《禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
号：密级：ＨＵＡＺＨＯＮＧＡＧＲＩＣＵＬＴＵＲＡＬＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ硕士学位论文ＭＡＳＴＥＲ’ＳＤＥＧＲＥＥＤＩＳＳＥＲＴＡＴＩＯＮ禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究ＩＳＯＬＡＴＩＯＮ，ＩＤＥＮＴＩＦＩＣＡＴＩＯＮ，ＧＥＮＥＴＩＣＥＶＯＬＵＴＩＯＮＡＮＡＬＹＳＩＳＡＮＤＳＴＵＤＹＯＦＰＡＴＨＯＧＥＮＩＣＩＴＹＩＮＭＩＣＥＯＦＡＶＩＡＮＩＮＦＬＵＥＮＺＡＶＩＲＵＳＡＮＤＳＷＩＮＥＩＮＦＬＵＥＮＺＡ苏惠娟研究生：ＣＡＤＩＤＡＴＥＩＪＵＡＮ２０１５３０２１１０１８８ＳＴＵＤＥＮＴＮ学号：预防兽医学专业：ＭＡＩＶＥＶＥＴＥＲＩＮＡＲＹＭＥＤＩＣＩＮＥＪＯＲ：ＰＲＥＶＥＮＴ周红波教授导师．ＳＵＰＥＲＶＩＳＯＲ：ＰＲＯＦＥＳＳＯＲＺＨＯＵＨＯＮＧＢＯ中国武汉ＷＵＨＡＮ，ＣＨＩＮＡ二○一八年六月ＪＵＮＥ２０１８， 华中农业大学硕士学位论文禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究Isolation,Identification,GeneticEvolutionAnalysisandStudyofPathogenicityinMiceofAvianInfluenzaVirusandSwineInfluenzaVirus研究生:苏惠娟学号:2015302110188指导教师:周红波教授指导小组:陈焕春院士金梅林教授张安定教授专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学获得学位名称：农学硕士获得学位时间：2018年6月26日华中农业大学动物科技学院动物医学院二○一八年六月 ＇ｉ华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书否如需保密，解密时间年月曰独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成，－。尽我所知果，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其也教育机构的学位或证书ｆ而使用过的材料一，指导教师对此进行了审定。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。：：曰研究生签名名）时间年＜月丨秦、韻３学位论文使用授权书本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本，；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版并提供＠录检索和阅览服务、、汇，可以采用影印缩印或扫描等复制手段保存编学位、论文。本人同意华中农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表传播学位论文的全部或部分内容，为存在馆际合作关系的兄弟高校用户提供文献传递和交换服务，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力。注：保密学位论文、（即涉及技术秘密商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论文。）在解密后适用于本授权书学位淹文作者签名Ｈｉ导师签名：签名曰期：年６月曰签名曰期：年么月巧曰注０：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间ａ 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究目录摘要.......................................................................................................................................iAbstract...............................................................................................................................iii缩略语表（Abbreviation）.................................................................................................v1.前言...................................................................................................................................11.1流感病毒概况.........................................................................................................11.1.1流感病毒的病原学.......................................................................................11.1.2流感病毒的分类...........................................................................................31.1.3流感病毒流行概述.......................................................................................41.2H9N2亚型禽流感概述..........................................................................................41.2.1H9N2亚型AIV的遗传进化及流行情况...................................................41.2.2研究H9N2亚型AIV的意义......................................................................51.3H1N1亚型猪流感概述..........................................................................................51.3.1H1N1亚型SIV的遗传进化及流行情况....................................................51.3.2研究欧亚禽系H1N1亚型SIV的意义.......................................................62.材料和方法.......................................................................................................................82.1实验材料.................................................................................................................82.1.1病料及毒株...................................................................................................82.1.2SPF鸡胚....................................................................................................82.1.3Balb/c小鼠.................................................................................................82.1.4主要工具酶及试剂......................................................................................82.1.5主要培养基及试剂的配制..........................................................................92.1.6主要仪器及设备..........................................................................................92.1.7其他实验材料............................................................................................102.1.8分子生物学软件.........................................................................................102.2实验方法..............................................................................................................102.2.1病料的采集和处理....................................................................................102.2.2病毒的增殖及处理....................................................................................112.2.3HA试验......................................................................................................112.2.4有限稀释法纯化病毒.................................................................................11I 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文2.2.5半数细胞培养物感染量（TCID50）的测定.............................................112.2.6病毒RNA的提取.....................................................................................122.2.7引物设计.....................................................................................................122.2.8病毒基因组的反转录................................................................................132.2.9病毒cDNA的PCR扩增..........................................................................132.2.10PCR产物的回收与纯化...........................................................................132.2.11连接反应...................................................................................................142.2.12连接产物的转化.......................................................................................142.2.13阳性重组质粒的筛选与鉴定...................................................................142.2.14序列分析..................................................................................................152.2.15病毒对BALB/c小鼠的致病性...............................................................153.结果与分析.....................................................................................................................183.1禽流感病毒的分离鉴定、基因组测序及遗传进化分析...................................183.1.1病毒的分离鉴定........................................................................................183.1.22株禽流感病毒基因组片段重组质粒的PCR鉴定..............................183.1.32株禽流感病毒全基因组核苷酸序列测定...........................................193.1.42株H9N2亚型AIV全基因组序列分析..............................................203.1.4.1HA基因序列分析............................................................................203.1.4.2NA基因序列分析............................................................................233.1.4.3PB2基因序列分析...........................................................................233.1.4.4PB1基因序列分析...........................................................................253.1.4.5PA基因序列分析.............................................................................273.1.4.6NP基因序列分析.............................................................................273.1.4.7M基因序列分析...............................................................................293.1.4.8NS基因序列分析.............................................................................303.2猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析及其对小鼠的致病性研究...............323.2.1病毒的分离鉴定.........................................................................................323.2.2HuBEA-H1N1全基因组核苷酸序列测定...............................................333.2.3湖北H1N1亚型猪流感病毒全基因组序列分析....................................333.2.3.1HA基因序列分析............................................................................33II 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究3.2.3.2NA基因序列分析............................................................................343.2.3.3PB2基因序列分析...........................................................................343.2.3.4PB1基因序列分析...........................................................................343.2.3.5PA基因序列分析.............................................................................353.2.3.6NP基因序列分析.............................................................................353.2.3.7M基因序列分析...............................................................................353.2.3.8NS基因序列分析.............................................................................353.2.4HuBEA-H1N1与HuNEA-H1N1的序列比对........................................443.2.5中国猪流感流行概况................................................................................443.2.5.1中国欧亚禽系H1N1亚型SIV的基因型及其分布情况..............453.2.62株H1N1亚型流感病毒在细胞上的增殖曲线...................................483.2.7.H1N1流感病毒对小鼠的致病性试验.....................................................503.2.7.12株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后的临床症状.........503.2.7.22株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后的存活率.............503.2.7.32株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后体重变化情况.....513.2.7.42株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后肺脏眼观病变.....523.2.7.52株H1N1流感病毒在SPFBalb/c小鼠体内复制情况.............523.2.7.62株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后肺脏组织病变.....534.讨论.................................................................................................................................554.1H9N2亚型禽流感病毒........................................................................................554.2H1N1亚型猪流感病毒........................................................................................565.结论.................................................................................................................................58参考文献............................................................................................................................59致谢....................................................................................................................................69III 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究摘要为了解湖北地区禽流感（avianinfluenza,AI）和猪流感（swineinfluenza，SI）的流行情况，我们对2016年湖北地区养鸡场、养猪场开展病原的分离鉴定。对分离到的流感病毒进行全基因组序列的测定及遗传进化分析，并初步探究了猪流感病毒的生物学特性及其对小鼠的致病性。对中国猪流感的分布及遗传进化、流行情况做了初步的统计分析，为有效防控流感的暴发提供理论依据。本研究的主要内容如下：1、禽流感病毒的分离鉴定、基因组测序及遗传进化分析从鸡群中分离出2株禽流感病毒（avianinfluenzavirus,AIV），对2株病毒用RT-PCR扩增基因组片段，病毒的HA、NA基因测序结果Blast分析发现2株病毒为H9N2亚型禽流感病毒。构建了2株H9N2亚型禽流感病毒的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因的系统发育进化树，发现HA和NA基因属于Y280谱系，PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系，PB2和M基因属于G1-like谱系。2株病毒的HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-，具有低致病性流感病毒的分子特征。2株病毒在HA蛋白上比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313(NCS)。2株病毒均产生了HA蛋白234位点从Q到L的突变，因此或许能够结合唾液酸α-2,6受体而具备感染哺乳动物的能力。2株病毒均产生了M2蛋白31位点从S到N的突变，因此可能能够抵抗金刚烷胺类离子通道阻断剂的作用。2、猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析及其对小鼠的致病性研究从发病猪中分离出1株猪流感病毒(swineinfluenzavirus，SIV)，命名为A/swine/Hubei/221/2016（简称为HuBEA-H1N1），RT-PCR扩增分离毒株的基因组片段，病毒HA、NA基因测序结果Blast分析发现病毒是H1N1亚型猪流感病毒。构建1株H1N1亚型SIV的HA、NA、PB2、PB1、PA、NP、M和NS基因的系统发育进化树，HuBEA-H1N1与A/Hunan/42443/2015（简称为HuNEA-H1N1）的遗传距离较近。2株H1N1流感病毒均属于欧亚禽系H1N1流感病毒。HuBEA-H1N1与HuNEA-H1N1毒株的PB2、PB1、PA和NP基因来源于pandemicH1N1/2009，HuBEA-H1N1与HuNEA-H1N1毒株的HA、NA、M和NS基因来源于欧亚禽系流感病毒，因此H1N1猪流感分离株是一个重组型欧亚禽系猪流感病毒。i 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文对中国猪流感的流行情况研究发现，中国的猪流感病毒以H1N1亚型为主，近年来中国主要流行欧亚禽系H1N1亚型SIV。欧亚禽系H1N1亚型SIV总共分为11个基因型，重组型欧亚禽系H1N1亚型SIV近年来出现的越来越多，特别是病毒聚合酶基因片段PB2、PB1、PA和NP来源于pandemicH1N1/2009病毒的重组株出现的越来越多。HuBEA-H1N1与HuNEA-H1N1的基因组片段高度同源，因此在测定H1N1分离毒株HuBEA-H1N1的生物学特性及其对小鼠的致病性试验时将毒株A/Hunan/42443/2015作为对照。分离毒株A/swine/Hubei/221/2016较毒株A/Hunan/42443/2015在MDCK细胞、Nptr细胞、A549细胞上的增殖滴度略低。2株病毒对BALB/c小鼠的致病性试验显示，分离株A/swine/Hubei/221/2016对小鼠的致死率为25%，毒株A/Hunan/42443/2015对小鼠的致死率为100%。2株病毒均能引起不同程度的肺脏、气管和鼻甲的感染。综上所述，本研究通过对鸡场和猪场流感病毒的分离和鉴定，开展了2株H9N2亚型AIV和1株H1N1亚型SIV基因组序列的遗传进化研究，对猪流感病毒分离株进行了致病性研究，并分析了中国猪流感病毒的流行情况。从分子水平掌握H9N2亚型AIV和H1N1亚型SIV的遗传特性和变异规律，为流感疫苗的筛选及流感的防制奠定了重要基础。关键词：H9N2亚型；欧亚禽系H1N1；遗传进化；致病性ii 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究AbstractInordertomastertheregularpatternsofthepandemicandgeneticvariationofavianinfluenzavirusandswineinfluenzavirusinHubeiprovince,weisolatedandidentifiedtheinfluenzaviruspathogens,andonthisbasis,researchedthegeneticevolutionofvirussequences.Geneticandphylogeneticanalysisofinfluenzaviruswasconducted.WeinvestigatethepathogenicityofA/swine/Hubei/221/2016(H1N1)andA/Hunan/42443/2015.Astatisticalanalysisofthedistribution,geneticevolutionandprevalenceofswineinfluenzavirusinChinawasconducted.Providetheoreticalbasisforeffectivepreventionandcontroloftheoutbreakofinfluenza.Themainresearchcontentsareasfollows:1.Isolation,identificationandgeneticevolutionanalysisofAIVTwostrainsofavianinfluenzaviruswereisolatedfromthediseasedchickenflocks.BlastanalysisofthesequencingresultsshowedthattwostrainswereH9N2subtypeavianinfluenzaviruses.ThephylogenetictreesofwholegenomesequenceoftheH9N2isolatedstrainswereconstructed.TheresultshowedHAandNAgeneoftwoH9N2isolatedstrainsbelongedtoY280-likelineage,whichwidelyspreadinourcountry.PB1,PA,NPandNSgenebelongedtoSHF98-likelineage.PB2andMgenebelongedtoG1-likelineage.MolecularanalysisofwholegenomesequencefoundthattheaminoacidsequenceofHAgenesoftheH9N2isolatedstrainshadthecleavagesites-RSSR↓GLF-,whichrepresentsthemolecularbasisoflowpathogenicavianinfluenzavirusstrain.ComparedwiththeprevalentstrainY280,thetwoH9N2isolatedstrainshad313(NCS)potentialglycosylationsiteinHAprotein.ThepositionL234QofHAgeneoftheH9N2isolatedstrainsweremutated,indicatingthattherewasanaffinityofavianinfluenzavirusesforhuman-typereceptors.ThepositionN31SofM2proteinoftheH9N2isolatedstrainsweremutated,indicatingthattherewasaresistancetoamantadinedrugs.2.Isolation,identificationandgeneticevolutionanalysisofoneH1N1isolatedstrainandpathogenicityofoneH1N1isolatedstraininmiceOnestrainofswineinfluenzaviruswasisolatedfromthediseasedswineflocks.RT-PCRwasusedtoamplifywholegenomesequencefromoneisolatedstrain,BlastanalysisofthesequencingresultsshowedthattheisolatedstrainwasH1N1subtypeSIV.ThephylogenetictreesofwholegenomesequenceoftheH1N1isolatedstrainwereconstructed.Thevirusisolatedin2016(A/swine/Hubei/221/2016)washighlyidenticaltoiii 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文ahumanisolatedH1N1in2015(A/Hunan/42443/2015).Thus,swinesmightbethesourceofhumanH1N1infections.TheH1N1swineinfluenzavirusisolateandA/Hunan/42443/2015belongedtoeurasianavianlike-H1N1.PB2,PB1,PAandNPgeneofA/swine/Hubei/221/2016belongedtopandemicH1N1/2009.HA,NA,MandNSgenebelongedtoeurasianavianlikeH1N1.ThepatternofgeneticreassortmentofA/Hunan/42443/2016wasthesameasA/swine/Hubei/221/2016.AnalysisoftheepidemictrendofswineinfluenzavirusinChinarevealedEurasianavianlikeH1N1swineinfluenzaviruswasanimportantconstituentpartofswineinfluenzavirus.Inaddition,theEurasianavianlikeH1N1SIVwithPB2,PB1,PAandNPgenebelongedtopandemicH1N1/2009appearedmoreandmorefrequentlyinrecentyears.Thevirusisolatedin2016(A/swine/Hubei/221/2016)washighlyidenticaltoA/Hunan/42443/2015.ToinvestigatethepathogenicityofH1N1isolatedstrain,pathogenictestwascarriedoutonBALB/cmicewithA/Hunan/42443/2015servedasacontrolgroup.A/Hunan/42443/2015replicatedhigherthanA/swine/Hubei/221/2016inMDCK,NptrandA549cells.AllthemiceinoculatedwithA/Hunan/42443/2015wereresultingin100%lethality.MiceinfectedwithA/swine/Hubei/221/2016causedalethalityof25%.A/swine/Hubei/221/2016andA/Hunan/42443/2015replicatedsystemicallyinmice,whichcouldbedetectedfromthetestedorgans,includingthelung,tracheaandnasalturbinate.Insummary,thisstudycarriedouttheisolationandidentificationofavianinfluenzavirusandswineinfluenzavirus.WeanalysedthegeneticevolutionaryrelationshipofgenomegeneoftwoH9N2AIVisolatesandoneH1N1SIVisolate.WeinvestigatedthepathogenicityoftheH1N1isolateinmice.AnalysisoftheepidemictrendofswineinfluenzavirusinChinawascarriedout.ThestudycanhelpustomasterthegeneticcharacteristicsandvariationofH9N2AIVandH1N1SIVfrommolecularlevel,andlaidanimportantfoundationforthepreventionandcontroltechnologyofinfluenzaandaswellasvaccinedevelopment.Keywords：H9N2subtype；EurasianavianH1N1；Geneticevolution；Pathogenicityiv 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究缩略语表（Abbreviation）缩写英文名称中文名称A549humanlungadenocarcinomacell人肺腺癌细胞AIVAvianinfluenzavirus禽流感病毒AmpAmpicillin氨苄青霉素bpbasepair碱基对cDNAcomplementaryDNA互补的DNADNADeoxyribonucleotideacid脱氧核糖核酸dNTPDeoxyrinediaminetriphoshate脱氧核糖核苷三磷酸ggram克GlobalInitiativeonSharingAllInfluenza全球共享所有流感项目GISAIDData数据hhour小时HAhemagglutinin血凝素蛋白HPAIVHighlyPathogeniticAvianinfluenzavirus高致病性禽流感MMatrixprotein基质蛋白M1Matrixprotein1基质蛋白1M2Matrixprotein2基质蛋白2MDCKMadin-Darbycaninekidneycells犬肾细胞minminute分钟mlmilliliter毫升NANeuraminidase神经氨酸酶蛋白美国国家生物技术信息NCBInationalcenterofbiotechnologyinformation中心NPNucleoprotein核蛋白NptrNewbornpigtreachealepithelialcells新生猪气管上皮细胞NSNonstructuralprotein非结构蛋白NS1Nonstructuralprotein1非结构蛋白1NS2Nonstructuralprotein2非结构蛋白2ORFOpenreadingframe开放阅读框PAPolymerasacid酸性聚合酶PCRPolymerasechainreaction聚合酶链反应PB1Polymerasbase1碱性聚合酶1PB2Polymerasbase2碱性聚合酶2PBSPhosphatebufferdsaline磷酸盐缓冲液RT-PCRReversetranscriptase-PCR反转录PCRsSecond秒SIVSwineinfluenzavirus猪流感病毒SPFSpecificpathogen-free无特定病原体的TCID5050percenttissuecultureinfectivedose半数组织培养物感染量μlMicroliter微升WHOworldhealthorganization世界卫生组织v 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究1.前言1.1流感病毒概况1.1.1流感病毒的病原学流感病毒是单股负链RNA病毒(Websteretal1992)，属于正粘病毒科。流感病毒的基因组分为8个节段(PaleseandWang2012)，共编码16种蛋白(Liuetal2013)。病毒粒子呈球形或扁圆，少数呈杆状或丝状（如图1-1），直径为80-120nm(张月娥2013)。病毒粒子的结构简单，由囊膜、基质蛋白和核心构成。病毒粒子表面有一层囊膜，囊膜由双层脂质构成。囊膜内镶嵌着2种纤突，分别为HA和NA。流感病毒的基因组含有PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M和NS8个基因片段(Stephensonetal2003,Chenetal2001)。图1-1流感病毒结构模式图(KrugandAramini2009)Fig.1-1Structureofinfluenzavirus(KrugandAramini2009)流感病毒的RNA聚合酶缺乏校正功能，因此流感病毒常发生基因重组(任义品2014)。流感病毒抗原的改变分为抗原漂移和抗原转变(金元昌等2003)，抗原漂移和抗原转变发生于病毒表面的血凝素（HA）和神经氨酸酶蛋白（NA），血凝素的变异频率高于神经氨酸酶(Brown2000)。HA是病毒表面囊膜的一种囊膜纤突，它通过刺激机体产生的中和抗体来对抗病毒的感染(SuarezandSchultz-Cherry2000)。HA的主要作用是帮助病毒的吸附与穿膜，流感病毒感染机体时，首先吸附于细胞上，然1 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文后病毒的HA蛋白裂解为HA1和HA2(Liuetal2010)。因此，血凝素裂解位点的分子特征与流感病毒的毒力和致病性息息相关，HA裂解位点处碱性氨基酸的数量越多，病毒的毒力越强(WebsterandLaver1972)。若HA裂解位点存在极少的碱性氨基酸，只能引发轻微的感染(WebsterandRott1987,KlenkandRott1988,HorimotoandKawaoka2001)。血凝素上的糖蛋白可以结合细胞的唾液酸受体来帮助病毒入侵机体，使病毒进入宿主细胞内并改变自身的抗原性(Gohrbandtetal2011)。HA1亚单位位于血凝素的头部具有结合受体的活性位点。HA2位于血凝素杆状部分，含有位于病毒囊膜双层亲水性分子层的糖蛋白，它参与融合过程(PlotkinandDushoff2003)。至今已经发现并鉴定出的血凝素有18种(Bakeretal1987,Fouchieretal2005)。神经氨酸酶(NA)是流感病毒表面的一种囊膜纤突(何后军等2004)，也是流感病毒的表面抗原。NA是一种外切糖苷酶，可以分割HA与细胞上的唾液酸受体，从而促进成熟病毒粒子的释放(HorimotoandKawaoka2001,Matrosovichetal1999)。NA有四个结构域，分别为头部、茎部、跨膜域以及氨基酸胞浆尾(Jinetal1997,Mitnauletal1996,SpiessandHandschin1987,BaigentandMcCauley2001)。氨基酸胞浆尾序列较保守，在不同亚型的流感病毒中，头部序列同源性较高，改变头部氨基酸位点可能导致神经氨酸酶失活(王曲直2006)。核蛋白（NP）的主要功能为构成病毒的核衣壳(Gormanetal1991)。NP与病毒RNA及病毒聚合酶结合，形成核糖核蛋白体，起到稳定病毒的RNA的作用(朱建国和陆苹2003)。NP蛋白上有亲核信号，从而使NP蛋白、聚合酶和病毒RNA的复合物向细胞核移动并进入细胞核中(Mandleretal1991,Biswasetal1998,Eisfeldetal2015)。NP蛋白的氨基酸序列较保守，NP蛋白313位点的氨基酸从苯丙氨酸（F）到缬氨酸（V）的突变是病毒感染人类的一个过渡。NP蛋白101、289、375位点的氨基酸突变与病毒对小鼠的毒力息息相关(Reidetal2004,Sakabeetal2011,Ilyushinaetal2010)。NP蛋白184位氨基酸被赖氨酸（K）替换后使局部电荷增强从而抑制鸡的免疫功能，使病毒对鸡的毒力增强(Wasilenkoetal2008)。基质蛋白（M）基因编码M1蛋白和M2蛋白组成。M1蛋白是病毒粒子中含量最多的蛋白。M1蛋白可以维持病毒的基本形态，能够与核糖核蛋白体相互作用从而帮助病毒的转录、装配和出芽，有利于形成和释放成熟病毒粒子(朱建国2004)。M2蛋白具有选择性离子通道，能够改变高尔基体内的pH值，酸化病毒粒子的内部环境(Lenevaetal2009,DuQSetal2009,DuffandAshley1992)。M2蛋白第27、30、312 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究和34位的氨基酸若发生突变，金刚烷胺类药物将不能阻断流感病毒的M2离子通道(TakeuchiandLamb1994)。PB2、PB1、PA这3种蛋白为聚合酶蛋白，它们之间有非常紧密的相互作用(Arranzetal2012,Colomaetal2009,Moelleretal2012)。PA与PB2之间已被证实具有相互作用(Hemerkaetal2009)，PB1与PA之间相互作用的结构域已被发现，同时PB1与PB2间相互作用的结构域也已被确定(Heetal2008,Obayashietal2008,Sugiyamaetal2009)。PB2蛋白的627和701位氨基酸与病毒对哺乳动物的适应性息息相关(Subbaraoetal1993)。PB1蛋白能够催化病毒RNA的合成与延伸(Hookeretal2001)，PB1聚合酶由基序Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ构成，这四个基序同源性非常高，其中，PB1蛋白的第306、406、445和481位氨基酸为天冬氨酸、甘氨酸、天冬氨酸和赖氨酸，这些氨基酸是不可变的，它们对于PB1蛋白的功能是必须的(Chenetal2001b,Gibbsetal2003)。PB1的一小段开放阅读框中可以编码PB1-F2蛋白。PA蛋白是三个聚合酶蛋白中最小的一个，在病毒复制转录过程中跟随PB1和PB2随着链的延伸而移动(GonzalezandOrtin1999,Leeetal2003)，PA蛋白的第36位氨基酸与病毒聚合酶活性息息相关(朱云等2011)，PA的第295位氨基酸和第616位氨基酸的突变与病毒对小鼠的致病性有紧密关系(Hulse-Postetal2007)。非结构蛋白（NS）基因编码NS1蛋白和NS2蛋白。目前的研究认为NS1为病毒的非结构蛋白，NS2为病毒的组成部分(Ludwigetal1999)且具有核定位信号(O'Neilletal1998)。因此检测机体内NS1蛋白的抗体可以鉴定机体是被野毒感染还是注射了疫苗(Inoueetal1992)。NS1蛋白通过结合mRNA来抑制细胞内mRNA的拼接，进而通过抑制干扰素基因的表达来抑制天然免疫。龙进学等研究发现，NS基因上第263~277位核苷酸的缺失能够增强H5N1亚型流感病毒对鸡的致病性(龙进学等2006)。1.1.2流感病毒的分类流感病毒分为A型、B型和C型，又称为甲型、乙型和丙型(Bean1984)。A型流感病毒能够感染多种动物物种，造成很大危害。B型流感病毒主要感染人。C型流感病毒可以感染人和猪。禽流感病毒均为A型流感病毒。基于禽流感病毒HA基因的差异，禽流感病毒分为18个HA亚型。基于禽流感病毒NA基因的差异，禽流感病毒分为11个NA亚型(HommeandEasterday1970,Brownetal.1993)。3 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文1.1.3流感病毒流行概述甲型流感病毒感染多种动物物种，动物可以通过携带病毒进行流感的传播(Herfstetal2012)。多种病毒之间的相互作用、宿主和环境因素决定了流感病毒的传播效率，病毒与宿主之间的相容性决定了病毒的嗜性。重力限制了病毒粒子的传播距离，直径小于5μm的含有流感病毒的微粒可以悬浮在空气中并在空气中传播。空气湿度和温度可能会影响病毒的颗粒大小和存活能力。禽流感为人畜共患病，活禽市场和养殖场是造成人感染禽流感病毒的重要场所。1878年禽流感在意大利首次暴发，此后禽流感在世界各地广泛流行，给养殖业和人类健康造成了严重的损失(Alexander2000)。自1996年中国广东省出现高致病性H5N1禽流感病毒以来，这种高致病性H5N1禽流感病毒已成为一种地方性流行毒株并在我国的多个地区的家禽中流行，这种高致病性禽流感病毒已在基因和抗原上进化为完全不同的血统并造成人的死亡。1.2H9N2亚型禽流感概述1.2.1H9N2亚型AIV的遗传进化及流行情况H9N2亚型AIV与其他亚型流感病毒的重组导致了其复杂的遗传结构。在中国稳定传播的H9N2亚型AIV的谱系有：以A/Chicken/Beijing/1/94（H9N2）为代表的BJ-like、A/Quail/HongKong/G1/97（H9N2）为代表的G1-like、A/Duck/HongKong/Y439/97（H9N2）为代表的Y439-like以及A/Chicken/Shanghai/F/98（H9N2）为代表的SHF98-like。H9N2流感病毒虽为低致病性病毒，但其与其他病毒发生频繁重组，所以其毒力的改变可能造成潜在的流感的暴发。H9N2流感病毒的内部基因比表面基因更加多样化，这是H9N2流感病毒在鸡、鸭、小型家禽和野生鸟类之间广泛重组的结果。在2009~2013年间，中国很多亚型的流感病毒出现基因来源于H9N2的新型重组毒株。H9N2亚型流感病毒已在欧亚和非洲国家的各类陆生家禽中流行，并在人类和哺乳动物中造成零星感染。中国被认为是H9N2流感病毒的流行中心。在2013年，一种含有H9N2病毒6个内部基因的新型重组H7N9病毒在中国引起了严重的人类疫情。2013至2016年间，中国确诊的H9N2亚型流感病毒感染病例越来越多。由此可见，H9N2亚型流感病毒发生了很大的生物学特性的改变，但是，导致这些变化的基因的遗传进化在很大程度上是未知的。4 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究与高致病性H5N1亚型禽流感病毒不同，低致病性H9N2亚型流感病毒在疾病管理和公共卫生控制中受到的关注较少(Xuetal2007)。在20世纪80年代，从鹌鹑中分离出H9N2亚型流感病毒，这是第一次从陆地家禽中分离出H9N2亚型流感病毒。在中国，H9N2病毒最初是在1976至1985年间在香港进行流感病毒监测时从家鸭身上分离出来的。随后，H9N2亚型流感病毒于1994年在中国广东省的鸡只中传播。病毒随后适应于鸡和其他陆地鸟类，如野鸡、朱卡和其他小型家禽。因此，我国鹌鹑种群极有可能导致H9N2亚型流感病毒从鸭到鸡的种间传播。1994年中国暴发了流感病毒A/Chicken/Beijing/1/94（H9N2）代表株(陈伯伦等1994)，此毒株导致感染鸡的病死率达到10%~80%(Guoetal2000)。此后，1997年华北地区鸡只感染H9N2亚型AIV(陈福勇和夏春1999)，1997年香港人感染内部基因片段来源于H9N2亚型AIV的H5N1亚型AIV(Guanetal2000)，1999年人感染H9N2亚型流感病毒(郭元吉等1999)。2001~2003年，人们从香港的家禽中分离出H9N2亚型流感病毒(Choietal2004)。2008~2009年，H9N2亚型流感病毒在病猪体内分离到(赵国等2010)。1.2.2研究H9N2亚型AIV的意义H9N2病毒优先与人型唾液酸受体结合(Buttetal2005)，并可以通过飞沫在雪貂之间传播。很多家禽都感染有H9N2亚型禽流感病毒，且病毒在家禽体内表现为隐性感染带毒状态，家禽是人们日常饮食的主要来源之一，家禽养殖人员、执业兽医、家禽屠宰者、家禽运输工等人都与家禽有着频繁和密切的接触，增加了病毒感染人类的可能。本研究于2016年从湖北省规模化养鸡场的病鸡中分离到2株H9N2亚型禽流感病毒，并对其进行遗传进化分析，分析其8个基因组片段的分子生物学特征，以期了解湖北省养鸡厂目前的H9N2亚型禽流感病毒的遗传变异情况，为该病的综合防控提供理论依据。1.3H1N1亚型猪流感概述1.3.1H1N1亚型SIV的遗传进化及流行情况猪流感（SwineInfluenza，SI）目前的亚型有H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2等。猪流感病毒基因的重排造成了猪流感的流行5 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文(Kaverin2010,TaubenbergerandKash2010)，H1N1亚型猪流感病毒分为3类，分别为经典H1N1、欧亚禽系H1N1、和类人H1N1亚型猪流感病毒。经典H1N1亚型猪流感病毒以A/California/04/2009为代表，欧亚禽系H1N1亚型猪流感病毒以A/swine/Italy/671/1987为代表，类人H1N1亚型猪流感病毒以A/WSN/1933为代表。在中国大陆已经报道过的猪流感有11种亚型，分别为：H1N1、H1N2、H1N7、H2N3、H3N1、H3N2、H3N3、H3N6、H4N6、H5N1和H9N2。其中以H1N1、H1N2和H3N2亚型为主。H1N1亚型流感病毒的宿主范围不断扩大，例如2009年大流行的H1N1流感病毒，这株流感病毒经过基因重排后可以在人、猫、狗、火鸡等多种动物间传播(McCullersetal2011,Berhaneetal2010,Dundonetal2010,Sretaetal2010)。首个有记载的猪流感病例发生在1918年的北美，当时人类甲型H1N1流感病毒大流行。这种1918年人类大流行的H1N1流感病毒被认为是在1918年之前从鸟类传染给人类的，人类病毒在大流行期间很可能已经转移到猪身上了。H1N1欧亚类禽型猪流感病毒起源于一种禽流感H1N1病毒(Ludwigetal1995,Scholtisseketal1983,Schultzetal1991)。1979年以前，欧洲猪群仅感染经典猪流感病毒。1979年从比利时和德国的猪中分离出一种与经典猪流感病毒遗传进化不同的禽流感H1N1病毒，这种病毒现在被称为欧亚禽系H1N1猪流感病毒，这种病毒迅速在猪群中流行并迅速超过了原有的经典猪流感病毒。类禽型H1N1亚型猪流感病毒已在猪群中处于流行优势(Campitellietal1997)。在中国，H1N1亚型猪流感病毒可以直接由禽传染给猪(Guanetal1996)，从病毒的流行趋势、遗传进化分析等均可以看出，欧亚禽系H1N1猪流感越来越成为养殖业的重要危害之一，因此开展对欧亚禽系H1N1猪流感的研究迫在眉睫(Gartenetal2009,ZimmerandBurke2009,Smithetal2009)。1.3.2研究欧亚禽系H1N1亚型SIV的意义猪流感病毒引起猪的流感，未感染猪主要通过直接接触感染猪感染流感病毒，流感病毒传播迅速，通常在几天内全部猪群感染发病。猪流感病毒也可以通过野生动物进行传播，野猪就可以在农场之间传播流感病毒。这种疾病在世界各地的猪群中造成严重的发病率。猪流感对养殖业和人类健康造成了巨大危害，因此开展对猪流感病毒的遗传进化及致病性的研究迫在眉睫。6 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究本研究从猪场发病猪只中分离到1株H1N1亚型猪流感病毒，将其命名为A/swine/Hubei/221/2016，利用系统发育分析的方法可以追溯SIV的遗传多样性，分析其8个基因组片段的分子生物学特征。研究猪流感病毒分离株对小鼠的致病性，以期了解此猪流感病毒的遗传变异情况，为欧亚禽系H1N1亚型猪流感的综合防控提供理论依据。7 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文2.材料和方法2.1实验材料2.1.1病料及毒株2016年从湖北地区规模化养鸡场中采取鸡的喉拭子和泄殖腔拭子作为病毒分离的病料并分别将病料编号。2016年从湖北地区生猪养殖场疑似流感发病的猪中，采取病猪的鼻拭子和咽喉拭子作为病毒分离的病料并分别将病料编号。小鼠致病性试验中的2株H1N1亚型流感病毒分别为在湖北地区分离的A/swine/Hubei/221/2016毒株和用8质粒系统拯救的A/Hunan/42443/2015毒株（8质粒由中国疾病预防控制中心朱闻斐老师惠赠）(Zhuetal2016)，A/Hunan/42443/2015毒株能够导致人的重症肺炎，该病毒是欧亚禽系流感病毒的基因重组株，其HA、NA、M和NS基因与欧亚禽系SIV的基因片段高度相似，其PB2、PB1、PA和NP基因源于pandemicH1N1/2009。A/swine/Hubei/221/2016的8个基因片段与A/Hunan/42443/2015高度相似，因此取A/Hunan/42443/2015毒株作为对照进行小鼠感染试验。2.1.2SPF鸡胚SPF鸡胚均由山东益吉达生物科技有限公司提供，孵化至9~11日龄备用。2.1.3Balb/c小鼠6周龄SPF清洁级雌性Balb/c小鼠购于华中农业大学实验动物中心，动物实验在具有生物安全的二级实验室进行，所有操作按照动物福利与伦理委员会要求进行。2.1.4主要工具酶及试剂TransTaq-TDNAPolymerase,dNTP,Trans2kplusDNAMarker,Trans5kDNAMarker等工具酶和试剂购自北京全式金生物技术有限公司；ReverseTranscriptaseXL(AMV),RibonucleasseRNaseInhibitor(RRI),大肠杆菌感受态细胞DH5α购自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司；TRIzol试剂购自大连宝生物（TaKaRa）工程有限公司；DNA回收试剂盒，质粒提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；8 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究酵母浸出粉（Yeastextractpowder）及胰蛋白胨（Tryptone）购自英国OXOID公司；琼脂粉购自北京原平皓生物技术公司，日本进口分装；NaCl、无水乙醇、异丙醇、氯仿等常规试剂均购自国药集团化学试剂有限公司，所有试剂和药品都为分析纯。2.1.5主要培养基及试剂的配制LB和LA培养基：称取5gYeastextract、10gTryptone、10gNaCl溶于1L去离子H2O中，LA培养基在LB的基础上按15g/L添加Agar，121℃高压蒸汽灭菌15min，室温保存备用。PBS缓冲液：称取NaCll8g、Na2HPO41.42g、KH2PO40.24g及KCl0.21g，溶于950mL三蒸水中，充分搅拌溶解，调节PH值到7.4，定容至1000mL，在超净台中用0.22μm滤器过滤除菌，室温保存备用。50×TAE：242.0gTris，57.1ml冰醋酸，100ml0.5mol/LEDTA，pH8.0，加水定容至1000ml。琼脂糖凝胶（1％）：取2ml50×TAE电泳缓冲液加去离子水定容至100ml，加入1g琼脂糖，加热至完全溶解后倒胶。1%鸡红细胞悬液，0.9%生理盐水等均按照常规方法配制。苏木精染液：苏木精1g，无水乙醇10ml，硫酸铝钾20g，蒸馏水200ml，氧化汞0.5g，冰醋酸8ml。先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，再将这两种液体混合后煮沸（约1min），离火后向该混合液中迅速加入氧化汞，并用玻璃棒搅拌至染液变为紫红色，随即用冷水冷却至室温，然后加入冰醋酸并混匀，过滤后使用。伊红染液：伊红Y0.5g，蒸馏水100ml，先用少许蒸馏水溶解伊红Y，然后加入全部蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀，过滤后使用。2.1.6主要仪器及设备超低温冰箱，美国NewBruswickScientific公司。手提式高压蒸汽灭菌锅，上海医用核子仪器厂。DK-S22型电热恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司。DYY-Ⅲ稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂。EDC-810型PCR仪，北京东胜创新生物科技有限公司。9 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文JY2001电子天平，上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂。Microfuge台式冷冻离心机，美国Beckman公司。Milli-QAcademic超纯水机，美国Millipore公司。SHY-250生化培养箱，上海精宏实验设备有限公司。倒置显微镜，日本Olympus公司；ThermoScientificFinnpipette移液枪，上海智理科学仪器有限公司。XW-80A微型涡旋混合仪，上海沪西分析仪器厂有限公司。超净工作台，北京哈东联仪器制造有限公司；2.1.7其他实验材料无水乙醚购自华中农业大学设备科。MDCK细胞、Nptr细胞、A549细胞均由本实验室保存。Nptr细胞：新生猪气管上皮细胞（new-bornpigtrachea，Nptr）是由来源于新生猪气管组织的原代细胞连续传代培养得到的，分离自人、猪、禽等物种的流感病毒均能在该细胞上有效增殖并产生明显的细胞病变（Ferrarietal2003）。2.1.8分子生物学软件序列分析软件MEGA6(version6.06)；序列分析软件Lasergene7(version7.1,包括EditSeq，MegAlign软件）；引物设计软件PrimerPremier（Version5.0）。2.2实验方法2.2.1病料的采集和处理首先观察病鸡头面部的鼻腔和眼结膜、羽毛以及鸡爪的病理变化，然后采集喉拭子和泄殖腔拭子。观察疑似流感发病的猪，采集鼻拭子和咽喉拭子。鸡的泄殖腔、喉拭子以及猪的鼻拭子和咽喉拭子按照1:5比例加入含2%双抗和20%甘油的PBS制成匀浆，4℃12000r/min离心10min后取上清液作为接种鸡胚的病毒液。10 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究2.2.2病毒的增殖及处理取处理好的病毒液，用无菌PBS做103稀释，经鸡胚尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，每个鸡胚接种0.2ml，每个病料样品接种3枚鸡胚，置37℃温箱中孵化培养。12h后每6h观察鸡胚死亡情况，24h前死亡的鸡胚废弃，24h后死亡的鸡胚4℃冷藏过夜后取尿囊液检测。对3天后尚未死亡的鸡胚也做4℃冷藏过夜处理后取尿囊液。收取的尿囊液测定血凝价，若无血凝活性或者血凝价很低，则用尿囊液继续盲传3代，若HA仍为阴性即判定病毒分离是阴性。有血凝价的尿囊液以12000r/min离心10min，收集上清液，置-80℃保存备用。2.2.3HA试验将无菌收集的鸡胚尿囊液以1%鸡红细胞采用β微量法进行HA试验，以HA价≥3log2为试验阳性。若无血凝活性或者血凝价很低，则用尿囊液继续盲传3代，HA仍为阴性即判定病毒分离为阴性。2.2.4有限稀释法纯化病毒将病毒原液用无菌PBS按照10倍倍比稀释法稀释病毒至10-8；选取10-2~10-8稀释度的病毒液接种9日龄SPF鸡胚，每个稀释度病毒液各接种3枚，放置37℃培养箱中培养，12h后每6h观察鸡胚死亡情况，弃去24h内死亡鸡胚，24h后死亡的鸡胚放置4℃保存过夜后，收集鸡胚尿囊液并测定每个鸡胚的血凝价，保存稀释倍数最高且有血凝价的鸡胚尿囊液记为F1代病毒；按照同样方法稀释F1代病毒10-5~10-8接胚、培养、收胚、HA测定，用同样方法保存F2代、F3代；F3代病毒按照1000倍稀释接种3枚SPF鸡胚，37℃培养箱培养72h后收取尿囊液并测定血凝价HA，并标记HA效价、日期和编号入库保存。2.2.5半数细胞培养物感染量（TCID50）的测定在96孔板培养MDCK细胞，让细胞在96孔板底部长满单层。在离心管中用DMEM细胞培养液将病毒液作连续10倍的稀释，从10-1~10-11。弃掉96孔板内细胞培养基并用无菌PBS将96孔板内细胞洗一遍，将稀释好的病毒接种到96孔培养板中，每一稀释度接种一纵排，共8孔，每孔接种100µl，做一排正常细胞对照，1h11 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文后将96孔培养板内的液体换为加有0.5µg/mlTPCK胰酶的DMEM培养基放入温箱培养，逐日观察记录结果，结果的计算按Reed-Muench两氏法或Karber法。2.2.6病毒RNA的提取取新鲜的鸡胚尿囊液病毒样品300μl，加到装有700μlTrizol的1.5mlEP管中，上下轻轻颠倒混匀，冰浴15min；加200μl氯仿，涡旋振荡15s（注意计时），冰上静置15min；4℃12000r/min离心15min，取上清400μl至另一干净的1.5ml无RNA酶的EP管中（尽量避免吸到中间层沉淀）；加入等体积的异丙醇，将EP管中液体轻轻上下颠倒混匀（不涡旋，以免损伤RNA链，使其断裂），室温静置10min；4℃12000r/min离心10min，弃上清留沉淀；加入1ml无水乙醇，轻轻上下颠倒EP管洗涤沉淀；4℃12000r/min离心10min弃上清（用移液枪吸弃无水乙醇）；置EP管于超净台风干5min（EP管底部沉淀变透明，但不可过干，否则RNA沉淀变得难溶），加入20μlDEPCH2O溶解底部沉淀。样品可用于RT-PCR或存于-80℃备用。2.2.7引物设计参考E.Hoffman等所有A型流感病毒全长基因扩增的通用引物序列，设计了cDNA反转录通用单链引物U12，以及基因组8个片段的上下游引物（由上海生工生物工程有限公司合成）。引物的核苷酸序列见下表：表2-1本研究中所用引物Table2-1Primersusedinthisstudy引物序列（5’---3’）引物长度U125’AGCAAAAGCAGG3’12bpPB2-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTC3’28bpPB2-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTCGTTT3’34bpPB1-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGCA3’28bpPB1-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGCATTT3’33bpPA-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAC3’29bpPA-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTACTT3’33bpHA-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGG3’28bpHA-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’35bpNP-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTA3’29bpNP-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTATTTTT3’36bpNA-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGAGT3’29bpNA-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGAGTTTTTT3’36bpM-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGTAG3’29bpM-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGTAGTTTTT3’36bpNS-F5’TATTCGTCTCAGGGAGCAAAAGCAGGGTG3’29bpNS-R5’ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAAGGGTGTTTT3’35bp12 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究2.2.8病毒基因组的反转录无菌超净台环境中，以溶于DEPC水中的病毒RNA为模板，在20μl反转录体系中利用RT-PCR技术扩增病毒基因组。其反应体系如下：表2-2病毒基因组反转录体系（20μl）Table2-2ThereversetranscriptionPCRsystemofAIVgenome（20μl）试剂组分用量（μl）U12（10μM）2dNTP2AMV（50U/μl）15×Buffer4RRI（40U/μl）1TemplateRNA10混匀后置PCR仪上42℃60min、72℃15min、16℃10min进行反转录反应，反应产物可直接用于PCR扩增或-20℃保存备用。2.2.9病毒cDNA的PCR扩增以反转录的cDNA为模板，使用表2-1中的基因组片段的上下游引物进行PCR扩增流感病毒基因组片段。PCR反应体系和条件如下：表2-3PCR反应体系（25μl）Table2-3ThereactionsystemofPCR（25μl）试剂组分用量（μl）F（10μM）1R（10μM）110×TransTaq-TBuffer2.5TransTaq-T0.5TemplatecDNA22.5mMdNTP0.5ddH2Oupto25μlPCR反应条件如下：95℃预变性10min；进入PCR循环（循环次数为30次）：95℃30s，56℃退火30s，72℃延伸；最后72℃延伸10min，16℃冷却5min。同时设无模板的阴性对照。反应结束后，将PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测。2.2.10PCR产物的回收与纯化电泳结束后在紫外光下从凝胶上切下目的DNA片段的琼脂糖凝胶，用DNA快速回收试剂盒（北京天根）回收DNA。具体方法如下：13 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文切下目的DNA回收片段，放入一无菌的1.5ml的EP管中，加入与切下的琼脂糖凝胶相等质量的GDPBuffer，于55℃水浴10min，水浴期间颠倒混匀2次，使凝胶完全溶解。将溶解的液体转至吸附柱，于室温静置2min，10000r/min离心1min。将收集管中液体加入吸附柱并重复步骤（2）。向吸附柱中加入600μl漂洗液，10000r/min离心30s，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放入收集管中，重复步骤（4）。将吸附柱放回收集管中，10000r/min离心30s，尽量除尽漂洗液，将吸附柱置于室温放置5min，彻底晾干漂洗液，以防残留的漂洗液影响以后的酶切实验；将吸附柱转至一干净的1.5mlEP管中，在吸附膜中间位置加入适量的洗脱缓冲液，在吸附膜中间位置加入20μl洗脱缓冲液，室温放置5min，12000r/min离心1min，即得到DNA片段溶液，可用于连接反应，也可于-20℃保存备用。2.2.11连接反应克隆目的基因连接反应体系组成为20μl体系，其中加入10μlPCR回收产物、1.0μlpMD18-TvectorDNA、9.0μlLigationSolutionI，16℃水浴连接过夜。2.2.12连接产物的转化取50μl感受态细胞DH5α置于冰上。加入10μl连接产物，混匀后，冰浴30min。42℃热激90s，冰浴2min，使之冷却。加入500μlLB混匀，220r/min，37℃摇床培养45min后3500r/min离心5min，吸弃300μl上清，重悬菌体后吸取200μl培养液，涂布Amp抗性平板上。37℃温箱培养12h可出现单菌落。2.2.13阳性重组质粒的筛选与鉴定随机挑取平板上转化的单个菌落，接种至3ml含抗生素Amp的LB培养液中，37℃300r/min振荡培养过夜。保存菌种后，用普通质粒小提试剂盒提取质粒，具体步骤如下：柱平衡：将吸附柱CP3放入收集管中，向其中加入500μl的平衡液BL，12000r/min，离心1min，将吸附柱重新放回收集管中；取2ml的菌液，加入1.5mlEP管中，12000r/min离心1min，弃上清；向EP管中加入250μlBufferP1（已加RNaseA，于4℃保存），重悬菌体沉淀；再加入250μlBufferP2，温和地上下翻转6~8次，使菌体充分裂解；再加入350μlBufferP3，立即温和地上下翻转6~8次，充分14 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究混匀，此时出现白色絮状沉淀，12000r/min，离心5min；将上清转移至吸附柱中，注意不要吸到沉淀。静置2min，12000r/min，离心1min，弃去收集管中废液；向吸附柱中加入600μl的漂洗液PW（用前检查是否加入无水乙醇），12000r/min，离心1min，弃去收集管中废液；重复步骤（7）一次后，空柱12000r/min，离心2min，将吸附柱中残余的漂洗液除去；将吸附柱置于新的EP管中，打开盖子，置于37℃恒温箱中放置5min；向吸附柱的中央加入30μl的EB，静置2min，12000r/min，离心2min，将质粒洗脱至EP管中，并检测质粒浓度。以提取的每个重组质粒做为模板PCR鉴定，使用表2-1中的上下游引物扩增重组质粒中的目的基因片段。PCR反应体系和条件如下：表2-4PCR反应体系（20μl）Table2-4ThereactionsystemofPCR（20μl）试剂组分用量（μl）F（10μM）1R（10μM）12×TransPCRmix10模板质粒2去离子水6PCR扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳鉴定筛选出阳性克隆子，每个阳性克隆送3~5个测序（由擎科生物有限公司完成）。2.2.14序列分析利用MEGA6软件进行病毒基因组的基因序列的校对和分析。从GenBank下载已收录的流感病毒毒株的基因组序列。利用MEGA6软件分析病毒基因的同源性、核苷酸和氨基酸序列位点，绘制流感病毒分离株的系统发育进化树，分析流感病毒分离株基因组的分子遗传变异情况。2.2.15病毒对BALB/c小鼠的致病性小鼠感染实验与临床症状观察：取6周龄BALB/c小鼠通过吸入适量乙醚麻醉后，将50μl体积的104.5TCID50的病毒经鼻腔接种方式感染小鼠。从接种后1dpi到14dpi观察小鼠的临床症状，每天测量小鼠体重并记录，记录各组小鼠的死亡情况，小鼠体重下降大于等于原始体重的25%即判定为死亡，判定死亡的小鼠对其麻醉后放入干冰约30min，给予安乐死处理。15 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文4.5TCID组织脏器中病毒载量的测定：以1050的病毒接种6周龄小鼠后，分别在1dpi、4dpi、7dpi取小鼠的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、气管、脑、鼻甲8种组织迅速冻入-80℃冰箱备用，用于测定组织脏器中的病毒载量。称量小鼠各脏器的重量，加入1ml含1万单位双抗的PBS缓冲液，进行无菌匀浆。将匀浆后的组织反复冻融两次释放细胞内的病毒，将组织匀浆液12000rpm/min离心10min，收获上清。将上清液连续的10倍倍比稀释，进行TCID50的测定，以确定病毒在脏器中的病毒载量。组织病理观察：病毒以104.5TCID50接种6周龄小鼠后，在4dpi取小鼠的肺脏，用4%的多聚甲醛组织固定液固定，用来制作病理切片。病理切片准备如下：组织修块：将感染小鼠的肺组织在固定液中充分固定，用低浓度乙醇或清水冲洗半小时以上，然后用锋利的刀片修成3~5mm厚的组织块。脱水与透明：组织块经50%乙醇（2h）→70%乙醇（2h）→80%乙醇（1.5~2h）→90%乙醇（1~1.5h）→无水乙醇Ⅰ（0.5h）→无水乙醇Ⅱ（0.5h）这些步骤逐步脱水；然后经二甲苯透明，透明步骤为：无水乙醇：二甲苯[1:1（v：v）]（15min）→二甲苯Ⅰ（15min）→二甲苯Ⅱ（15min）。浸蜡与包埋：透明好的组织块依次经过3种不同熔点的石蜡。石蜡Ⅰ（熔点54~56℃，0.5h）→石蜡Ⅱ（熔点56~58℃，0.5h）→石蜡Ⅲ（熔点58~60℃，0.5~1h）。浸蜡时间依组织块大小而定。浸蜡后的组织块浸入熔点为60℃的石蜡中包埋。切片制作：用切片机将蜡块切成4μm厚的连续切片，置涂有明胶粘片剂的载玻片上，于恒温展片台上展开，放入50℃烤箱中烤干4h以上，常温保存备用。苏木素-伊红（hematoxylinandeosin;H&E）染色：二甲苯Ⅰ（15min）→二甲苯Ⅱ（15min）→无水乙醇/二甲苯（1:1）（2min）→100%乙醇Ⅰ（5min）→100%乙醇Ⅱ（5min）→80%乙醇（5min）→蒸馏水（5min）→苏木素染液（15~20min）→蒸馏水（3min）→1%盐酸乙醇分色（5~10s）。脱水与透明：染色后的切片经纯酒精脱水，再经二甲苯使切片透明。步骤如下：95%乙醇（2min）→无水乙醇Ⅰ（3min）→无水乙醇Ⅱ（5min）→95%乙醇（2min）→90%乙醇（2min）→80%乙醇（2min）→70%乙醇（2min或过夜）→50%乙醇（2min）→蒸馏水（2min）→无水乙醇/二甲苯（1:1）（2min）→二甲苯Ⅰ（5min）→二甲苯Ⅱ（5min）。16 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究封固：将已透明的切片滴上加拿大树胶，盖上盖玻片封固。待树胶略干后，标记切片后即可在显微镜下观察。镜下观察细胞核呈蓝色，胞质、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈红色。17 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文3.结果与分析3.1禽流感病毒的分离鉴定、基因组测序及遗传进化分析3.1.1病毒的分离鉴定在湖北各养鸡场共采集380份活禽的泄殖腔拭子和喉拭子，共分离到2株H9N2亚型禽流感病毒。有流感症状的鸡表现为体温升高、食欲差、饮水量增大，不爱活动。病鸡鼻腔分泌物增加、眼结膜充血、流泪。本研究中测序的2株禽流感病毒背景资料见下表：表3-12株湖北地区AIV分离株背景资料Table3-1Backgroundof2AIVisolatesisolatedinHubei阳性编号病毒命名病毒亚型宿主分离地点采样年份32A/Chicken/Hubei/32/2016H9N2鸡湖北2016115A/Chicken/Hubei/115/2016H9N2鸡湖北20163.1.22株禽流感病毒基因组片段重组质粒的PCR鉴定将2株禽流感病毒基因组片段克隆于pMD18-T载体上，对重组质粒进行PCR鉴定，PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，扩增出与预期相符病毒基因组片段。选取A/Chicken/Hubei/115/2016毒株的基因组片段重组质粒跑胶鉴定，跑胶鉴定图如图3-1。图3-1禽流感病毒全基因组PCR扩增鉴定Fig.3-1PCRidentificationofAIVgenome注：2~9为阳性编号115样品，1为Trans15KDNAMarker，10为Trans2KDNAMarker。Note:ThegenomeofA/avian/Hubei/144/2016arenumber2tonumber9.Trans15KDNAMarkerisnumber1.Trans2KDNAMarkerisnumber10.18 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究3.1.32株禽流感病毒全基因组核苷酸序列测定病毒基因组片段与pMD18-T载体重组后，通过PCR鉴定出阳性克隆子，每个基因送3~5个阳性克隆子测序。将病毒基因的测序序列用MEGA6软件进行序列的拼接，得到仅含病毒基因组序列的基因序列。将2株禽流感病毒的基因组测序结果Blast分析发现，2株病毒均属于H9N2亚型，判定这2株病毒为H9N2亚型禽流感病毒，这2株病毒的阳性编号分别为32和115，分别被命名为A/Chicken/Hubei/32/2016（H9N2）和A/Chicken/Hubei/115/2016（H9N2）。Blast序列比对结果见下表：表3-22株H9N2亚型禽流感分离株序列比对Table3-2Thesequencealignmentofthe2H9N2AIVisolates名称基因GeneBank最高相似度毒株亚型相似度基因登录号A/Chicken/Hubei/HAA/chicken/Jingmen/JM0305/2017H9N299%MF794991.132/2016NAA/chicken/Jingmen/JM0305/2017H9N299%MF794993.1PB2A/chicken/Jingmen/JM0305/2017H9N299%MF794998.1PB1A/chicken/Beijing/0331/2013H9N298%KM609837.1PAA/duck/Wenzhou/YHQL64/2014H9N299%KU143497.1NPA/chicken/Hubei/2014H9N299%KT164852.1MA/chicken/Taizhou/TZJF02/2015H7N999%KU143332.1NSA/chicken/Wenzhou/YHQL04/2014H9N299%KU143453.1A/Chicken/Hubei/HAA/chicken/Anhui/AH326/2016H9N299%MG051186.1115/2016NAA/chicken/Jingmen/JM0305/2017H9N299%MF794993.1PB2A/chicken/Hubei/2014H9N299%KT164848.1PB1A/chicken/Beijing/0331/2013H9N298%KM609837.1PAA/chicken/Hebei/SJZ01/2015H10N899%KY402018.1NPA/duck/Japan/AQ-HE28/2015H9N299%LC208513.1MA/chicken/Jiangsu/JS4539/2014H9N299%KX867844.1NSA/Anhui/DEWH72-03/2013H7N999%CY181533.119 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文3.1.42株H9N2亚型AIV全基因组序列分析3.1.4.1HA基因序列分析2株H9N2亚型AIV的ORF框长1683bp，编码560个氨基酸。遗传进化分析发现（如图3-2），2株H9N2亚型AIV的HA基因均位于Y280-like分支或者称为h9.4.2分支。2株病毒的HA基因核苷酸同源性为97.0%，推导的氨基酸同源性为97.3%。A/Chicken/Hubei/32/2016和A/Chicken/Hubei/115/2016分离株与A/chicken/Beijing/1/94、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Quail/HongKong/G1/97、A/Duck/HongKong/Y439/97的核苷酸推导的氨基酸同源性分别为89.5%和89.3%、91.2%和90.8%、87.5%和87.7%、84.6%和84.8%；2株病毒的HA基因与A/chicken/Beijing/1/94和A/Duck/HongKong/Y280/97亲缘关系相距均较远，但两者比较起来，与A/Duck/HongKong/Y280/97亲缘关系近一些。2株病毒的HA裂解位点为-RSSR↓GLF-，仅含有2个碱性氨基酸R，为低致病性禽流感病毒的分子特征。H9N2亚型AIV从最开始的A/turkey/Wisconsin/1966（h9.1亚系）到现在的Y280亚系(h9.4.2亚系)，出现的裂解位点有-VSSR↓GLF-，-ASNR↓GLF-，-ASYR↓GLF-，-RSSR↓GLF-，2株病毒的HA裂解位点均为-RSSR↓GLF-模式，与Y280亚分支的HA裂解位点模式一致。对2株病毒及参考毒株A/Chicken/Shanghai/F/98和A/Duck/HongKong/Y280/97的HA蛋白潜在糖基化位点预测（见表3-3）发现，与参考毒株不同的是，2株分离株均增加的潜在糖基化位点为313（NCS），主要因为2株分离株315位点发生了P到S的突变。A/Chicken/Hubei/32/2016毒株29位点从N到S的突变使其丢失一个潜在糖基化位点。这些增加的潜在糖基化位点有可能改变HA蛋白抗原性、病毒宿主范围以及病毒毒力。HA受体结合位点由130环区、190螺旋区和220环区3个二级结构区构成(张卓等2015)，H9N2亚型禽流感病毒HA基因的109、161、163、191、198、202、203、146~150和232~237位构成一个袋状结构。对HA的受体结合位点分析发现（见表3-4），HA的受体结合位点在109（Y）、161（W）、163（T）、202（L）、203（Y）位较为保守。在191、198位点变异较大，2株病毒左侧臂与国内疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98及代表株A/Chicken/Beijing/1/94均不同。研究表明，第234位点为Q（Gln）时，病毒只能感染禽类。当234位点为L（Leu）时，病毒可能发20 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究具有感染哺乳动物的能力。2株病毒234位点均为L，均具有可能感染人类的分子特征。受体结合位点右侧臂为146~150位点（H9亚型排位），2株病毒的受体结合位点右侧臂均为GTSTA模式。表3-32株H9N2亚型AIV的HA蛋白潜在糖基化位点Table3-3PotentialglycosylationsitesinHAgeneof2H9N2subtypeAIVstrains毒株2982141298305313492A/Chicken/Hubei/32/2016-NPSNVSNTTNVSNCSNGTA/Chicken/Hubei/115/2016NSTNPSNVSNTTNVSNCSNGTA/Chicken/Shanghai/F/98NSTNPSNVSNTTNVS-NGTA/Duck/HongKong/Y280/97NSTNPSNVSNTTNVS-NGT表3-42株H9N2亚型AIV的HA受体结合位点Table3-4TheHAreceptorbindingsitesoftwostrainsofH9N2subtypeAIV毒株左侧壁109161163191198202203Strains（232-237）A/Chicken/Hubei/32/2016YWTNTLYNGLMGRA/Chicken/Hubei/115/2016YWTNTLYNDLMGRA/Chicken/Shanghai/F/98YWTNALYNGQQGRA/Chicken/Beijing/1/94YWTNVLYNGQQGRA/Quail/HongKong/Gl/97YWTHELYNDLQGRA/Duck/HongKong/Y439/97YWTHELYNDQQGRA/Duck/HongKong/Y280/97YWTNTLYNGLQGRA/chicken/HongKong/G9/97YWTNALYNGLQGR21 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文91A/Chicken/Hubei/32/201654A/chicken/Jingmen/JM0305/2017(H9N2)99A/chicken/Hubei/01/201589A/chicken/Suqian/SQ1602/2016(H9N2)A/chicken/Yunnan/YNKM/2015(H9N2)7196A/chicken/Sichuan/SZQ60/2015(H9N2)A/goose/Guangdong/G3183/20143533A/duck/Wuhan/WHYF14/2014A/chicken/Dongguan/1674/2014(H9N2)63A/chicken/Hubei/201499A/Anserfabalis/Anhui/L139/2014(H9N2)A/Chicken/Hubei/115/201699A/chicken/Wuhan/JXQL01/201599A/chicken/Rizhao/853/201399A/chicken/Jiangsu/WJ101/2012100A/chicken/Henan/HF/201246A/chicken/Shandong/QD6/2012A/chicken/Hunan/12/2011A/chicken/Rizhao/723/20139587A/chicken/Shandong/LC1/20132394A/chicken/Hubei/79/2011A/chicken/Shandong/WG10/2011A/chicken/Anhui/WANG/2010(H9N2)98A/chicken/Anhui/A12/201146A/chicken/Anhui/WBQ/201199A/brambling/Beijing/16/20126957A/chicken/Zhejiang/607/2011A/chicken/Shandong/E/201098Y280-likeA/chicken/Jiangxi/12/200754A/chicken/Tibet/S4/2009A/chicken/Fujian/11302/2005h9.4.259A/chicken/Hubei/10/2009A/chicken/Shandong/09/2011A/chicken/Hubei/A23/20108298A/chicken/Hubei/A28/2010A/chicken/Hubei/A25/201010900A/chicken/Hubei/A27/2010100A/chicken/Hubei/A1/201095A/chicken/Hubei/A29/201084A/chicken/Hubei/A30/2010A/chicken/Hubei/581/201178A/chicken/Hubei/661/201118100A/chicken/Hubei/558/201190A/chicken/Hubei/580/2011A/chicken/Zhejiang/HJ/200765A/Duck/HongKong/Y280/97A/chicken/Beijing/8/982597A/chicken/Hebei/31/006098A/chicken/Hubei/01/1999A/chicken/HongKong/SF1/03A/chicken/Shanghai/10/01A/chicken/Guangxi/10/996996A/chicken/Guangxi/37/2005(H9N2)83A/bird/Guangxi/82/2005(H9N2)100A/duck/Guangxi/51/2005(H9N2)5247A/bird/Guangxi/83/2005(H9N2)32A/Chicken/HongKong/G9/9741A/chicken/Guangdong/SS/94A/chicken/Shandong/6/9695A/Chicken/Shanghai/F/98A/Chicken/Beijing/1/94A/Quail/HongKong/G1/97G1-like100A/chicken/Heilongjiang/35/00A/turkey/Wisconsin/1/1966100A/duck/Wuhan/WHYF05/2014Y439-like100A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)0.02图3-2H9N2亚型AIVHA基因遗传进化图Fig.3-2PhylogeneticmapofHAgeneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株22 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究3.1.4.2NA基因序列分析2株H9N2亚型AIV的NA基因的ORF框长1410bp，编码469个氨基酸。2株H9N2亚型AIV均位于Y280-like分支或称为h9.4.2分支（如图3-3）。2株H9N2AIV的核苷酸同源性为99.9%，2株病毒与标准毒株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Quail/HongKong/Gl/97和A/Chicken/HongKong/G9/97的核苷酸同源性分别为89.9%、91.1%、86.5%、88.3%。与遗传进化分析结果一致。2株病毒遗传进化上相较疫苗株SHF98更接近A/Duck/HongKong/Y280/97。NA基因相对往年毒株及标准株未发生大的遗传变异。2株病毒含有6个相同的潜在糖基化位点（见表3-5），分别为43（NNS）、44（NSS）、66（NST）、83（NWS）、143（NGT）和231（NGT）。2株病毒均增加的一个潜在糖基化位点为43（NNS），其余位点与疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98及标准株A/Duck/HongKong/Y280/97一致。表3-52株H9N2亚型AIV的NA潜在糖基化位点Table3-5PotentialglycosylationsitesinHAgeneof2H9N2subtypeAIVstrains毒株43446683143231A/Chicken/Hubei/32/2016NNSNSSNSTNWSNGTNGTA/Chicken/Hubei/115/2016NNSNSSNSTNWSNGTNGTA/Duck/HongKong/Y280/97-NPSNSTNWSNGTNGTA/Chicken/Shanghai/F/98-NPSNSTNWSNGTNGT3.1.4.3PB2基因序列分析2株H9N2亚型AIV的PB2基因的完整ORF框长2280bp，编码氨基酸759个。2株病毒均位于G1-like分支，且位于同一个亚分支（如图3-4），核苷酸同源性达到97.2%。2株病毒均与2017年分离的人源H7N9亚型AIVA/Qingyuan/GIRD01/2017（H7N9）遗传距离较近，A/Chicken/Hubei/32/2016毒株与它的核苷酸同源性达到97.4%，A/Chicken/Hubei/115/2016毒株与它的核苷酸同源性达到97.9%。A/Chicken/Hubei/32/2016毒株与标准株A/Chicken/Beijing/1/94的核苷酸同源性为84.2%，与标准株A/Quail/Hongkong/G1/97的核苷酸同源性为86.6%。A/Chicken/Hubei/115/2016毒株与标准株A/Chicken/Beijing/1/94的核苷酸同源性为84.9%，与标准株A/Quail/Hongkong/G1/97的核苷酸同源性为87.4%。23 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文有研究表明(MassinvanderWerfandNaffakh2001)，PB2蛋白的627位点与病毒毒力以及病毒宿主范围密切相关，全部的人源流感病毒PB2蛋白627位点的氨基酸为K，而禽源病毒此位点的氨基酸为E。PB2蛋白上的有些氨基酸位点影响病毒对哺乳动物的致病性(Katzetal2000,Lietal2005)，通过对这些位点的研究发现，2株病毒均具有以下氨基酸位点：63（I）、318（R）、333（T）、627（E）、675（L）、683（T）、701（D）和714（S）。这些位点的氨基酸具有对哺乳动物低致病性的分子特征。说明这2个分离株是禽源流感病毒，2株病毒的PB2基因具有低致病性分子特征。A/brambling/Beijing/16/2012A/chicken/Guangdong/WSL11/2011A/duck/Hunan/S4111/2011A/chicken/Gansu/419/2012A/chicken/Zhejiang/607/2011A/chicken/Guangdong/SQL10/2011A/chicken/Shandong/09/2011A/chicken/Shandong/E/2010A/chicken/Hunan/12/2011A/swine/Taizhou/5/2008A/chicken/Shandong/L1/2007A/chicken/Shandong/B2/2007A/chicken/Tibet/S4/2009A/chicken/Jiangxi/12/2007A/chicken/Zhejiang/HJ/2007Y280-likeA/chicken/EasternChina/SD88/2008A/chicken/Rizhao/723/2013h9.4.2A/chicken/Rizhao/853/2013A/Chicken/Hubei/32/2016A/Chicken/Hubei/115/2016A/chicken/Guangdong/SYX12/2011JA/chicken/Guangdong/SYX12/2011A/swine/Guangxi/S11/2005(H9N2)A/chicken/Guangdong/SS/94A/chicken/Shandong/6/96A/Duck/HongKong/Y280/97A/chicken/Beijing/8/98A/chicken/Hebei/31/00A/Chicken/Shanghai/F/98A/chicken/Shanghai/10/01A/Chicken/Beijing/1/94A/Chicken/HongKong/G9/97A/chicken/HongKong/SF1/03G9-likeA/chicken/Heilongjiang/35/00A/turkey/Wisconsin/1/1966A/Quail/HongKong/G1/970.01图3-3H9N2亚型AIVNA基因遗传进化图Fig.3-3PhylogeneticmapofNAgeneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株24 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究100A/Chicken/Hubei/32/201691A/chicken/Jingmen/JM0305/2017(H9N2)44A/Qingyuan/GIRD01/2017(H7N9)A/Chicken/Hubei/115/201611A/environment/Hunan/27420/2014(H9N2)A/environment/Hunan/27408/2014(H9N2)61A/chicken/Dongguan/1674/2014(H9N2)A/environment/Hunan/21403/2014(H9N2)88A/chicken/Hubei/20148399A/chicken/Hubei/2014(H9N2)A/duck/Wuhan/WHYF14/201459A/chicken/Hebei/SJZ01/2015(H10N8)99A/mink/China/01/2014(H9N2)A/chicken/Hubei/01/2015G1-like96A/mink/China/02/2014(H9N2)A/pigeon/Hubei/269/20129978A/pigeon/Hubei/230/201284A/chicken/Hubei/SC122/20139872A/pigeon/Hubei/227/2012A/chicken/Hubei/SIC3/201265A/chicken/Wuhan/JXQL01/201510064A/chicken/Hubei/SIC7/2013A/chicken/Hubei/79/2011100A/chicken/Hubei/10/2009A/duck/Wuhan/WHYF05/201498100A/chicken/Hubei/ZYSJF15/2016A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)100A/Chicken/HongKong/G9/97(H9N2)A/turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)100A/chicken/Hubei/01/1999100A/duck/Hubei/W1/2004100100A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)91A/chicken/Hubei/C1/2007CK/BJ-like70A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)100A/duck/Hubei/C1146/2011100A/chicken/Hubei/C4071/2010100A/chicken/Hubei/C4196/20090.02图3-4H9N2亚型AIVPB2基因遗传进化图Fig.3-4PhylogeneticmapofPB2geneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株3.1.4.4PB1基因序列分析2株病毒的PB1基因全长为2340bp，其中包含一个长度为2274bp的完整ORF框，共编码757个氨基酸。2株H9N2亚型AIV的PB1基因均位于SHF98-like分支，但是位于不同的亚分支（如图3-5）。2株H9N2亚型AIV的PB1基因的核苷酸同源性为87.1%。毒株A/Chicken/Hubei/32/2016与A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Duck/HongKong/Y439/97的核苷酸同源性分别为88.2%、93.2%、88.9%，毒株A/Chicken/Hubei/115/2016与参考毒株A/Chicken/Beijing/1/94、25 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Duck/HongKong/Y439/97的核苷酸同源性分别为87.6%、90.3%、87.6%。有研究表明，PB1基因上有影响病毒对小鼠致病性的关键氨基酸位点，对这些位点的分析发现，2株病毒的第13位氨基酸发生了从L到P的突变，198（K）、317（M）和678（S）均未发生变异。98A/chicken/Jiangxi/13214/2014(H10N6)99A/chicken/Jiangxi/13206/201456A/Chicken/Hubei/32/2016A/chicken/Beijing/0331/2013(H9N2)9970A/chicken/Beijing/1115/2013(H9N2)77A/mink/Shandong/F6/2013(H9N2)99A/mink/Shandong/F10/2013(H9N2)96A/chicken/Hubei/01/2015A/chicken/Hubei/SC122/2013A/pigeon/Hubei/269/201210056A/pigeon/Hubei/227/201278A/chicken/Hubei/SIC3/201298A/pigeon/Hubei/228/2012A/chicken/Hubei/79/2011100A/chicken/Hubei/2014100A/duck/Wuhan/WHYF14/2014100SHF98-like94100A/chicken/Wuhan/JXQL01/201578A/chicken/Hubei/ZYSJF15/2016A/chicken/Hubei/SIC7/2013100A/duck/Hubei/C1146/2011A/chicken/Hubei/10/20096365A/chicken/Hubei/C4071/2010100100A/chicken/Hubei/C4196/2009A/chicken/Hubei/C1/200792A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)A/Pavocristatus/Jiangxi/JA1/2016(H5N6)A/chicken/Ganzhou/GZ27/2015(H5N6)10057A/duck/Hubei/ZYSYF24/2015(H5N6)72A/duck/Hubei/ZYSYF1/2015(H5N6)86A/duck/Anhui/S4/2016(H5N6)A/Chicken/Hubei/115/201660A/chicken/Zhejiang/194/2016(H5N2)A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)100A/Chicken/HongKong/G9/97(H9N2)A/duck/Wuhan/WHYF05/201464A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)68A/turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)76A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)99CK/BJ-like100A/chicken/Hubei/01/1999100A/duck/Hubei/W1/20040.02图3-5H9N2亚型AIVPB1基因遗传进化图Fig.3-5PhylogeneticmapofPB1geneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株26 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究3.1.4.5PA基因序列分析2株病毒的PA基因的全长为2233bp，内含一个完整的ORF阅读框，长度为2151bp，PA基因共编码716个氨基酸。2株病毒的PA基因均位于SHF98-like分支，2株病毒位于相同的小分支且均与禽源H9N2亲缘关系较近（如图3-6），2株病毒PA基因的核苷酸同源性为97.9%，A/Chicken/Hubei/32/2016毒株与A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Quail/HongKong/Gl/97和A/Duck/HongKong/Y439/97的核苷酸同源性分别为88.8%、95.3%、87.9%、89.8%和89.4%。A/Chicken/Hubei/115/2016毒株与标准毒株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Shanghai/F/98、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Quail/HongKong/Gl/97和A/Duck/HongKong/Y439/97的核苷酸同源性分别为89.1%、95.4%、88.1%、90.0%和89.7%。研究表明，PA基因上的T97I突变可以提高流感病毒对哺乳动物的致病性(Songetal2009)，本研究中的2株病毒均发生了突变，97位点均为T。K615N突变可以提高流感病毒对小鼠的致病性，S224P突变和N383D突变能提高流感病毒对鸭的致病性(Songetal2011)，2株病毒均发生突变，615位点均为K。2株病毒的224位点均突变为S，而383位点依然为D。因此两株病毒可能具有更高的对哺乳动物和小鼠的致病性。3.1.4.6NP基因序列分析2株H9N2亚型AIV的NP基因长1565bp，其中含有一个长为1497bp的完整ORF框，共编码498个氨基酸。2株病毒的NP基因均位于SHF98-like分支，但是位于不同的亚分支（如图3-7），2株病毒间的核苷酸同源性为94.9%，毒株A/Chicken/Hubei/32/2016与A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Shanghai/F/98和A/Duck/Hongkong/Y439/97的核苷酸同源性分别为88.7%、94.3%和91.2%。毒株A/Chicken/Hubei/115/2016与A/Chicken/Beijing/1/94、A/Chicken/Shanghai/F/98和A/Duck/Hongkong/Y439/97的核苷酸同源性分别为88.9%、94.2%和90.9%，其中A/Chicken/Hubei/115/2016毒株与2016年分离的H7N9亚型毒株A/Chicken/Longquan/LQ78/2016遗传进化关系很近，核苷酸同源性达到99.1%。NP蛋白上影响病毒致病力的位点包括184位点和319位点，已有研究表明，NP基因的K184A突变与病毒毒力和增殖能力息息相关(Wasilenkoetal2008)，NP27 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文基因上K319N突变会增强病毒对小鼠的致病性(Gabrieletal2005)。2株病毒的NP蛋白184位点均为K，319位点均为N。A/duck/Jiangxi/36477/201390A/chicken/Jiangxi/33621/201341A/duck/Jiangxi/JXA132308/2013(H9N2)A/Chicken/Hubei/32/20163965A/chicken/Hubei/01/2015A/chicken/Jiangxi/36291/2013A/chicken/Jiangxi/33583/2013A/chicken/Wuhan/JXQL01/2015A/duck/Wuhan/WHYF14/2014(H9N2)100A/duck/Wuhan/WHYF14/2014A/chicken/Wenzhou/YHQL04/2014(H9N2)10062A/chicken/Suzhou/4960/2013(H9N2)A/chicken/Hubei/2014A/chicken/Hebei/SJZ01/2015(H10N8)A/chicken/Taizhou/TZJF05/2015(H9N2)5583A/duck/Wenzhou/YHQL64/2014(H9N2)86SHF98-like87A/chicken/Hubei/ZYSJF15/2016A/Chicken/Hubei/115/2016100A/chicken/Fujian/S1XA35/2017(H9N2)h9.4.259A/chicken/Hubei/SIC3/201299A/pigeon/Hubei/269/2012A/pigeon/Hubei/227/201294A/chicken/Hubei/SC122/201399A/pigeon/Hubei/228/201293A/pigeon/Hubei/230/2012A/chicken/Hubei/SIC7/201399A/chicken/Hubei/79/2011A/chicken/Hubei/C4071/201076100A/chicken/Hubei/C4196/200910095A/duck/Hubei/C1146/2011A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)A/chicken/Hubei/C1/2007100A/duck/Hubei/W1/200449100A/chicken/Hubei/01/199996A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)100A/Chicken/HongKong/G9/97(H9N2)A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)44A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2))A/turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)A/duck/Wuhan/WHYF05/2014Y439-like100A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)0.02图3-6H9N2亚型AIVPA基因遗传进化图Fig.3-6PhylogeneticmapofPAgeneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株28 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究98A/chicken/Hubei/01/2015A/duck/Wuhan/WHYF14/201456A/chicken/Hebei/SJZ01/2015(H10N8)A/chicken/Hubei/SC122/201345A/pigeon/Hubei/269/2012A/pigeon/Hubei/227/201269A/pigeon/Hubei/228/2012A/chicken/Hubei/SIC3/20129554A/chicken/Hubei/ZYSJF15/201643A/chicken/Shaanxi/xa0414/2013(H9N2)A/chicken/Ganzhou/GZ86/2016(H9N2)73A/pigeon/Guangxi/158/2014(H6N2)100A/Chicken/Hubei/32/201644A/chicken/Hubei/2014(H9N2)99A/chicken/Hubei/2014(H9N2)10079A/chicken/Hubei/2014SHF98-likeA/chicken/Shandong/02/2011(H9N2)A/chicken/Hubei/10/2009A/chicken/Hubei/79/201193A/chicken/Hubei/SIC7/201397A/Chicken/Hubei/115/20169810090A/duck/Japan/AQ-HE28/2015(H9N2)A/chicken/Longquan/LQ78/2016(H7N9)100A/chicken/Taizhou/TZJF02/2015(H7N9)A/Anhui/1-BALFRG6/2013(H7N9)75A/Anhui/DEWH72-03/2013(H7N9)5987A/Anhui/1-BALFRG8/2013(H7N9)A/chicken/Hubei/C4196/2009100A/chicken/Hubei/C4071/2010100A/duck/Hubei/C1146/2011A/chicken/Hubei/C1/2007A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)61A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)A/turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)A/duck/Wuhan/WHYF05/201492A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)86100A/chicken/Hubei/01/1999100A/Chicken/HongKong/G9/97(H9N2)0.02图3-7H9N2亚型AIVNP基因遗传进化图Fig.3-7PhylogeneticmapofNPgeneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株3.1.4.7M基因序列分析2株H9N2亚型AIV的M基因全长1027bp，其中包含2个开放阅读框，分别编码M1蛋白和M2蛋白。M1蛋白的ORF框长759bp，是M基因中的第26～784位核苷酸，M1蛋白含有252个氨基酸。M2蛋白含有97个氨基酸，编码M2蛋白的29 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文ORF框由两个不连续的基因片段组成，分别为M基因的第26～51位核苷酸和740～1007位核苷酸。2株病毒的M基因遗传进化关系很近（如图3-8），均位于G1-like分支，2株病毒与2013年、2014年和2016年的禽源H7N9亚型AIV亲缘关系很近。2株病毒与参考毒株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Quail/HongKong/Gl/97、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Duck/HongKong/Y439/97和A/Chicken/HongKong/G9/97的核苷酸同源性分别为91.3%~92.2%、93.5%~94.0%、91.1%~91.9%、89.4%~90.2%和91.7%~92.5%。M1蛋白上的15、30、121、167和215位点的氨基酸变异与病毒对小鼠的致病性密切相关，2株病毒的氨基酸位点30（D）、121（T）和167（T），均具有对小鼠低致病性的分子特征。而2株病毒的氨基酸位点15（I）和215（A）均表现出对小鼠高致病性的分子特征。研究表明，M2蛋白上的31氨基酸位点由S变异为N或I使病毒对金刚烷胺耐药，2株病毒的M2蛋白的第31位氨基酸均为N，因此可能对金刚烷胺耐药。2株病毒的M2蛋白64、69氨基酸位点分别为S和P，呈现高致病性流感病毒的分子特征。3.1.4.8NS基因序列分析2株H9N2亚型禽流感病毒的NS基因全长890bp，含有2个完整的ORF阅读框，分别编码NS1蛋白和NS2蛋白。NS1蛋白总共217个氨基酸，NS2蛋白总共121个氨基酸。分离的2株H9N2亚型AIV的NS基因在遗传进化树上均位于CK/BJ-like分支，且2株病毒间遗传进化关系较近，均位于同一亚分支（如图3-9）。A/Chicken/Hubei/32/2016与2017年在广东分离的鸡源H7N9禽流感病毒A/Chicken/Guangdong/J2/2017（H7N9）遗传进化关系较近，核苷酸同源性达到98.5%。A/Chicken/Hubei/115/2016毒株与2013年在安徽分离的人源H7N9亚型AIVA/Anhui/DEWH72-03/2013（H7N9）遗传进化关系很近，核苷酸同源性达到98.2%。A/Chicken/Hubei/32/2016与参考毒株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Quail/HongKong/Gl/97、A/Duck/HongKong/Y439/97和A/Chicken/HongKong/G9/97的核苷酸同源性分别为93.4%、92.9%、90.5%、93.4%和91.5%。A/Chicken/Hubei/115/2016病毒与参考毒株A/Chicken/Beijing/1/94、A/Duck/HongKong/Y280/97、A/Quail/HongKong/Gl/97、A/Duck/HongKong/Y439/9730 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究和A/Chicken/HongKong/G9/97的核苷酸同源性分别为93.6%、93.2%、90.5%、87.2%和91.2%。A/chicken/Taizhou/TZJF02/2015(H7N9)65A/chicken/Yuhuan/YH15/2016(H9N2)81A/Chicken/Hubei/32/2016A/chicken/Wenzhou/YHQL04/2014(H9N2)A/chicken/Rizhao/853/2013(H9N2)48A/chicken/Hangzhou/174/2013(H7N9)A/mink/China/01/2014(H9N2)A/goose/Jiangsu/1027/2013(H7N9)A/Chicken/Hubei/115/201685A/chicken/Jiangsu/JS4539/2014(H9N2)78A/duck/Wenzhou/YJYF24/2015(H7N9)60A/treesparrow/Shanghai/01/2013(H7N9)A/chicken/Beijing/0331/2013(H9N2)72A/duck/Ganzhou/GZ188/2016(H9N2)A/chicken/Wenzhou/HATSLG01/2015(H7N9)50A/chicken/Beijing/1115/2013(H9N2)A/chicken/Jiangsu/C1020/2012(H9N2)A/chicken/Wuhan/JXQL01/201562A/chicken/Hunan/12/2011(H9N2)G1-like99A/chicken/Hubei/01/2015A/chicken/Hubei/ZYSJF15/2016A/chicken/Hubei/79/201163A/duck/Wuhan/WHYF14/201487A/chicken/Hubei/2014A/chicken/Hubei/SC122/201366A/chicken/Hubei/SIC3/20129495A/pigeon/Hubei/227/2012A/Hangzhou/1/2013(H7N9)99100A/Shanghai/4664T/2013(H7N9)A/chicken/Hubei/SIC7/201358A/swine/Taizhou/5/2008(H9N2)A/duck/Hubei/C1146/201132A/chicken/Hubei/C4071/2010100100A/chicken/Hubei/C4196/2009A/chicken/Guangxi/55/2005(H9N2)61A/chicken/Hubei/10/200997A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)A/HongKong/156/97(H5N1)78A/duck/Wuhan/WHYF05/201470A/wildduck/Korea/MHC39-26/2011(H7N9)100A/turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)33A/chicken/Heilongjiang/35/00(H9N2)A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)80A/chicken/Hubei/C1/200786A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)93A/chicken/Fujian/25/00(H9N2)A/chicken/HongKong/G9/1997(H9N2)99A/Chicken/HongKong/G9/97(H9N2)50A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)h9.4.295A/chicken/Hubei/01/199947A/duck/Hubei/W1/2004A/chicken/Guangxi/4/1999(H9N2)42A/swine/Guangxi/S11/2005(H9N2)75A/chicken/Guangxi/37/2005(H9N2)100A/bird/Guangxi/83/2005(H9N2)A/duck/Guangxi/51/2005(H9N2)0.01图3-8H9N2亚型AIVM基因遗传进化图Fig.3-8PhylogeneticmapofMgeneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株31 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文83A/chicken/Hubei/01/201572A/chicken/Hubei/ZYSJF15/201629A/duck/Wenzhou/YHQL64/2014(H9N2)A/chicken/Ganzhou/GZ140/2016(H9N2)19A/chicken/Wenzhou/YHQL04/2014(H9N2)A/Chicken/Hubei/32/201696A/chicken/Guangdong/J2/2017(H7N9)99A/chicken/Suzhou/040201H/2013(H7N9)A/Zhejiang/DTID-ZJU01/2013(H7N9)56A/Anhui/1-DEWH730/2013(H7N9)A/Chicken/Hubei/115/20167241A/Anhui/DEWH72-03/2013(H7N9)82A/duck/Hubei/C1146/2011A/chicken/Hubei/79/201148SHF98-likeA/chicken/Hubei/C4196/200998A/chicken/Hubei/10/2009A/chicken/Hubei/C4071/2010h9.4.299A/chicken/Hubei/SIC7/2013A/duck/Wuhan/WHYF14/20149970A/pigeon/Hubei/228/2012A/pigeon/Hubei/230/201295A/chicken/Hubei/SC122/20139862A/chicken/Wuhan/JXQL01/201569A/chicken/Hubei/2014A/chicken/Hubei/SIC3/201285A/pigeon/Hubei/227/2012A/pigeon/Hubei/269/2012A/Chicken/Shanghai/F/98(H9N2)A/Chicken/HongKong/G9/97(H9N2)A/Duck/HongKong/Y280/97(H9N2)9989A/chicken/Hubei/01/199999A/duck/Hubei/W1/2004A/Chicken/Beijing/1/94(H9N2)100A/HongKong/156/97(H5N1)G1-likeA/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)99A/turkey/Wisconsin/1/1966(H9N2)A/duck/Wuhan/WHYF05/201410060A/chicken/Hubei/C1/2007Y439-like99A/Duck/HongKong/Y439/97(H9N2)0.01图3-9H9N2亚型AIVNS基因遗传进化图Fig.3-9PhylogeneticmapofNSgeneofH9N2subtypeAIV●表示本试验毒株3.2猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析及其对小鼠的致病性研究3.2.1病毒的分离鉴定2016年从湖北某猪场疑似流感症状的猪中分离到一株类禽型H1N1猪流感病毒，采样阳性编号为221，命名为A/swine/Hubei/221/2016，简称为HuBEA-H1N1。32 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究3.2.2HuBEA-H1N1全基因组核苷酸序列测定将毒株A/swine/Hubei/221/2016的8个基因片段克隆于pMD-18T载体后，对其8个基因片段进行了序列测定，并将病毒的基因序列提交到GISAID数据库。测序结果Blast分析显示，基因组8个片段均为H1N1亚型猪流感。Blast结果见下表：表3-61株H1N1亚型猪流感序列比对分析Table3-6SequencealignmentanalysisofoneH1N1swineinfluenzavirus名称基因GeneBank最高相似度毒株亚型相似度基因登录号A/swine/HubeiHAA/Jiangsu/ALS1/2011H1N198%HQ908440.1/221/2016NAA/swine/Guangxi/NNXD2023/2013H1N199%MF927874.1PB2A/Nonoai/LACENRS-714/2009H1N198%KY925585.1PB1A/Osorio/LACENRS-2638/2009H1N199%KY926421.1PAA/Ontario/147265/2009H1N198%CY076762.1NPA/Singapore/276/2009H1N198%CY069620.1MA/Jiangsu/ALS1/2011H1N199%HQ908443.1NSA/swine/Guangxi/NNXD2023/2013H1N199%MF927876.13.2.3湖北H1N1亚型猪流感病毒全基因组序列分析3.2.3.1HA基因序列分析毒株A/swine/Hubei/221/2016的HA基因全长为1760bp，其中含有一个长1701bp的ORF框，编码566个氨基酸。A/swine/Hubei/221/2016毒株的HA基因位于EurasianavianlikeH1N1分支下的Group1亚分支（如图3-10），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到99.1%，氨基酸同源性也是99.1%。A/swine/Hubei/221/2016毒株HA蛋白的裂解位点为-PSIQSR↓GLF-，与其他参考毒株一致，与A/Hunan/42443/2015毒株一致。此裂解位点仅含有一个碱性氨基酸R，有低致病性流感病毒的分子特征。通过分析HA蛋白的受体结合位点发现，A/swine/Hubei/221/2016毒株HA蛋白受体结合位点为108（Y）、148-152（GTTAA）、167（W）、197（H）、204（V）、208（L）、209（Y）和238-243（REQAGR），除位点151突变为A外，其余位点均较为保守，目前151位点的突变还有待研究。33 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文A/swine/Hubei/221/2016毒株HA蛋白的潜在糖基化位点有6个，分别为28（NSTD）、40（NVTV）、71（NCSV）、291（NCTT）、498（NGTY）和557（NGSL），这些糖基化位点较为保守，与参考毒株相比未发生突变，与毒株A/Hunan/42443/2015一致。3.2.3.2NA基因序列分析毒株A/swine/Hubei/221/2016的NA基因的ORF框长1410bp，编码469个氨基酸。遗传进化分析表明，A/swine/Hubei/221/2016毒株的NA基因位于EurasianavianlikeH1N1分支下的Group1亚分支（如图3-11），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到98.4%，氨基酸同源性达到98.7%。A/swine/Hubei/221/2016毒株的NA蛋白有7个潜在N-糖基化位点，分别是44（NQSE）、58（NNTW）、63（NQTY）、68（NVSN）、88（NSSL）、146（NGTI）和235（NGSC），与参考毒株A/Hunan/42443/2015相同。3.2.3.3PB2基因序列分析A/swine/Hubei/221/2016的PB2基因全长2341bp，含有一个长为2280bp的ORF框，编码760个氨基酸。遗传进化分析表明，A/swine/Hubei/221/2016的PB2基因位于InfluenzaA(H1N1)分支也称为pandemicH1N1/2009分支（如图3-12），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到97.8%，氨基酸同源性达到98.2%。3.2.3.4PB1基因序列分析毒株A/swine/Hubei/221/2016的PB1基因全长2341bp，含有一个长为2274bp的ORF框，编码758个氨基酸。遗传进化分析表明，A/swine/Hubei/221/2016毒株的PB1基因位于InfluenzaA(H1N1)分支也称为pandemicH1N1/2009分支（如图3-13），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到99.2%，氨基酸同源性达到99.6%。34 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究3.2.3.5PA基因序列分析毒株A/swine/Hubei/221/2016的PA基因全长2231bp，含有一个长为2151bp的ORF框，编码717个氨基酸。遗传进化分析表明，A/swine/Hubei/221/2016毒株的PA基因位于InfluenzaA(H1N1)分支也称为pandemicH1N1/2009分支（如图3-14），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到98%，氨基酸同源性达到98.6%。3.2.3.6NP基因序列分析毒株A/swine/Hubei/221/2016的NP基因全长1580bp，含有一个长为1497bp的ORF框，编码498个氨基酸。遗传进化分析表明，A/swine/Hubei/221/2016毒株的NP基因位于InfluenzaA(H1N1)分支也称为pandemicH1N1/2009分支（如图3-15），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到98.5%，氨基酸同源性达到99.4%。3.2.3.7M基因序列分析毒株A/swine/Hubei/221/2016的M基因全长1018bp，含有两个完整的ORF框，分别编码M1蛋白和M2蛋白。遗传进化分析表明，A/swine/Hubei/221/2016毒株的M基因位于EurasianavianlikeH1N1分支（如图3-16），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到99.0%。3.2.3.8NS基因序列分析毒株A/swine/Hubei/221/2016的NS基因全长890bp，含有两个ORF框，分别编码NS1和NS2两种蛋白。遗传进化分析表明，A/swine/Hubei/221/2016毒株的NS基因位于EurasianavianlikeH1N1分支（如图3-17），与2015年在湖南人体内分离的A/Hunan/42443/2015遗传距离较近，核苷酸同源性达到97.4%。35 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文A/swine/Guangdong/NS2433/201299A/swine/Guangdong/NS2434/201292A/swine/Guangdong/2481/2012A/swine/Guangxi/3617/2011A/swine/Guangxi/3612/20117604A/swine/Guangxi/NS3248/2011A/swine/Guangdong/306/2013A/swine/Guangxi/3880/20119509A/swine/Guangdong/128/201290A/swine/Guangdong/2583/2012709986A/swine/Guangdong/NS2541/2012A/swine/Guangdong/104/2013Group2A/swine/Guangdong/NS3241/20119999A/swine/Guangdong/NS3243/2011A/swine/Guangxi/2841/2010A/swine/Guangdong/2410/201099A/swine/Guangdong/2436/2010A/swine/Guangdong/2403/201099A/swine/Guangdong/2420/2010A/swine/Guangdong/2407/20109968A/swine/Guangdong/2418/2010A/swine/Guangdong/2419/201065A/swine/Guangdong/2424/2010A/swine/Guangdong/2434/2010A/Jiangsu/1/2011EurasianavianlikeH1N199A/swine/Heilongjiang/B106/2011A/swine/Jiangsu/38/201199A/swine/Guangdong/95/2013A/swine/Guangxi/2499/201164A/swine/Guangxi/3871/2011A/swine/Guangxi/3878/2011A/swine/Guangxi/3863/20118767A/swine/Guangxi/3861/2011A/swine/Guangxi/3852/2011A/swine/Guangxi/3843/2011A/swine/Guangxi/3879/2011Group196A/swine/Guangxi/3858/2011A/swine/Guangxi/1/201383A/Hunan/42443/2015A/swine/Hubei/221/20167538A/swine/Guangxi/BB1/20134168A/swine/Ningjin/03/2014A/swine/Zhucheng/43/201522A/swine/Shandong/S269/2014A/swine/Zhucheng/90/201471A/swine/Shandong/S113/201499A/swine/Shandong/S153/20145827A/swine/Shandong/S93/2014A/swine/England/453/2006A/swine/Shandong/RS/200899A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)classicalH1N1A/swine/Shandong/LY/2008A/swine/Guangdong/2/01(H1N1)99A/California/04/2009(H1N1)A/Sichuan/1/2009(H1N1)99A/swine/Nanchang/F9/201081InfluenzaA(H1N1)A/swine/China/Suizhou-80/201185A/swine/Yunnan/74/200969A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)0.05图3-10H1N1亚型SIVHA基因遗传进化图Fig.3-10PhylogeneticmapofHAgeneofH1N1subtypeSIV●表示本试验毒株36 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究86A/swine/Guangdong/2583/2012A/swine/Guangdong/NS2541/201287A/swine/Guangdong/128/2012A/swine/Guangxi/3880/201198A/swine/Guangdong/306/2013100A/swine/Guangdong/104/2013A/swine/Guangdong/NS3241/20119994A/swine/Guangdong/NS3243/2011A/swine/Guangxi/2841/2010Group2A/swine/Guangdong/2403/2010100A/swine/Guangdong/2407/20105698A/swine/Guangdong/2410/2010A/swine/Guangdong/2417/201099A/swine/Guangdong/1623/2010A/swine/Guangdong/1605/2010100A/swine/Guangdong/1624/2010100A/swine/Guangdong/1/201099A/swine/Guangxi/S2/2013A/swine/Guangdong/3747/2011(H1N1)100A/swine/Guangdong/2/2013100A/swine/Guangdong/30/201358A/swine/Hunan/951/2013Group3A/swine/Guangdong/32/201310051EurasianavianlikeH1N192A/swine/Guangdong/5/201399A/swine/Guangdong/6/201368A/swine/Jiangsu/zg1/201079A/swine/Jiangsu/zg2/201073A/swine/Hunan/196/2011A/swine/Jiangsu/zg13/2011A/Jiangsu/1/2011100A/swine/Guangxi/3861/2011A/swine/Guangxi/3863/201158A/swine/Guangxi/3852/2011A/swine/Guangxi/3843/201187A/swine/Guangxi/3858/201150A/swine/Guangxi/1/2013Group158A/swine/Guangxi/BB1/2013A/swine/Zhucheng/43/201566A/Hunan/42443/201584A/swine/Hubei/221/201674A/swine/Ningjin/03/2014A/swine/Shandong/S269/2014A/swine/Zhucheng/90/201466100A/swine/Shandong/S113/201499A/swine/Shandong/S153/2014A/swine/Shandong/S93/2014A/Switzerland/9356/2009(H1N1)A/California/04/2009(H1N1)63A/Sichuan/1/2009(H1N1)100InfluenzaA(H1N1)A/swine/Yunnan/74/20098468A/swine/Nanchang/F9/201087A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)A/swine/England/453/2006A/Duck/Bavaria/1/77A/swine/Fujian/FZ/2008A/swine/HongKong/813/1993(H1N1)100A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)ClassicalH1N1100100A/swine/Shandong/LY/200899A/swine/Shandong/RS/20080.05图3-11H1N1亚型SIVNA基因遗传进化图Fig.3-11PhylogeneticmapofNAgeneofH1N1subtypeSIV●表示本试验毒株37 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文A/swine/Hubei/03/200999A/swine/Hubei/104/200998A/swine/Hubei/101/200961A/swine/Shanghai/3/2014A/swine/Guangdong/6/201340A/swine/Liaoning/32/2006Group1A/swine/Shandong/275/200991800A/swine/Shandong/101/200861A/swine/Shandong/327/200999A/swine/Guangdong/NS2887/201299A/Jiangsu/1/2011A/swine/Henan/11/2005EurasianavianlikeH1N1100A/swine/Guangxi/NS3248/2011A/swine/Guangdong/1605/2010A/swine/Guangdong/1611/2010100A/swine/Guangdong/1613/2010100A/swine/Guangdong/1616/2010Group2100A/swine/Guangdong/1617/2010A/swine/Guangdong/1619/2010100A/swine/Guangdong/1623/2010A/swine/Guangdong/1624/2010A/swine/England/453/2006A/Duck/Bavaria/1/77100A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)100A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)(2)ClassicalH1N1A/swine/HongKong/813/1993(H1N1)98A/swine/Guangdong/1/2010Triple-reassortantH1N1A/swine/Hebei/10/2006(H1N2)65A/Sichuan/1/2009(H1N1)47A/California/04/2009(H1N1)A/swine/Shandong/01/200910076A/swine/Yunnan/74/200995A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)A/swine/Nanchang/F9/2010100A/swine/Guangdong/306/2013A/swine/Guangxi/1/201398A/swine/Guangxi/BB1/2013InfluenzaA(H1N1)41A/swine/Hubei/221/20164255A/swine/Ningjin/03/201444A/Hunan/42443/201543A/swine/Shandong/S269/2014A/swine/Zhucheng/90/201474A/swine/Shandong/S113/201499A/swine/Shandong/S153/201498A/swine/Shandong/S93/20140.02图3-12H1N1亚型SIVPB2基因遗传进化图Fig.3-12PhylogeneticmapofPB2geneofH1N1subtypeSIV●表示本试验毒株38 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究A/swine/Guangdong/1434/2010A/swine/Guangdong/1436/201096A/swine/Guangdong/1430/201098A/swine/Guangdong/1409/2010A/swine/Guangdong/1437/2010A/swine/Guangdong/1425/201089A/swine/Nanchang/F9/2010A/California/04/2009(H1N1)A/Sichuan/1/2009(H1N1)13A/swine/Yunnan/74/200983A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)InfluenzaA(H1N1)A/swine/Guangdong/306/2013A/swine/Guangxi/BB1/2013100A/Hunan/42443/201510065A/swine/Hubei/221/201695A/swine/Shandong/S269/201497A/swine/Shandong/S93/2014100A/swine/Tianjin/184/2011A/swine/Tianjin/3/2011100A/swine/Tianjin/42/2011100A/swine/Tianjin/47/2011A/swine/Guangdong/1/2010A/Duck/Bavaria/1/77A/swine/England/453/2006A/Switzerland/9356/2009(H1N1)99A/swine/Guangxi/3618/2011A/swine/Guangxi/NS3248/201110097A/swine/Guangxi/3614/2011100A/swine/Guangxi/3617/2011A/swine/Guangxi/3880/201110099A/swine/Guangdong/104/2013100A/Jiangsu/1/2011A/swine/Henan/11/2005EurasianavianlikeH1N1A/swine/Guangdong/1619/2010A/swine/Guangdong/1624/2010100100A/swine/Guangdong/1617/2010A/swine/Guangdong/1623/2010A/swine/Guangdong/1616/2010100A/swine/Guangdong/2419/2010A/swine/Guangdong/2420/2010100A/swine/Guangdong/2424/2010A/swine/Guangdong/2434/201089A/swine/Guangdong/2436/2010A/swine/Tianjin/01/04(H1N1)A/swine/HongKong/813/1993(H1N1)100A/swine/Shandong/LY/2008100classicalH1N1A/swine/Shandong/RS/2008100A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)63A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)(2)0.05图3-13H1N1亚型SIVPB1基因遗传进化图Fig.3-13PhylogeneticmapofPB1geneofH1N1subtypeSIV●表示本试验毒株39 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文35A/swine/Guangxi/BB1/2013A/swine/Hubei/221/2016A/Hunan/42443/201580A/swine/Guangdong/306/201331A/swine/Guangxi/1/2013A/swine/Shandong/S269/201410089A/swine/Shandong/S153/201492A/swine/Shandong/S93/2014A/swine/Guangdong/NS2897/2012A/California/04/2009(H1N1)93InfluenzaA(H1N1)A/Sichuan/1/2009(H1N1)93A/swine/Guangdong/1436/2010A/swine/Guangdong/1437/2010100A/swine/Nanchang/F9/201053A/swine/Yunnan/74/200996A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)100A/swine/Tianjin/184/201199A/swine/Tianjin/3/2011100100A/swine/Tianjin/42/2011A/swine/Guangdong/1/2010A/Duck/Bavaria/1/77A/swine/England/453/2006A/Switzerland/9356/2009(H1N1)A/swine/Hubei/01/2009100100A/swine/Hubei/101/2009A/swine/Hubei/104/2009100A/swine/Hubei/03/2009A/swine/Jiangsu/s15/201199100A/swine/Jiangsu/s16/201199A/swine/Jiangsu/S14/2011EurasianavianlikeH1N1A/swine/Guangxi/24/2011100A/swine/Guangdong/NS2887/2012A/swine/Sichuan/62/201299A/swine/Tianjin/2/2011A/swine/Tianjin/45/201155A/Jiangsu/1/201156A/swine/Jiangsu/zg3/2010100A/swine/Jiangsu/zg8/2010100A/swine/Tianjin/01/04(H1N1)A/swine/Henan/01/06(H1N1)A/swine/HongKong/813/1993(H1N1)10092A/swine/Shandong/LY/2008100A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)classicalH1N1100A/swine/Shandong/RS/200879A/swine/Shandong/1123/2008(H1N1)0.02图3-14H1N1亚型SIVPA基因遗传进化图Fig.3-14PhylogeneticmapofPAgeneofH1N1subtypeSIV●表示本试验毒株40 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究A/swine/Hubei/101/200999A/swine/Hubei/104/2009A/swine/Hubei/01/200960A/swine/Hubei/03/200956A/swine/Zhejiang/1/2007A/swine/Fujian/204/20079994A/swine/Shandong/275/2009A/swine/Hunan/196/2011A/swine/Hunan/153/2013100A/swine/Tianjin/Y9/201176100A/Jiangsu/1/2011A/swine/Guangdong/2420/2010EurasianavianlikeH1N1A/swine/Guangdong/2434/2010A/swine/Guangdong/2407/2010A/swine/Guangdong/2417/201099A/swine/Guangdong/2418/2010100A/swine/Guangdong/2419/2010A/swine/Guangdong/2424/201099A/swine/Guangdong/2410/2010A/swine/Guangdong/2436/2010100A/Switzerland/9356/2009(H1N1)A/swine/England/453/2006A/Duck/Bavaria/1/77100A/swine/Henan/01/06(H1N1)100A/swine/Tianjin/01/04(H1N1)A/swine/Fujian/FZ/200879A/swine/Shandong/RS/2008100A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)66A/swine/Shandong/LY/200898classicalH1N1A/swine/HongKong/813/1993(H1N1)54A/swine/Beijing/94/1991A/swine/Guangdong/1/2010A/Sichuan/1/2009(H1N1)100A/California/04/2009(H1N1)74A/swine/Zhucheng/90/20149998A/swine/Hubei/221/2016A/Hunan/42443/2015InfluenzaA(H1N1)A/swine/Yunnan/74/200944A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)31A/swine/Nanchang/F9/201037A/swine/Guangdong/NS94/2012100A/swine/Guangdong/NS99/20120.02图3-15H1N1亚型SIVNP试验基因遗传进化图Fig.3-15PhylogeneticmapofNPgeneofH1N1subtypeSIV●表示本毒株41 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文A/swine/Guangxi/3871/2011A/swine/Guangxi/3878/2011A/swine/Guangxi/3863/2011A/swine/Guangxi/3861/2011A/swine/Guangxi/3858/2011A/swine/Guangxi/3852/201143A/swine/Guangxi/3843/2011A/swine/Guangdong/95/2013A/swine/Guangxi/2499/2011A/swine/Guangxi/3879/2011A/swine/Guangxi/BB1/2013A/swine/Guangxi/1/201376A/swine/Ningjin/03/20144617A/swine/Shandong/S269/2014A/Hunan/42443/2015EurasianavianlikeH1N1A/swine/Hubei/221/201644A/swine/Shandong/S153/2014A/swine/Shandong/S93/20145880A/swine/Shandong/S113/2014A/swine/Zhucheng/90/2014A/swine/Henan/11/2005A/Jiangsu/1/201192A/swine/Guangdong/NS2887/201299A/swine/Guangdong/NS2899/201289A/swine/Guangdong/2583/201291A/swine/Guangdong/NS2541/201299A/swine/Guangxi/3880/2011A/swine/Guangdong/NS2433/20126087A/swine/Guangdong/NS2434/2012A/Switzerland/9356/2009(H1N1)A/swine/Guangdong/1436/2010A/swine/Guangdong/1437/201092A/swine/Guangdong/1434/201085A/swine/Guangdong/1430/2010A/swine/Guangdong/1409/2010A/swine/Guangdong/1408/2010A/swine/Guangdong/1397/2010A/swine/Guangdong/1367/201088A/swine/Guangdong/306/201399A/swine/Guangdong/NS2897/2012InfluenzaA(H1N1)99A/swine/Tianjin/42/201189A/swine/Tianjin/47/201194A/swine/Tianjin/3/2011A/swine/Tianjin/184/20116490A/Sichuan/1/2009(H1N1)A/California/04/2009(H1N1)A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)A/swine/Nanchang/F9/2010A/swine/Yunnan/74/2009A/swine/England/453/2006A/Duck/Bavaria/1/77A/swine/Fujian/FZ/2008A/swine/HongKong/813/1993(H1N1)99A/swine/Shandong/LY/2008ClassicalH1N199A/swine/Shandong/RS/200899A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)0.02图3-16H1N1亚型SIVM基因遗传进化图Fig.3-16PhylogeneticmapofMgeneofH1N1subtypeSIV●表示本试验毒株42 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究A/swine/Shandong/S153/201483A/swine/Shandong/S93/2014A/swine/Shandong/S113/201459A/swine/Zhucheng/90/201471A/swine/Shandong/S269/2014A/swine/Ningjin/03/201455A/swine/Hubei/221/2016A/swine/Guangxi/BB1/201362A/swine/Guangxi/1/2013Group299A/swine/Guangdong/306/2013A/Hunan/42443/201574A/swine/Guangdong/2420/2010A/swine/Guangdong/2419/2010100100A/swine/Guangdong/2424/2010A/swine/Guangdong/2434/2010A/swine/Guangdong/1/20107173A/swine/Guangxi/S2/2013A/swine/Nanchang/F9/201087A/swine/Yunnan/74/2009A/swine/Heilongjiang/44/2009(H1N1)10082A/Sichuan/1/2009(H1N1)10033A/California/04/2009(H1N1)InfluenzaA(H1N1)A/swine/Tianjin/184/2011A/swine/Tianjin/47/201191A/swine/Tianjin/3/201195A/swine/Tianjin/42/2011A/swine/HongKong/813/1993(H1N1)65A/swine/Shandong/LY/2008ClassicalH1N1100A/swine/Guangdong/6/2010(H1N1)62A/swine/Fujian/FZ/2008A/swine/Shandong/RS/2008A/Switzerland/9356/2009(H1N1)53A/swine/England/453/2006100A/swine/Liaoning/32/2006A/swine/Guangdong/5/201357100A/swine/Guangdong/6/201385Group1100A/swine/Guangdong/2/2013A/swine/Guangdong/32/2013A/swine/Henan/11/20051480A/swine/Shanghai/3/2014A/Jiangsu/1/201197A/swine/Tianjin/2/201163A/swine/Tianjin/Y9/2011A/Duck/Bavaria/1/770.05图3-17H1N1亚型SIVNS基因遗传进化图Fig.3-17PhylogeneticmapofNSgeneofH1N1SIV●表示本试验毒株43 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文3.2.4HuBEA-H1N1与HuNEA-H1N1的序列比对遗传进化分析发现，A/swine/Hubei/221/2016与感染人的H1N1病毒（A/Hunan/42443/2015）高度同源。因此对2株H1N1病毒做了氨基酸差异分析（如表3-7），2株病毒间的氨基酸差异较小。2株H1N1病毒HA蛋白上的151和204位点存在差异，151和204位点均属于病毒的HA受体结合位点。A/swine/Hubei/221/2016的HA蛋白在151和204位点分别为A和V，A/Hunan/42443/2015的HA蛋白在151和204位点分别为V和D。表3-7A/swine/Hubei/221/2016和A/Hunan/42443/2015之间的氨基酸差异Table3-7AminoacidsubstitutionbetweenHuBEA-H1N1andHuNEA-H1N1基因毒株突变位点PB21361220355391411461553590655667718A/swine/Hubei/221/2016KRIIEVVISVVRA/Hunan/42443/2015QKVRDIIVGLIKPB1105171216278362533581A/swine/Hubei/221/2016DMGETSDA/Hunan/42443/2015NVDKMNNPA3058225228263269386432626639A/swine/Hubei/221/2016TDNNTKEIRTA/Hunan/42443/2015IGSSARDVKAHA2151204319371A/swine/Hubei/221/2016KAVKRA/Hunan/42443/2015EVDEQNP128373424484A/swine/Hubei/221/2016ETTGA/Hunan/42443/2015DNIENA1676122286314329A/swine/Hubei/221/2016TAVSMSA/Hunan/42443/2015ATININM13637207A/swine/Hubei/221/2016NICA/Hunan/42443/2015STSNS121545662808184109170171216A/swine/Hubei/221/2016RIAKALLHTVSA/Hunan/42443/2015QVTRTIVQIDPNS2143489A/swine/Hubei/221/2016LRAA/Hunan/42443/2015MQV3.2.5中国猪流感流行概况从NCBI和GISAID数据库下载所有中国猪流感病毒的HA基因序列，总共511株病毒。统计每个年份各种亚型的病毒数目，发现中国猪流感分为5种亚型：H1N1、H1N2、H3N2、H5N1和H9N2。近年来中国猪流感以H1N1、H1N2和H3N2为主，其中H1N1亚型占了大多数，因此，对所有中国流行的H1N1亚型SIV的HA基因进行遗传进化分析，将H1N1亚型SIV分为3种类型：欧亚禽系H1N1、2009大流行H1N1和经典H1N1猪流感病毒。统计每个年份3种H1N1亚型SIV的数目，得到图3-18。通过分析中国猪流感随时间的的流行分布情况（如图3-18）发现，中国从1998年首次分离到猪流感病毒以来，猪流感病毒的数量急剧上升。从2005年第44 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究一次出现欧亚禽系H1N1亚型SIV以来，欧亚禽系H1N1亚型SIV出现地越来越多，在同一年份分离的所有SIV中占据了较大的比例。2012年及以后，猪流感毒株数量降低，这可能与猪流感的预防和控制有关，也可能是因为近年来分离的猪流感病毒还未在数据库公开。简言之，欧亚禽系H1N1亚型SIV越来越成为SIV的重要组成部分。图3-18中国猪流感病毒随时间的分布Fig.3-18DistributionaccordingtotimeofSIVisolatedinChina.3.2.5.1中国欧亚禽系H1N1亚型SIV的基因型及其分布情况下载所有在中国分离的欧亚禽系H1N1SIV基因组序列（按HA基因分类），总共194株病毒。对所有病毒的8个基因进行遗传进化分析，然后根据基因的进化来源对每株病毒的8个基因进行分类，分类后统计，得到中国欧亚禽系H1N1猪流感的基因型分类图（如图3-19），基因被划分为5类，分别为Group1、Group2、Group3、pandemicH1N1和triple-reassortantH1N1(Yangetal2016),中国的欧亚禽系H1N1猪流感被分为11个基因型，将这些基因型按字母从A到K的排序进行命名（如图3-19），大多数病毒为以下5个基因型：A、B、C、H和J。其中基因型A、基因型B和基因型C的病毒的8个基因片段均来源于欧亚禽系H1N1猪流感病毒。基因型H的病毒的4个基因PB2、PB1、PA和NP基因来源于pandemicH1N1/2009，其余4个基因片段来源于欧亚禽系H1N1猪流感病毒。基因型J的病毒的HA和NA45 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文基因来源于欧亚禽系H1N1亚型SIV，其余6个基因片段来源于pandemicH1N1/2009亚型SIV。本研究的分离株A/swine/Hubei/221/2016属于基因型H。预测基因型H的病毒有可能成为传染性强且毒力强的毒株，因为有研究表明毒株A/Hunan/42443/2015毒株造成了人的重症肺炎(Zhuetal2016)。图3-19欧亚禽系H1N1亚型猪流感病毒基因型分类Fig.3-19GenotypeclassificationofEurasianavian-likeH1N1influenzaAvirus.我们分析了毒株数目较多的5个基因型（A、B、C、H和J），将这5个基因型的毒株按年份进行统计，得到这5个基因型的毒株数目在中国随时间变化的趋势图（如图3-20）。从图3-20可以发现，2007~2013年间基因型A的毒株一直占大多数，基因型H于2013年首次出现后，基因型H的病毒毒株数量越来越多。46 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究图3-20各基因型欧亚禽系H1N1在中国的流行情况Fig.3-20EpidemicsituationofeverygenotypeEurasianavian-likeH1N1inChina.对5种基因型的欧亚禽系H1N1病毒按分离的省份进行统计，得到5种基因型的病毒的地理分布图（如图3-21）。每一个省份内均有一个饼状图，没有饼状图的省份为并未分离到病毒的省份。饼状图的大小代表该省份中毒株总数量的多少，饼状图越大代表该省份的毒株数量越多。饼状图中一种颜色代表一种基因型。通过对病毒的地理分布图分析发现，广东省是分离到欧亚禽系H1N1猪流感最多的省份，其次为江苏和广西，重组的基因型H和基因型J的病毒大部分分布于山东、天津、广东、广西、湖北和湖南。47 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文图3-21各基因型欧亚禽系H1N1亚型猪流感在中国各地发生频率Fig.3-21FrequenciesoftheEurasianavian-likeH1N1swineinfluenzavirusgenotypesacrossChina.注：饼状图的大小代表毒株数量Note:Thesizeofthepiechartrepresentsthequantityofstrains.3.2.62株H1N1亚型流感病毒在细胞上的增殖曲线由于毒株A/swine/Hubei/221/2016与参考毒株A/Hunan/42443/2015的亲缘关系很近，因此，我们将病毒A/Hunan/42443/2015做为对照做了2株病毒在细胞上的增殖曲线。-3TCID将2株病毒按照1050每个细胞的剂量接种MDCK细胞、Nptr细胞和A549细胞，接毒后的细胞放置于37℃的5%CO2培养箱培养，分别于培养12h、24h、48h、72h后取含有病毒粒子的上清液，将上清液接种MDCK细胞测得病毒的TCID50，绘制出病毒在各种细胞上的增殖曲线。分析2株病毒在MDCK细胞上的增殖曲线（如图3-22）发现，2株病毒可以在MDCK细胞上很好地增殖，最高增殖滴度达到104TCID50，在MDCK细胞上，毒株A/swine/Hubei/221/2016的增殖滴度略低于毒株A/Hunan/42443/2015。48 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究分析2株病毒在Nptr细胞上的增殖曲线（如图3-23）发现，2株病毒可以在Nptr细胞上很好地增殖，最高增殖滴度达到108TCID50，在Nptr细胞上A/swine/Hubei/221/2016的增殖滴度略低于A/Hunan/42443/2015。分析2株病毒在A549细胞上的增殖曲线（如图3-24）发现，2株病毒可以在A549细胞上很好地增殖，最高增殖滴度达到105TCID50，同时在A549细胞上毒株A/swine/Hubei/221/2016增殖滴度略低于毒株A/Hunan/42443/2015。这说明毒株A/Hunan/42443/2015较毒株A/swine/Hubei/221/2016能更好地在细胞上增殖。2株病毒在Nptr细胞上的适应性最高，其次为A549细胞。图3-222株H1N1亚型流感病毒在MDCK细胞上的增殖曲线Fig3-22ProliferationcurveoftwoH1N1influenzavirusesonMDCKcells图3-232株H1N1亚型流感病毒在Nptr细胞上的增殖曲线Fig3-23ProliferationcurveoftwoH1N1influenzavirusesonNptrcells49 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文图3-242株H1N1亚型流感病毒在A549细胞上的增殖曲线Fig3-24ProliferationcurveoftwoH1N1influenzavirusesonA549cells3.2.7.H1N1流感病毒对小鼠的致病性试验3.2.7.12株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后的临床症状A/swine/Hubei/221/2016和A/Hunan/42443/2015感染小鼠后的第1d到14d观察小鼠的临床症状。小鼠在感染病毒后第3d出现明显的流感感染症状，主要包括精神不振、厌食、扎堆、炸毛、弓背、发抖、眯眼、呼吸短促、偶尔可见打喷嚏，到后期呈现极度消瘦、呼吸困难、尾部血管发紫、痴呆，最后死亡。感染A/swine/Hubei/221/2016的小鼠症状较为轻微，感染A/Hunan/42443/2015的小鼠症状较为严重。初步判断A/swine/Hubei/221/2016毒力较弱。3.2.7.22株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后的存活率为研究病毒A/swine/Hubei/221/2016在小鼠体内的致病性，我们将与其亲缘关系较近的病毒A/Hunan/42443/2015用8质粒系统（8质粒由中国疾病预防控制中心朱闻斐老师惠赠）拯救出来，选取A/Hunan/42443/2015毒株作为对照。将小鼠分为34.5TCID组，分别接种A/swine/Hubei/221/2016、A/Hunan/42443/2015和PBS，用1050的病毒剂量对小鼠攻毒。攻毒后第1d到第14d观察小鼠死亡情况，当小鼠体重减少量大于等于原体重的25%即判定为死亡并处以安乐死，计算小鼠存活率。如图3-25所示，PBS组小鼠全部存活。A/swine/Hubei/221/2016对小鼠的毒力较弱，致死率为50 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究25%，病毒感染后第4d有一只小鼠死亡，感染后第5d又有一只小鼠死亡，共死亡两只小鼠。A/Hunan/42443/2015组的小鼠全部死亡，致死率为100%。说明分离株A/swine/Hubei/221/2016对小鼠的致病力较弱。图3-25小鼠感染2株H1N1病毒后的存活率Fig.3-25Thesurvival（%）ofmiceafterinfectionwithtwostrainsofH1N1influenza3.2.7.32株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后体重变化情况在观察小鼠存活率的同时，我们也测量了小鼠体重指数的变化情况。如图3-26，A/swine/Hubei/221/2016组的小鼠体重在1~7d持续下降，随后体重又恢复到与PBS组小鼠体重基本持平的水平。然而，感染A/Hunan/42443/2015毒株的小鼠体重大幅度地持续下降且没有恢复，最终导致小鼠死亡。说明分离株A/swine/Hubei/221/2016对小鼠的致病性较低。图3-26小鼠感染2株H1N1病毒后的体重指数Fig.3-26ThevariationofmiceweightindexafterinfectionwithtwostrainsofH1N1influenza51 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文3.2.7.42株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后肺脏眼观病变对3组小鼠分别鼻腔接种104.5TCID50的A/swine/Hubei/221/2016的病毒液、104.5TCID50的A/Hunan/42443/2015的病毒液以及50μlPBS。接种4d后，取小鼠肺脏肉眼观察病变。接种PBS的小鼠的肺脏较为正常，接种病毒液的2组小鼠肺脏均可见宏观病变。病理研究表明，接种病毒液的2组小鼠肺脏均具有轻微的淤血现象，感染HuBEA-H1N1病毒的小鼠肺脏淤血情况较轻微，感染HuNEA-H1N1病毒的小鼠肺脏淤血情况较严重，这说明HuNEA-H1N1毒株对小鼠的肺脏损伤相比HuBEA-H1N1毒株严重一些，如图3-27。图3-27小鼠感染H1N1流感病毒后肺脏的眼观病理变化Fig.3-27LunglesionsofmiceinfectedwithH1N1subtypeinfluenza注：A图为接种PBS的肺，B图为感染HuBEA-H1N1病毒的肺，C图为感染HuNEA-H1N1病毒的肺。Note:LunginoculatedwithPBSismapA.LunginoculatedwithHuBEA-H1N1virusismapB.LunginoculatedwithHuNEA-H1N1virusismapC.3.2.7.52株H1N1流感病毒在SPFBalb/c小鼠体内复制情况在小鼠攻毒后第1d、3d、5d，PBS组、HuBEA-H1N1组和HuNEA-H1N1组各剖杀3只小鼠，取其心、肝、脾、肺、肾、气管、鼻甲、脑8种组织器官，测定病毒在各组织器官的增殖滴度（如图3-28）。通过测定组织匀浆液在MDCK细胞上的TCID50发现，小鼠的心、肝、脾、肾和脑组织均未被检测到病毒，在小鼠的鼻甲、肺、气管中检测到了病毒。感染后第7d的小鼠均被检测到病毒，整体来说，组织病毒载量在第7d比第1d和第3d高，A/Hunan/42443/2015的增殖滴度较A/swine/Hubei/221/2016高。52 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究图3-28.2株流感病毒在小鼠呼吸系统的复制Fig.3-28Replicationoftwoinfluenzavirusintherespiratorytractsofmice注：NT表示鼻甲，TR表示气管，LU表示肺脏Note:NTrepresentnasalturbinate.TRrepresenttrachea.LUrepresentlung.3.2.7.62株H1N1流感病毒感染SPFBalb/c小鼠后肺脏组织病变将小鼠分为3组，分别鼻腔接种50μlPBS、50μl104.5TCID50剂量的A/swine/Hubei/221/2016病毒液和50μl104.5TCID50剂量的A/Hunan/42443/2015病毒液。小鼠感染病毒4d后，取小鼠肺脏检查病理变化（如图3-29），2株病毒感染小鼠后引起了小鼠不同程度的肺脏病理变化。毒株A/swine/Hubei/221/2016感染小鼠4d后，小鼠肺脏呈现局部的轻度淤血，大部分肺泡壁上皮细胞呈“空泡”样变性，部分肺泡腔内可见少量散在分布的巨噬细胞并导致轻度肺炎。A/Hunan/42443/2015毒株感染小鼠4d后，小鼠肺脏呈中等程度淤血，大部分血管呈现血管炎，主要表现为，血管周围可见淋巴细胞浸润，呈“管套”现象，部分血管壁上皮细胞变性。肺脏存在散在的轻度间质性肺炎，主要表现为肺泡壁上皮细胞“空泡”样变性，肺泡腔内可见数量不等的巨噬细胞和脱落的肺泡壁上皮细胞，肺脏呈现轻度间质性肺炎，伴有明显的淋巴细胞浸润性血管炎。2株病毒在感染小鼠4d后均导致了小鼠肺脏的损伤。53 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文图3-29H1N1流感病毒感染小鼠后的肺脏病理变化Fig.3-29HistopathologicchangeoflungfromH1N1virus-infectedmice54 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究4.讨论4.1H9N2亚型禽流感病毒H9N2亚型流感病毒可以分为北美毒株和欧亚毒株。通过病毒基因组片段的遗传进化分析发现，2株病毒均属于欧亚毒株。欧亚毒株谱系主要分为BJ-like分支、G1-like分支、Y439-like分支、Y280-like分支和SHF98-like分支。2008年有了一种新的遗传谱系划分方法，将以1966年第一次分离到的H9N2流感病毒A/turkey/Wisconsin1/1966作为代表的谱系命名为H9.1谱系，将以A/Duck/HongKong/Y439/97为代表的Y439-like分支命名为h9.3谱系，将G1-like分支命名为h9.4.1谱系，将BJ-Like分支、G9-like分支、Y280-like分支和SHF98-like分支命名为h9.4.2谱系。本研究对于2016年从鸡场分离的2株H9N2亚型AIV进行了全基因组遗传进化分析。对HA基因的遗传进化分析发现，2株病毒的HA基因属于Y280-like分支。2株病毒的HA基因与A/Duck/HongKong/Y280/97亲缘关系较近、同源性较高，与疫苗株A/Chicken/Shanghai/F/98的亲缘关系相对较远。SunY等人对1994~2008年流行的H9N2亚型AIV分析发现，中国在1994~2008年主要流行CK/BJ-Like分支的病毒。对1998~2004年流行的H9N2亚型AIV分析表明，中国在1998~2004年时，CK/BJ-like分支和SHF98-like分支的病毒共流行，其中SHF98-like分支占主导位置。2004~2008年，SHF98-like分支完全取代了CK/BJ-like分支变为优势毒株(Sunetal2010)。ZhouJP等人对2006~2010年间的H9N2亚型AIV研究发现，Y280-like分支的病毒变为主要流行毒株(Zhouetal2012)。对于2013~2015年H9N2的研究发现，H9N2亚型AIV依旧以Y280分支为主(鞠勇2016)。通过本研究发现，湖北地区可能也流行Y280-like分支的病毒。研究发现，2株病毒的HA基因裂解位点-RSSR↓GLF-具有低致病性分子特征，2株病毒比当前流行株Y280多了一个潜在糖基化位点313（NCS），其中234氨基酸位点从Q突变为L，使得病毒或许可以结合唾液酸a-2,6受体而具备感染哺乳动物的能力。2株H9N2亚型AIV的NA基因均属于Y280-like分支，NA基因无较大变异，2株病毒NA基因增加了一个潜在糖基化位点43（NNS）。对NA的受体结合位点研究发现，参考株A/Duck/HongKong/Y280/97在第367~372位为KEDSRS，疫苗株55 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文A/Chicken/Shanghai/F/98为KKDSRS，2株分离病毒则为KNGSRS，参考株在400~403位点为SDNW，2株分离株为SDDW，这两处位点的变异与近年来分离的H9N2亚型毒株一致。这些变化是否影响神经氨酸酶活性还有待进一步研究。2株H9N2亚型AIV的内部6个基因片段变异缓慢，其中4个基因片段PB1、PA、NP、NS依旧属于SHF98分支，PB2和M基因属于G1-like分支。PB2、PB1、PA和NP这4个蛋白对流感病毒的复制和转录至关重要，当这些基因发生片段重组时，可以使H9N2亚型AIV跨种传播。已有研究表明，M2蛋白上26、27、30、31、34位点的变异使病毒对金刚烷胺类药物产生耐药性，本研究中的2株病毒的M2蛋白31位点从S变异为N，因此或许可以抵抗金刚烷胺类离子通道阻断剂的作用。虽然M2蛋白这些位点使病毒耐药的机制尚不明确，但是研究新的抵抗流感病毒的药物迫在眉睫，应尽早研制有效替代药物。4.2H1N1亚型猪流感病毒中国为养猪大国，为满足人们日益增长的对猪肉的需求，集约化养殖成了中国养殖业的主要方式，但这也促进了猪流感的传播与流行，严重地影响了中国养殖业的发展，在猪群中主要流行H1N1亚型流感病毒，同时H1N1亚型流感病毒感染人、猪和禽的报道层出不穷(Rohmetal1996,Shope1931)，因此我们应该对H1N1亚型猪流感投入更多的关注。本研究于2016年从湖北某猪场分离到一株猪流感病毒，命名为A/swine/Hubei/221/2016。经全基因组测序及遗传进化分析发现，病毒内部基因发生了一定的重组，其中聚合酶片段PB2、PB1、PA和NP基因均来源于pandemicH1N1/2009，而其他4个基因片段HA、NA、M和NS基因来源于欧亚禽系H1N1亚型流感病毒。对病毒8个基因组片段的分析发现，病毒的所有基因片段均与病毒A/Hunan/42443/2015亲缘关系很近。因此有可能分离株也能跨种传播造成人的感染。从NCBI数据库和GISAID数据库下载中国所有猪流感病毒的HA基因序列，然后对其进行遗传进化分析和分类分析。研究发现，在2007年以前，中国猪群中主要流行H3N2亚型猪流感和H9N2亚型猪流感，从2008年开始中国猪群中的流感以H1N1亚型占主要流行趋势，从2008年开始，H1N1亚型的流感病毒大大增加，增加的H1N1亚型猪流感主要以欧亚禽系H1N1亚型猪流感为主。欧亚禽系H1N1亚型猪流感病毒在所有SIV中占的比例越来越大。56 禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究中国猪流感病毒主要以欧亚禽系H1N1为主。因此我们对中国的欧亚禽系H1N1亚型猪流感进行了分析，发现中国的欧亚禽系H1N1猪流感总共有11个基因型，其中5个基因型的病毒数量最多，这5个基因型分别是基因型A、基因型B、基因型C、基因型H和基因型J。基因型A、基因型B和基因型C3种基因型的病毒，其基因组的8个基因片段均来源于欧亚禽系H1N1猪流感病毒。基因型H的病毒有4个基因PB2、PB1、PA和NP来源于pandemicH1N1/2009。基因型J的病毒HA和NA基因来源于欧亚禽系H1N1亚型禽流感病毒，其余6个基因片段来源于pandemicH1N1/2009病毒。毒株A/swine/Hubei/221/2016和A/Hunan/42443/2015均属于基因型H，预测未来可能会出现越来越多的基因型为H的重配病毒株。预测基因型H的病毒有可能成为传染性强且毒力强的毒株，因为有研究表明毒株A/Hunan/42443/2015毒株造成了人的重症肺炎(Zhuetal2016)。我们做了分离株H1N1亚型猪流感病毒对小鼠的致病性试验，由于分离毒株与毒株A/Hunan/42443/2015的亲缘关系较近，我们将A/Hunan/42443/2015毒株作为对照毒株。A/swine/Hubei/221/2016对小鼠的致病力明显低于A/Hunan/42443/2015毒株。对2株病毒的氨基酸序列比较分析发现两株病毒的PB2基因590位点的氨基酸存在差异，此位点的氨基酸突变有可能影响了病毒的聚合酶活性。HA基因的151位点和204位点也存在氨基酸差异，这两个位点是受体结合位点，因此推测这2个位点的变化导致了2株病毒间的致病力差异。57 华中农业大学2018届硕士研究生学位论文5.结论1）从发病鸡群中分离出2株H9N2亚型AIV。2株H9N2亚型AIV的HA和NA均为Y280谱系，PB1、PA、NP和NS基因属于SHF98-like谱系，PB2和M基因属于G1-like谱系。2）从发病猪中分离出1株H1N1亚型SIV。病毒为欧亚禽系H1N1流感病毒，其基因组8个片段均与A/Hunan/42443/2015遗传距离较近。它的4个基因PB2、PB1、PA和NP来源于pandemicH1N1/2009病毒的基因片段，其他4个基因HA、NA、M和NS来源于欧亚禽系流感病毒。3）中国主要流行欧亚禽系H1N1亚型猪流感，中国从2013年开始出现越来越多的重组型欧亚禽系H1N1亚型SIV，特别是病毒聚合酶基因片段（PB2、PB1、PA和NP）来源于pandemicH1N1/2009病毒的重组株。4）分离株A/swine/Hubei/221/2016在MDCK细胞、Nptr细胞和A549细胞上的增殖滴度均低于毒株A/Hunan/42443/2015。分离株A/swine/Hubei/221/2016对小鼠的致病性较毒株A/Hunan/42443/2015弱。58 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禽流感和猪流感病毒的分离鉴定、遗传进化分析和致病性研究致谢岁月如白驹过隙，转眼三年研究生已经过去，在即将毕业之际，首先感谢我的导师周红波教授。三年前，怀着对微生物科学研究的向往，报考了导师的硕士研究生，导师在专业领域所取得的卓著的成就，开启了我对微生物研究兴趣的大门。从论文的选题、实验设计再到论文的写作，导师都花费宝贵的时间从实验室研究的大方向以及个人特点出发综合考虑给学生制定出良好的发展规划，同时留给学生足够的拓展空间，让学生在科学的殿堂里自由驰骋。导师周红波教授不仅在学业上对我孜孜不倦的教诲，在生活上对我们的关怀也无微不至。每逢逢年过节，导师为了缓解我们的思乡之苦，总会组织实验室人员聚餐，让我们感受到家的温馨。导师在科学领域已经取得了巨大的成就，但是他还致力于为国家培养优秀的人才。值此论文付梓之际，我真诚的向我的导师致以最衷心的感谢和最崇高的敬意。衷心感谢华中农业大学动物医学院陈焕春院士、金梅林教授、张安定教授、胡薛英教授、贺帅鹏老师，本人研究生的学习离不开诸位老师的悉心指导和培养！由衷感谢张世硕、阳姹、王瑞芳、高清霞、朱银杏、郭克磊、刘小坤、白绕仙、李国利、魏小琴、明凡、王玉刚、石丽娟、高小臣、罗润波、肖榕、任晨玮、王彪雄、王芳芳、程泰烺、贾鹏飞、李鹏、孙慧敏、任彩月、黄坤等实验室同学，感谢你们为我顺利完成试验付出的辛勤劳动和无私奉献！同时我还要感谢我的室友：康亭亭、李育霖、杨艳艳。在短短的三年时光里，一起逛街购物、看电影和跑步锻炼，一起探讨科研问题，一起憧憬人生。我们每个人都不一样，都有各自的梦想和目标，有着不一样的个性和生活方式，感谢你们的包容、理解和帮助，有了你们值得信任的依靠，我时常可以更加有能量面对未知的困难。希望我们都有一个美好的前程和幸福的家庭。最后，致谢我挚爱的家人。父亲永远是我做人做事的榜样，母亲教会我善良和勤劳，还有姐姐宽慰的话语一直温暖我的心窝。他们朴素踏实的性格是我欣然前行的标榜。离开美丽的华农，这个有8年记忆的地方，我即将踏入真实的社会来展示自己的才华和能量，检验学识和品格，创造价值和自我升级。“勤读力耕，立己达人”，学海无涯，将有限的生命付之于无限的科研事业中，追求真知，追求实践。69
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