牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索

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分类号学号硕士学位论文牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索俞徐斌指导教师于汉寿副教授专业名称微生物学研究方向微生物资源与分子生态学答辩日期二〇一三年五月 THEBIOLOGICALCHARACTERISTICSOFSPIROPLASMAISOLATEDFROMGADFLYANDFLYANDSEARCHINGFORPATHOGENICRELATEDFACTORSOFSPIROPLASMAMELLIFERUMBYYUXUBINADISSERTATIONSUBMITTEDTONANJINGAGRICULTURALUNIVERSITYINPARTICALFUFILMENTOFTHEREQUIRMENTSFORTHEMASTERDEGREEOFSCIENCESUPERVISEDBY:ASSOCIATEPROFESSORYUHANSHOUDEPARTMENTOFMICROBIOLOGYCOLLEGEOFLIFESCIENCESNANJINGAGRICULTURALUNIVERSITYNANJING210095,P.R.CHINAMAY2013 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者(需亲笔)签名：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论,的规定,同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权南京农业大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编学位论文。保密口,在年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密‘请在以上方框内打学位论文作者(需亲笔)签名：年月。曰导师(需亲笔)签名：年爻月曰 本研究受国家自然科学基金项目资助(编号：。特此感谢 目录目录目录文献综述一、虻蝇类昆虫螺原体的研究概况螺原体的基本生物学特征虻科和蝇科类昆虫简介虻蝇类昆虫螺原体与宿主的关系虻蝇类昆虫螺原体的生物多样性与地理位置的关系二、螺原体致病相关因子研究进展动植物中主要致病性螺原体螺原体主要致病相关因子點附相关膜蛋白几丁质酶和几丁质脱乙酰基酶其他潜在致病相关因子三、本研究的主要内容、目的和意义第一章牛虻和家蝇螺原体的生物学特性材料与方法牛虻和家蝇样品的采集、保存及鉴定螺原体的分离、纯化及保存及培养基的配制螺原体的分离、纯化及保存螺原体形态,运动性,滤过性研究暗视野显微镜及透射电镜下观察菌体的形态和运动性固体菌落形态特征观察及螺原体滤过性研究螺原体生长特性的研究螺原体生长曲线的测定透射电镜下观察不同生长时期的螺原体形态以及其繁殖方式对螺原体生长的影响 俞徐斌牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索螺原体对血清的需求螺原体对碳水化合物的利用不同蔗糖浓度对螺原体生长的影响螺原体对精氨酸和尿素的利用螺原体对抗生素的敏感试验暗视野显微镜下螺原体点状的观察螺原体单向血清学分析生长抑制试验代谢抑制试验螺原体系统发育学分析螺原体基因组的提取方法目的片段的扩增与电泳检测目的片段测序系统发育分析结果与分析昆虫的采集、保存及鉴定螺原体的分离、纯化及保存螺原体形态、运动性、滤过性研究螺原体分离菌株的生长特性暗视野显微镜下螺原体点状观察螺原体单向血清学分析螺原体系统发育学分析小结与讨论参文献第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析与克隆表达第一节蜜蜂螺原体儿丁质酶序列生物信息学分析材料与方法施结果与分析儿丁质酶氨基酸序列的结构及其编码氨基酸序列的理化性质 目录几丁质酶氨基酸序列与其他细菌的似性比较螺原体几丁质酶的疏水性亲水性、膜结构域、信号肽、功能域预测螺原体几丁质酶的二级结构,三级结构特征螺原体几丁质酶氨基酸序列‘子系统进化特征第二节蜜蜂螺原体潜在致病相关基因的克与表达材料与方法供试菌株与试剂方法结果与分析小结与讨论附录：部分牛虻螺原体菌株及序列搜索结果攻读硕士期间发表的学术论文 摘要牛虻和家姆螺原体生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索摘要螺原体(是一类无细胞壁、形态呈螺旋状的原核生物,以昆虫和植物为主要宿主,大多数与宿主互生,少数对动植物具有致病性。国外研究人员从紀姆类昆虫体内分离到大量的螺原体,这类昆虫体内具有丰富的螺原体资源。而国内有关昆虫螺原体的研究很少。本研究的目标首先是调查我国虻蝇类昆虫体内螺原体的存在情况,初步了解螺原体的生物多样性和地理多样性。此外,螺原体引起的蜜蜂爬蜂病在我国发生普遍,其次是在测定蜜蜂螺原体基因组序列的基灿上,选择蜜蜂螺原体致病过程中可能涉及的一些致病相关因子,应用生物信息学方法进行分析,并研究部分潜在致病相关基因的体外表达,为今后深入研究蜜蜂螺原体的致病机理奠定基础。主要研究结果有：第一,从江苏南京、浙江永康、广西桂林三地采集的只牛虻和只苍蝇样品中分离得到大量螺原体菌株。对其中分离自嗜牛原妃(的株螺原体和分离自家姆的株螺原体的基本生物学特性进行了研究。株螺原体在形态学,生理生化特性上基本一致。在对数生长期呈典型的螺旋状,呈翻滚式运动,菌体能通过孔径为以及的微孔滤膜,在固体培养基上的菌落呈颗粒状或者不规则状,生长的范围在之间,最适在左右；它们都能代谢葡萄糖和果糖,除、、株菌外其他菌株均能利用甘露醇；分离菌株均不能代请精氨酸和尿素,生长速度较快,大约在就能达到对数生长期。单向血清学试验结果表明,牛虻螺原体与蜜蜂螺原体、引起乳鼠白内障的及中华绒螯蟹颤抖病的的亲缘关系较远。第二,采用改良过的法提取螺原体基因组,扩增序列。根据序列构建系统发育树,所有分离菌株分为个进化支,分别为和。大多紀姆类昆虫螺原体菌株与聚类,且自展值接近而与聚类与聚类。进一步利用转录间隔区序列(以及编码聚合酶亚基的基因(作为基因,进行系统发育学分析,验证了的分析结果,并能有效地区分不同紀姆类螺原体菌株。根据分离菌株的生物学特性、部分血清学特性和系统发育学分析,将分离自牛虻的菌株、初步鉴定为 俞徐斌牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索为。分离自家蝇的和分离自牛虻的其他菌株等均初步鉴定为。第三,在测定了蜜蜂螺原体基因组序列的基础上,对蜜蜂螺原体所特有的几丁质酶基因进行生物信息学分析,结果表明：(不同细菌几丁质酶的氨基酸序列长度大小及其理化性质虽存在一定差异,但都含有个保守氨基酸片段,分别是。螺原体几丁质酶无跨膜结构域,但有一个与相匹配的功能结构域,具有降解碳水化合物的功能；其二级结构是以卷曲和螺旋为主要的结构元件,折叠和转角散布于整个结构,其目标蛋白序列与模型序列的相似度达到,可认为目标蛋白的三维结构与模型三维结构基本相似。(依据几丁质酶氨基酸序列构建的进化树分析,不同细菌几丁质酶的进化关系上可分为四大支；蜜蜂螺原体几丁质酶与其他细菌几丁质酶的亲缘关系较远。第四,经生物信息学分析,几丁质酶基因、几丁质脱乙酰基酶基因和蛋白基因是蜜蜂螺原体中个可能与致病相关的基因。本研究成功克隆出这个基因的全长,并在大肠杆菌中完整表达了几丁质脱乙醜基酵基因和蛋白基因,部分表达了几丁质醉基因,进一步证实螺原体中的编码色氨酸而非终止密码子。本研究结果为今后进一步确定这些基因在蜜蜂螺原体致病过程中的作用奠定基础。关键词：牛虻；螺原体；生物学特性；生物信息学；致病相关因子；克隆表达 AJ3S丁丁,,,, 俞徐斌牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索,,,,,,,, ABSTRACTrelatedfactorsinpathogenesisof5.melliferumCH-1.KEYWORDS： 文献综述文献综述一、蛇螺类昆虫螺原体的研究概况螺原体的基本生物学特征螺原体是一类呈螺旋状、无细胞壁的原核生物,是原核生物中能独立生活和自我复制的最小及最简单的生命形式之一。与其他细菌相比,螺原体基因组较小,介于之间,基因组最小与最大的菌株分别是与；,。在结构上,螺原体无细胞壁和鞭毛结构,仅靠具有三层结构的的单位膜包裹(。螺原体普遍存在于节肢动物体内和植物花表面,节肢动物中又以昆虫为主要宿主,在膜翅目昆虫和双翅目昆虫中均有分离到螺原体的报道,据等调查研究,虹科类与姆科类昆虫是螺原体最丰富的资源库(,。蛇科和頓科类昆虫简介蛇科昆虫在全世界范围内分布广泛,在我国的东北,华北地区亦名“瞎蛇”,有的地区也有“牛紋子”,“牛苍姆”之称。在分类学上,它属于节肢动物门,昆虫纲,双翅目,蛇科,大部分蛇科昆虫体长头半球形；触角牛角状,复眼大,常有金属光泽(许再福等,。生活史过程包括卵、幼虫、踊和成虫个阶段,其幼虫的滋生场所较为繁杂,大体上可分为水生、半水生和陆生等几种类型,但以潮湿的泥土为主。雌性类虹：科大部分吸血,在草原地带或者山区,虹科类昆虫也会对野外工作人员造成威胁,尤其是对牲畜如牛,马骚扰甚大(刘增加,。此外,蛇类幼虫多为肉食性,也可叮咬人,有调査表明,在稻田中作业的农民,手脚被其叮咬后轻者可产生伤口和肿块,重则引起继发感染。蛇对畜牧业的危害也较严重,有统计资料表明,由于它的吸血骚扰可导致畜肉和奶的产量下降,严重时产奶量可下降。此外,虹还是卫生害虫中最重要的机械吸血传播疾病者,由蛇传播的疾病包括苏拉病、家畜的血孢子虫和焦虫等原虫病,马传贫等病毒病(卫生害虫及其危害,。据年统计,全世界蛇科种类约有种,我国蛇科类余种(猫保中等,。幡科昆虫在分类学上属于节肢动物门,昆虫纲,双翅目,姆科,大部分妮科昆虫体色为灰黑色,胸部背板具有黑色纵条纹；体长在之间,头部有额囊缝,唇瓣发达,触角芒羽状；成虫多取食人畜粪便,食物以及腐烂的有机物,它是肺结核、伤寒、拒疾百日咳、霍乱、肺炎等人类多种疾病病原携带者和介体,因此该科昆 俞徐斌牛忙和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索虫有许多是非常重要的卫生害虫(许再福等。据年统计,全世界姆科种类约有余种,我国贼科类余种(播保中等,。牛蛇中药材名虹；虫)为专性吸血昆虫,也是传统的抗血栓中药材,在多种抗血检中成药生产中被用作原料。近年来,中国科学院昆明动物研究所赖初研究员领导的课题组围绕牛虹：成功吸血的分子机制和发挥抗血栓的物质基础等问题对其开展了较为系统的研究,从牛虹：唾液腺中分离了多种功能活性蛋白或多肽(,。最近,该课题组与美国国立卫生研究院(的教授和博士合作,从牛蛇唾液腺中鉴定出了一类新型去整合素家族蛋白,该蛋白通过作用于膜受体以及从而显著地抑制血小板聚集和抑制血管生成。该工作提供了一类新型的抗血栓或血管生成抑制剂类抗肿瘤药物候选分子(,。蛇頓类昆虫螺原体与宿主的关系螺原体作为昆虫内共生细菌之一,它们和宿主之间的关系分为互惠共生、致病(和共栖(三种,其中大多数为共栖关系(。螺原体的致病性与否跟其穿过昆虫肠道屏障有紧密联系,一旦穿过昆虫肠道进入血淋巴或者生殖系统就可能对宿主产生致病性(。在已有的报道中,所有虹：科昆虫螺原体与宿主间的关系为共栖关系,螺原体对虹：科宿主无明显的病症。有研究表明内共生体对昆虫起着重要的促进作用,它们可能涉及了昆虫细胞的多项生理功能,如信号转导,泡囊运输,细胞程序化死亡等(也有研究报道指出内共生菌的存在有益于宿主昆虫防御天敌,提高昆虫对环境的忍耐以及提高繁殖力等(,。目前,对于螺原体与昆虫之间的相互作用研究较少,尤其是对媚科类螺原体与宿主间的相互作用在国内外并无深入的研究。蛇螺类昆虫螺原体的生物多样性与地理位置的关系在温暖气候条件下,经过螺原体生物多样性的大量调查,发现蛇妮类昆虫螺原体宿主遍布于南美、北美、欧洲、非洲、澳大利亚、亚洲等地(,。由于螺原体与宿主关系密切,螺原体的分布受到宿主地理分布的限制。早期的研究表明,某些螺原体有明确的地理分布,例如,仅能在较小的地理区域(美国乔治亚州)的忙类昆虫中分离到,而能在美国东南地区及俄克拉何马州分离到(。随着取样地点的增加,螺原体的分布可能包括了更广泛的地理区域。从澳大利亚、哥斯达黎加等地搜集不同区域蛇姆类昆虫分离螺原体,结果共分离到近株螺原体。之后对这些分离物进行单向血清学分析,统计结果表明这些菌株属于螺原体个新血清组,并且在每一个地点都可以分到不同血清组类 文献综述型的螺原体,例如在澳大利亚就可以分到种不同血清组类型的螺原体,。蛇虫里类昆虫是螺原体最富有的资源库,随着螺原体资源的广泛调查,大量的蛇姆类昆虫螺原体被发现,目前已在蛇科和姆科昆虫体内分离到的螺原体见表。表此姆类昆虫螺原体的血清组类型表是根据,,,等文献整理得到。,：表示无从表中可以看出,仅从蛇媚类昆虫中分离得到的螺原体就覆盖了个螺原体血清组,这揭示着亡觸类昆虫蕴含着丰富的螺原体资源。还可以得出在同一种蛇绳中可以分离到不同种类的螺原体,也进一步证明了蛇媽类昆虫螺原体的宿主特异性不强,说明螺原体的传播方式可能是水平传播。根据部分序列对蛇媚类昆虫螺原体进行系统发育学分析(图,得出,大部分蛇姆类螺原体都属于这一大进化支,血清组为组中的虹：姆螺原体属于这一进化支。结合表和图可以得出：在鹿虫亡 俞徐斌牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索和食跑姆宿主中分别分禹得到和两种螺原体,在系统发育学上的亲缘关系较近；不同采集地点的同一宿主(宿主均为中分罔到的螺原体如分离自法国)和分离自美国)的两株菌的亲缘关系较近；在同一地点同一宿主体内分离得到两种或两种以上的不同种类螺原体,如澳大利亚分离菌株群,等,分别代表新的血清组、、等。综上所述,地理分布可能在螺原体血清组分类上起到非常重要的作用,如果对其它地方的蛇绳类昆虫宿主广泛调查,则可能也会出现同样的不同血清组或者处于不同进化支的螺原体分离群。’以—丨以—,袖‘‘一站——‘——糊——￡—‘——“—输办——图根据部分序列对姆类螺原体构建的树 文献综述二、螺原体致病相关因子研究进展动植物中主要致病性螺原体到目前为止,已发现多种螺原体可导致动植物病害。首次被发现的对植物具有致病性的螺原体是导致玉米矮化病的类似于支原体的微生物,后来被命名为。年,另一种致病性螺原体分离培养成功,该螺原体能感染相橘的靭皮部蹄管,并且经昆虫传播到其他植物宿主中(,。最近研究发现在华盛顿州和加利福尼亚州还感染胡萝卜引起紫叶病(。年,在长春花植物中分离到另一株病原螺原体能引起紫苑黄化病(。在动物致病性螺原体中,首先在美国马里兰州发现引起蜜蜂的病害,甚至大量死亡的后来,在法国也发现能引起蜜蜂“五月病”(的另一种螺原体这两种致病性螺原体对蜜蜂养殖造成较大的损失(。年,等在兔壁風中又成功分离到另一病原菌能使乳鼠患白内障(,。近二十年来,在其他动物中也陆续发现了致病性螺原体,如等发现的能引起果幡性比失调,等发现引起奸病的：以及国内王文教授发现了能导致中华绒螯蟹颤抖病的螺原体新种等在患有痒病的羊眼中分离到；。表致病性螺原体基因组特征表示未测定；根据年中国微生物学会学术年会(南京)上王文教授的报告整理。‘近年来,随着分子生物学的发展,尤其是基因组测序技术的快速发展,给各国学者对螺原体致病相关因子的研究提供了方便。一些研究机构和实验室对以上的部分病原菌进行了基因组测序,从而在分子机制水平来进一步了解螺原体的传播以及在致病 俞徐斌牛蛇和家幌螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索过程中涉及的一些潜在致病相关因子(,。目前基因组已测序和正在测序的螺原体有等,但由于所测螺原体基因组中含有大量的病毒重复序列,目前还没有螺原体的基因组完成图公布。已测序的螺原体基因组一般特征如表。从表可以看出,已测定的株螺原体基因组旳大小在之间,含量在基因的平均大小,预测的功能蛋白的数量以及的数量因菌株而异；螺原体的基因组大小均比一般的细菌小。螺原体主要致病相关因子在螺原体中的一些毒力因子参与螺原体对宿主昆虫的吸附和侵入,从表中看出,在螺原体传播转移和侵入昆虫宿主过程中,可能涉及的因子有几丁质酶,几丁质脱乙醜基酶,蛋白,蛋白质,蛋白质,脂蛋白,點附素等,其中几丁质酶和几丁质脱乙酷基酶是螺原体中特有的因子,在已测序的其他螺原体基因组中,并未发现有几丁质酶基因和几丁质脱乙酰基酶基因。表螺原体致病相关因子螺原体随着昆虫介体在相橘初皮部之间活动而进行传播,并引起相橘相应的病症,目前许多科学家都致力于在分子水平研究螺原体是如何进入昆虫体内进行传播。研究较多的是中的點附相关膜蛋白,在细胞中不仅螺原体基因组中含有编码黏附相关膜蛋白的基因,其细胞内所含有的个质粒中的个质粒也编码个薪附相关膜蛋白(。不管在支原体还是在螺原体中,膜脂蛋白已 文献综述成为研究的焦点。黏附相关膜蛋白(支原体与螺原体都是没有细胞壁的柔膜菌纲中的原核生物,在致病过程中首先要黏附到宿主表面,如肺炎支原体侵染过程的第一步就是依靠末端的特殊结构點附于呼吸道點膜上皮细胞表面,通过不同机制引起宿主细胞损伤,涉及到點附蛋白,,和然后通过产生致病因子过氧化氢使宿主细胞的触酶(失去活力,最终侵入宿主细胞。与肺炎支原体(类似的其他支原体种也可通过细胞膜融合侵入宿主细胞,如穿透支原体和发酵支原体丨、。黏附相关因子在人和动物致病性支原体中就有进一步的研究,当支原体黏附到人或者动物宿主细胞时,寄主细胞上的膜受体则会有相应的变化(。支原体點附蛋白以及编码點附蛋白的基因调控表达也相应都有一些变化(。广—“————图的结构域组成(”螺原体与支原体都缺少细胞壁,侵染过程中的第一步也是依靠细胞膜表面的一些吸附相关蛋白點附到宿主表面。研究表明,被介体叶赠传播的过程中涉及到了黏附和侵入两个步骤,在这个过程中就可能涉及到蛋白,该蛋白质的末端含有膜连接结构,末端信号序列的存在,这表明是一个膜结合表面蛋白,经核苷酸测序比对分析,的上游有三个,其中编码一个与同源性较高的蛋白,参与了枯草芽孢杆菌染色体分离(,则编码蛋白质,在的端存在信号肽序列,并有六个重复基序(,这些基序的存在可能与螺原体基因水平转移有关,在末端附近存在即跨膜区；蛋白与同源性比较高,如图, 俞徐斌牛蛇和家幡螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索。在附着到叶婢单层细胞过程中起到了关键黏附作用(。与相类似蛋白还有它是由：细胞内的质粒编码的,它也是螺原体进入叶婢细胞内重要蛋白(。在點附到宿主细胞之后,主要依靠与宿主细胞膜结合后形成细胞质囊泡侵入叶婢唾液腺细胞,即需要受体介导的内吞作用(。体内的蛋白的可变异性为螺原体与宿主间的相互作用的研究提供依据,也为研究螺原体在各种宿主上的定殖提供了理论基础(。在中华绒螯蟹致病性螺原体■中,是一个點附相关蛋白,王文等在体外克隆表达出,并利用这个蛋白作为抗原,注射到中华续螯蟹体内,发现能引起榜蟹的免疫反应,而且能使一些免疫相关的基因如上调(。通过介体叶婢的作用在植物间传播,在此过程中,脂蛋白起到了重要作用。等将野生型菌株用随机插入失活基因的方法把体内编码脂蛋白的基因打断突变成然后将突变型和野生型菌株分别感染宿主叶峰,结果发现,的传播能力以及传播效率均比野生型菌株低,且穿过叶婢唾液腺的能力也显著降低,将突变菌株回复突变后,传播能力和穿过唾液腺效率又变回野生型能力,这说明脂蛋白在以叶蝶为介体的植物间传播过程中起到了重要作用(。螺旋蛋白作为螺原体细胞膜上的主要成分,是螺原体属所特有的蛋白,也是螺原体膜上最为丰富的脂蛋白,这类蛋白含有典型的信号肽序列(大约个氨基酸),高度保守的中心区,螺旋和两个氨基酸重复序列,螺旋将这个蛋白错定在细胞膜上,组成脂蛋白,这类脂蛋白一般都具有抗原性(。等指出,螺旋蛋白可能不是致病所需的因子,但以昆虫介导的传播离不开螺旋蛋白。等将编码螺旋蛋白基因突变后,螺原体传播效率降低了倍(。等将引起中华线螯蟹颤抖病的病原菌编码螺旋蛋白基因在大肠杆菌中克隆表达并将重组蛋白作为抗原,注射到河蟹体内,引起河蟹的免疫反应(,。为进一步了解螺原体在叶蜂介导下的传播分子机制,等用蛋白质印迹法来检测叶婢体内蛋白与螺原体蛋白的相互作用,结果发现,与螺原体作用的叶赠体内蛋白质有七个,大小在之间,对这些蛋白质进行鉴定,结果发现,叶赠体内蛋白质为甘露醇糖蛋白,属于糖蛋白凝集素类。而与这类糖蛋白凝集素结合的螺原体蛋白被鉴定为螺旋蛋白(,大小为。 文献综述几丁质酶和几丁质脱乙酰基酶自从首次报道了芽孢杆菌、能产生几丁质酵以来,人们陆续发现在其他微生物也能产生几丁质酶：细菌如粘质沙雷氏菌’放线菌如灰色链霉菌和一些真菌如球孢白僵菌米曲霉在自然界中,产几丁质酶的微生物分布广泛,它们对几丁质的降解起着重要的作用(陈三风等,,,彭仁旺等,。微生物产几丁质酶按反应初级产物类型可分为内切几丁质酶和外切几丁质酶。根据其氨基酸序列的同源性可分成家族和家族两大类按最适作用可分为酸性、中性和碱性几丁质酶。家族广泛存在于各种生物中,而家族大多存在于植物中,自从在灰色链霉菌中发现第一个非植物来源的家族几丁质酶后,研究表明链霉菌中普遍存在家族几丁质酶。阿洛菌素可抑制家族几丁质酶,而对家族不起作用(欧阳石文等,。虽然各种几丁质酶差异较大,但多数微生物几丁质酶都具有相似的结构域,从端到端依次含有信号肽(,几丁质酶催化域(,几丁质结合域以及一个短的端区域(图。信号肽几丁质酶信化域几丁质结佥域端区域图微生物几丁质酵的一级结构(冯俊丽等,几丁质酶在抗病基因工程、害虫防治、医药以及动物饲料等行业都有广泛的应用。许多科学家致力于将外源微生物的几丁质酶基因转入植物中以增加植物的抗病抗虫性,这些植物表达的几丁质酶生物活性不仅可以抗真菌,还对植物线虫、昆虫和其他一些病原微生物具有抗性作用。如苏云金芽孢杆菌⑶、产生的几丁质酶对昆虫致病作用,由于许多昆虫的中肠具有围食膜(围食膜由几丁质、蛋白质和透明质酸等组成,主要成分是几丁质,而围食膜是昆虫防止病原细菌或病毒传染的天然屏障,苏云金芽孢杆菌产生的几丁质酶水解昆虫中肠的几丁质,有助于苏云金芽孢杆菌侵染昆虫(。等研究证明,几丁质是昆虫表皮和围食膜的重要组成成分,昆虫生长、发育的各个时期都需要一定量的几丁质(,。等发现几丁质酶能够使分离自舞毒蛾或龄幼虫的围食膜穿孔,用含有几丁质酶 俞徐斌牛和家蝶螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索的食物饲喂幼虫,同样可观察到围食膜上有穿孔(。用灰色链霉菌的几丁质酶处理黄杉毒蛾⑴幼虫的离体围食膜,围食膜表面也变得粗糖,整个表面出现小洞或被侵烛的坑(。徐红革等测定了沙雷氏杆菌菌株产几丁质酶对棉铃虫不同虫龄幼虫的毒力,并考察了几丁质酶对棉铃虫幼虫发育的影响(徐红革等,。此外,微生物几丁质酶在害虫生物防治中起到增效作用,等在年期间进行了大面积森林防治云杉卷叶蛾试验。分别用苏云金芽孢杆菌制剂加几丁质酶、单用苏云金芽孢杆菌制剂和对照个处理。结果显示苏云金芽孢杆菌制剂加酶处理幼虫死亡率比单用苏云金芽孢杆菌制剂提高。几丁质脱乙醜基酶(是几丁质降解酶成员之一,它可以将几丁质转化为壳聚糖(,几丁质脱乙醜基酶来源广泛,如真菌、酵母和昆虫等都发现几丁质脱乙醜基酶的存在,是几丁质降解酶系成员之一,能够催化几丁质中糖苷键连接的乙酰基葡糖胺的乙酰胺基的水解。等研究结果表明几丁质脱乙醜基酶基因也与中肠围食膜有关。搭带夜蛾几丁质脱乙酰基酶旳作用是参与改变围食膜中的几丁质的物理和化学性质,而这一生化过程不仅改变几丁质的纤维结构,而且对围食膜蛋白的结合程度、围食膜的完整性和孔隙率产生影响。目前,通过破坏几丁质结构或几丁质代谢的平衡来杀死昆虫以达到防治害虫的目的,具有极大的发展潜力。如等从炭谊病菌的‘中分离纯化并鉴定出几丁质脱乙醜基酶(；李玲等从苜宿实夜蛾中克隆出几丁质脱乙酰基酶基因,并对编码几丁质脱乙酷基酶序列以及氨基酸序列进行分析,为分子水平上研究几丁质脱乙酰基酶的功能、几丁质的代谢机制及生物防治新方法奠定基础(李玲等,。最近应用基因组学和蛋白质学技术研究发现,两株蜜蜂螺原体：和中均存在编码几丁质酶和几丁质脱乙酷基酶基因,等推测几丁质酶与几丁质脱乙酰基酶可能是蜜蜂螺原体对蜜蜂潜在致病因子之一。等将植物致病性螺原体与昆虫致病性螺原体於的基因组进行比较,发现■—些特有的基因如,和这些基因编码产物能消化纤维二糖,几丁质,乙酰酸等物质,因此螺原体就通过利用几丁质酶降解昆虫肠道几丁质来促进其侵入蜜蜂肠上皮细胞；另外,螺原体也可能利用纤维二糖酶来部分水解蜜蜂体内花粉的细胞壁中的纤维二糖当作自身额外的碳源,说明这些基因的存在可能与螺原体适应蜜蜂肠道内环境有关。对以上两个基因组比较还发现：所特有的几丁质酶基因和纤维二糖酶基因都与唾菌体 文献综述基因相邻,提示这些基因可能由唾菌体介导的水平转移得到；经里面的数据比对,在柔膜菌纲中没有发现其他物种含有几丁质酶基因,的几丁质酶基因与乳球菌属、和肠球菌属中的几丁质酶基因同源性比较高(,,。目前,研究人员已经克隆了乳酸乳球菌属和肠球菌属中的几丁质酶基因以及粉纹夜蛾、棉铃虫、搭带夜蛾等几种昆虫的几丁质脱乙酷基酶基因并对其活性和功能进行了初步研究(,。其他潜在致病相关因子支原体细胞表面存在點附蛋白,这类蛋白在支原体和它们的宿主间的互作中起重要作用(,如點附蛋白和。来自于中基因片段中编码的与以上两个點附蛋白具有很高的相似性(图,但该蛋白质的功能需要进一步验证(。,嫁一纖國】图基因组中片段组成转运蛋白系统一般有多个由个氨基酸亚基组成,有一个高度保守的与结合的结构域,两个疏水性跨膜结构域,有多个螺旋跨膜片段形成一个通道,大多数转运蛋白在生物学功能上与跨膜转运有关(。转运蛋白系统(也被认为与螺原体致病性有关,等发现稻瘟病菌在感染水稻过程中通过上调编码蛋白基因来阻止水稻的防御机制(,,,；转运蛋白在化脓性链球菌中,是毒力因子之一(,。研究人员根据如基因组的测序和功能预测结果,注释了个转运蛋白系统的功能,其中个系统参与了修复和氧化应激反应,推测这类转运蛋白对螺原体吸收养分,耐药性起到关键作用,也可能是螺原体中一个毒力因子,需要进一步验证(。 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索此外,有报道螺原体对糖类的利用与其致病性有关。等通过转座子祁随机插入基因组的方法将果糖操纵子声基因断裂,使螺原体：不能利用果糖,得到突变株’,然后将此突变株注射到叶婢中,借助叶婢传播感染长春花植物,与感染野生型相比,长春花植物症状减轻甚至未发现症状；回复突变试验结果显示斤基因的回复突变导致恢复利用果糖,这也间接地恢复了螺原体对植物的致病性(,。细胞中葡萄糖通透酶由两个不同多肽组成,分别由和声泊基因编码；等通过同源重组将：细胞中；基因突变,使螺原体不能运输利用葡萄糖,但结果得到的突变株与野生型一样对长春花植物具有致病性；这说明并不是螺原体致病所需要的因子,同时也说明在果糖和葡萄糖都存在的条件下,螺原体优先利用果糖。对感染了■或者的植物进行碳水化合物的提取,并用核磁共振分析提取液,发现提取液中很多糖类积累,尤其是果糖,说明感染了螺原体的长春花植物果糖的积累和螺原体优先利用果糖之间存在一定关系(。磷酸甘油激酶在螺原体侵入到叶婢宿主细胞时起到了内在化(作用。等用共聚焦显微镜观察含有螺原体的叶虫单唾液腺发现,螺原体与宿主细胞上的肌动微丝骨架相结合,与肌动微丝骨架结合的蛋白经液相色谱质谱联用分析鉴定为憐酸甘油激酶；将基因克隆并体外表达,再进行体外竞争性试验,进一步证实了螺原体内在化到宿主细胞中需要的存在；等还发现以叶单为介体的螺原体的传播能力与螺原体中的磷酸甘油激酶和叶幡体内肌动蛋白的结合能力有关,磷酸甘油激酶的主要结合区在,在第氨基酸之间(。信号识别颗粒(,普遍存在于真核生物中,而有研究报道在细菌中发现有一种核糖核蛋白颗粒,这类颗粒蛋白与真核生物中的信号识别颗粒具有同源序列(。类似于真核生物信号识别颗粒的蛋白参与了大分子的运输,将细胞内新合成的膜蛋白插入到细胞质膜中。有研究报道,大肠杆菌中类似于真核生物的颗粒蛋白已经被证明在大肠杆菌中蛋白质输出过程中的重要作用(,。具有致病性的酵母菌白色念珠菌中分离到与高度同源的蛋白质,该蛋白质可能在致病过程中起作用(。等在螺原体蛋白质组中还鉴定出类似于真菌信号识别颗粒的蛋白、未知功能的蛋白和蛋白等,目前对于这类蛋白质的功能并不清楚,但这类蛋白均属于诱导型表达蛋白。在丰富的培养基和合适的培养条件下都能产生这类蛋白,说明这类蛋白在螺原体生理活动中起重要作用,结合基因组测序和功能注释结果,将这类蛋白归为 文献综述昨的潜在毒力因子(,。三、本研究的主要内容、目的和意义螺原体是原核生物中能独立生活和自我复制的最小及最简单的生命形式之一,它是通过细胞壁的缺失和基因组的减少等途径从梭菌属退行性进化而来。由于螺原体无细胞壁和鞭毛,以及特有的细胞骨架及菌体形状呈螺旋状等特性,它常作为研究细胞的基本生物学特性及运动的模式生物,是一类重要的微生物资源。目前,国外对虹：姆类昆虫螺原体的资源搜索工作较多,而我国有关虹：姆类昆虫螺原体资源很少有报道,本研究主要内容之一是搜集我国部分地区蛇姆类螺原体,从江苏省南京市,广西壮族自治区桂林市以及浙江省永康市三个地方采集牛蛇和苍绳样本分离螺原体,并研究分离菌株的基本生物学特性,血清学特性及系统发育学特性等,初步确定其分类地位,为进一步研究我国昆虫螺原体资源、生物多样性及其地理分布提供重要资料。此外,爬蜂病在蜜蜂养殖业发生普遍,此病害导致蜂产品下降,严重威胁着养蜂业的生产。螺原体是引起蜜蜂爬蜂病的病原之一,感染蜜蜂螺原体的蜜蜂前期症状不明显,中期则行动缓慢,后期失去飞翔能力,然后爬到蜂场低桂处聚集,最后抽搐而死(黄坚,。自年从病蜂体内分离到蜜蜂螺原体诉以来,许多研究人员对蜜蜂螺原体性爬蜂病的发病规律、侵染循环进行了探索,如李霞等对螺原体的侵染循环以及在蜜蜂体内的定殖进行了初步的研究(李霞但目前对蜜蜂螺原体的致病机理了解很少。近年来,通过测定螺原体基因组序列对蜜蜂螺原体致病相关因子进行了探索,并与昆虫非致病性螺原体比较陆续发现或推测蜜蜂螺原体的一些致病相关因子,如：几丁质酶,几丁质脱乙酷基酶,以及蛋白等,但这些因子在致病过程中的确切作用有待进一步明确。为此,本研究在测定了引起我国蜜蜂螺原体病的主要病原：基因组序列的基础上,应用生物信息学技术分析几丁质酶,进一步克隆表达种与致病可能相关的基因：几丁质酶基因、几丁质脱乙酷基酶基因以及蛋白基因,为进一步研究蜜蜂螺原体的致病机理以及爬蜂病的诊断和防治奠定基础。同时,由于螺原体基因组较小,缺少细胞壁等特殊性,本研究也为今后建立螺原体基因敲除等遗传操作系统进行相关基因表达特性与功能分析提供重要信息。 俞徐斌牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索参考文献,,,,,,,,,,,,,,, 文献综述,,,,,,,,,,,,, 俞徐斌牛虹和家顿螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索,,,？,,,,,,,,,,, 文献综述,,,,,,,,,, 俞徐斌牛忙和家媚螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索,,,,,,,,,,,,,’ 文献综述,,,,,,,,,,,,,, 俞徐斌中蛇和家贼螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索,,,,,,,,,,,陈三风,李季伦几丁质酶研究历史和发展前景微生物学通报,,冯俊丽,朱旭芬微生物几丁质酶的分子生物学研究浙江大学学报黄坚论蜜蜂爬蜂病及其防治措施中国蜂业,】】李玲,樊东,吴丽梅,等苜猜实夜蛾几丁质脱乙酰基酶基因序列的克隆与序列分析植物保护,李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及在蜜蜂体内的定殖研究南京农业大学硕士学位论文,南京, 文献综述刘增加甘肃蛇类调查研究报告与综述西北国防医学杂志,播保中昆虫学基础与常见种类识别科学出版社欧阳石文,冯兰香,赵开军几丁质酶的三级结构和催化机制■生命的化学,彭仁旺,管考梅,黄秀梨球孢白僵菌两种胞外几丁质酶的诱导和纯化微生物学报,,徐红革,彭辉银沙雷氏杆菌菌株产几丁质酶对棉铃虫不同虫龄幼虫的后致死作用微生物学报,卫生害虫及其危害续中国媒介生物学及控制杂志,许再福普通昆虫学科学出版社 第一章牛忙和家赐螺原体的生物学特性第一章牛蛇和家螺螺原体的生物学特性要：从江苏南京,浙江永康,广西桂林三地采集只牛紀样品,在南京六合区采集只苍竭■样本,经宿主鉴定牛妃为嗜牛原紀分离到螺原体的苍竭■属于家姆。用常规方法分离到大量螺原体,并对其中个分离物进行纯化,将纯化得到的菌株进行形态学观察、生理生化试全、单向血清学试验以及系统发育学分析。研究发现株螺原体在形态学,生理生化特性上基本一致,在对数生长期呈典型的螺旋状,均能通过孔径、的滤膜。根据分离菌株的生物学特性、部分血清学特性和系统发育学分析,将分离自牛紀的菌株、初步鉴定为为。分离自家姆的和分离自牛紀的其他菌株等均初步鉴定为。结果初步表明,在我国牛紀体内也存在丰冨的螺原体资源,且同一种牛：体内可能存在种或种以上不同种的螺原体,大部分牛紀体内的螺原体与分离自法国)的亲缘关系最近。这些结果揭示我国紀賤类昆虫螺原体具有丰富的生物多样性和地理分布多样性。关键词：螺原体；牛系统发育分析；生物学特性；法—螺原体(是一种螺旋状、无细胞壁,能独立生活和自我复制的最简单的一类原核生物,它的基因组在之间(,。螺原体没有细胞壁和鞭毛,仅靠单层膜包裹整个细胞,常作为研究运动的模式生物(。螺原体主要存在于昆虫体内、植物体内和植物花表面,它和宿主的关系可分为互利共生(、偏利互生(和寄生(种,其中大多数为共生或者互生关系(。蛇科昆虫体内具有丰富的螺原体资源,在美国马里兰州,首次发现蛇科昆虫螺原体(,。目前在美国和法国,已有大量的螺原体从蛇科昆虫,如马顿和鹿幡体内分离得到(。年等报道,虫亡姆类是螺原体最富有的资源库,仅蛇科类昆虫中分离到的螺原体就已经覆盖了个螺原体血清组(,到年,又新增加了个血清组：年等从哥斯达黎加的虹：科昆虫中分离到多种螺原体,属于新增加的血清组；年等在澳大利亚的蛇科昆虫里也分离到大量螺原体,属于新增加的血清组这 俞徐斌牛和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索充分说明了螺原体属内具有很丰富的生物多样性和地理多样性。系统发育学研究表明,从蛇科宿主中分离到的菌株包括’,均属于这一大支并且这几株菌株之间亲缘关系较近(；其中加标准菌株和标准菌株分别是从法国和美国的蛇科宿主和体内分离得到(。而标准菌株则是在美国马里兰、丨的双翅目媚科宿主体内分离得到(,属于这一大进化支。年,等根据序列对株螺原体构建系统发育树,将螺原体分成三大进化支：进化枝、进化枝、进化枝(。研究表明序列可以作为一■个遗传在种水平上进行螺原体的分类鉴定(,并能区分大多数不同血清组的螺原体,甚至部分不同的血清亚组,这就为利用序列分析来逐渐取代经典的血清学方法提供了依据(,。近年来,许多研究人员在不能有效区分不同血清亚组的情况下,尝试利用一些新的基因构建系统发育树,在分子水平对螺原体种进行分类鉴定,如等对序列进行分析,较好的区分了不同血清亚组的螺原体等利用基因对奸蟹中的螺原体进行了分析还有等分别用了等序列对果绳中的螺原体进行了系统发育学分析(,,它们都很好的区分螺原体种间关系。目前还没有我国虹：科、媚科昆虫螺原体的相关报道,本研究以牛蛇和家幡体内分离到的株螺原体为研究对象,通过形态学特性、生理生化特性研究、单向血清学试验以及系统发育学分析初步确定其分类地位,为进一步研究螺原体与宿主间的相互作用提供信息。材料与方法牛蛇和家頓样品的采集、保存及鉴定年至年,在浙江永康,江苏南京,广西桂林个省市采集牛蛇及苍绳样本。并选择形态完整、典型的部分牛蛇样本和苍幡样本,保存在含有的乙醇离心管中,用于宿主鉴定。分离到螺原体的牛虹样本和苍姆样本,根据《中国动物志》并在南京农业大学植物保护学院昆虫学系孙长海老师协助下,进行宿主鉴定。 第一章牛：和家幡螺原体的生物学特性螺原体的分离、纯化及保存及培养基的配制准确称量表中各种组分后溶解,将溶解液的调节到左右,用滤纸除去溶液中大颗粒,高压灭菌。待培养基冷却后,加入经孔径为的滤膜过滤的胎牛血清及青霉素钠陈永萱等。表培养基及基本培养基的配方鹿糖(酷红水(注：成分：牛心脏浸出液,蛋白胨,氯化钠固体培养基则在含有表成分的液体培养基中加入的琼脂,高压灭菌后,待冷却至°左右,加入过滤除菌后的胎牛血清和青霉素钠。将瓶装的液体培养基分别分装到无菌的离心管中,使每个离心管中含有培养基,°过夜静置培养观察其是否在分装培养基过程中污染其他杂菌。若无污染,则°保存,备用。分装培养基与分装培养基操作一致。螺原体的分离、纯化及保存将采集到的牛蛇进行分类标号,将整个牛蛇用的次氯酸钠溶液进行表面消毒再用无菌水洗漆次,用无菌摄子将牛忙从腹部剖开,取其腹部,在的培养基内碾碎,并浸泡用孔径的微孔滤膜加压过滤；取将滤液放到新鲜培养基中于°培养箱中培养；逐日观察培养基颜色变化,并用暗视野显微镜(型)观察(陈永萱等,。用梯度稀释法对分离到的菌株进行纯化(,,即将对数生长期的螺原体菌液用培养基作的梯度稀释,然后再°培养箱中静置培养,每天观察培养基的颜色变化情况,直至最后一管生长至对数生长期,如此反复次,即可获得螺原体的纯培养。应用种方法保存螺原体：转管继代培养,甘油保存和滤纸片法。甘油保存法是将对生长期的螺原体与的甘油等体积混合,放入冰箱中保藏。滤纸片保存法是将对数生长期的螺原体菌液滴加到经过高压灭菌且烘干后直径为的滤纸片 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索中,室温瞭干后将滤纸片放入无菌离心管中,密封放入冰箱中保存。螺原体形态,运动性,滤过性研究暗视野显微镜及透射电镜下观察菌体的形态和运动性取的螺原体对数生长期的菌液,用暗视野显微镜(观察螺原体的形态和运动性。分别取对数生长期的螺原体、、、、菌液,离心弃上清,用洗涤次,加入等体积的戊二酸固定,于°静置,吸一滴固定后的液体置于铜网上,静置,用滤纸吸干溶液,再用的憐妈酸钠溶液(染色,用滤纸吸千,风干后用透射电镜(观察,并拍照记录螺原体的形态特征(阮康勤等,。固体菌落形态特征观察及螺原体滤过性研究将对数生长期的螺原体菌液涂布于固体培养基表面,°静置培养,并逐日观察培养基颜色,待固体培养由红色变为黄色时,用倒置显微镜(观察螺原体的菌落形态,并测量其大小(陈永萱等,。用无菌注射器吸取对数生长期的螺原体菌液,加压通过、的微孔滤膜,用暗视野显微镜观察有无螺原体存在；同时取：滤液到新鲜的培养基中,°静置培养,观察有无螺原体(。螺原体生长特性的研究螺原体生长曲线的测定釆用颜色改变单位(计数法(曹玉璞等,测定螺原体的生长曲线。将培养至对数生长期的螺原体菌液用液体培养基作梯度稀释,于°下静置培养,观察培养基颜色变化,以培养基颜色改变的最后一管作为待测菌液的。取初始浓度为的对数生长期的螺原体菌液接种于的新鲜培养基中,平行管,°下静置培养,采用法计数,同时用暗视野显微镜每观察一次活动菌体数及菌体形态变化情况。次重复。透射电镜下观察不同生长时期的螺原体形态以及其繁殖方式选取一株牛蛇螺原体,用负染法在透射电子显微镜下观察不同生长阶段的螺原体形态,并拍照记录不同时期的形态特征,推测其可能的繁殖方式(阮康勤等,。 第一章牛和家贼螺原体的生物学特性对螺原体生长的影响配制的憐酸缓冲液(,代替培养基中的蒸馈水,调节分别为、、、、、、和共八个梯度,分别接种对数生长期的螺原体菌液,每接种量为,每个个重复,°恒温培养,后镜检活动菌体数,并同步法计数,绘制螺原体生长随变化的曲线图。继续培养一周,变色或者菌体数量明显增加的转接的菌液到新鲜培养基中,重复次,根据法计数结果确定螺原体生长的范围(陈永萱等,。螺原体对血清的需求取对数生长期的螺原体菌液接种于不含胎牛血清的培养基中,：静置培养,连续转管次,观察其生长情况,并用暗视野显微镜观察验证(陈永萱等,。螺原体对碳水化合物的利用将葡萄糖、果糖、木糖、山梨糖、半乳糖和甘露醇等单糖配成的母液,将乳糖和鹿糖配成的母液,分别用孔径为的微孔滤膜过滤灭菌后,加入培养基内,使加入后单糖的浓度为,双糖的浓度为,使总体积为。接种对数生长期的菌液,°静置培养,逐日观察培养基颜色变化,同时用暗视野显微镜检查菌体是否有明显增加,将变黄的培养液移入含糖的培养基中进行转管培养,如此转管次以上,以避免接种时带入的培养基影响。同时以接种培养基和不加糖的基本培养基作为对照。变黄的处理作为阳性,未变的处理保留观察周。次重复(陈永萱等,。不同蔬糖浓度对螺原体生长的影响在培养基中,分别加入不同量的鹿糖,使其终浓度分别为、、、、、、、分别接种对数期的牛蛇螺原体、、菌液,每中加菌液,每个鹿糖浓度平行管,°恒温静置培养,后镜检螺原体,并同步法计数,绘制不同鹿糖浓度对螺原体生长的影响曲线图。继续培养一周,变色或菌体数目明显增加的转接至同样培养基次,确定适合螺原体生长的鹿糖浓度范围。螺原体对精氨酸和尿素的利用将精氨酸和尿素分别配成、的母液,过滤灭菌后加入基中,使精氨酸的最终浓度为,尿素为接种对数生长期的菌液,°静置培养,逐日观察培养基颜色变化,并用暗视野显微镜检查菌体量是否增加。将培 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索养基颜色发生改变和菌体量明显增加的培养液在含尿素或精氨酸的培养基中至少转管次。以培养基颜色变深或菌量明显增加的作为阳性,接种基本培养基和培养基作为对照。重复次。螺原体对抗生素的敏感试验抗生素敏感性试验方法根据参照文献郭永红等,稍作修改,接种量为,测定了其最低抑制浓度值(和最低杀菌浓度值。供试菌株有：、、、暗视野显微镜下螺原体点状的观察在固体培养基中接种牛螺原体菌液,均匀涂布,在°培养箱中培养,待培养基变黄色之后,在超净台上用倒置显微镜观察到螺原体菌落,并用牙签挑取菌落放置在含有的培养基的无菌载玻片上,均勻散幵,盖上无菌盖玻片,在暗视野显微镜下观察螺原体,并拍照记录螺原体形态特征,从载玻片上吸取转接到新鲜培养基中,°恒温静置培养,待培养基变黄,取菌液镜检,拍照观察其形态特征。螺原体单向血清学分析利用抗原抗体反应的原理,本研究采用生长抑制试验,代谢抑制试验种血清学方法来分析分离菌株螺原体与其他螺原体之间的亲缘关系。供试菌株：牛蛇螺原体、、家幡螺原体,蜜蜂螺原体。实验室已保存的抗血清：,和正常兔血清。生长抑制试验取直径灭菌干燥的圆形滤纸片,滴加抗血清,在超净台中吹干。待吹干后,将其放入已接的供试菌株的固体培养基中央,°下静置培养,待培养基变黄后,测量滤纸边缘到菌落生长边缘的距离,即生长抑制距离,并用倒置显微镜观察验证,每个处理重复次正常的兔血清作对照。代谢抑制试验将抗血清在无菌离心管中做倍稀释至第管,各取滴入微孔测定板(孔,分别以不加抗血清的抗原孔和不加供试菌株的培养基孔作为菌液对照和空白对照,然后向孔加入供试菌株的培养液( 第一章牛蛇和家姆螺原体的生物学特性用培养基将各孔滴加至密封后于°下静置培养,当培养基空白对照颜色未变化而菌液对照颜色变黄时,立即判断结果,即记录能抑制颜色变化的抗血清的最高稀释度,作为该抗血清对供试菌株的代谢抑制效价,次重复(。螺原体系统发育学分析螺原体基因组的提取方法采用方法稍作修改提取螺原体基因组(王冠明等,即去除其中巯基乙醇这一有毒试剂,具体方法如下：将螺原体菌株接种于液体培养基中,°静置培养。待培养基变黄后,取螺原体菌液离心。沉淀物加入的缓冲液,反复吹打使螺原体菌体重新悬浮,加入和的蛋白酶尺,混勻后置于°水浴锅温育。加入…充分混勻后,再加入溶液,混匀后再°温育。加入等体积的酷氯仿异戊醇混勻,离心将上清转入新管中,加入倍体积的异丙醇,轻轻混匀,离心。沉淀用的乙醇洗漆后,离心弃乙醇。风干后加；含溶解基因组。电泳检测基因组。目旳片段的扩増与电泳检测扩增,以及序列所用引物如表所示(,,扩增片段分为序列及序列(包括及的部分序列、间隔区)以及编码聚合酶亚基序列。表扩增引物基因产物引物编号引物序列—,,’’’ 俞徐斌牛虹和家喊螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索扩增,以及序列所用的体系相同：含模板酶总体系为,所用试剂均购自东盛生物公司。反应程序为：°预变性°变性退火,°延伸,共个循环,最后°延伸。扩增产物立即用的琼脂糖电泳检测或°保存备用。序列反应程序为：°预变性°变性,°退火°延伸,共个循环,最后°延伸。扩增产物立即用的琼脂糖电泳检测或°保存备用。序列扩增程序为：°预变性°变性,：退火,°延伸,共个循环,最后延伸。扩增产物立即用的琼脂糖电泳检测或°保存备用。目旳片段测序经的琼脂糖凝胶电泳检测,挑取条带单一明亮的扩增产物送上海美吉生物医药科技有限公司进行测序。系统发育分析采用多种生物学软件对测得的序列进行分析,构建系统发育树。本研究中用到的软件及功能主要有：基于法基础上的系统发育树的构建工具,主要用于序列格式的编辑整理,比对结果可进行系统发育树的构建。系统发育树构建软件,可进行多种系统发育分析方法的运算。通过比较直观的窗口进行操作,并能够对构建的系统发育树进行编辑。将测序所得序列在中进行比对。根据比对结果,下载与菌株以及同源并经过菌种鉴定的序列,并将其整理成格式的文件。用进行多重比对后,对所选序列的长度进行编辑整理,使进行系统发育分析的序列长度基本一致,然后用采用邻接法(构建系统发育树(,以与属亲缘关系比较近的作为外群。结果与分析昆虫的采集、保存及鉴定年至年间,在浙江永康,江苏南京,广西桂林个省市,共采集牛亡样本只,苍姆样本只。将采集到的一部分昆虫样本进行编号,用乙醇浸 第一章牛虹和家崎螺原体的生物学特性泡保存样本,：保存用于宿主昆虫的鉴定。经宿主鉴定,分离到螺原体的宿主牛虹：为嗜牛原虹：双翅目！科’原蛇属图。大小不同,体色差异的牛！处于不同成长阶段；苍绳被鉴定为家姆双翅目虫單科、’家姆属(图。議議■图螺原体宿主(、：嗜牛原：家蝇)：：螺原体的分离、纯化及保存采用常规的昆虫螺原体的分离方法,对采自不同地区的牛蛇进行螺原体分离,在所有的牛蛇个体中均分离到大量螺原体,共分离得到管螺原体分离物。表来自三个地点的分离菌株宿主采集时间釆样地点菌株名宿主浙江永康嗜牛原蛇虹：科双翅目嗜牛原忙科双翅目嗜牛原科双翅目嗜牛原蛇！科双翅目嗜牛原蛇！科双翅目嗜牛原蛇虫亡科双翅目嗜牛原蛇虹科双翅目江苏南京嗜牛原蛇蛇科双翅目嗜牛原蛇科双翅目嗜牛原虹：科双翅目家虫場姆科双翅目广西桂林嗜牛原忙蛇科双翅目嗜牛原蛇蛇科双翅目嗜牛原蛇虹：科双翅目嗜牛原蛇！科双翅目嗜牛原蛇科双翅目嗜牛原虹：科双翅目注：每个菌株保存方法有滤纸片保存,甘油保存 俞徐斌牛蛇和家妈螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索牛虹：分离率达到。仅分离到一株螺原体。而在只家姆样品中只分离到一株螺原体,苍姆分离率低,仅为。挑取株分离自三个不同地区来自不同牛蛇个体的分离物以及株家姆螺原体分离物,釆用梯度稀释法纯化次后得到纯菌株表。将纯化后的株牛虹螺原体采用不同的方法保存。采用甘油保存法保存菌株半年后,螺原体菌株代谢能力下降,活化所需时间比较长；釆用滤纸片保存法,在一年后活化所需时间较短,代谢能力旺盛。螺原体形态、运动性、滤过性研究在°静置培养条件下,分尚得到的牛蛇螺原体在培养基中生长良好,分禹自三个地区的牛虹；螺原体均生长的较快,大部分菌株在液体培养中培养后,培养基有红色变为黄色；而、、这三株菌株生长比其他菌株慢,需要生长使培养基变黄。上述菌株在无菌注射器加压情况下,均能通过孔径、的微孔滤膜,过滤到新鲜的培养基中均能生长良好。在暗视野显微镜观察下均可见大量螺旋细丝状螺原体(图它们在液体培养基中呈螺旋翻滚式运动。图暗视野显微镜下的螺原体形态采用负染法在透射电子显微镜下观察分离菌株的显微结构。所有分离菌株在生长对数期均可见丝状螺旋菌体,在较高的方法倍数下可见单位膜结构和尖端结构(图。对于螺原体的大小和螺旋数,各菌株之间存在差异。其中形态较粗,螺旋数较少,约为个；而、、形态比较细长,螺旋数在之间。 第一章牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性,赏广—喻■；■、卿、：邏‘“—攀”、上厂；、一—图牛蛇螺原体经负染后在透射电镜下的形态局部放大图；局部放大图；注：箭头表示单位膜结构倒置显微镜下观察分离菌株的菌落形态,分离菌株的生长速度存在着差异,大部分菌株在°培养时,均能使培养基变黄,而菌株、、则需要才使培养基变黄。株菌的菌落形态有所差异,有圆形,颗粒状,則蛋状,有補圆形,不规则状等；大小在之间。(图飞◎、图螺原体,和的菌落形‘态培养基,螺原体分离菌株的生长特性 俞徐斌牛和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索表表示株螺原体对各种碳水化合物的代谢能力。从表中可以看出,所有分离菌株都可以利用葡萄糖、果糖作为碳源,不能利用半乳糖、山梨糖、木糖、乳糖；所有分离菌株都能利用庶糖,大部分菌株除、、不能利用甘露醇外,其他菌株均能利用甘露醇。在暗视野显微镜下可见大量螺旋细丝状菌体在做剧烈翻滚运动。而所有菌株均不能代谢精氨酸,接种培养一周后培养基仍为红色,镜检视野可见极少菌体,运动缓慢,菌体变形。所有分离菌株都不能代谢尿素。表供试菌株对几种物质的代谢特性单糖多糖其他物质菌株甘露醇木糖半乳糖山梨糖果糖葡萄糖乳糖鹿糖精氣酸尿素不加血清■■■■■注为阳性反应,表示能利用：：为阴性反应,表示不能利用；在不含胎牛血清的培养基中,供试菌株都不能生长,说明株分离菌株依赖血清中的留醇。在含不同浓度的氨节青霉素钠(、、、培养基中,所有供试菌株都能良好生长。牛蛇螺原体在低于和高于鹿糖浓度下均不能生长,暗视野显微镜下观察到的菌体严重变形；最适鹿糖浓度在至之间,偏离最适渗透压越远,菌体变形越严重,螺原体生长量越少图。 第一章牛忙和家赠螺原体的生物学特性不同鹿糖浓度对螺原体生长的影响「“—鹿糖浓度(图不同庶糖浓度对螺原体生长的影晌表四株螺原体对几种抗生素的敏感性抗生素…“——‘：霄：素卡那：素：■注最低抑制浓度最低杀菌浓度由于螺原体没有细胞壁,且对抗生素敏感性也是细菌的重要生理生化特性,有必要测定其对部分抗生素的敏感性。株螺原体对四环素比较敏感,其次是氯霉素,庆大霉素,卡那霉素；青霉素对螺原体无明显的抑制作用；株螺原体对种抗生素有明显的差异：牛蛇螺原体、对四环素的敏感性比蜜蜂螺原体■更加敏感,牛蛇螺原体、对于庆大霉素和卡那霉素比蜜蜂螺原体敏感性弱(表。在最适温度下,牛蛇螺原体和家媚螺原体的生长速度均快于蜜蜂螺原体。牛蛇螺原体菌株之间以及牛螺原体与家姆螺原体之间的生长差异略有不同,牛蛇螺原体和家姆螺原体均在时达到对数生长期,并快速 俞徐斌牛虹：和家贼螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索进入稳定期,稳定期大概能持续,但很快进入衰亡期,在之内菌体基本衰亡殆尽,取衰亡末期的菌体进行观察,菌体严重变形,呈团状及点状。这说明了牛虫亡螺原体相对于蜜蜂螺原体,其生长周期明显快于蜜蜂螺原体(图。最适温度下螺原体生长曲——■——念—彳“：像■幸——“：丄、：丨——■—图螺原体最适温度下的生长曲线在电镜下观察不同时期,牛蛇螺原体的不同形态(图,结果显示,螺原体在延滞期(图和图)时,螺原体呈点状,在培养基中,°下静置培养至,点状螺原体缓慢生长至对数期(图,形成典型的螺旋状,再由对数期进入稳定期图和随着螺原体代谢物的增加以及培养基中的营养成分的减少,螺原体再由稳定期进入衰亡期(图,形态又变回原来的点状,形成一个完整的生长周期。事‘■二泰“‘“‘—贫—二产贫響图电镜下观察不同生长时期螺原体形态 第一章牛蛇和家姆螺原体的生物学特性牛！亡螺原体与家姆螺原体的最适均为之间,每个螺原体之间的最适略有差异(图。继续培养的结果表明螺原体最低耐受约为,最高耐受高达强酸强碱下对所有牛蛇螺原体均有致死效应,此时在暗视野显微镜下观察到的螺原体形态严重变形或者成团状。在最适范围内,所有螺原体均有典型的螺旋状,运动性也最强。在较低和较高的下,螺原体生长量少,呈圆点状,螺旋状不明显。謂■―“聽■、”？、‘‘‘‘‘■‘■‘‘：；？勺？；：？‘】‘‘‘■图分离菌株在不同下的生长曲线浙江永康菌株广西桂林菌株江苏南京菌株暗视野显微镜下螺原体点状观察挑菌落镜检■泡■■液体静罝培养■图螺原体点状 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索挑取菌落在暗视野显微镜下观察到的螺原体形态为点状,无典型的螺旋状,但经过培养后,培养基由红色变为黄色,螺原体由点状变成典型的螺旋状,这说明螺原体在暗视野显微镜下观察到的点状物均为螺原体处在延滞期和衰亡期所分裂出来的子细胞,在良好的生长条件下,这些子细胞会生长为典型的螺旋状(图。螺原体单向血清学分析生长抑制试验结果见表和图,对于抗血清和啡对牛蛇螺原体和苍姆螺原体的抑菌圈均为零,无明显的抑菌圈,说明它们间无明显的血清学关系,分离得到牛蛇螺原体菌株与三个菌株的亲缘关系较远。表生长抑制试验抗血清菌株(±图生长抑制试验、、、、分别是洲抗体对,,,、、、、分别是抗体对,,,,、、、、分别是抗体对、、、阴性对照(阴性血清对 第一章牛蛇和家姆螺原体的生物学特性、、、、、、、、；、、、、、瞧一—图代谢抑制试验、、分别是抗体以及对菌株、、分别是抗体以及对菌株、分别是抗体,以及对菌株、、分别是抗体,以及对菌株是抗体■对菌株分别为正常兔血清对菌株为阳性对照、、以及对菌株、、分别是抗体以及对菌株、、分别是抗体以及对菌株、、分别是抗体以及对菌株,代谢抑制试验测定所得结果与生长抑制试验的结果一致(表和图。抗血清和对牛蛇螺原体和苍姆螺原体的抗血清效价均为零。这进一步说明它们间无明显的血清学关系,分离得到牛蛇螺原体菌株与这三个菌株的亲缘关系较远。 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索表代谢抑制试验一抗血清菌株(螺原体系统发育学分析采用改良后法提取螺原体基因组,电泳检测条带清晰明亮,大小在以上,获得了,以及十七株螺原体基因组。(图选择了三个保守序列和序列来比较牛虹：螺原体与其他已知序列的螺原体的关系,初步了解分离菌株的分类地位。参照前人报道的螺原体,以及引物,成功扩增出牛蛇螺原体,,和苍绳螺原体的序列和序列。扩增出来的电泳条带明亮清晰且单一(图、、,将所测得的序列提交到中,获得了登入序列号如表。图株螺原体基因组将测得的株菌序列在数据库中进行搜索,结果表明,在序列和序列中,与大部分牛蛇螺原体相似度最高的是而,则与加相似度最高,达到；菌株与相似度也达到。从中 第一章牛蛇和家妈螺原体的生物学特性下载的序列进行初步分析后,选择不同血清组和不同血清亚组的标准菌株用于系统发育学分析。经多重序列比对后编辑整理,用于构建、及序列系统发育树的碱基序列长度分别约为和。表和序列的序列号序歹号囷株名注：序列未提交根据,序列,序列,釆用邻接法构建了系统发育树进行分析图、、。一方面,基于序列构建的系统发育树显示,分离菌株分为两支：大部分菌株均属于支,与高度聚类’而则属于进化支,与高度聚类。基于序列与序列构建的发育树也得到了一致结果。另一方面,基于序列构建的系统发育树显示,,与：聚类自展值达到与聚类自展值达到与：聚类自展值达到而且序列与序列构建的系统发育树进一步证明,菌株,与亲缘关系较近,与：亲缘关系较近；与 俞徐斌牛虹和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索亲缘关系较近。图蟪原体菌株增图谱注：表示图螺原体菌株扩增图谱注表示。。图螺原体菌株扩增图谱注表示 第一章牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性參▲①■￠—「⑴參—图根据序列对株螺原体构建的发育树法,次)注：不同颜色代表不同地理位置；不同形状代表不同宿主：； 俞徐斌牛虹和家喊螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索參】〗‘严—￡攀七合“■厂春印咖厂—飞图根据序列对株媒原体构建的发育树法,次)注：不同颜色代表不同地理位置；不同形状代表不同宿主：； 第一章牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性？；上；卜二一「图根据序列对株螺原体构建的系统发育树注：不同颜色代表不同地理位置；不同形状代表不同宿主：； 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索小结与讨论节肢动物门是动物界最大的一门,种类繁多。我国地处亚州东部,地域辽阔,生态环境多种多样,昆虫资源丰富,牛蛇既是中药材,又是卫生害虫,已成为越来越多研究者的研究对象,如赖铺领导的团队通过对牛！唾液腺分泌物中蛋白质和多肽的结构和药理功能进行了系统的研究(,。本研究从牛蛇体内分离到大量的螺原体菌株,分离率达,而家姆螺原体分离率并不高。本文研究了其中个代表性菌株的基本生物学特性。这是国内首次在牛蛇体内分离到大量螺原体。按照国际柔膜菌纲分类委员会规定,鉴定一个菌株需要对其进行多相分类研究和详细描述,除了描述其表型特征和血清学特征外,还需要了解其系统发育学特性(,。本研究对分离菌株的形态学,基本生物学以及系统发育学特性进行了测定。结果表明,所有牛虹：螺原体和家幡螺原体分离菌株在培养基中生长良好,在含有青霉素的液体培养基中也都能良好生长,并且螺原体在生长过程中需要血清；暗视野显微镜以及负染电镜下都观察到在对数生长期的螺原体呈典型的螺旋状,做翻滚式运动,这些表型特性符合等对螺原体属形态的描述(,。代谢能力研究表明,牛蛇螺原体菌株均不能利用尿素和精氨酸；所分离的大部分牛蛇螺原体与家贼螺原体无明显差异却与蜜蜂螺原体：糖类代谢和精氨酸利用方面有差异；可能两者之间在相关的代谢途径中存在差异。大部分牛蛇螺原体与,以及则在代谢甘露醇能力上有差异。牛虹螺原体,在低于和高于鹿糖浓度下均不能生长,最适鹿糖浓度在至之间,偏离最适渗透压越远,菌体变形越严重,螺原体生长量越少。牛蛇螺原体与家顿螺原体的最适均为之间,不同螺原体菌株的最适略有差异。继续培养的结果表明螺原体最低耐受约为,最高耐受高达,强酸强碱下对所有牛蛇螺原体均有致死效应,此时在暗视野显微镜下观察到的螺原体严重变形或者成团状。在最适范围内,所有螺原体均有典型的螺旋状,运动性也最强。在较低和较高的下,螺原体生长量少,呈圆点状,螺旋状不明显。从株螺原体中挑取株螺原体,在体外测定其对抗生素敏感性,在测定的青霉素的浓度范围内对株螺原体无任何抑制或者致死作用,这是因为青霉素的作用机理是抑制细菌细胞壁的合成,而螺原体无细胞壁。其它种抗生素的作用机制是抑制蛋白质或核酸的合成,因而对株螺原体的生长都有不同程度的影响。不同抗生素对不同螺原体菌株生长的影响存在差异,其中以四环素抑制作用最强,其次是氯霉素,庆大霉素,卡那霉素。因此,四环素可用于蹄选含有四环素抗性基因重组型螺原体。 第一章牛和家姆螺原体的生物学特性在暗视野显微镜下,经常观察到一些点状物,为了进一步确认点状是螺原体的某一时期的一种形态,本研究在菌落中挑取螺原体单菌落在暗视野观察下,在视野内均无典型的螺旋状,经过的培养,在暗视野显微镜下观察到典型的螺旋状,与之前的猜测结果一致：点状是螺原体生命周期中一个特殊形态,且有可能处于延滞期与衰亡期的临界。通过对处于不同生长时期的螺原体进行负染电子显微镜下观察,了解其不同生长阶段的形态特征。螺原体在延滞期时的形态为点状,对数生长期为典型的螺旋状,到了稳定期,螺原体的形态开始多样化,有串珠状,芽状,分枝状,这可能与它的生殖方式有关(到了衰亡期,由于缺乏营养以及的下降,螺原体菌体幵始解体,成为点状。从株螺原体中,挑取代表性的株菌,测定了其生长曲线。结果表明,株菌的生长曲线都分为延滞期,对数期,稳定期,衰亡期个典型时期。株牛蛇螺原体和株家姆螺原体的生长速度明显快于蜜蜂螺原体,稳定期和衰亡期明显小于蜜蜂螺原体。生长速度出现较大差异可能与蜜蜂和牛蛇的不同生活习性有关。螺原体的分类基础是借鉴支原体的分类的基础,根据菌株之间血清学关系来确定其亲缘关系。等年提出用于支原体(种的鉴定(而后在螺原体血清学研究和分类,鉴定上有了广泛的应用(,。本研究利用的抗血清,引起乳鼠白内障的的抗血清及引起中华绒毛蟹颤抖病的的抗血清对株牛蛇螺原体和株家幡螺原体进行单向血清学试验,包括代谢抑制试验和生长抑制试验。生长抑制试验表明,种抗体对株牛忙螺原体和株家绳螺原体均无明显的抑菌圈；代谢抑制试验与生长试验结果一致,种抗体对牛虹：螺原体和家贼螺原体的效价均为。初步的血清学分析表明牛！螺原体和家姆螺原体与蜜蜂螺原体引起乳鼠白内障的及引起中华绒毛蟹颤抖病的的亲缘关系较远。螺原体基因组提取的方法此前有试剂盒法、法等(李霞等,,所提取的基因组均能用于后续的等分子生物学实验。本研究用改良过的方法提取螺原体基因组,并去掉了其中的琉基乙醇这一有毒试剂,结果表明这一方法也适用于螺原体基因组的提取,不影响后续分子实验的效果。此方法的优点在于减少了法中的有机毒害物质的使用,同时由于该方法提取的基因组中含有,也为与相关实验提供了方便,如后续试验中只需要可在提取的混合核酸中加入,去除其中的,反之可用去除,试验需要提取到高纯度的或时,可根据具体需要采用其他提 俞徐斌牛！和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索纯方法。但其缺点是比一般的提取方法如法耗时,可能也含有其他杂质。此外,法在植物病原物核酸的提取和检测中运用广泛,如提取病毒、类病毒、植原体、细菌、真菌侵染植物的叶、芽、基、柄的总核酸(赵嘉等,吴发红等,昂沙沙等,。因此,法已成为一种广泛的核酸提取的方法。本研究采用了个序列片段对牛蛇螺原体及家姆螺原体进行了系统发育学分析,以求获得更加精确的螺原体种间关系。无论是基于序列,序列还是序列构建的发育树均表明,分离到的大部分牛虹：螺原体和家姆螺原体属于—支但属于不同亚支,所有的牛蛇螺原体和家幡螺原体与蜜蜂螺原体亲缘关系较远,差异较大；在年分离到的牛蛇螺原体属于一大进化支,与聚类；大部分牛蛇螺原体和家虫帛螺原体与聚类；和与聚类。个基因座都有效且一致性地反映了我国三个地方虹：姆类昆虫螺原体之间以及与其他昆虫螺原体间的亲缘关系。根据分离菌株的生物学特性、部分血清学特性和系统发育学分析,将分离菌株、、、、、、、、、、、初步鉴定为,、为：为。从我国虹：姆类昆虫宿主分离到的螺原体与国外株标准菌株的亲缘关系非常近。这株标准菌株以及的血清型分别是属于,组和组。有研究表明,利用对个血清组的螺原体构建系统发育树,反映出的螺原体的亲缘关系与经典的血清学反映的关系一致,所以初步推测在我国分离到的虹：姆类昆虫螺原体主要主要有血清型和组和组,其确定的血清型还有待更全面的血清学试验验证。如扩大采样地点和牛蛇的样本数量,可能会分离到更多不同种类的螺原体菌株。目前在蛇科宿主中已报道的螺原体种或菌株大部分属于系统发育树的这一大支(与除外),其中与本研究中的分离株亲缘关系较近的是分离自法国的,和美国的。本研究中的株牛虹：螺原体的宿主采样地点为浙江永康,株为江苏南京,株为广西桂林,株家姆螺原体的宿主米自江苏南京。在同一地点可分离到亲缘关系较远的菌株,而不同地理位置的分离菌株的亲缘关系可能很近,揭示了地理位置与螺原体的亲缘关系没有显著的相关性。不管是牛蛇宿主还是家姆宿主,都分 第一章牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性离到了与：亲缘关系较近的螺原体菌株,这进一步说明了牛虹：螺原体的宿主特性不强。从牛蛇体内分离到与■分离自亲缘关系较近的菌株,这增加了：的宿主范围。由此说明,牛虹螺原体具有丰富的生物多样性和地理多样性。另外,从这个采样地点发现,个地方的玮度均不相同,随着讳度的升高,螺原体在牛蛇体内的多样性逐渐减少。此结论需要增加不同玮度的釆样地点加以证实。参考文献,,,,,,,, 俞徐斌牛蛇和家赐螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索,,,,,,,,,,,,,, 第一章牛虹和家禪螺原体的生物学特性,,,,,,,昂沙沙,荚荣,卢伟白腐真菌总提取方法的研究生物学杂志,,曹玉璞,叶元康支原体与支原体病北京：人民出版社陈永萱,薛宝梯,郭永红蜜蜂螺原体基本性状的研究中国科学：辑,郭永红,陈永萱三株螺原体对抗生素敏感性的体外测定微生物通报,李霞,于汉寿,回丽静,等南京及周边地区螺原体菌株的系统发育及遗传多样性分析南京农业大学学报,阮康勤,于汉寿,张晶,等蜜蜂螺原体南京分离株形态多样性南京农业大学学报,,王冠明,韩烈保,马秀杰,等麦冬基因组提取方法研究生物技术通报,吴发红,黄东益,黄小龙,等几种真菌提取方法的比较中国农学通报,于汉寿,阮康勤,纪燕玲,等种植物花螺原体的分离及其基本特性微生物学报,赵嘉,梁宁,刘海船,等一种改进的致病疫霉基因组提取方法安徽农学通报, 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达—第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析与克隆表达第一节蜜蜂螺原体几丁质酶序列生物信息学分析摘要：用生物信息学方法对中的螺原体属,假单胞属,乳酸球菌属,弧菌属等细菌的几丁质酵的氨基酸序列的结构,理化性质,信号肽,疏水性亲水性进行分析,并预测螺原体致病相关因子几丁质酶的二级结构,三级结构,跨膜结构域,功能域,分析与其他细菌的几丁质酶之间的进化关系。结果表明：不同细菌的几丁质酵的氨基酸序列及其理化性质存在一定的差异,含有个保守氨基酸序列,分别是螺原体几丁质酶与其他细菌几丁质酶在进化关系上关系较远；螺原体几丁质醉无跨膜结构域,但有一个与相匹配的功能域,具有降解碳水化合物的功能；其二级结构以卷曲和螺旋为主要的结构元件,折叠和转角散布于整个结构；其目标蛋白序列与模型序列的相似度达到目标蛋白的三维结构与模型三维结构基本相似。根据进化关系,微生物几丁质酶可分为四大支：,。对几丁质酶氨基酸进行生物信息学分析可为几丁质酶基因的克隆、表达特性研究及其功能分析提供理论参考。关键词：几丁质酶；螺原体；氨基酸序列；生物信息学目几丁质酶是一类所有与几丁质降解有关的酶,包括脱乙酰酶,壳聚糖酶,几丁寡糖酶,几丁二糖酶等；狭义的几丁质酶是指催化水解至少含有一个乙酰葡萄糖胺基团糖苷键的酶,包括几丁内切酶和几丁外切酶(陈少波等,。几丁质酶普遍存在于动植物以及微生物中,细菌中的几丁质酶将几丁质转化成自身更容易利用的糖类形式,同时能将细菌本身固定在含有几丁质的表面(,。根据氨基酸序列的同源性,几丁质酶可分成家族和家族两大类。家族存在于多种生物如病毒、细菌、真菌、昆虫、节肢动物、植物和哺乳动物中,这类酶蛋白的三级结构中有两个二级结构单元的氨基酸序列是保守的,且其中的谷氨酸残基是高度保守的(。对一种橡胶树几丁质酶的射线衍射图谱分析显示：酶分子的三级结构是(,圆桶形折叠,圆桶的中心部分是平行的链组成的内桶,依次是—,螺旋将链逐个连接起来,构成外桶依次是—, 俞徐斌牛蛇和家贼螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索内外桶紧挨在一起。螺旋和链间并不是直接相连,二者中间有一段无规则卷曲。家族的几丁质酶都有类似的结构,其中卩、链是结构相似的保守序列(。在中,催化氨基酸位于链的末端(见图。參图的二级结构,几丁质酶与几丁三糖和几丁四糖复合物晶体的射线衍射图谱显示,底物结合的部位是保守序列卩、链形成的环状缝。进一步的研究显示,活性部位所在的沟最多可以容纳六个糖残基(刘晨光等,。通过对蜜蜂螺原体和的全基因组测序分析,并与昆虫相关的螺原体比较发现了蜜蜂螺原体特有的潜在致病相关因子—几丁质脱乙酸酶和几丁质酶,在螺原体基因组中存在编码这两种酶的基因,为螺原体在蜜蜂体内高度专一性的寄生生活方式提供了有力证据(。等推测几丁质酶有以下作用：(保护机制,即细菌在昆虫肠道障碍中的自我保护；(调控昆虫肠道中的几丁质酶的活性(,防御寄生虫的侵袭和阻止凝集素型毒素进入菌体内(。几丁质酶在螺原体内的确切功能还需进一步研究和验证。为了初步了解蜜蜂螺原体几丁质酶的结构以及与其他细菌几丁质酶的进化关系,本研究首先应用生物信息学方法对中注册的假单胞菌属,肠球菌属,乳酸球菌属,弧菌属,螺原体属等不同菌种的几丁质酶的氨基酸序列组成,结构,理化性质进行分析,根据基因组测序和功能注释,初步预测螺原体 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达几丁质酶的二级结构,三级结构,跨膜结构域,信号肽及亚细胞定位,功能域及其分子进化关系,为几丁质酶基因的克隆、表达特性分析及进一步的功能研究提供参考。材料与方法材料从美国国家生物技术信息中心(,中检索到已注册、正式发表、物种来源明确的种不同细菌几丁质酶的氨基酸序列,登录号见表。常用软件、及,若干网站等)。表来自不同菌株的几丁质薛的登录号菌株登录号方法螺原体的几丁质酶基因序列来自于对讲基因组的测序和基因功能注释(本实验室未发表数据),将几丁质酶基因翻译成一个完整的蛋白质氨基酸序列。序列相似性(搜索用里的完成(获得相应的同源蛋白质序列的登录号。多序列比对用, 俞徐斌牛虹和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索。来自不同菌种的几丁质酶氨基酸序列的组成、相似性、结构及理化参数性质分析在的在线工具网站完成。蛋白质序列基本理化参数分析：；跨膜结构域的预测：；疏水性分析：,。预测蛋白质的亚细胞定位在线工具,和信号肽预测分析用在线工具完成。氨基酸序列系统进化树(的构建用,和完成,即先在软件中进行多序列比对,再用按方案进行进化树构建(,,蛋白质二级结构预测用在线完成(并分析各种结构元件占二级结构的比例；再通过英国中心数据库和利用的在线工具分析其功能结构域(。蛋白质三级结构预测在在线完成,所得结果用软件观察蛋白质的三维立体结构(,。结果与分析几丁质酶氨基酸序列的结构及其编码氨基酸序列的理化性质来自不同微生物间的几丁质酶幵放阅读框长度大小不一,螺原体几丁质酶的氨基酸残基数,蛋白质分子量,摩尔消光系数(极性氨基酸比例均明显小于其他细菌的；螺原体几丁质酶的酸性(氨基酸比例高于其他细菌除外)；碱性(氨基酸比例,带电氨基酸(比例和理论等电点(也高于其他细菌。所有序列编码的氨基酸序列半衰期、疏水性氨基酸比例均基本一致；蛋白质不稳定性指数表明所有细菌序列编码的氨基酸序列均属于稳定蛋白(见表。 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达表种微生物几丁质藤氨基酸序列的结构和理化性质结构和理化性质‘幵放阅读框全长推导氣基酸残基数分子量理论等电点摩尔消光系数半衰期酸性氣基酸比例丨诚性氧基酸比例带电氣基酸比例丨极性氣基酸比例疏水氨基酸比例蛋白质不稳定系数脂肪系数总平均疏水性几丁质酶氨基酸序列与其他细菌的相似性比较对种细菌几丁质酶的氨基酸序列多重比对结果表明,螺原体几丁质酶氨基酸序列与其他细菌的具有较高的相似性,尤其在至氨基酸之间趋于保守,可能是重要的功能域,分别有个保守的氨基酸序列(图,卩位附近的,第位附近的第附近的第位附近的,第位附近的图。在分子上残基起广义酸碱催化作用,残基对催化作用也起了重要作用,它可以通过和残基上梭基氧原子形成氢键,使残基的酸性加强(,。与附近的谷氨酸(以及在附近,附近和附近的天冬氨酸(附近可能与催化位点有关。瞧：：■■■■■‘■參《■■脅■■■■■■黌擎垂義：！分别表元氧基酸相同,氧甚酸保守图种细菌几丁质酵氨基酸序列多重比对 俞徐斌牛虹和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索螺原体几丁质酶的疏水性亲水性、跨膜结构域、信号肽、功能域预测跨膜结构域是膜蛋白与膜脂结合的主要部位,对蛋白质起铺定作用。一般由个疏水氨基酸残基组成,形成螺旋(翟中和等。几丁质酶整个肽链处在膜外,无明显的跨膜区(图。参仲￡—兰口■。图基于的方法对蜜蜂螺原体几丁质酵跨膜结构域预测产气———疏水值±,图蜜蜂螺原体°‘几丁质酵氣基酸亲水性的预测蛋白质疏水性亲水性的预测是蛋白质二级结构预测以及功能域划分的必要过程王廷华等,。几丁质酶多肽链上的第位氛基酸具有最低的亲水值,分值为即亲水性最强；第位氧基酸具有最高疏水值,分值为,即疏水性最强；在整个肽链中,亲水氨基酸均匀分布,且数量多于疏水性氨基酸(图。因此,预测得出几丁质酶整个肽链表现为亲水性,没有明显的疏水区域,应属亲水性蛋白。基于隐马尔科夫)和神经网络)方法对几丁质酶信号肽的预测,并没有预测到几丁质酶的信号肽；基于软件对几丁质酶亚细胞定位的预测得到几丁质酶定位在细胞质内。 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达￠广雷峰；,《‘‘‘‘‘■‘■—“■‘乂“？。《图基于和方法对蜜蜂螺原体几丁质酵信号肽的预测；；———图基于软件对蜜蜂螺原体几丁质酶亚细胞定位的预测拆图蜜蜂螺原体几丁质酶功能结构域的预测通过网站中心数据库比对,得到一个保守功能域,属于蛋白质家族,作用于碳水化合物的糖苷键。螺原体几丁质酶的二级结构和三级结构特征分别用、、和分别代表螺旋、折叠、卷 俞徐斌牛蛇和家喊螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索曲和线圈,、时蛋白质二级结构为型,、时,蛋白质二级结构型,、时为型(,。预测表明,螺旋(和无规则卷曲(是几丁质酶最多的结构元件,分别占,转角和延伸链散布于整个结构,二者分别占和图。几丁质酶预测结果为型(。：—‘“―‘“‘‘“”“：：：：；‘螺旋折无规则卷曲转角图蜜蜂螺原体几丁质薛二级结构预测■图蜜蜂蟪原体几丁质薛的三维结构通过自动同源建模服务器预测了几丁质酶的三维立体结构,整体结构为中心圆木桶型,外侧有规律地排布着螺旋,在圆桶内侧排布着折叠,与模型三维结构相似度为。螺原体几丁质酶氨基酸序列分子系统进化特征在分子进化水平上,不同细菌的几丁质酶氨基酸序列可分为、两大类；其中大类又分别分为假单胞菌属■沙雷氏菌属波霍尔德杆菌乳酸球菌属),弧菌属),肠球菌属)三类, 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达在这一支中,与的几丁质酶亲缘关系最近(图。———°,■图根据种细菌几丁质醇氣基酸序列构建分子进化树(基于中法)菌株名详见表 俞徐斌牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索第二节蜜蜂螺原体潜在致病相关基因的克隆与表达摘要：本研究利用质粒载体,在体外对蜜蜂螺原体几丁质脱乙耽基酵基因,几丁质酶基因以及编码蛋白基因进行克隆,并在大肠杆菌中表达。结果显示：成功构建含有编码完整几丁质酵基因的载体并且成功的将以上重组载体转化到表达宿主大肠杆菌￡中,通过电泳检测蛋白,除了未检测到预期大小的目的蛋白夕卜,其他个含有重组质粒的样本均检测出含有预期大小的目的蛋白。该结果是国内首次克隆并表达出蜜蜂螺原体潜在致病相关因子。为后续利用基因敲除技术来研究蜜蜂螺原体致病过程中所涉及蛋白质的功能奠定基础。关键词：螺原体；致病相关因子；克隆；表达■——目丨蜜蜂螺原体自年在病害蜜蜂体内分离到以来,许多研究人员对螺原体侵入蜜蜂的机制和侵染循环进行了探索如等通过对蜜蜂螺原体基因组测序来推测蜜蜂螺原体菌株中可能存在的致病因子(；李霞等对螺原体的侵染循环以及在蜜蜂体内的定殖进行了初步的研究(李霞,。然而,由于《对蜜蜂的侵染过程比较复杂,到目前为止,其侵染机制尚缺之系统深入研究。最近,通过测定,以及等蜜蜂螺原体菌株的基因组序列对蜜蜂螺原体致病相关因子进行了探索,并与昆虫非致病性螺原体比较陆续发现或推测蜜蜂螺原体的一些致病相关因子,如點附相关蛋白、几丁质酶(、几丁质脱乙酷基酶(、以及类似于真核生物中信号识别颗粒的蛋白等,但这些因子在蜜蜂螺原体致病过程中的确切作用有待进一步明确。与其他致病性螺原体相比,几丁质酶和几丁质脱乙酷基酶是蜜蜂螺原体：和所特有(。黏附相关蛋白在较早之前就有了研究,王文等从克隆表达出蛋白,并利用这个蛋白作为抗原,注射到中华绒螯蟹体内,发现能引起榜蟹的免疫反应,而且能使一些免疫相关的基因如上调(,。有研究报道,几丁质酶和几丁质脱乙酰基酶对昆虫肠道内的围食膜起到了破坏作 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达用。如等用灰色链霉菌的几丁质酶处理黄杉毒蛾幼虫的离体围食膜,围食膜表面也变得粗糖整个表面出现小洞或被侵烛的坑。等研究结果表明几丁质脱乙醜基醇基因也与中肠围食膜有关。蓿带夜蛾几丁质脱乙醜基酶的作用是参与改变围食膜中的几丁质的物理和化学性质,而这一生化过程不仅改变几丁质的纤维结构,而且对围食膜蛋白的结合程度、围食膜的完整性和孔隙率产生影响(,。据此研究人员推测,几丁质酶和几丁质脱乙醜基酶在蜜蜂螺原体侵入蜜蜂肠道过程中起到了关键作用(。信号识别颗粒普遍存在于真核生物中,如大麦、小麦、拟南芥、黑曲霉等,有研究报道在细菌中发现有一种核糖核蛋白颗粒这类颗粒蛋白与真核生物中的信号识别颗粒(具有同源序列(。类似于真核生物信号识别颗粒的蛋白参与了大分子的运输,将细胞内新合成的膜蛋白插入到细胞质膜中；有研究报道,大肠杆菌中类似于真核生物的颗粒蛋白已经被证明在蛋白质输出过程中的重要作用(。具有致病性的酵母菌(白色念珠菌)中分离到与高度同源的蛋白质,该蛋白质可能在致病过程中起作用。蛋白以及蛋白在螺原体蛋白质组中并未检测到,但在丰富培养基和合适条件下能检测到这两个蛋白,此类蛋白属于诱导型表达蛋白,可能参与了螺原体重要生理活动,因此推测这类蛋白可能是螺原体潜在的毒力因子之一。爬蜂病在我国发生普遍,主要是由蜜蜂螺原体引起,其致病机理以及蜜蜂螺原体在致病过程中所涉及的相关因子在国内未曾有过详细报道。本研究在蜜蜂螺原体基因组测序的基础上分析其可能的致病相关因子,首次从蜜蜂螺原体内克隆表达个潜在致病相关因子,包括类似于信号识别颗粒的蛋白,几丁质脱乙酷基酶及部分表达了几丁质酶,研究它们的表达特性,为后续利用基因敲除技术研究蜜蜂螺原体致病过程中所涉及蛋白质的功能奠定基础。材料与方法供试菌株与试剂供试菌株：蜜蜂螺原体；克隆宿主大肠杆菌感受态与表达宿主大肠杆菌感受态均购于东盛生物试剂公司。试剂：限制性内切酶,连接酶以及即用型蛋白质分子质量标准均购于公司；试剂聚合酶,均购于东盛生物试剂公司；琼脂糖回收试剂盒购于上海捷瑞生物工程有限公司； 俞徐斌牛虹和家贼螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索,十二院基硫酸钠(,’’亚甲基双丙稀酰胺(,丙稀醜胺(,过硫酸按(,上样缓冲液,电泳缓冲液均购于南京寿德生物试剂公司。质粒载体是由南京农业大学生命科学学院郑会明老师赠送。方法蜜蜂螺原体基因组的提取,具体方法见第一章。扩增目的基因片段,所需引物是根据全基因组测序以及功能注释,获得编码几丁质脱乙酷基酶(,几丁质酶(以及蛋白质的完整基因片段,并用软件进行引物设计,引物见表,扩增条件与程序见表表扩增引物弓丨物名称引物序列(；目的基因片段的检测,琼脂糖凝胶电泳检测或保存。将含有目的基因片段的产物进行琼脂糖凝胶回收,用限制性内切酶双酶切回收产物。和油双酶切体系：回收产物总体积°温浴。琼脂糖凝胶电泳检测,回收酶切条带。培养含有质粒的大肠钎菌,提取质粒,方法见《分子克隆实验指南》第三版(黄培堂等,碱法提取小量质粒,并用琼脂糖凝胶电泳检测质粒。 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达用限制性内切酶及,恐双酶切质粒,和双酶切体系：质粒总体积表目的基因的扩增条件与扩增程序扩增基因扩增体系(扩增程序““基因组模板：,酶：。〇基因、广：二。上二纽：、,,”“：产丰吳板：酶：‘……””」；基因组板：,。。酶：°温浴。琼脂糖凝胶电泳检测,回收酶切条带。酶连片段与载体的连接反应体系：双切质粒双切片段总体积°连接过夜。转化大肠杆菌获得重组质粒。验证重组质粒。包括菌液验证,重组质粒双酶切验证和测序验证。测序验证则委托北京六合华大基因科技股份有限公司进行测序。将成功构建的质粒,转化到表达宿主大肠杆菌中,先在°摇床培养箱中摇菌再加入诱导剂,转到°培养箱摇菌。未加的大肠杆菌作为空白对照。 俞徐斌牛和家妈螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索制作,分离胶：編分离储胶总体积浓缩胶：分离。。储胶总体积制作蛋白样本,取菌液离心,收集大肠杆菌,加入无菌水,轻轻吹打混匀,嗟菌体悬浮,再将菌悬液在沸水中煮沸,待菌体冷却,检测或保存。目的蛋白的检测,取经沸水处理过的蛋白样品与上样缓冲液混勾加入胶孔中。先稳流进行电泳,将样本跑至分离胶,再稳压行电泳再进行染色,过夜脱色。拍照记录电泳检测结果。结果与分析应用改良的方法提取螺原体基因组,所提取的基因组经电泳检测,条带清晰明亮(如图可用于后续的扩增。用碱法提取质粒,条带清晰明亮,可用于双酶切实验,双酶切后回收产物如图。 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达■§图螺原体基因组与电泳图谱基因组双酶切回收产物—一图及产物回收电泳图谱编码基因片段编码基因片段编码几丁质脱乙酰基酶基因片段、、分别是编码基因、编码基因、编码几丁质脱乙酷基酶基因的双酶切回收、、成功扩增出编码,和蛋白质基因,片段大小与预期大小一致,条带清晰明亮,将目的片段经双酶切后进行切胶回收,回收条带比产物略暗(图,但不影响酶连反应,将经双酶切的回收产物用于酶连反应。 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索图重组质粒的鉴定和双酵切鉴定双酶切双切双酶切、、分别是编码基因,编码丨基因,编码基因,、、、、,、、、、提取重组质粒,。以重组质粒为模板,可扩增出单一条带,片段长度与产物长度一致,重组质粒用酶进行双酶切产生了约和两个片段；以重组质粒为模板,可扩增出单一条带,片段长度与产物长度一致；重组质粒用酶、酶进行双酶切产生了约和两个片段；以重组质粒为模板,可扩增出单一条带,片段长度与产物长度一致,重组质粒用酶、酶进行双酶切产生了约和两个片段。结果见图。这各冱这￥图蜜蜂螺原体编码基因 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达■了夂〔￠了了久大：▲了￡；￡權【￡￠：￡图蜜蜂螺原体编码基因经过测序鉴定,编码几丁质脱乙酰基酶基因及编码蛋白的基因片段测序的结果与基因组测序结果一致,具有完整的开放阅读框。编码基因长度大小为,编码个氨基酸；编码的基因长度为编码个氨基酸；：迅基因长度大小为口,编码个氨基酸(图,。结果显示,体外表达的几丁质酶大小约而预期几丁质酶的大小约为,除：含有几丁质酶的大肠杆菌样品中没有检测到预期大小的目的条带外,其他诱导表达的样品均检测到与预期大小一致的目的条带,几丁质脱乙酷基酶和大小分别约为左右(图。丁：夏《■￡丁丁霣丨图蜜蜂螺原体编码基因注：方框表示经下游引物进行定点突变的密码子： 俞徐斌牛蛇和家姆螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索神纏細：,盪；谓伽⑷！■漏—丨图箭头表宗自蛋白表达条带)；；小结与讨论用生物信息学方法对中的螺原体属,假单胞属,乳酸球菌属,弧菌属等细菌的几丁质酶的氨基酸序列的结构,理化性质,信号肽,疏水性亲水性进行分析,并预测螺原体致病相关因子几丁质酶的二级结构,三级结构,跨膜结构域,功能域,分析与其他细菌的几丁质酶之间的进化关系。结果表明：不同细菌的几丁质酶的氨基酸序列及其理化性质存在一定的差异,含有个保守氨基酸序列,分别是；螺原体几丁质酶无跨膜结构域,存在细胞质中,但未预测到信号肽；经比对得出几丁质酶与相匹配的功能域,具有降解碳水化合物的功能；其二级结构是以卷曲和螺旋为主要的结构元件,折叠和转角散布于整个结构；其目标蛋白序列与模型序列的相似度达到,可认为目标蛋白的三维结构与模型三维结构基本相似。在进化关系上分为四大支：,,。螺原体几丁质酶与其他细菌几丁质酶在进化关系上关系较远。本研究对部分潜在致病相关因子进行了克隆表达,通过电泳检测蛋白,除了含有的大肠杆菌样品中未检测到预期大小的目的蛋白外,其他样品均检测出含有预期大小的目的蛋白。本研究中并未预测到螺原体几丁质酶的信号肽,这与大多数的细菌的几丁质酶的 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克隆表达结构存在着差异,大部分细菌的几丁质酶都含有信号肽序列(冯俊丽等,,可能是螺原体受到病毒的入侵导致一些基因退化的原因(。同源建模预测所得几丁质酶的三维结构是借助于机械的数学运算,基于几丁质酶与己知同源蛋白质三维结构的数据库中比对得出的结果,其确切的三维结构还需要实验进一步验证：纯化出几丁质酶结晶体进行衍射,根据衍射数据来解出其三维结构(李兰芬等,。螺原体几丁质酶与其他细菌几丁质酶的进化关系较远,但与具有致病性的弧菌属和乳球菌属进化关系比其他细菌的几丁质酶较近,关于弧菌属和乳球菌属对各自宿主的致病性是否因其菌体内几丁质酶的研究未曾有过报道。电泳未能检测到预期大小的几丁质酶是由于螺原体作为柔膜菌纲中的一员存在着其特殊性：在大部分柔膜菌纲中的细菌体内编码色氨酸而非终止密码子(,,若在大肠杆菌中进行基因克隆表达,碱基序列中含有的基因将会受到表达的限制(,。根据对几丁质酶基因测序结果得出编码几丁质酶的基因第位碱基,位碱基以及位碱基均为均可通过下游引物设计将突变成,而几丁质酶的基因第位碱基是即第这三个碱基(编码的是终止密码,无法通过下游引物设计进行突变,若使几丁质酶在螺原体体外完整的表达,则需用扩增技术将突变成。对于已完整表达出来的蛋白如蛋白及几丁质脱乙酰基酶,则可测定其蛋白质的理化性质及的酶活性来进一步验证生物信息学分析结果。本研究中用了检测了相关基因的表达情况,如需进一步确定其表达情况,则可用技术(蛋白免疫印迹)或者目标蛋白的微量测序对其表达进一步的确认。由于检测系统通常采用酶促底物显色法,因其灵敏度较低且显色缓慢,所以此方法的应用受到一定的限制(张莉萍等。几丁质酶与几丁质脱乙酰基酶在蜜蜂螺原体体内可能有以下作用：第一,螺原体将蜜蜂肠道中的几丁质作为底物,转化成更利于自身利用的碳源以适应蜜蜂肠道内环境；第二,利用几丁质和几丁质酶与几丁质脱乙酷基酶的相互作用,螺原体點附在蜜蜂肠道的细胞上,为侵入细胞寻找有利条件；第三,以上两个酶可能会改变蜜蜂肠道内围食膜的理化性质以便螺原体顺利侵入细胞。类似于真核生物信号识别颗粒的蛋白的作用可能与螺原体细胞质膜上运输蛋白质有关,参与了螺原体分泌毒力蛋白的过程,由此推测,蛋白可能在蜜蜂螺原体侵入蜜蜂体内细胞之后对宿主细胞起到了间接的毒力破坏作用。上述蛋白质的功能有待于今后进一步验证。目前国外研究螺原体基因功能验证的方法有：(基因敲除,根据同源重组原理使目的基因失活,再根据表型蹄选重组子,如等第一次将同源重组方法用于研究螺原体基因功能,将螺原体运动型基因《失活后发现此基因并不是螺原体致病性所需的基因 俞徐斌牛忙和家幡螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索；运用转座子随机插入基因组中,使具有功能的目的基因失活来观察螺原体的表型,根据表型来蹄选重组子,如等运用转座子将野生型螺原体中果糖操纵子基因进行插入失活来研究果糖的利用与螺原体致病性之间的关系。本研究克隆并表达出蜜蜂螺原体致病过程所涉及的部分可能致病相关因子,为初步建立蜜蜂螺原体的可遗传操作系统提供信息,为后续利用基因敲除技术来研究蜜蜂螺原体致病过程中所涉及蛋白质的功能奠定基础。参考文献,,,,,,,,,,,,,, 第二章蜜蜂螺原体致病相关因子生物信息学分析及克陸表达,,,,,,,,生物信息学：序列与基因组分析北京：高等教育出版,,,,,：, 俞徐斌牛蛇和家蝶螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索】,,,人,,,,,陈少波,吴根福几丁质酶研究进展科技通报,黄培堂分子克隆指南科学出版社刘晨光,陈西广,刘万顺儿丁质酶的三级结构和催化机理生命的化学,,李兰芬,南洁,苏晓东蛋白质晶体学技术的发展与展望生物物理学报,李霞蜜蜂螺原体的侵染循环及在蜜蜂体内的定殖研究南京农业大学硕士学位论文,南京,王廷华,部晓莉蛋白质理论与技术北京：科学出版社翟中和,王喜忠,丁明孝细胞生物学北京：高等教育出版社,张莉萍,蒋纪惜,检测蛋白表达的方法及初步应用第三军医大学学报,, 全文总结全文总结本研究从江苏南京,浙江永康,广西桂林三地的牛蛇和家媚体内进行螺原体的分离,进一步扩大了我国螺原体宿主范围和地理范围,初步了解螺原体的生物多样性和地理多样性。此外,在蜜蜂螺原体基因组测序的基础上,初步探索了蜜蜂螺原体在致病过程中可能涉及的相关因子,并检测了部分相关因子在体外的表达情况,分析了蜜蜂螺原体潜在致病相关因子在蜜蜂螺原体致病过程中可能的作用,为今后确认这些因子在致病过程中的功能提供信息。一、本文的研究结果有：第一,从江苏南京,浙江永康,广西桂林三地采集只牛蛇样品,只苍姆样品,其中苍媚样品采自江苏南京。采集到的牛蛇经宿主鉴定为嗜牛原蛇双翅目蛇科原虫亡属；苍虫吊在分类学上属于家幡(双翅目,妮科(家幡属(。用常规方法分离到大量螺原体,对其中个分离物进行纯化,并对分离菌株进行形态学的观察,生理生化试验,单向血清学试验以及系统发育学分析。株螺原体在形态学,生理生化特性上基本一致：都没有细胞壁,在对数生长期呈典型的螺旋状,呈翻滚式运动,菌体能通过孔径为以及的微孔滤膜,在固体培养基上呈颗粒状或者不规则状,生长的范围在之间,最适在左右；它们都能代谢葡萄糖和果糖,其中株不能利用甘露醇,其他菌株均能利用甘露醇；分离株均不能代谢精氨酸和尿素,生长速度较快,大约在就能达到对数生长期。分离菌株的以上特征符合螺原体属的描述。单向血清学试验结果表明,牛蛇螺原体与蜜蜂螺原体引起乳鼠白内障的及中华线蟹颤抖病的的亲缘关系较远。第二,采用改良的法提取螺原体基因组,扩增序列,根据序列进行系统发育学分析发现所有分离菌株分为个进化支,分别为,；大多数牛螺原体菌株与聚类,且自展值达到；而,与聚类,与：聚类。为进一步验证根据得出的系统发育树分析结果,根据前人设计的引物,扩增出转录间隔区以及编码聚合酶亚基的基因作为基因进行系统发育分析,有效地区分出不同虹：幡类菌株,进一步验证了的分析结果。第三,根据分离菌株的生物学特性、部分血清学特性和系统发育学分析,将分离 俞徐斌牛和家赐螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索自牛虹：的菌株、初步鉴定为为分离自家绳的和分离自牛虹：的其他菌株等均初步鉴定为。第四,初步表明,在我国牛虹：体内也存在丰富的螺原体资源,且同一种牛蛇体内可能存在种或种以上不同种的螺原体,大部分牛蛇体内的螺原体与分离自法国)的亲缘关系最近。这些结果揭示了蛇绳类螺原体具有丰富的生物多样性和地理多样性,如在我国境内进一步扩大采集蛇姆类样品地点以及数量,则会发现更多的虹：姆类螺原体资源。第五,为探索蜜蜂螺原体致病过程中可能涉及的致病相关因子的分子特征,本研究对蜜蜂螺原体基因组测序结果进行分析并选择蜜蜂螺原体所特有的几丁质酶基因,用生物信息学方法对中的螺原体属,假单胞属,乳酸球菌属,弧菌属等细菌的几丁质酶的氨基酸序列的结构,理化性质,信号肽,疏水性亲水性进行分析,并预测螺原体几丁质酶的二级结构,三级结构,跨膜结构域,功能域,分析与其他细菌的几丁质酶之间的进化关系。结果表明：不同细菌的几丁质酶的氨基酸序列长度大小及其理化性质存在一定的差异,含有个保守氨基酸序列,分别是,,；螺原体几丁质酶无跨膜结构域,但有一个与相匹配的功能域,具有降解碳水化合物的功能；其二级结构是以卷曲和螺旋为主要的结构元件,折叠和转角散布于整个结构；其目标蛋白序列与模型序列的相似度达到,可认为目标蛋白的三维结构与模型三维结构基本相似。在进化关系上分为四大支：,；螺原体几丁质酶与其他细菌几丁质酶在进化关系上关系较远。利用生物信息学对该基因进行分析,可为几丁质酶基因的克隆和遗传操作提供理论参考。第六,对部分潜在致病相关因子进行了克隆表达,通过电泳检测蛋白,除了含有的大肠杆菌样品中未检测到预期大小的目的蛋白(几丁质酶)夕卜,其他样品均检测出含有预期大小的目的蛋白。由于柔膜菌纲中大部分细菌的编码的不是终止密码,而是编码色氨酸,所以若要在体外完整的克隆表达出含有的基因片段,则需要通过技术将进行定点突变成。本研究分析以上可能涉及的相关因子的功能,并对其进行克隆表达,检测了其表达情况,为今后研究这些相关因子在螺原体致病过程中的作用奠定基础。 全文总结二、本文的主要创新点：在国内首次从牛紀和家蝶体内分离到大量螺原体,并研究了螺原体分离菌株的生物学特性,初步确定了其分类地位；克隆表达了蜜蜂螺原体中可能与致病相关的因子,包括蜜蜂螺原体特有的几丁质酶基因及几丁质脱乙酷基酶基因。三、尚待解决的问题：若进一步确认牛蛇螺原体分离菌株的分类地位,需要进行较全面的血清学分析,即用分离菌株与其他螺原体标准模式菌株的抗血清进行交叉反应试验来确定分离菌的血清组的分类；需采集更多位于不同缂度的牛蛇样品来分析随着讳度的变化牛蛇螺原体多样性变化情况；需要将克隆的蜜蜂螺原体几丁质酶基因中进行定点突变成,使其在大肠杆菌中完全表达,并进一步研究其特性；还需要借助于基因敲除等技术进一步确定几丁质酶等相关因子的功能,特别是在蜜蜂螺原体致病过程中的作用。 P付录：部分牛虻螺原体菌株及序列搜索结果：？￡：：：！明￡：棘？；？￡￡；：；：？如必￡？°財？；；辦“糾—「：■仍成淑画丨十■》國———？：拍夺：幼？；■丨〒纖§的找；伽妳：￡：；；？：二？：：泣搜■；丨妳呤”丨？：■邮少抑仰丨；■时 俞徐斌牛虻和家蝇螺原体的生物学特性及蜜蜂螺原体致病相关因子的探索‘■：识丨￡了从忘：；；：：的￠,桃；枳的￠：；￡？成：？丨杰；浙函序列搜索结果：；：；！；：；：！；；,,？：：；；：：学￠￡：■；报‘￡；￡：；；扣：：如■么：；；！；！￡：￡；￡：？：：丨的二：： NM1108-5ColorkeyforalignmentscoresQueryHHHHHHHHBHHHHHHHHHHHHHBBEHHBBHBBHHBBHBBBHHHBSEBBBBBSDIIIIII125050075010001250?MaxTotalQueiyEMax,()?iscip?iuR.,,Acccssionscoresc:orecovervaiueidentSti'OtMUSfns；、！；,；：、；：？？广丨：沾代；？‘￠￡：：：払☆￡■；「￡？：游；卿！：；亡；！；；丨：￡￠■；：丨；￡：；‘似,：卿的以只；；：：：；；丨■：丨￡丨助？：￡：：；￡叫：！；￡丨？：；；：丨：二：巾丨：？：图序列搜索结果 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mm致谢三年的研究生历程随着论文撰写工作的完成,也即将落下帷幕,然而,这一路走来却受到了太多的恩惠！首先,要感谢我的导师于汉寿副教授！从选题之初,课题进程到论文的撰写,无不倾注了导师的心血。于老师严谨求实的治学态度、循循善诱的教学方法,使我终身受益。他不仅教我如何去做研究,更教我做人的道理、为人处事的方式和对待人生的态度。在此,谨向恩师致以深深的敬意和由衷的感谢！感谢王志伟教授为我的课题和论文撰写提供许多宝贵建议以及在思想上给予我的指导！感谢纪燕玲老师,三年来在学习、生活和思想上给予我的无私关怀、鼓励、开导和帮助！特别感谢生命科察方学实验中心胡冰、贺子义老师在电镜观察方面给予我的无私指导和帮助！特别感谢植保学院孙长海老师在昆虫鉴定方面给予我耐心的指导与帮助！感谢本实验室的师姐李霞、杜文珍、回丽静、亢燕,师兄俞英豪、郭英鹏、刘宝虎、王永、高龙在工作上给予我的无私帮助；感谢同窗好友冯彦霞、任向荣、王晗、张红侠、谢薇薇在工作、生活中对我的关怀和帮助；感谢师弟史明乐、韦祥银、张光亮、王庆璨、张涛、郑青松,师妹周丹霞、张向向、邢转青、张春燕、危蓉萍对我工作的支持、理解及宽容。特别感谢小组(张中楠,李梦婕,林芳宇和董瀛泽同学)及胡卫从,顾延安和刘子叶同学的全力支持和帮助！感谢生科院郑会明老师在实验上的热心帮助和耐心指导！最后感谢我的父母对我默默地支持、关怀与理解！是他们的疼爱与奉献,让我拥有更多选择的权力,让我更加勇敢地去面对人生,面对挑战！俞徐斌二〇一三年五月