用，不能反映物质、病毒、寄主之间的综合关系，并且操作繁琐。综上所述，传统筛选方法的局限性，影响了植物源抗病毒物质的筛选速度和开发进程。因此，探讨和建立更加快速、简便、直观的抗病毒物质筛选评价体系十分必要。1.4.2植物源抗病毒物质的筛选及其作用机制初步探究如前所述，我国科研人员不断发现具有抗病毒活性的植物源物质，部分活性物质已经应用于农业生产中，并研制出许多植物病毒抑制剂的产品。但依旧存在一些需要解决和完善的问题，如许多活性物质的作用机理尚不完全清楚，病害三角关系不够明确；目前从植物中分离出来的大都是一些大分子物质，而小分子的活性物质则较少；许多抑制物还停留在粗提物阶段，缺乏对其中有效成分的追踪研究；病毒、寄主、抑制剂之间的互作关系有待进一步研究，具体的作用机理揭示的不够完善；绝大多数的植物源抗病毒物质仅停留在室内筛选层面，实际应用的防治效率较低；部分活性物质存在成本造价较[64-66]高，批量生产困难，环境稳定性较差等问题。因此有必要进一步扩大筛选范围，加大筛选力度，寻找更加高效稳定的植物源抗病毒物质，探究其全面的作用方式与机制，为其应用与病毒抑制剂的开发做理论研究。7 西南大学硕士学位论文1.4.3抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制初步探究烟草赤星病是烟叶生产上危害最严重的真菌病害之一，目前其病菌生物学特性，寄主抗病性，病害消长规律以及综合防治等方面已进行了较为深入的研究。而对抑制烟草赤星病的植物源物质的研究相对较少，一般多集中在放线菌等微生物的代谢粗产物方面，但其成份较为复杂，具体的活性物质难以分离，研究周期长，大多难以进行规模化生产。而植物源抑菌物质具有抑菌作用广谱，生物活性多样的特点，且容易从植物中提取和纯化，活性稳定，结构特异，使用安全，弥补了农用抗生素开发难度大的问题。因此从植物中筛选具有高度抑菌活性且成份单一的物质，对烟草赤星病以及其它真菌病害的防治具有现实意义，进一步研究其作用机制也将为天然产物农药的开发提供更多理论依据。据报道，柠檬苦素、黄连素、甘草素以及熊果酸等多种植物源物质对病毒、真菌等病原物均具有一定活性，但其研究范围多局限于医学、食品等领域。这些植物源物质对农业生产中的病原物是否存在抑制作用，是否能够应用于植物病害的防治，是否能够提高植物对病毒、真菌病害的抗病能力，及其作用机制都有待探讨和研究。本研究一方面结合分子生物技术对目前常用的病毒抑制物筛选方法进行优化和创新，尝试建立更加快速、有效、直观的抗病毒物质筛选与评价体系。另一方面结合相关研究和报道，广泛搜集可能具有抗病毒、抑菌活性的植物源物质，测定这些物质在抗TMV和烟草赤星病方面的作用，筛选出具有高度活性与开发潜力的植物源活性物质，探讨其作用方式和机制，为进一步研发抗病毒、抑菌制剂及其田间应用提供一定理论依据。8 第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系植物病毒对寄主细胞的绝对寄生性，使得植物一旦被病毒侵染就终生处在被病毒危害的状态，因此植物病毒病的防治较其他病害的防治更加困难，也给高选择性的植物病毒抑制剂的研究带来了很大的困难。目前从植物中获取具有高度抗病毒活性的化合物是病毒抑制剂研发的重要手段之一。室内筛选抗病毒物质主要为生物学方法，较常用的有枯斑寄主法与漂浮叶碟法，但是受到寄主的特殊性、抗病机制差异、药剂作用方式等原因的限制，2种方法在筛选和评价抗病毒物质时还不够便捷、高效。而大田试验测定药效的工作量大且费时费力，因此需要一种快速有效的筛选评价体系来辅助开发抗病毒物质。1986年Powell等人利用农杆菌首次将烟草花叶病毒的蛋白衣壳基因成功导入烟草，并获得抗烟草花叶病毒病转基因植株，从而建立了农杆菌介导法对植物病毒的研究方式[67]。后来有学者将含TMV-GFP的农杆菌导入植物中，在紫外灯光下可观察到绿色荧光，这一现象能够反映病毒的扩散与移动情况。本实验以此为基础，一方面提取稳定表达荧光的病毒并摩擦接种至处理后的本氏烟，通过荧光斑点的大小、数量以及亮度评价病毒在植物叶片内的含量和扩散情况。另一方面，围绕接毒位点注射不同药剂，通过比较荧光扩散的方向来判断药剂在植物体内对病毒复制的影响。将2种试验结果与ELISA检测和田间药效试验结果综合比较，初步验证了2种方法的可行性与可信度，从而建立起一种新的快速、简单、有效的植物病毒抑制剂筛选评价体系。2.1材料和方法2.1.1.供试药剂宁南霉素（8%水剂，普利特生物有限公司）；氨基寡糖（0.5%水剂，河北奥德植保药业有限公司）；毒氟磷（30%可湿性粉剂，广西田园生化股份有限公司）；东旺杀毒（24%水乳剂，北京市东旺农药厂）；嘧肽霉素（2%水剂，沈阳红旗林药有限公司）。2.1.2植物材料本氏烟（Nicotianabenthamiana）种子，由西南大学植物保护学院植物病理实验室提供，于光照培养室培养。田间试验地点为湖南郴州市桂阳县烟草基地，供试烟草品种为湘烟三号。2.1.3供试毒源烟草花叶病毒荧光标记载体TMV-GFP（pSPDK661）由清华大学刘玉乐教授实验室馈赠。9 西南大学硕士学位论文2.1.4含TMV-GFP侵染性克隆的农杆菌菌液制备（1）从-80℃冰箱中取出含TMV-GFP全长载体的农杆菌菌液10μL。（2）将10μL菌液加入10mL含有卡那霉素和链霉素YEP培养基中，225rpm，28℃，培养12h。（3）从20mL菌液中取2mL加入浓度为20μM的乙酰丁香酮（AS）10μL，加入到50mL含有卡那霉素和链霉素YEP培养基中225rpm，28℃，培养12h。（4）从50mL农杆菌菌液中取2mL加入到50mL离心管中，室温，5000rpm离心15min，弃上清液。（5）将沉淀用新配置的重悬液调节OD600值至1.0-1.2，室温静置3-4h。重悬液配方100mL体系：MgCl2（1M）1mLMES（0.5M）2mL加灭菌水至100mLAS（100mM）100μL2.1.5粗提TMV-GFP病毒粒子的制备（1）取接种发病的TMV病叶，加等量（W/V）磷酸缓冲液（0.2M，pH7，0,4℃）研磨至匀浆。（2）静置3-5分钟后，用尼龙纱过滤，滤液在60℃水浴锅中加热10min。（3）将滤液加入适当离心管中，于4℃，5000rpm离心5min，弃沉淀。（4）上清液置于新离心管中，依次加上清液体积4%的NaCl，4%的聚乙二醇（分子量6000），边加边搅拌，置于4℃条件下搅拌4h或过夜。（5）将搅拌后的上清液于4℃，5000rpm离心20min，弃上清液。（6）在沉淀中加入初汁液0.05-0.1（V/V）量的磷酸缓冲液（0.01M，pH7.0，4℃），悬浮1-3h。（7）将悬浮液于4℃，10000rpm离心10min，弃沉淀。上清液为病毒粒子粗提液。2.1.6五点注药接种处理将药剂按照表2-1进行稀释，选取长势相近健康的本氏烟，每株选取同一层次、同一叶位的一张叶片。于叶脉间呈环状均匀选取五个点，利用5mL注射器吸取药剂分别从5个点定量注射，使药剂连接成环而环中心无药剂即可，对照组用去离子水做相同处理。每组处理3株烟，重复3次。24h后，于药环中心注射制备好的含TMV-GFP的农杆菌液。72h后用紫外灯照射，连续5d观察荧光斑扩散情况并拍照（图2-1）。利用十字交叉法10 第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系测量病毒扩散直径，计算其抑制率。计算公式如下：对照平均荧光斑直径-处理平均荧光斑直径抑制率（%）=×100对照荧光斑直径表2-1供试药剂及浓度Table2-1Theselectedinhibitorsandconcentration供试药剂稀释浓度宁南霉素（8%水剂）2000氨基寡糖（0.5%水剂）2000毒氟磷（30%可湿性粉剂）3500东旺杀毒（24%水乳剂）5000嘧肽霉素（2%水剂）5000清水对照-磷酸缓冲液0.1M2.1.7注药摩擦接种处理将药剂按照表2-1进行稀释，选取长势相近健康的本氏烟，每株选取同一层次、同一叶位的一张叶片。在左右半片叶上各选取2点，用5mL注射器吸取药剂分别从各点注射，使药剂浸润右半片叶即可（约1mL），对照组用去离子水做相同处理。24h后，针对注射药剂的叶片，用毛笔摩擦法，于右半片叶上均匀喷洒600筛目金刚砂，用毛笔蘸取TMV病毒粗提取液，每片叶按相同方向刷动15次，左半片叶为毛笔蘸取去离子水做相同处理；72h后用紫外灯照射，观察荧光斑点数量并拍照。并统计荧光斑点数，计算抑制率。计算公式为：对照平均荧光斑点数-处理平均荧光斑点数抑制率（%）=×100对照荧光斑点数2.1.8ELISA法测定烟草叶片病毒含量（1）试剂的配置ELISA洗涤液（0.01mol/LPBST）：称取Na2HP04·12H2O2.9g，KH2PO40.2g，NaCl8g，KCl0.2g置于容量瓶，定容至1000mL，调pH至7.4，1000mL0.01mol/LPBS中加入0.5mLTween-20。包被液：精密称取碳酸钠约0.318g，碳酸氢钠约0.586g，加去离子水至200mL，o2-8C保存。11 西南大学硕士学位论文TMV单克隆抗体（一抗）1：1000封闭液稀释。封闭液：ELISA封闭液：0.01mol/LPBST中加入脱脂奶粉至终浓度5％。酶标抗体（二抗）：取0.5μLHRP标记的羊抗兔IgG，加4999.5μLPBS稀释后使用。底物溶液：将40mg邻苯二胺（OPD）和40µLH2O2加入100mL底物缓冲液，避光保存。底物缓冲液：称取Na2HPO456.77g，柠檬酸5.6g，定容至1000mL。终止液（约2mol/L硫酸）：取约40mL纯化水，缓慢向其中加入浓硫酸（≥98%）约5mL，并不断摇匀（或搅拌）；（2）取0.2g样品加入2mLCBS一起研磨，研磨液置离心管于5000rpm离心5min，取上层清液待用；（3）把上层清液注入酶标板，每孔100µL，重复2次，把酶标板用PE手套稍加密封，置于4℃包被过夜，将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原；（4）倒掉包被液，铺上厚报纸拍干酶标板，用PBST洗涤3min，PBST应浸没每孔静置，拍干酶标板，重复洗涤共三次，最后一次将酶标板彻底拍干，洗涤是除去未结合的抗原及杂质；（5）加入封闭液：每孔加入150µL，置于37℃，孵育0.5h用PBST洗涤液洗涤三次，每次3min，彻底拍干酶标板。用以封闭固相上的空余间隙，防止非特异抗体直接吸附到固相载体上，或者吸附到包被抗原的表面；（6）加入稀释的受检血清：每孔100µL，置于37℃，孵育2h后用PBST洗涤液洗涤三次，每次3min，彻底拍干酶标板。其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去；（7）加入酶标抗抗体：每孔加入100µL，置于37℃，孵育2h后用PBST洗涤液洗涤三次，每次3min，彻底拍干酶标板。与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量（8）添加底物反应显色，每孔100µL，37℃静置15-20min（避光反应）；（9）添加终止剂：待酶标板颜色变为黄色后，每孔加入50µL酶终止剂，由黄色变为黄棕色；（10）将酶标板置于酶标仪中检测各孔492nm的OD值，若OD=待测样品/阴性样品＞2.1，则存在该种病毒。2.1.9田间药效试验共设6个试验处理组，每个处理重复3次，随机区组试验。每处理共150株烟，每12 第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系一小区即50株烟。每个处理间设保护行。以清水做空白对照（CK）。表2-2烟草病毒病药药效试验施药方法Table2-2Themethodsuesedinefficacytestofpesticideontabaccovirusdisease药剂名称使用量使用方法2宁南霉素（8%水剂）50g/667m，兑水15kg移栽前一天喷施，20、30、40d各一次2氨基寡糖（0.5%水剂）60g/667m，兑水15kg移栽后20、30、40d各叶面喷施一次东旺杀毒（24%水乳剂）800倍稀释移栽前一天喷施，20、30、40d各一次2100mL/667m，兑水移栽后20、30、40d各叶面喷施一次嘧肽霉素（2%水剂）15kg清水常规操作（空白对照）每个处理组选取3个点，每点调查20株烟，一共调查5次病毒病的发病情况，同时调查对照区。计算病情指数和防治效果。病情分级标准：0级为全株无病；1级为心叶脉明或轻微花叶，或上部1/3叶片花叶但不变形，植株无明显矮化；2级为1/3至1/2叶片花叶，或少数叶片变形，或叶片主脉变黑，植株矮化为正常株高的2/3以上；3级为1/2至2/3叶片花叶，或变形或主侧脉坏死，或植株矮化为正常株高的1/2至2/3；4级为株叶片花叶，严重变形或坏死，病株矮化为正常株高的1/3～1/2。发病率：发病率（%）=（发病株/调查总株数）×100病情指数：病情指数={Σ（各级病株×该病级值）/（调查总株×最高病级值）}×100防治效果：防治效果（%）={（对照区病情指数-处理区病情指数）/对照区病情指数}×1002.2结果与分析2.2.1五点注药接种试验分别将不同药剂按照图2-1流程处理烟草，接种病毒2d后于紫外灯下观察荧光表达情况。图2-2（A-F）显示宁南霉素与氨基寡糖处理后病毒的荧光斑直径明显小于清水对照组，图2-2（G-I）显示接种后5d时2种药剂处理组心叶上的荧光斑亮度弱于清水对照组，说明2种药剂在病毒侵染前期对TMV的增殖有抑制作用，并且能延缓TMV的移动速度，减慢系统侵染进程。接种病毒5d时统计各组处理的荧光斑直径，见表2-3，结果显示几种毒抑制剂的荧光斑直径均小于清水对照组，说明几种药剂对TMV的移动扩散有一13 西南大学硕士学位论文定抑制作用。用SPSS分析各组处理的抑制效率，结果显示采用五点注药接种方法时，宁南霉素的抑制效果最佳，达到35.8%；氨基寡糖与嘧肽霉素的抑制效果次之，分别为25.5%和26.3%；毒氟磷、东旺杀毒的抑制效率最低，仅为16.2%与13.9%；统计结果还显示磷酸缓冲液处理后病毒的荧光直径大于清水对照组，说明其对病毒移动扩散有一定负抑制作用。药农剂杆菌菌液图2-1五点注药接种法流程图Fig.2-1Thechartwiththefive-pointinjectionofinhubitorinoculationmethodABCDEFGHI图2-2五点注药处理叶片后荧光斑扩散情况Fig.2-2Fluorescentspotspreadafterfiveinjectionsofviralinhibitors注：A、D：宁南霉素处理；B、E：氨基寡糖处理；C、F：清水对照；G、H、I：从左至右依次为5d时宁南霉素、氨基寡糖、清水对照系统侵染Note:A,D:Ningnanmycin;B,E:Aminooligosaccharide;C,F:CK;G,H,I:Fromlefttorightare5dningnanmycin,aminooligosaccharide,CKsysteminfection14 第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系表2-3病毒抑制剂抑制效果差异分析表Table2-3Analysisofinhibitioneffectofvirusinhibitors处理平均荧光斑直径平均抑制率差异显著性药剂名称cm%5%宁南霉素0.8835.8a氨基寡糖1.0225.5ab毒氟磷1.1516.2bc东旺杀毒1.1813.9c嘧肽霉素1.0126.3ab磷酸缓冲液1.65--清水对照1.37--2.2.2注药摩擦接种试验接种病毒2d后观察荧光斑点情况，如图2-3，宁南霉素与氨基寡糖处理烟草叶片后，病毒荧光斑点数较清水对照明显减少，说明其影响了病毒的初积累量。统计各株烟草的荧光斑点数，见表2-4，宁南霉素、氨基寡糖、毒氟磷、嘧肽霉素处理后的荧光斑点数量明显低于清水处理组；东旺杀毒处理组荧光斑点数量高于其它药剂处理组但依旧低于清水处理组，说明几种药剂处理后均能影响病毒的侵染。但几种药剂对病毒侵染的抑制率存在一定差异，其中宁南霉素的抑制效果最佳，平均抑制率达到了78.2%；嘧肽霉素、氨基寡糖、毒氟磷抑制效果次之，平均抑制率分别为67.6%、57.5%、55.3%；东旺杀毒的抑制率为27.9%，低于其它药剂组的抑制效率；磷酸缓冲液处理组荧光斑点数出现增多现象，并高于清水处理组，说明其存在一定负抑制效果。比较2种室内筛选方法对几种药剂抑制效果的评价发现，两者的实验结果具有较好的一致性，均显示抑制效果最好的药剂依次为宁南霉素、嘧肽霉素、氨基寡糖、毒氟磷、东旺杀毒。并且2种方法均显示磷酸缓冲液对病毒侵染移动具有一定负抑制作用，分析其原因可能由于缓冲液与植物细胞液环境相似，使植株内液体流动性增强，从而促进病毒的移动与扩散。15 西南大学硕士学位论文ABCDEFGHI图2-3注药摩擦接种荧光斑点情况Fig.2-3Thefluorescentspotsintheleavestreatedwiththeinjectionoftheinhibitors.注：A、D：宁南霉素处理；B、E：氨基寡糖处理；C、F：清水对照；G、H、I：从左至右依次为5d时宁南霉素、氨基寡糖、清水对照系统侵染Note:A,D:ningnanmycin;B,E:C,aminooligosaccharide;F:CK;G,H,I:Fromlefttorightareningnanmycin,aminooligosaccharide,thCKsysteminfection,respectively,onthe5day表2-4病毒抑制剂抑制效果差异分析表Table2-4Analysisoftheinhibitioneffectofvirusinhibitors平均抑制率差异显著性药剂名称处理平均荧光斑点数%5%宁南霉素3978.2a氨基寡糖7657.5b毒氟磷8055.3b东旺杀毒12927.9c嘧肽霉素5867.6ab磷酸缓冲液213--清水对照179--16 第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系2.2.3酶联免疫法（ELISA）测病毒含量为验证2种处理方法的准确性，分别用ELISA法检测接种6d后烟草叶片中病毒的含量。结果见图2-4，氨基寡糖、宁南霉素、毒氟磷、东旺杀毒处理的叶片病毒含量低于清水处理，其中氨基寡糖的效果最佳，其次为毒氟磷、宁南霉素、东旺杀毒；嘧肽霉素处理组的病毒含量与对照组无统计学差异，可能与药剂的作用方式和植物吸收程度有关；磷酸缓冲液处理组的病毒含量高于清水对照组，对病毒的扩散增殖有促进作用。对比ELISA与本文筛选评价体系的实验结果，3种方法均显示磷酸缓冲液促进病毒移动，使病毒含量增加；除嘧肽霉素的实验结果与ELISA检测结果有一定偏差以外，其余处理组的评价结果与ELISA检测结果具有较好一致性，整体评价趋势相近，其中宁南霉素、氨基寡糖、毒氟磷3种药剂的评价结果一致性最高。图2-4ELISA检测药剂处理后烟草病毒含量Fig.2-4DeterminationoftobaccoviruscontentbyELISAmethod2.2.4田间药效试验2.2.4.1烟草花叶病毒病的发病情况调查各处理组中烟草花叶病毒病的发生情况，图2-5显示，几组药剂处理后的发病率均随时间呈上升趋势，随后逐渐趋于稳定；氨基寡糖、嘧肽霉素以及东旺杀毒处理组的发病率较低，并且明显低于清水处理组，说明这几种药剂能够降低病毒病的发生情况。由图2-6可知，所有处理组的病情指数随时间延长逐渐上升，并逐渐达到比较平稳的状态。其中东旺杀毒与氨基寡糖处理组的病情指数上升幅度较低且一直低于对照组，说明这两种病毒抑制剂对病情具有一定延缓作用；嘧肽霉素在前期的病情指数低于对照组，中后期逐渐趋于对照组数值，说明其对病情的控制在前期较好，在后期有所降低；宁南霉素的病情指数高于对照处理，但随时间的延长，发病率与病情指数都有一定降低的趋势，推测与作用时间以及调查时间有关。17 西南大学硕士学位论文图2-5发病率折线图Fig.2-5Linechartoftheincidencerate图2-6病情指数折线图Fig.2-6Linechartofthediseaseindex表2-5相对防效差异性分析表Table2-5Analysisoftherelativepreventioneffect相对防效平均值差异显著性处理病指平均值%5%宁南霉素10.9--氨基寡糖2.858.09a东旺杀毒2.665.58a嘧肽霉素5.223.45b清水对照6.3--18 第2章探索和建立抗TMV物质的快速筛选评价体系2.2.4.2烟草花叶病毒病的防治效果几种药剂对烟草花叶病毒病的防治效果见表2-5，东旺杀毒以及嘧肽霉素的病指平均数分别为2.8、2.6与5.2，明显低于清水对照组的病情指数，说明这3种病毒抑制剂降低了烟草病毒病的发病程度，其中东旺杀毒和氨基寡糖的抑制作用最明显；而宁南霉素处理组的病指平均数高于对照组，说明在本调查时间段内其对烟草发病率以及病情发展的抑制作用不明显。氨基寡糖、东旺杀毒和嘧肽霉素的相对防效分别为58.09%、65.58%和23.45%，说明这3种植物病毒抑制剂具有较好的防治效果，其中氨基寡糖和东旺杀毒的防治效果最佳，与嘧肽霉素的防效存在显著差异；宁南霉素的相对防效平均值为负值。综上所述，室内筛选得出的抑制效果较好的药剂为宁南霉素、氨基寡糖、东旺杀毒和嘧肽霉素，ELISA结果显示除嘧肽霉素有一定差异外，其余实验结果的趋势基本一致并与对照组结果差异显著。而大田试验中除了宁南霉素的实验结果与室内结果存在一定偏差外，其余药剂的试验结果基本一致，说明室内筛选病毒抑制剂的2种方法能够在一定范围内评价出药剂的抑制效果。2.3小结与讨论建立抗病毒物质快速筛选评价体系为抑制剂的研发提供了良好的方法基础。本试验在室内盆栽试验的条件下，建立起以五点注药接种与注药摩擦接种为基础的抗病毒物质筛选评价方法。用2种方法测定宁南霉素、氨基寡糖、毒氟磷、东旺杀毒以及嘧肽霉素这几种市面常用的植物病毒抑制剂的防治效果，结合ELISA检测与田间药效试验对该体系进行验证，结果显示该体系对5种药剂的评价结果与ELISA结果基本一致，大田药效实验结果与室内筛选评价结果也具有一定的一致性，说明本文建立的2种抗病毒物质筛选评价方法具有可行性，能够在一定范围内评价对病毒的抑制效果，是一种可以推广使用的评价筛选体系。可在大量筛选抗病毒物质的工作中发挥较大的作用，能够加快抑制物筛选速度，观察抑制作用特点，推动病毒抑制剂的研发。对实验结果的分析，有如下几点讨论：（1）田间药效实验中宁南霉素的防治效果较差，这与室内试验的结果有一定差距。因为室内测定时，环境条件是稳定的，变量较少，而进行田间实验时，其处于开放空间中，周围环境不可控，药剂的挥发、其它动植物的干扰、雨水的冲击等条件都会影响药剂的效果。并且不同烟草间的抗性不同，适用的防治措施也有差异。因此，在用该方法评价药剂抑制效果后，要根据当地气候条件及烟草品种来选择合适用药剂，并采取多种药剂交叉使用来弥补单一措施或者单一药剂带来的防效下降现象。（2）本试验在对抑制剂的治疗效果进行试验时，发现各种抑制剂的治疗效果甚微，一旦病毒开始扩散侵染，便无治愈可能。因此，筛选抗病毒物质时还是要以保护作用为主。19 西南大学硕士学位论文（3）本文初步建立的体系能够快速直观的在室内观察到药剂在病毒扩散过程中的抑制效果。传统的药剂评价系统使用枯斑半叶法，试验时长约需7-10d，并且寄主要求必须是枯斑寄主，而本试验只需3-5d即可观察局部到系统侵染的整个过程，且任何可侵染寄主均可作为实验材料。同时注药摩擦接种法避免了介导体农杆菌与病毒抑制剂的直接接触，排除了抑制剂对农杆菌有作用而抑制病毒扩散增殖的可能。（4）采用注射方法处理烟草时，药剂浓度约为喷施时使用浓度的1/5-1/2，因此在施用时，其最适浓度应加以实验再行应用。目前，除了对化学药剂的合成研究外，更多的是从植物源、微生物源、动物源以及矿物源中提取天然的抗植物病毒活性物质，并对这些提取物进行分离筛选。AechanaPrabahar等研究表明异丙肾上腺素、维生素B2、阿托品注射液、阿苯达唑及新霉素片等生物药剂对TMV也可能具有抑制作用，其具体抑制[68,69]效果和作用机制都需要进一步验证。20 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究从天然产物（植物、动物、微生物、矿质元素）中筛选具有抗病毒作用的活性物质对植物病毒抑制剂的开发具有巨大价值。目前从植物中获得抗病毒物质的研究和报道较多，植物源物质往往具有种类丰富、活性多样、对环境安全等特点，极具开发为天然产物农药的潜力。据统计，全世界通过植物获取的药物约占30%，其创造的工业产值约占药品总产值的50%。另一方面，随着社会大众对生态环境、低碳经济和食品安全等问题的重视程度提升，天然产物农药尤其是植物源农药将具有更广阔的应用前景。我国地缘辽阔，植物资源极其丰富，因此从中寻找具有抗病毒活性的化合物或先导化合物已成为[70,71]病毒抑制剂研发的热点。烟草花叶病毒病是烟草生产上最重要的病害之一，TMV也是研究最早、最为深入的病毒之一，可通过汁液和微伤口传播，因此TMV常作为抗病毒物质筛选的重要靶标之一。本研究收集多种在动物或人体研究中具有抗病毒活性的植物源物质作为筛选对象，以TMV做为筛选靶标，在本氏烟盆栽试验的基础上，初步筛选出具有较高抗TMV活性的物质，并依据前人研究成果和试验方法，探究其具体的作用方式和机制，以期为植物病毒抑制剂的开发提供理论研究依据。3.1材料和方法3.1.1植物材料本氏烟（Nicotianabenthamiana）种子，由西南大学植物保护学院植物病毒实验室提供，在温室育苗盆中播种，培养至4~6叶期备用。3.1.2供试毒源烟草花叶病毒荧光标记载体TMV-GFP（pSPDK661）由清华大学刘玉乐教授实验室馈赠。菌液活化参见第2章2.1.4。3.1.3供试物质表3-1待筛选物质Table3-1Thesubstancetobescreened编号物质名生物活性NumberNameActive抗肿瘤、抗菌消炎、抗高血脂、抗氧化、抗糖尿病、1熊果酸[72-75]抗病毒[76,77]2黄连素抗菌、抗炎、调节糖脂代谢、抗肿瘤21 西南大学硕士学位论文[78]3姜黄素抗氧化、抗肿瘤、抑菌[79]杀虫作用（竹桃蚜虫、吹绵蚧和菜蝽等）；抑菌作4柠檬苦素[80]用（小麦纹枯、小麦赤霉和玉米大斑等病原菌）57，8-2羟基-4苯基香豆素65，7-2羟基-4苯基香豆素[81-85]77-甲氧基香豆素抗病毒、生长调节作用、抗菌作用、抗血凝86-甲氧基香豆素94-羟基香豆素104-甲氧基香豆素[86-88]11茶多酚抑菌、抗肿瘤、抗氧化[89-91]12丁香油抗真菌、防腐、抗氧化[92]13丁香油酚影响昆虫信息素、抗真菌、抗氧化[93]14毒氟灵（阳性对照）抗病毒[94,95]15香菇多糖（阳性对照）抗癌、抗病毒、抗氧化16清水（阴性对照）17溶剂（阴性对照）[96-98]18甘草酸抗病毒、抗肿瘤[99-102]19鱼腥草提取物抗炎、抗肿瘤、抑菌3.1.4病程相关蛋白引物设计表3-2RT-qPCR引物序列检测基因的表达Table3-2PrimersequencesusedforRT-qPCR基因名上游引物下游引物GenenameForwardprimersequencesReverseprimersequencesactinCTTGAAACAGCAAAGACCAGCCATCCTATCAGCAATGCCCGNPR1TAGCGTATTGCGATGCAAAGTAGTGAGCCTCTTGGCGATTPR1ATGGTCAATACGGCGAAAACCCTAGCACATCCAACACGAAPR2CAACCCGCCCAAAGATAGTATCCAAAAGGGCATCAAAAAG3.1.5病毒粒体的电镜观察3.1.5.1载网制备（1）95%乙醇清洗载玻片，随后在过滤的洗衣粉水中浸泡数秒，用擦镜纸擦拭干；（2）载玻片置于含有0.4%的Pioloform氯仿溶液内，数秒后垂直提起，使载玻片上的氯仿在空气中挥发，形成膜；（3）氯仿挥发完全后，用新的一次性刀片在膜的四周划割几下；（4）载玻片与水面呈45度缓慢压入蒸馏水中，借助浮力使膜慢慢脱落；22 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究（5）观察水面上的薄膜，选择颜色均匀、干净、平整的部分，镊子夹持干净的镍网轻轻摆放在膜上；（6）镊子夹持比膜稍大一点的封口膜，从一侧轻轻附于镍网上，然后迅速提起，膜朝上置于培养皿中，自然干燥后待用。3.1.5.2病毒粒子形态观察（1）覆膜镍网在纯化的病毒悬浮液上吸附10min；（2）超纯水漂洗3次，每次5min；（3）1%的戊二醛溶液固定样品10-15min；（4）重复（2）；（5）1%的醋酸铀染液负染1-2min；（6）重复步骤（2）；（7）干燥后置于JEM-2100型透射电镜下观察。3.1.6粗提病毒与试剂混合后摩擦接种供试物质与粗提纯病毒等体积混合1h。选取健康、生长旺盛的5-6叶期本氏烟；针对同一叶位的叶片，均匀喷洒600筛目金刚砂，用毛笔蘸取混合液，按相同方向刷动15次，每个浓度处3株，重复3次，以清水为对照处理，并在2、4、6、8、10d于紫外灯下观察统计荧光斑点数目。3.1.7ELISA法测定烟草叶片中病毒含量实验方法同第2章2.1.8。3.1.8处理方法与酶活性测定3.1.8.1处理方法（1）选取健康、生长旺盛的5-6叶期本氏烟，用配置好的植物源物质喷洒叶片；（2）48h后选取同一生育期、同一叶位的叶片，接种相同体积TMV-GFP农杆菌菌液，每个浓度处理3株，重复3次。并在2-10d于紫外灯下观察荧光斑大小。3.1.8.2超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）[103]（1）试剂的配制A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液：取Na2HPO4•12H2O（分子量358.14）71.7g；B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4•2H2O（分子量156.01）31.2g，分别用蒸馏水定容到1000mL。0.05mol/LPBS（pH7.8）：分别取A母液（Na2HPO4）228.75mL，B母液（NaH2PO4）21.25mL，用蒸馏水定容至1000mL。14.5mM甲硫氨酸溶液：取2.1637gMet用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至1000mL。23 西南大学硕士学位论文30μMEDTA-Na2溶液：取0.001gEDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至100mL。60μM核黄素溶液：取0.0023g核黄素用磷酸缓冲液定容至100mL，避光保存。2.25mM氮蓝四唑（NBT）溶液：取0.1840gNBT用PBS定容至100mL，避光保存；（2）酶液制备取0.2g干净样品置于预冷的研钵中，加入2mL50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）冰浴研磨成匀浆，转入离心管，在4℃、12000rpm下离心20min，上清液即为酶液；（3）酶活性测定反应混合液配制，分别取Met溶液162mL，EDTA-Na2溶液0.6mL，磷酸缓冲液5.4mL，NBT溶液6mL，核黄素溶液6mL，混合后摇匀；分别取3mL反应混合液和30μL酶液于试管中，将试管置于光照培养箱中在4000LUX光照下处理20min；同时做2支对照管，其中1支试管取3mL反应混合液加入30μLPBS（不加酶液）照光后测定作为最大光还原管，另1支只加缓冲液置于黑暗条件下用于调零；以不照光的对照管（只有缓冲液并置于暗处）调零后，避光测OD560（出现颜色即可测定）；（4）酶活性计算SOD活性单位以抑制NBT光化还原50％所需酶量（样品值要在最大管的一半左右才合适，否则要调整酶量）为1个酶活单位（u）SOD总活性＝[（Ack-AE）×V]/（1/2Ack×W×Vt）SOD比活力＝SOD总活性/蛋白质含量SOD总活性以鲜重酶单位每克表示（u/gFW）；Ack为照光对照管的吸光度；AE为样品管的吸光度；V为样品液总体积（mL，1.6mL，加入PBS的体积）；Vt为测定时的酶液用量（mL，30μL）；W为样品鲜重（g）；蛋白质含量单位为mg/g。3.1.8.3过氧化氢酶（CAT）活性测定（1）试剂配制：0.15mol/L磷酸缓冲液（pH7.0）：取A母液（Na2HPO4）457.5mL和B母液（NaH2PO4）292.5mL混合后蒸馏水定容至1000mL。（2）反应液配制：200mLPBS（0.15M，pH7.0），加入0.3092mL30%的H2O2摇匀。（3）样品测定：取3mL反应液加入0.1mL粗酶液，以PBS为对照调零，测定OD240（测定40s）。（4）酶活性计算：以每分钟OD值减少0.01为1个酶活性单位（u）。CAT=[ΔA240×Vt]/（W×Vs×0.01×t）（u/g/min）ΔA240：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（mL，1.6mL）；Vs为测定时取用酶液体积（mL，0.1mL）。3.1.8.4多酚氧化酶（PPO）活性测定（1）试剂制备：0.05mol/L邻苯二酚溶液：0.55055g邻苯二酚，蒸馏水溶定容至100mL；24 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究（2）反应液制备：1mL邻苯二酚溶液+1.5mLPBS（pH7.0）+0.5mL酶液；（3）样品测定：反应体系加入酶液后开始计时，1min后测398nm的吸光度；（4）结果计算：将每分钟OD增加0.01定义为1个活力单位（u）。公式如下：PPO=[ΔA398×Vt]/（W×Vs×0.01×t）（u/gmin）ΔA398：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（mL，1.6mL）；Vs为测定时取用酶液体积（mL，0.1mL）。3.1.8.5过氧化物酶（POD）活性测定（愈创木酚法）（1）试剂配制：0.2mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取A母液（Na2HPO4）123mL和B母液（NaH2PO4）877mL混匀即为1000mLPBS（0.2M，pH6.0）；（2）反应液配制（以60个样为准）：取200mLPBS（0.2M，pH6.0），加入0.076mL液体（原液）愈创木酚（2-甲氧基酚）加热搅拌溶解，冷却后加入0.112mlL30％的H2O2，混匀后保存于冰箱中备用；（3）样品测定：取3mL反应液并加入30μL酶液，以PBS为对照调零，而后测定OD470值（测定40s）。（边加样边测定，测定前等待5s，动作要快，如果慢的话，要保证每个样品从加好样到开始记时的时间相差不大）每30s读数一次；（4）酶活性计算：以每minOD值变化（升高）0.01为1个酶活性单位（u）；POD=（ΔA470×Vt）/（W×Vs×0.01×t）（u/g/min）ΔA470：为反应时间内吸光度的变化；W为样品鲜重（g）；t为反应时间（min）；Vt为提取酶液总体积（mL，1.6mL）；Vs为测定时取用酶液体积（mL，30μL）。3.1.9烟草叶片丙二醛含量测定（1）试剂配制10%TCA：100g三氯乙酸→1000mL0.67%TBA：3.35g硫代巴比妥酸→500mL10%TCA（避光）（2）测定步骤0.2g样品+1.6mL10%TCA研磨→12000rpm离心10min→上清1.5mL+1.5mL0.67%TBA→沸水煮30min→冷却，离心→上清OD450，OD532，OD600（3）计算组织中MDA含量：MDA浓度C（μmol/L）=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450MDA含量（μmol/gFW）=C×V/W式中V为提取液体积（1.6mL），W为样品鲜重（0.2g）。3.1.10烟草叶片超氧阴离子自由基产生速率的测定（羟胺氧化法）（1）试剂的配制1mM盐酸羟胺溶液：称取0.02085g盐酸羟胺用蒸馏水定容至300mL。25 西南大学硕士学位论文17mM对氨基苯磺酸溶液：称取1.1776g对氨基苯磺酸用少量冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=1：3配制）加热溶解后定容至400mL。7mMα-萘胺溶液：称取0.4008gα-萘胺用冰醋酸水溶液（冰醋酸：水=3：1配制）定容至400mL；（2）制做亚硝酸根标准曲线取亚硝酸钠6.9g定容至1000mL，为0.1mol/L亚硝酸钠溶液，分别制成10、20、30、40、50mmol/L的标准溶液。取各标准溶液各1mL，重复步骤（3），于波长530nm测定OD值，以OD值为纵坐标，亚硝酸钠浓度（mmol/L）为横坐标绘制标准曲线；（3）超氧阴离子自由基含量的测定样品液提取方法同SOD测定；取0.5mL提取液（粗酶液）中加入0.5mlPBS（0.05M，pH7.8），1mL的1mM盐酸羟胺溶液后摇匀；在25℃下保温1小时；依次先加入1mL17mM对氨基苯磺酸，再加入1mL7mMα-萘胺，混合后快速摇匀；在25℃下保温20min后在5000rpm下离心3min后马上进行测定；以对照管调零（用水调零），取粉红色水相液测定OD530值。2-2-超氧阴离子自由基含量的计算：由测得的OD530，查NO标准曲线得到[NO]；2-[NO]×2=[超氧阴离子自由基]。3.1.11烟草叶片过氧化物测定（DAB、NBT）3.1.11.1DAB染色法（1）10mMNa2HPO4DAB染色液：在离心管中，50mgDAB溶于45mL的去离子水中，磁力搅拌器搅拌，加入0.2MHCl使pH降到3，DAB是光敏感溶液，用锡箔纸包住离心管，加入25µLTween-20和2.5mL200mMNa2HPO4，现配现用；（2）配置好的植物源物质喷洒本氏烟24h后，用刀片将所有处理的烟叶用刀片从底部切下，至少从3个植株上取样，每株植株取3片叶片，以健康不处理的烟叶为对照；（3）三个叶片被用于一个染色重复，将叶片放在四孔的细胞培养板中，加入适当的DAB染液，抽真空5min；（4）室温，100rpm，黑暗条件下染色8h；（5）染色完毕，倒掉染色液，加入提前配置好的脱色漂白液（乙醇：乙酸：甘油=3：1：1），将已加入漂白液的板放入煮沸（90-95℃）的水中，脱色15min；（6）脱色结束，倒掉脱色液，用95%的乙醇漂洗一次，晾干，拍照。3.1.11.2NBT染色法（1）试剂的配制磷酸缓冲液（PH7.5）：将12g的NaH2PO4溶于100mL的去离子水中，得到1MNaH2PO4，将14.2g的Na2HPO4溶于100mL的去离子水中，得到1MNa2HPO4。取26 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究16mL1MNaH2PO4和84mL1MNa2HPO4混合，用去离子水定容至2000mL，得到50mMPH7.5的磷酸缓冲液NBT染色液配制：在离心管中，将0.1gNBT溶于50mM的磷酸缓冲液中（pH7.5），体积定容至50mL得到0.2%的溶液，用搅拌器混匀，黑暗保存；（2）植物的处理如上述3.1.11.1中DAB染色步骤所述；（3）三个叶片被用于一个染色重复，将叶片放在四孔的细胞培养板中，加入适当的NBT染液，抽真空5min；室温，100rpm，染色4h；（4）染色完毕，倒掉染色液，将染色后的叶片放入煮沸（90-95℃）的95%的乙醇中脱色，煮15min；（5）脱色结束，再用95%的乙醇漂洗一次，晾干，拍照。3.1.12防卫反应相关基因（1）RNA的提取：喷洒植物叶片48h后，农杆菌注射法接种TMV-GFP，收集第八天不同处理的接种叶片。利用提取植物总RNA。TM（2）RNA反转录：利用反转录试剂盒iScriptcDNASynthesisKit（Bio-Red）将RNA反转录，先对提取RNA的浓度进行换算，其中RNAtemplate的有效浓度成分是1μg，反转录体系为：5×iScriptreactionmix4μLiScriptreversetranscriptase1μLNaclease-freewaterxμLRNAtemplate1μg20μL（3）实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR使用QuantinovaTMSYBRGreenPCRKit（QIAGEN，GER）扩增，合成cDNA以后，用无菌水稀释2-5倍，将PCR板上的大致布局设计好，然后按照布局来进行试验；检测NPR1、PR1、PR2这三个基因，内参基因选用actin，所用引物见表3-2。每个实验进行3次生物学重复。3.1.13植物细胞质膜透性的测定（电导仪法）（1）取新鲜叶0.3g，自来水冲洗表面污渍，再用去离子水冲洗几遍后吸干水分；（2）样品剪碎放入试管中，加10mL去离子水，在室温下放置3h使叶片充分吸水后测定溶液电导率（R1）；（3）在100℃沸水浴煮20min杀死叶片组织，冷却到室温后测定溶液电导率（R2）；（4）用公式计算质膜相对透性（用相对电导率表示）：相对电导率（%）=R1/R2×10027 西南大学硕士学位论文3.2结果与分析3.2.1几种植物源物质的抗病毒效果与初步筛选本研究一共收集15种植物源物质作为筛选对象，并且以香菇多糖、清水、溶剂分别作为对照，因作用机制原因舍去毒氟磷对照组。以数字1-17编号，详见表3-1。如图3-1-a，将TMV-GFP农杆菌导入植物中，在紫外灯光下可观察到绿色荧光蛋白的表达，荧光斑点的大小、强弱随着时间而增强，间接反映病毒的分布、扩散和增殖情况，说明本实验室保存的TMV-GFP毒源能够在本氏烟中稳定表达，可以进行后续试验。在接种TMV-GFP前48h用配置好的各植物源物质溶液喷洒本氏烟整株叶片，2d后开始在紫外灯下观察、记录荧光的扩散和强弱情况。如图3-1-b显示，1、5、7、9、10、11这6种物质预先处理本氏烟后接种病毒，绿色荧光斑的大小和亮度较16（清水对照）和17号（溶剂对照）有不同程度的减弱，其中1、9、10号物质的荧光表达情况与阳性对照15号（香菇多糖）相近，说明这几种物质处理本氏烟后病毒的表达和初侵染量可能有不同程度的降低。依据处理方式的特点以及多数抗病毒植物源物质能够提高植物防御酶活性，且酶活性峰值往往集中在接种后2d-12d这一特点，再次重复和测定了烟草叶片在预处理后6d的防御酶活性，1、9、10号物质处理后烟草的CAT、POD、PPO较16、17对照组都有一定提高，高于阳性对照15号在处理后第6d时的酶活性。但要注意的是由于不同物质对植物酶活性提高的程度和峰值出现时间的影响存在差异，因此不能完全说明几种物质对植物防御酶活整体影响的高低。综合上述试验中几种物质对TMV初侵染量影响和第6d时酶活性高低情况，选择效果较好的1号（熊果酸）和10号（4-甲氧基香豆素）进一步试验。28 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究ab图3-1几种植物源物质预处理对TMV初侵染和移动的影响Fig.3-1TheinfluenceofplantsourcematerialpretreatmenteffectsontheprimaryinfectionandmovementofTMV注：a：健康烟草接种后TMV-GFP侵染情况；b：几种物质喷施烟叶后接种TMV-GFP第3d的侵染情况Note:a:InfectionofTMV-GFPincontrolNicotianabenthamiana;b:InfectionofTMV-GFPincontrolNicotianabenthamiantreatedwithseveralkindsofmaterialat3dayspostinoculation(dpi)29 西南大学硕士学位论文CATPPO）1FW703.0-）602.550·min2.01-401·min1FW-1.530U·g20U·g1.0100.5活性（0活性（0.01579101115161715791011151617CATPPO处理处理PODSOD）160.0300.01FW140.0）-250.0120.01FW-200.0100.0·min1-80.0U·g150.060.0100.0U·g40.020.050.0活性（活（0.00.015791011151617SOD15791011151617POD处理处理图3-2接种叶片防御酶活性Fig.3-2ThedefenseenzymeactivityoftheInoculatedleaf3.2.2抗病毒活性物质复筛为验证初步筛选出的1号和10号植物源物质具有抗病毒作用，再次预处理本氏烟，于接种后3-5d连续观察和记录病毒的侵染情况（图3-3-a）。结果显示熊果酸（用A表示）和4-甲氧基香豆素（用B表示）处理后，荧光斑的面积和强度与空白对照（用D表示）相比明显较弱，尤其在接种后的3-4d，差别明显。但随着时间的延长，荧光强度和面积之间的差别逐渐减小。图3-3-b，接种叶片ELISA结果显示，各处理组叶片中的病毒含量随时间延长不断增长，在15d时达到较高值。A、B、C处理本氏烟后，其接种叶片内的病毒含量均显著低于D，尤其在接种后2d左右，处理组与对照之间差异明显，与荧光强度的结果较一致。在2-10d时，三组处理之间的病毒含量差异不大，但仍与对照组之间存在差异。到15d时处理组与对照组接种叶片内的病毒含量逐渐接近，但此时B处理组的病毒含量仍然低于其他处理，说明A和B这2种植物源物质处理本氏烟后，能够降低烟叶中初侵时的病毒积累量，在2-15d内处理组病毒含量仍低于对照组，且荧光强度与ELISA结果之间具有一致性。2种物质对病毒初侵染量的影响与阳性对照C（香菇多糖）效果相当，但B显示出更长的时效性。那么A和B对烟草的保护作用除了能够影响初侵染病毒含量这一机理以外是否在存在其他作用机制。30 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究ab图3-3植物源活性物质预处理烟草后对TMV的侵染和移动的影响Fig.3-3EffectsofplantsourceactivesubstancespretreatmentonTMVinfection注：a：3d-5d荧光图；A：熊果酸；B：4-甲氧基香豆素；C：香菇多糖；D：对照b：接种叶片ELISA结果；A：熊果酸；B：4-甲氧基香豆素；C：香菇多糖；D：对照Note:a:3d-5dfluorescencemap;A:ursolicacid;B:4-methoxycoumarin;C:lentinan;D:controlb:InoculatedleafELISAresults；A:ursolicacid;B:4-methoxycoumarin;C:lentinan;D:control3.2.3植物源活性物质的保护作用机理3.2.3.1植物源活性物质对防卫反应相关酶活性影响超氧化物歧化酶（SOD）是普遍存在与植物体内的一种抗氧化酶。SOD能够将超[104]氧阴离子自由基转化为H2O和O2，以避免超氧阴离子自由基对植物的伤害。因此31 西南大学硕士学位论文在病原物侵染寄主时，叶片组织中SOD活性上升。本试验结果显示，图3-4-a，A、B、C3种物质处理后的SOD活性从接种后第4d开始升高，各处理组的酶活性均大于对照组。PPO是一种诱导酶，它以游离态存在于细胞内，催化单元酚和邻二羟酚氧化为醌，并可催化单宁的合成，而醌和单宁不仅对真菌有毒性，对植物病毒也存在一定抑制作用。试验结果显示，图3-4-b，从接种后第2d开始，各组处理的酶活性开始提高，在第8d达到活性峰值，处理组与对照之间并无显著差异，此时C（香菇多糖）处理的酶活性相对较低，故推测多酚氧化酶（PPO）活性提高可能受病毒侵染影响，此时C处理组病毒含量较低故其活性也相对较低。过氧化物酶（POD）能够参与木质素的合成，使植物细[105]胞内丙二醛（MDA）含量降低。此外其还有利于活性氧的清除，能使活性氧维持在[106]较低水平，防止活性氧伤害。从图3-4-c可以看出，各处理组酶活性均高于对照组，并且在接种后第6d达到酶活性峰值，随后逐渐降低，对照组酶活性整体变化不大，没有明显的上升或下降。过氧化氢酶（CAT）主要作用是清除病原物侵染所导致的H2O2积累，将其转化为无毒害的H2O和O2，防止H2O2生成毒性最强的羟自由基。从图3-4-d可以看出，各组处理间没有特别明显的差异，酶活性相对平稳。abcb图3-4预处理对接种叶片防御酶活性的影响Fig.3-4Effectofplantsourcematerialpretreatmentondefenseenzymeactivity注：a：超氧化物歧化酶（SOD）；b：多酚氧化酶（PPO）；c：过氧化物酶（POD）；d：过氧化氢酶（CAT）Note:a:Superoxidedismutase(SOD);b:Polyphenoloxidase(PPO);c:Peroxidase(POD);d:catalase(CAT)3.2.3.2植物源活性物质对烟叶片膜质过氧化的影响丙二醛（MDA）能导致细胞膜结构和生理功能的破坏，植物在感病时会产生MDA，32 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究[107]其积累来自不饱和脂肪酸的降解，因此其含量的高低能表明细胞膜脂过氧化的程度。一般MDA含量越高，说明植株受到的伤害程度越大。从图3-5可以看出，病毒侵染烟草后，MDA含量升高。叶片内MDA含量随着时间的延长呈下降趋势，可能由于细胞自身的修复能力起作用。2-6d时各处理组MDA含量均小于对照，且存在显著性差异，说明处理组降低了细胞膜的膜脂过氧化程度，可能是因为处理后导致病毒初侵染含量降低，细胞膜受损减轻。6d后各组间的MDA含量差异逐渐消失。图3-5预处理对接种叶片丙二醛（MDA）含量的影响Fig.3-5EffectofplantsourcematerialpretreatmentonMDA3.2.3.3植物源活性物质对植物细胞质膜透性影响植物细胞膜能维持细胞的正常微环境和细胞代谢，细胞膜不仅是分隔胞内和胞外的屏障，也是植物细胞与外部环境发生物质交换的主要通道，还是感受外界胁迫的应激部位。因此质膜通透性一方面反映了细胞的受损程度，另一方面也反映了植物的抗逆性强[108]弱。图3-6显示了接种后第8d时烟草叶片细胞的质膜通透性，单用几种物质处理烟草，叶片的质膜通透性与健康对照相比无显著差异，而处理后接种病毒，各处理组的脂膜通透性有所提高，其中C处理后通透性升高幅度最大，分析可能由于香菇多糖能够诱导H2O2产生，从而对周围细胞产生一定伤害，导致细胞质膜透性升高。图3-6预处理对接种叶片质膜通透性的影响Fig.3-6Effectofplantsourcematerialpretreatmentonplasmamembrane33 西南大学硕士学位论文3.2.3.4植物源活性物质对烟草叶片活性氧含量影响3.2.3.4.1超氧阴离子自由基含量植物在正常情况下，超氧阴离子自由基含量维持在一个动态平衡状态下。当细胞受到外界刺激或者发生生理病变时，通常会产生过量的超氧阴离子自由基，其含量增加会[109]破坏核酸和染色质，损伤碱基修饰，破坏脂类代谢，降低酶活性，促进脂质过氧化。植物感病后超氧阴离子自由基含量急剧升高，如不及时清除，会对植物造成伤害。如图3-7，在接种后6-8d时，各处里组超氧阴离子自由基含量相差不大，对照组含量略高于处理组，但统计学上不存在显著差异。在第10d时，各组处理的超氧阴离子自由基含量有所升高，其中B处理的变化幅度相对较低。综上所述，活性氧与病毒侵染程度加重有一定关系，但几种物质对烟叶中的活性氧含量的影响统计学差异不明显，分析其原因可能主要有两点。第一是在此时间段内病毒含量较低，不足以引起明显的数据差异。另一种原因可能是检测时间距离处理时间过长，错过活性氧爆发期。ab图3-7预处理对接种叶片超氧阴离子自由基含量的影响Fig.3-7Effectofplantsourcematerialpretreatmentonmalondialdehydecontent2-注：a：NO标准曲线；b：超氧阴离子自由基含量2-Note:a:NOstandardcurve;b:superoxideanionfreeradicalcontent34 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究图3-8处理叶片后活性氧情况Fig.3-8Reactiveoxygenspeciesafterprocessingblade3.2.3.4.2DAB和NBT染色检测活性氧产生情况活性氧（ROS）在植物细胞中存在双重作用，作用机制也十分复杂，不同处理对其诱导产生时间各不相同，许多物质能够在24h-48h之间就能诱导氧化迸发，产生大量ROS，且在48h内恢复正常值，如PopW、香菇多糖都可以在短时间内诱导健康叶片产生活性氧。也有些物质能够使活性氧产生2个峰值，超氧阴离子自由基检测时间上缺少24h-48h数据，因此采用染色法检测单用药剂处理后24h叶片内的活性氧含量，如图3-8，香豆素与香菇多糖可能轻微诱导活性氧产生，熊果酸的诱导结果不明显。3.2.3.5植物源活性物质对病程相关蛋白基因表达量影响当植物受到病原物胁迫刺激时体内的茉莉酸及茉莉酸甲酯含量迅速上升，同时伴随着大量的次生代谢物质的生成，引发生理生化反应，诱导基因表达。大量研究表明外源施用某些物质时可以诱导病程相关蛋白基因表达量上调而使植物表现出抗病性。如图3-8，单用A、B、C三种物质处理本氏烟后，NPR1、PR1、PR2基因表达量明显高于健康植物，其中单用C物质处理对PR1、PR2基因表达上调程度较明显，但对NPR1相对表达量影响较弱；单用A时对NPR1、PR2均有较好表达上调作用；单用B除了对NPR1上调作用高于C外，对PR1、PR2的表达上调作用均小于A和C，但各处理仍然高于健康植株。处理后再接种TMV的结果显示，A和B处理对PR1和NPR1这2个基因的相对表达量都有上调作用，其中A对NPR1上调作用较B、C更明显，而B对PR1上调作用非常显著；但A、B、C对于PR2上调作用均不明显。综上所述，A、B这2种物质预处理会提高植物体内部分病程相关蛋白基因的表达水平，尤其对接种病毒后的提升幅度更大。对以上3种防卫基因的上调作用甚至高于阳性对照C，说明A、B能够诱导或促进植物体内部分病程相关蛋白基因的表达，提高PRs积累量，诱导植物的抗病性。35 西南大学硕士学位论文图3-8实时荧光定量PCR检测NPR1、PR1和PR2的表水平Fig.3-8Quantiativereal-timePCRanalysisofNPR1、PR1andPR2expressionlevels3.2.4植物源活性物质对TMV的体外作用3.2.4.1植物源物质与病毒粒体体外混合后侵染烟草植物源活性物质通常对病毒具有多种作用方式，以上试验显示A、B两种植物源物质具有保护作用，能够抑制TMV的侵染，因此探讨2种物质对病毒粒体的体外抑制作用。为避免农杆菌的影响，首先从接种TMV-GFP烟草中，粗提纯出病毒粒体，并通过摩擦接种的方式侵染健康烟草，发现其能正常侵染，并且绿色荧光蛋白表达稳定，可以作为体外抑制作用试验的毒源，图3-9-a。将A和B两种活性物质稀释成3个浓度，与粗提纯病毒粒体体外混合1h后摩擦接种至本氏烟，并于接种后的2至3天在紫外灯下观察统计荧光斑点情况。结果如图3-9-b与3-9-c，A和B处理TMV后接种本氏烟的荧光斑点数目与对照组相比有不同程度降低，说明处理后侵染成功的病毒量减少。对比A和B在不同浓度下的处理结果，发现A处理病毒后荧光斑点数随浓度降低有明显增多的趋势，升高幅度较大。而B处理后荧光斑点数目比较稳定，浓度影响不大。2种处理的荧光结果随时间延长，与对照之间的差异逐渐降低。检测以上处理后接种叶片中病毒含量，结果如图3-10，在5mg/mL浓度下A处理后的病毒含量最低，与CK差异显著，B处理次之，但B与对CK之间差异不显著；2mg/mL浓度下，C处理后病毒含量高于B，与CK无明显差异；当浓度稀释到1mg/mL时，A、B、CK处理组的病毒含量均没有明显差异。以上结果显示随着浓度降低，A和B对病毒粒体侵染活性的影响逐渐减弱，并且A处理后的病毒含量降低幅度更大，说明2种物质对TMV的体外作用具有剂量依赖性，只有在较高浓度情况下才会对病毒粒36 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究体的侵染活性有较大影响，这一结果与荧光斑点的变化情况相互对应。本试验对病毒处理的时间均为1h，处理时间较短，可能导致低浓度情况下抑制作用不明显，而处理时间对病毒侵染活性的影响还需进一步研究。a5mg/mL2mg/mL1mg/mL5mg/mL2mg/mL1mg/mLA+TMVMVVVVVVB+TMVCK+TMVbc图3-9植物源活性物质与TMV体外混合后接种烟草的侵染情况Fig.3-9InfectionofTobaccoinoculatedwithplant-derivedactivesubstancesandTMV注：a：粗提TMV侵染烟草；b：2d侵染情况；c：4d侵染情况Note:a:CoarseextractionTMVinfecttobacco;b:2dinfection;c:4dinfection图3-10接种叶片的ELISA结果Fig.3-10TheELISAresultsofinoculatedleaves37 西南大学硕士学位论文3.2.4.2植物源活性物质对粒体形态的影响以上试验结果表明A和B能在体外直接作用TMV粒体，因此分别用5mg/mL的A和B处理粗提纯TMV，并置于扫描电镜下进行观察，结果如图3-10，A处理TMV后，病毒粒体发生了明显的聚集现象，而B处理TMV后，病毒粒子也发生聚集，但与A处理相比病毒粒体聚集不明显。对照组的病毒分布均匀，无任何聚集现象。因此推测A和B对病毒侵染活性的影响可能是因为改变了病毒外壳蛋白的某些结构或作用力，导致病毒粒体形态结构改变。图3-10植物源活性物质对TMV形态的影响Fig.3-10Theeffectofplant-derivedactivesubstancesonTMVMorphology3.3小结与讨论通过对比15种植物源物质对本氏烟中病毒积累移动的影响，初步得到6种可能存在抗病毒活性的物质。用6种物质再次处理本氏烟并测定对烟叶防御酶活性的影响，发现熊果酸（A）、4-甲氧基香豆素（B）2种物质在第6d时对酶活有较大影响，推测这2种物质可能具有抗病毒活性，诱导植物抗病性的产生，因此进行下一步研究。再次复查2种物质对病毒初侵染的影响，并与阳性对照香菇多糖（C）的抑制效果进行比较，发现A、B2种物质可以减弱病毒荧光表达与扩散速度，接种叶片的ELISA结果也与这一现象相对应，处理后叶片的病毒含量明显低于空白对照，与已生产成植物源农药的香菇多糖效果相当。此实验结果与景炳年等人发现植物源病毒抑制剂VFB中甘草素和熊[110]果酸为其主要抗病毒活性物质的研究结果一致。景等人首先从VFB中分离出多种植物源物质，通过叶碟法、枯斑法测定这些物质的抗TMV活性，发现熊果酸和甘草素能够有效影响病毒的初侵染和增殖，是植物源病毒抑制剂VFB的主要活性物质。其中还38 第3章植物源抗TMV物质的筛选及其作用机制初步探究发现7-甲氧基香豆素等物质也有一定抗病毒活性并且可在体外直接作用病毒粒体，使分散的病毒发生聚集。近年有研究结果显示烟草根、茎、叶中所提取的香豆素混合物具有[84,89]不同程度的抗病毒活性。其实早在1960年国外就有报道，香豆素能够抑制TMV的复制，其抗病毒活性与浓度之间存在线性关系。高浓度香豆素抑制幼苗的生长和发育，刺激花下胚轴的生长，影响磷元素渗入曼陀罗叶片，说明香豆素能影响植物正常细胞的代谢活动。因此有学者推测香豆素与病毒在植物体内合成时的一些化合物的代谢有关，[85]但一直未有研究证实香豆素抗病毒机制到底如何。目前研究表明，植物源抗病毒物质的活性主要表现在以下几个方面。直接作用于病毒，如与病毒体外结合，降低病毒对寄主的侵染能力甚至导致病毒失活；作用于寄主上的病毒侵染接受位点，影响病毒侵染；诱导植物产生系统抗性，抑制病毒增殖。本文研究结果显示熊果酸（A）和4-甲氧基香豆素（B）对TMV侵染本氏烟具有保护作用，2种物质预处理烟草后均能降低TMV初侵染积累量；并对植物防御酶活性有一定影响，小幅度提高防御酶活性，使SOD、PPO、POD、CAT防御酶在接种后的2-10d出现活性峰值，此后逐渐下降。其中CAT的活性波动较小，提高幅度较低，推测可能与底物反馈调节有关。其次，A和B对植物细胞膜脂过氧化存在一定影响。各组处理的MDA含量整体呈下降趋势，接种后第2d的MDA含量最高，但均低于对照处组MDA含量，说明此时处理组细胞膜脂过氧化程度较低。随后MDA含量逐渐下降，达到平稳状态，各组之间的差异也逐渐缩小。推测这种变化的主要原因可能有以下几方面。首先除了活性物质降低病毒初侵染含量，减轻膜脂过氧化减少MDA积累以外，也可能因为接种时对叶片产生了损伤，从而导致接种前期MDA含量较高，随着细胞自身修复能力叶片中MDA含量逐渐降低；此外也有可能是因为实验过程中，农杆菌本身对寄主细胞存在一定毒性，损伤叶片细胞，导致MDA含量升高。目前对于活性氧（ROS）在系统获得性抗性（SAR）中与乙烯水杨酸（SA）等物质之间的具体关系，产生活性氧以及信号传递的机制尚不明确，许多研究结果之间还存在一定争议。有研究结果显示SA能抑制CAT活性，从而提高H2O2含量，以达到转化为第二信使的作用，进而引起防卫反应的发生。但也有学者发现，SAR启动时，植物体内的H2O2含量与CAT活性并未发生明显变化。多数情况下ROS与过敏反应（HR）相关，大多数能产生HR反应的植物均可积累大量ROS，并且其总共有2个含量峰值，第2个峰值大于第1个，而在不引起HR的植物中，只有强度较小的一个峰值。ROS还能作用于病原物，并促进木质素和植保素（PA）产生，强化细胞壁抵抗病原物的入侵。较低含量可以诱导植物防卫反应相关基因的表达，高浓度时会对植物细胞或病原物起伤害作用。综上所述，ROS在植物抗病性中的作用非常复杂，本实验显示各组处理在2-8d时，超氧阴离子含量差异不大，但随时间的延长和病毒侵染程度加重其含量逐39 西南大学硕士学位论文渐提高，其中C处理上升幅度较大，与其促进细胞质膜通透性的结果相对应。推测原因可能为香菇多糖能诱导H2O2产生导致周围细胞损伤，破坏细胞膜透性，使相对电导率升高，活性氧积累增多；ROS染色试验显示24h时B和C可能轻微诱导叶片中活性氧（ROS）含量，从而帮助植物抗病性的产生，但活性氧变化的规律并不明显。实时荧光定量PCR结果显示，A、B、C对植物体内防卫反应相关基因的表达量有一定影响，从而影响病程相关蛋白的产生。尤其是病毒侵染预处理的烟草后，A、B处理组防卫基因表达水平明显升高，并与对照之间存在显著差异。说明A和B能促进植物防卫基因表达，诱导产生病程相关蛋白，启动相关防卫反应，帮助植物抵抗病毒的侵染。此外，A和B在体外可以直接作用于病毒，影响TMV形态，尤其A在高浓度下能够使病毒粒体发生明显聚集，影响病毒的侵染活性，导致侵染成功的病毒量降低。其抑制作用可能与活性物质结合到病毒外壳蛋白或影响病毒外壳蛋白功能有关，从而使病毒对寄主受点的识别能力降低，甚至导致病毒失去侵染活力，抑制病毒侵入植物体内。据报道，大多数抗病毒活性物质具有影响病毒粒体形态的作用，但大都停留在现象观察层面，其具体的作用机理还有待深入研究。40 第4章抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制探究第4章抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制探究烟草赤星病是烟叶生产上危害最严重的植物病害之一，目前已对其生物学特性、寄主抗病性、病害消长规律以及综合防治等方面进行了较为广泛的研究。而对于赤星病的植物源活性物质的研究相对较少，一般多集中在放线菌等微生物的次生代谢产物方面，但是这些研究目前多停留在粗提物阶段，各组分之间存在一定的相互作用，抑菌作用机制往往较复杂，而具体的活性物质分离难度大，研究周期长，不稳定因素较多，难以获得成分单一的活性物质，即使能分离出活性物质，其结构也大同小异，具有新颖结构的分离物较少。植物源抑菌物质具有抑菌作用广，容易提取分离，作用方式多等特点，能够较好的弥补农用抗生素开发难度大的问题，因此筛选出成分单一且具有稳定抑菌活性的植物源物质，对天然产物抑菌农药的开发具有重要意义。此前收集的15种植物源物质，除了抗病毒作用之外，在抑菌作用方面也有许多报道。因此以赤星病菌作为靶标真菌，进行抑菌活性试验。对存在明显抑制活性的物质进一步研究其抑制赤星病菌的作用方式，并初步探讨其对赤星病菌的直接作用机理。目前报道的抑菌作用机制主要有提高寄主植物的抗病能力；影响病原菌细胞壁的合成；破坏病原菌细胞膜结构；抑制蛋白和核酸形成；阻碍细胞的电子传导和物质代谢。4.1材料与方法4.1.1供试菌株赤星病菌[Alternariaalternata(Freis)Keissler]菌株由西南大学植物保护学院马冠华副教授实验室馈赠。保存于4℃冰箱。4.1.2供试植物源物质同第3章表3-1。丁香油与Tween-80为2：1的体积比进行溶解，按照2倍稀释法，用去离子水稀释成不同含药量的试剂待用。具体含药量如下，33.33%、16.50%、8.30%、4.10%、2.10%、1.00%、0.50%、0.30%、0.10%，以不加丁香油溶剂为对照。4.1.3培养基PDA培养基的制备：将马铃薯（200g）切块煮熟后四层纱布过滤，将滤液补足至1000mL，加入葡萄糖（20g）和琼脂（20g），再次煮沸分装，高压灭菌备用。PD培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。4.1.4几种植物源活性物质对赤星病菌的活性测定取活化7d的赤星病菌，向皿中加入一定量的无菌水，用毛笔将平板上的分生孢子41 西南大学硕士学位论文洗刷下，并用纱布过滤，反复3次，并于10×20倍显微镜下计数，制成一个视野含有30-40个孢子的悬浮液，置于4℃保存备用。吸取200μL菌悬液均匀涂抹于PDA培养基，中心打孔（200μL药剂），28℃恒温培养72h后十字交叉法测量抑菌圈直径，以溶剂为对照，重复3次，分析观察抑菌特点。4.1.5丁香油对赤星病菌菌丝生长速率的影响将所需菌株活化培养7d后，使用打孔器（φ7mm）在菌落边缘切取菌饼，并将菌饼倒置于PDA平板中心上，以不加药平板为对照，每个处理重复3次。将平板倒置于培养箱内，28℃培养7d，用十字交叉法测量各皿的菌落直径，计算菌丝生长率。4.1.6丁香油对赤星病菌孢子萌发的影响从制备好的孢子悬浮液中吸取400μL孢子悬浮液均匀涂抹于丁香油含量（v/v）为2.06%、1.03%、0.52%、0.26%、0.13%的PDA平板，以不含药的混合液为对照，每处理重复3次，放入28℃培养箱保湿培养，24h后镜检，每个重复选取五个视野，每个视野重复调查超100个孢子，计算孢子萌发率。孢子萌发率（%）=孢子萌发数/调查的孢子总数×1004.1.7丁香油对赤星病菌菌丝生长量的影响将供试菌株在PDA平板上培养7d后，在菌落边缘用打孔器（φ7mm）切取10块菌柄接入含有100mLPD培养液的锥形瓶（250mL）中，震荡（28℃，225rpm）培养3d后，无菌条件下加入312μL、156μL、78μL、39μL丁香油制剂，使丁香油含量分别为A（0.312%）、B（0.156%）、C（0.078%）、D（0.039%），继续震荡（28℃，225rpm）培养4d，以不加药为空白对照，每个处理重复3次。菌丝用滤纸反复吸干培养液与水分，并用无菌水清洗3次，称量各处理菌丝重量。4.1.8丁香油对赤星病菌细胞膜通透性的影响[111]采用电导率法，将丁香油试剂加入到100mL三角瓶内配成不同浓度的混合液，且总体积为60mL。向不含有药剂的PD培养基中，放入10块菌饼后摇培（28℃，225rpm）3d，用滤纸反复吸干菌丝表面的培养液与水分，并使用无菌水清洗3次，称取1g新鲜菌丝加入到上述液体中，于28℃条件下保持震荡，分别测定不同时段与杀死处理（煮沸30min）时的电导率。以不加药为空白对照，每处理重复3次。按照下列公式计算相对渗透率。相对渗透率（%）=（某时刻的电导率-最初时的电导率）/死处理后的电导率×10042 第4章抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制探究4.1.9丁香油对赤星病菌菌丝膜脂质过氧化的影响[112]丙二醛（MDA）的测定采用2-硫代巴比妥酸（TBA）法。菌丝的获得同上，用0.05mol/L磷酸缓冲液冲洗3次，称取2g菌丝转移至30mL磷酸缓冲液中，分别加入药剂，使终浓度为5µg/mL，震荡（28℃225rpm）处理0、6、12、24h后分别过滤菌丝，加入液氮，冰浴下研磨后，加入4mL0.6%巴比妥酸（TBA）与10%三氯乙酸的混合液（配制时先用1mol/LNaOH溶解，再用三氯乙酸定容），离心（4℃、10000rpm）10min。将各处理上清液转移至洁净试管中，并置于沸水中处理15min，冰浴迅速冷却终止反应，离心（4℃、10000rpm）10min。取上清液，分别测定各处理样品在450、532、600nm的吸光值。磷酸缓冲液中MDA含量测定方法同菌丝，按体积比5:2的比例加入反应液。每个处理重复3次。按照下列公式计算MDA浓度，试中c为MDA浓度，单位：µmol/L。丙二醛含量（c）=6.45（OD532-OD600）-0.56OD4504.1.10丁香油对赤星病菌可溶性蛋白含量的影响同上称取菌丝0.25g，研钵液氮冷却后加入0.025mol/L的Tris-HCL（PH6.8）2mL磨至糊状，12000rpm，离心15min（4℃），收集上清液备用。烟草赤星病菌菌丝蛋白质含量的测定：取上述蛋白质粗提液0.2mL，加入考马斯亮蓝G-250染液5mL（100mg考马斯亮蓝G-250，50mL90%乙醇溶解，100mL85%（W/V）磷酸，蒸馏水定容至1000mL）混匀，25℃静止3min，在595nm处测吸光值。4.2结果与分析4.2.1对赤星病菌有抑菌作用的植物源活性物质筛选利用平板法测定15种植物源活性物质对烟草赤星病菌的活性，结果如图4-1-a，丁香油显示出较好的抑菌效果，选择丁香油作为后续实验研究对象。观察发现在抑菌圈交界处，赤星病菌菌丝多为白色气生菌丝，挑取交界处菌丝显微观察发现，菌丝颜色较浅，质地柔软，见图4-1-a。如表4-1与图4-1-c，将丁香油稀释成不同浓度进行抑菌活性实验发现，不同浓度丁香油处理后，抑菌圈直径大小明显不同，说明丁香油对烟草赤星病菌的抑制作用有明显的剂量依赖性，丁香油含量（v/v）为16.5%时，对烟草赤星病菌的抑菌圈直径可达4.37cm。目前，丁香油对于烟草赤星病抑制作用还未见报到，其作用机制还未明确。43 西南大学硕士学位论文ababcdecfghiCK图4-1丁香油对烟草赤星病菌的抑制活性和特点（10×20）Fig.4-1InhibitioneffectandcharacteristicsofAlternariaalternata注：a:丁香油抑菌作用；b:不同浓度下孢子萌发状况（10×20）；c:不同浓度抑菌圈大小；a-i：丁香油平板含药量依次为：33.00%、16.50%、8.25%、4.13%、2.0%、1.03%、0.52%、0.26%、0.13%Note:a:Cloveoilantibacterialeffect;b:Sporegerminationatdifferentconcentrations（10×20）;c:Differentconcentrationsofinhibitionzonesize：a-i:cloveoilcontentwere33.00%,16.50%,8.25%,4.13%,2.0%,1.03%,0.52%,0.26%,0.13%44 第4章抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制探究表4-1孢子萌发率与抑菌圈直径Table4-1Sporegerminationrateandinhibitionzone丁香油浓度（v/v）/%Concentration33.0016.508.254.132.071.030.520.260.13CK孢子萌发率/%Spore\\2.5a5.0a7.7b16.0c24.6d33.1egerminationrate抑菌圈直径/cm4.25a4.37a3.60b3.18c3.18c2.73d1.93e1.72e1.00f0.90finhibitionzone注：表中数据为平均数±标准误。同列数据后不同字母表示经Duncan氏新复极差法检验在P<0.05水平差异显著。Note:Dataaremean±SE.DifferentlettersinthesamecolumnindicatesignificantdifferenceatP<0.05levelbyDuncan’snewmultiplerangetest．4.2.2丁香油对赤星病菌孢子萌发的影响分生孢子能否正常萌发是赤星病菌侵染循环的关键，如分生孢子不能萌发，赤星病菌就不能形成初侵染，也不能利用分生孢子进行再侵染。表4-1与图4-1-b，试验表明在不同含药平板上培养24h后，赤星病菌的孢子萌发率不同，且对照组的孢子萌发率显著高于处理组，并存在显著性差异，说明丁香油能够有效抑制赤星病菌的孢子萌发。赤星病菌孢子萌发率随着丁香油浓度降低而提高，具有剂量依赖性。在丁香油含量为4.13%时孢子基本不能萌发。4.2.3丁香油对赤星病菌菌丝生长速率的影响分别测定1、2、3、4、6d的菌丝生长速率，图4-2显示丁香油对赤星病菌菌丝的生长有强烈的抑制作用。1.03%与0.52%丁香油含药量平板中，未见菌丝生长；在0.26%与0.13%浓度下，丁香油对赤星病菌的菌丝生长抑制作用随浓度的增大而增强，且菌丝生长速率均显著低于对照；在同一浓度下，随时间的延长，对菌丝生长的抑制作用则基本呈降低的趋势。孢子悬浮液在不同含药平板48h后的萌发结果，见图4-2与表4-2，在含药量为0.26%时，肉眼未能看见孢子萌发为菌丝，此时0.13%含药量平板与对照组的菌丝生长明显。结合菌丝生长速率的实验结果，确定丁香油的最低抑菌浓度在0.52%-0.26%之间。45 西南大学硕士学位论文图4-2丁香油对烟草赤星病菌菌丝生长速率的影响Fig.4-2TheeffectofcaryophyllusoilonmyceliumgrowthrateofAlternariaalternata表4-2丁香油的最低抑菌浓度Table4-2Theminimalinhibitingconcentrationofthecaryophyllusoil供试菌种丁香油浓度/%PathogenicConcentrationfungi33.0016.508.254.132.01.030.520.260.13CK赤星病菌Alrernaria--------++alternataabcdefghiCK图4-3丁香油的最低抑菌浓度Fig.4-3Theminimalinhibitingconcentrationofthecaryophyllusoil注：a-i丁香油平板含药量依次为：33.00%、16.50%、8.25%、4.13%、2.0%、1.03%、0.52%、0.26%、0.13%Note:a-i:cloveoilcontentwere33.00%,16.50%,8.25%,4.13%,2.0%,1.03%,0.52%,0.26%,0.13%46 第4章抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制探究4.2.4丁香油对赤星病菌菌丝生长量的影响菌丝可以构成真菌不同类型的营养结构和繁殖结构，与病害的蔓延直接相关。图4-4-a显示A、B、C、D这4种丁香油浓度对菌丝的生长量都有一定的抑制作用。不同浓度对菌丝的生长量影响不同，随着丁香油浓度的增大，菌丝生长量降低，抑制效果增加，并与对照相比存在显著差异。除了对菌丝生长量的影响之外，丁香油对菌丝的黑色素产生也有一定影响，图4-4-b。ab图4-4丁香油对赤星病菌菌丝生长量的影响Fig.4-4TheeffectofcaryophyllusoilonmyceliaweightofAlternariaalternata4.2.5丁香油对赤星病菌细胞膜通透性的影响菌丝体的内含物外渗，会导致所测溶液电导率上升，而细胞内含物外渗是由于细胞膜透性遭到了破坏，因此通过测定菌丝在丁香油溶液中的电导率的变化，可知丁香油对菌丝体的细胞膜是否有影响。图4-5显示，在处理5h前，各浓度丁香油处理与对照处理之间渗透率差异不明显；5h后各组之间的相对渗透率差异逐渐显现，随丁香油浓度的提高，相对渗透率增大，且升高幅度增大，组间差异明显；而对照组菌丝渗透率较低，且呈缓慢上升趋势。说明丁香油对赤星病菌菌丝的细胞膜透性具有影响，能够破坏细胞[113]膜结构，处理5h后对细胞膜的破坏作用逐渐显现，随浓度升高作用增强。47 西南大学硕士学位论文图4-5丁香油对赤星病菌菌丝相对渗透率的影响Fig.4-5TheeffectofcaryophyllusoilonmyceliarelativepermeabilityofAlternariaalternata4.2.6丁香油对赤星病菌菌丝脂质过氧化的影响丙二醛（MDA）是细胞膜脂质过氧化的产物，其含量可以反映细胞膜受损程度大小，菌丝内MDA含量越高，说明细胞膜脂质过氧化的程度越高，细胞膜的受损程度越大。测定不同浓度丁香油处理后的菌丝体内MDA含量，由图4-6可知，在处理3d后，赤星病菌菌丝体内的MDA含量增加，处理组与对照组之间存在显著差异，且随处理浓度降低MDA含量下降。说明丁香油加速了赤星病菌的脂质过氧化，加剧了细胞膜损伤程度。图4-6丁香油对赤星病菌菌丝脂质过氧化的影响Fig.4-6TheeffectofcaryophyllusoilonmycelialipidperoxidationofAlternariaalternata48 第4章抑制赤星病菌的植物源物质筛选及其作用机制探究4.2.7丁香油对赤星病菌可溶性蛋白含量的影响测试结果显示，图4-7，丁香油对赤星病菌菌丝体内蛋白质的合成有一定影响，但本实验中其剂量依赖性不够显著，各组处理之间不存在统计学差异，可能是由于丁香油使用浓度较低，导致组间差异不够明显，也可能由于可溶性蛋白因细胞膜受损外漏到培养液导致菌丝体内的含量降低，蛋白抑制率降低。同时统计学差异不显著，不能完全说明丁香油不能抑制赤星病菌菌丝体内的蛋白质合成，其对赤星病菌蛋白质合成的影响还需要进一步验证。图4-7丁香油对赤星病菌可溶性蛋白合成的影响Fig.4-6TheeffectofcaryophyllusoilonmyceliasoluableproteininofAlternariaalternata4.3小结与讨论据报道，丁香油是一种活性很强的植物源物质，具有抗菌、抗病毒、抗氧化和抗癌等多种生物活性。丁香油的抑菌作用非常广谱，并具有良好的安全性。丁香油对食品中[114]常见的腐败菌有良好的抑制作用，也可以作为香料用于烟草以及食品加工中。楼兴隆等人的研究显示，丁香油对白菜黑斑、小麦纹枯、玉米大斑、葡萄炭疽、番茄黑霉等[115]农业病原菌也有一定抑制作用。本研究对15种植物源物质的抑菌活性进行测定，结果显示丁香油对烟草赤星病菌具有较好的抑制作用，在一定浓度下能够有效抑制孢子萌发和菌丝的生长速度，从而降低菌丝积累量。细胞膜系统对胞内外的物质交换和信息传递具有重要作用，其稳定性直接影响细胞内的相关代谢反应。菌丝细胞膜含有类脂质、蛋白质、甾醇和一些盐类，当细胞膜受损越严重时，丙二醛积累量会越高，细胞的脂质过氧化程度越严重，产生的活性氧也越多。[116]活性氧可以直接影响基因转录与细胞的信号传递，MDA也能与蛋白质和核酸反应，使其丧失活性。本试验结果表明，丁香油能够改变细胞膜相对通透性，使细胞内外环境平衡发生改变，使细胞内含物外渗；丁香油在处理5h后对细胞膜通透性的影响才逐渐显现，且组间差异随时间延长而增大，说明丁香油可能需要较长的作用时间。丁香油还49 西南大学硕士学位论文[117-119]能导致细胞膜脂质过氧化程度加重，使MDA含量增加，加速细胞膜的损伤。而本实验中MDA的剂量依赖性不明显，可能是由于MDA是小分子物质，当细胞膜受损[120]后，其可以释放到培养液中，所以菌丝内的MDA含量降低。在对菌丝内蛋白含量影响实验中，各组处理与对照之间虽然没有统计学差异，但是组间蛋白含量存在波动，其处理后的蛋白合成抑制率略高于对照，丁香油对菌丝内蛋白合成的影响还需加大剂量验证。综上所述，丁香油主要作用于赤星病菌细胞膜，并且可以破坏细胞膜结构，从而导致细胞的死亡，抑制赤星病菌的生长。这也与DeviKP等人对沙门氏菌的研究结果相[121,122]对应。除此之外，良好的菌丝生长速率和孢子萌发抑制效果，说明其可以作用于病害循环的不同阶段，全面抑制赤星病，具有开发为植物源农药的潜在价值。本研究虽然明确了丁香油对赤星病菌的抑制作用主要是由于对细胞膜的破坏，但其作用于脂质过氧化或蛋白质合成的哪一步，对核酸复制有何影响，以及是否还有其他的作用位点都待更为深入的研究来明确。同时在试验中发现丁香油对赤星病菌菌丝黑色素的产生也具有一定的影响，可以进一步研究。50 第5章结论与展望第5章结论与展望5.1结论5.1.1探索和建立了抗TMV物质的快速筛选评价体系以盆栽试验为基础，结合农杆菌介导等方法，初步建立了五点注药接种和注药摩擦接种为基础的抗病毒物质的筛选评价方法。通过ELISA检测与田间药效试验比对本体系的评价筛选结果，发现具有较好的一致性。说明本文初步探索和建立的2种评价筛选方法是准确可信的，具有可行性。与传统的枯斑法和叶碟法相比，该体系能够快速直观的反映药剂在病毒扩散和复制过程中的作用特点，且操作简单，试验成本低，周期短。5.1.2筛选获得2种植物源抗TMV物质并初步明确了其作用机制通过对15种植物源物质进行抗病毒活性测定，发现熊果酸与4-甲氧基香豆素具有一定抗TMV作用，预处理烟草后可以明显降低病毒初侵染积累量。本文研究结果显示，2种物质处理叶片后可以不同程度提高植物防御反应酶中POD、SOD、PPO活性，帮助分解过量的超氧化物；其中熊果酸降低质膜过氧化程度更明显；同时2种植物源物质可以上调防卫反应基因PR1、PR2以及NPR1的表达量，促进病程相关蛋白的合成，从而激活一系列防卫反应的发生，有效降低病毒的初侵染含量与扩散速度。此外，2种物质在体外对TMV也有一定作用，通过电镜观察，熊果酸能够使病毒粒体发生凝集现象，并降低病毒侵染烟草的活性，使荧光斑点数量减少。4-甲氧基香豆素具有类似的作用，但其引起的凝集现象相对较弱。5.1.3明确丁香油可以抑制赤星病菌并初步分析了其抑菌机制对15种植物源物质的抑菌活性测定发现，丁香油能够抑制赤星病菌的孢子萌发并降低菌丝生长速度和菌丝积累量。本文试验结果显示，丁香油对赤星病菌的作用位点主要为细胞膜。其能够影响细胞膜相对通透性，改变细胞内外环境平衡，使细胞内含物外渗；还能导致细胞膜脂质过氧化程度加重，使MDA含量增加，加速细胞膜的损伤；其对细胞膜的破坏作用随时间延长和浓度增加而提高。5.2展望本文初步建立的抗病毒物质筛选评价体系，具有快速、直观、简便的特点，可以加快筛选速度简化评价流程，具有良好的准确性和应用潜力。但本筛选体系也存在一些需要改进和注意的地方。如，完善荧光与病毒含量之间更准确的对应关系；考虑注射药物与实际生产中对植物处理方法的差异性；处理植物时，注意药剂的作用方式，避免因忽视药物的作用方式而造成抑制效果评价过低，或因注射药剂进入叶片而提高了药物进入51 西南大学硕士学位论文量，增大抑制效果。本文从多种植物源物质中筛选出的熊果酸与4-甲氧基香豆素，显示出良好的抗TMV活性，具有开发为植物源抗病毒制剂的潜在价值。试验证明2种物质能够影响植物酶活性，提高防卫反应相关基因的表达，达到抑制病毒，降低植物受损程度的作用。电镜结果显示2种物质对病毒具有体外作用，能够使病毒粒体发生聚集现象，但具体的作用机制尚不清楚。另一方面，在上文中已经提到有学者发现2种物质对元素吸收有影响，因此可以对其在植物生长代谢中的作用与对病毒外壳蛋白的影响进行深入研究。本实验证明丁香油具有良好的抑菌活性，能够抑制赤星病菌孢子萌发和菌丝生长，具有良好、全面的抑制效果。丁香油的抑菌作用广谱，兼具杀虫防腐的活性，安全高效，具有开发为植物源抑菌农药的潜力。本文主要研究了丁香油对赤星病菌的直接作用，而病害三角关系是非常复杂的，应该进一步明确其活体防治的效果，探讨丁香油与植物之间的作用关系。在作用机理方面除了测定其对细胞膜的破坏作用外，还应对病菌的呼吸、酶活以及核酸的影响等方面进行研究。目前丁香油在食品抑菌方面应用较多，但丁香油易挥发、水溶性低、对光敏感等原因限制了其在农业生产中的应用。因此有必要探讨丁香油在农业生产中适用的乳化体系，以此提高抑菌的稳定性和有效性，推进田间应用的进程。最后结合本文收集待筛选物质的启示，在寻找抑菌、抗病毒活性物质的过程中或许可以更多的借鉴医学等领域的研究结果和试验方法，提高筛选成功率。52 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致谢致谢人生匆匆数十载，这趟行驶了七年的列车将要到站，也预示着20载的学生身份即将褪去，但这是我生命中无与伦比的美好时光。四年本科，三年研究生，终于要在这里，在西南大学，在植物保护学院划上句号了。人生总是来不及做好准备就要扮演下一个生命中的角色，甚至还来不及好好回味，就要背上行囊与过去再见。看着我密密麻麻，承载了我三年梦想与汗水的实验记录本，五味夹杂。翻开第一页，整整齐齐工工整整大段大段的记录，那时天真地想，这么厚的记录本字要够大才能写满。直到后来，字越来越小间距越来越密，再然后不留一点儿空隙，最后加了另一个记录本。这些密密麻麻的记录，代表了无数的失败，无数的汗水，无数个深夜路灯下疲惫的身影。回想当初为自己的研究生阶段设定的小目标，还未完成的所剩无几，算是对时光无愧，但也有遗憾与不舍，总之不负辛苦，迎来了一个好的结果。研究生这三年成长和收获的太多太多，首先要得益于我的恩师孙现超研究员在我学业与人生中的指导和帮助，感谢您的理解与包容，更感谢您的支持和建议，让我可以更勇敢的历练；感谢青老师每一次对我们的严格要求与批评，都让我们变得更好；还有与我们同吃同玩，像朋友一样混在我们中间的吴根土老师，实验室的活百度，总是帮我们解决大大小小的问题；还有从本科就是我的班主任的胡伟伟老师，感谢您一路上对我的悉心指导与关心；当然还有我亲爱的小伙伴魏周玲、邓永杰、孙淼、荆陈沉、任江平以及已经毕业了的师兄师姐，感谢你们不厌其烦的解答和帮助，让我解决了许多研究上的困难；也非常感谢我的师妹潘琪、朱虹、彭浩然，本科师弟许博文、张鸿铭的帮忙，帮我分担了我许多试验中的负担；还有我的舍友熊铭渝、郭兵、胡浩、杨亮，与优秀的人同伍，一直激励我奋斗前行；还有一起曾在篮球场上拼搏的兄弟们，全校亚军虽怀遗憾却更加记忆犹新；最后还要感谢我的女朋友谭蕊对我的支持，相伴6年，花样年华；这一路上要感谢的人太多太多，受到的帮助和关心太多太多，也惭愧自己为大家付出的不够多，一切我都铭记在心。感谢我的父母及家人，谢谢你们一直以来给予我的理解、鼓励和支持，你们是我不断取得进步的永恒动力。谨以此文献给所有在我人生的大道上曾经支持、鼓励、帮助过我的人，谢谢你们!最后衷心的祝愿孙老师、青老师、吴老师、胡老师工作顺利，身体健康，事61 西南大学硕士学位论文事顺心；祝愿一起毕业的小伙伴们都越来越好，得到自己想要的；祝愿师弟师妹们实验顺利，早日实现自己的小目标。62 在学期间发表和已录用论文及参加课题在学期间已发表和已录用论文及参加课题发表论文1.张旺，申杰.首次在中草药竹叶子上检测到黄瓜花叶病毒.中国植物病理学会2016年学术年会论文集，2016:2632.杜利娟,薛杨,张旺,等.根癌农杆菌介导VirE2-N-EGFP在2种茄科植物中的表达分析[J].安徽农业科学,2015(33):254-256.3.赵雪君,邓永杰,魏周玲,张旺.蔬菜中黄瓜花叶病毒的RT-LAMP快速检测[J].园艺学报,2016,43(6):1203-1210.4.邓永杰，张旺，黄国联，等.放线菌JY-22对烟草赤星病菌的抑菌控病作用.中国植物病理学会2016年学术年会论文集，2016:4505.DouY,ZhangW,HuQ,etal.ResearchonAssessingPublicWeb-chatAccountsbasedontheDispersedGrayModelandComprehensiveEvaluationModel[C]//InternationalConferenceonEducation,Sports,ArtsandManagementEngineering.2016.专利1.孙现超，许博文，张旺，魏周玲，等.一种植物病毒抑制剂的快速筛选方法,105572089A，2016.（审中）科研项目1.重庆市社会事业与民生保障创新专项：蔬菜生态高效安全标准化生产技术建立与示范（cstc2015shms-ztzx80012）2.中国烟草总公司四川省公司科技项目：四川烟草叶部斑点病害绿色防控技术研究与示范应用（SCYC201703）3.中国烟草总公司湖南省公司科技项目：湖南烟草病毒病综合防治技术研究与综合防治示范（14-16ZDAa02）63
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