青海地区藏、汉民族肺结核病的IL-12、SP-A表达水平分析

《青海地区藏、汉民族肺结核病的IL-12、SP-A表达水平分析》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

分类号：R521.9密级：公开UDC：610编号：2018151051010522015级攻读临床医学硕士学位研究生毕业论文青海地区藏、汉民族肺结核病的IL-12、SP-A表达水平分析AnalysisoftheSerumIL-12andSP-AExpressionLevelsAmongTibetanandHanTuberculosisPatientsinQinghaiArea指导教师：冯喜英教授学生姓名：冯斐学科专业名称：内科学（呼吸系病）研究方向：结核病学学院(系、部)：青海大学研究生院二零一八年五月 QinghaiUniversityMasterDissertationAnalysisoftheSerumIL-12andSP-AExpressionLevelsAmongTibetanandHanTuberculosisPatientsinQinghaiAreaSupervisor:FengXi-yingProfessorCandidate:FengFeiAcademicMajorApplidedfor:RespiratoryMedicineSpecificMajor:TuberculosisMedicineCollege(Department):QinghaiUniversityMay,2018 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：2018年5月28日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权青海大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。本论文属于：保密□不保密√（请在相应方框内打“√”），在_____年解密后适用本授权书。学位论文作者签名：指导教师签名：日期：2018年5月28日日期：2018年5月28日 摘要目的：通过研究青海地区藏族肺结核病患者、汉族肺结核病患者与其健康对照组之间的血清白介素-12、肺泡表面活性物质相关蛋白A因子浓度水平的差异，进一步探讨藏、汉民族肺结核病患者血清IL-12、SP-A的表达水平是否存在差异性。方法：选取自2017年1月起至2017年3月在青海省传染病院、青海大学附属医院严格按照2001年中华医学会结核病学分会的《肺结核诊断和治疗指南》确诊的藏族肺结核病例50例、汉族肺结核病例32例；2017年1月起至2017年3月青海大学附属医院体检中心检测结果均正常的藏族健康对照组47例、汉族健康对照组40例。分别采集晨起空腹外周静脉血提取血清，采用酶联免疫吸附法即ELISA方法对藏族肺结核病患者组及健康对照组、汉族肺结核病患者组及健康对照组的四组研究对象血清的IL-12、SP-A的浓度进行分析。结果：IL-12、SP-A因子浓度在藏族肺结核组、汉族肺结核组、藏族对照组、汉族对照组中差异均有统计学意义(P<0.05)。1.藏族肺结核病患者组IL-12因子水平低于藏族健康对照组；汉族肺结核病患者组IL-12因子水平低于汉族健康对照组，差异具有显著性(P<0.05)；2.藏族健康对照组IL-12因子的浓度水平低于汉族健康对照组，差异具有显著性(P<0.05)；3.藏族肺结核患者组IL-12因子的水平低于汉族肺结核患者组，差异具有显著性(P<0.05)。4.藏族健康对照组SP-A因子水平低于藏族肺结核患者组；汉族健康对照组SP-A因子水平低于汉族肺结核患者组，差异具有显著性(P<0.05)；5.藏族对照组与汉族对照组、藏族肺结核组与汉族肺结核组SP-A因子的浓度水平差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：1.青海地区藏族肺结核组、藏族对照组的IL-12因子水平分别低于汉族肺结核组、汉族对照组，这种差异可能是藏族患者更易感染肺结核的因素。2.青海地区藏、汉民族肺结核病例组IL-12因子浓度水平明显低于健康对照组，提示IL-12因子在肺结核的发病过程中起保护性作用。3.青海地区藏、汉民族肺结核病例组SP-A因子浓度水平明显高于健康对照组，提示SP-A因子参与了肺结核的发生及发展过程。关键词：青海地区，藏、汉民族肺结核病，IL-12，SP-AI AbstractObjective:Wedetectthelevelofseruminterleukin12(IL-12)andsurfactantassociatedproteinA(SP-A)inTibetansandHanChinesewithtuberculosis(TB)andtheirhealthycontrolgroupinQinghaiarea.anditshealthycontrolgrouplevelsinpatientswithtuberculosiswereTofurtherexplorewhetherthereisracialdifferenceintheserumIL-12andSP-AlevelsbetweenTibetanandHanTBpatients.Methods:50casesofTibetanand32casesofHanTBpatientsdiagnosedinQinghaiProvincialInfectiousDiseasesHospitalandAffiliatedHospitalofQinghaiUniversitywereenrolledfromJanuarytoMarch2017accordingtothe"DiagnosticandTherapeuticGuidelinesforTuberculosis"ofthe2001ChineseMedicalAssociation'sTuberculosisBranch.47casesofhealthyTibetanand40casesofHanwithnormalphysicalexamination(QinghaiUniversityMedicalCenter)resultswereenrolledascontrolgroup.Thefastingperipheralvenousbloodwascollectedinthemorningonanempty,andtheconcentrationofserumIL-12andSP-Aweredetectedbyenzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA).Results:TheconcentrationlevelsofIL-12andSP-Aweresignificantlydifferentinthefourgroups(P<0.05).1.TheconcentrationlevelsofIL-12inTibetanandHanTBgroupweresignificantlylowerthanthoseinTibetancontrolgroupandHancontrolgroup(P<0.05).2.TheconcentrationlevelsofIL-12inTibetancontrolgroupweresignificantlylowerthanthoseofHancontrolgroup,thedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).3.TheconcentrationlevelsofIL-12factorintheTibetanTBgroupwerelowerthanthoseoftheHanTBgroup,andthedifferencewasstatisticallysignificant(P<0.05).4.TheconcentrationlevelsofSP-AinTibetancontrolgroupandHancontrolgroupweresignificantlylowerthanthoseofTibetanTBgroupandHanTBgroup,respectively(P<0.05).5.TherewasnosignificantdifferenceintheconcentrationofSP-AfactorbetweenTibetancontrolgroupandHannationalitycontrolgroup,TibetantuberculosisgroupandHannationalitytuberculosisgroup(P>0.05).II Conclusions:1.TheconcentrationlevelsofIL-12ofTibetanandHanTBpatientsinQinghaiareaaredifferent,suggestingthatthereareracialdifferencesinIL-12concentrationbetweenTibetanandHanTBpatients.2.TheconcentrationlevelsofIL-12inTibetanandHanTBweresignificantlylowerthanthoseinhealthycontrolgroup,suggestingthatIL-12playsaprotectiveroleinthepathogenesisofpulmonarytuberculosis.3.TheconcentrationlevelsofSP-AinTibetanandHannationalitycasesinQinghaiweresignificantlyhigherthanthoseinhealthycontrolgroup,whichremindsusthattheinfectionofMycobacteriumtuberculosiscouldstimulatetheexpressionofSP-Aintheinflammatoryresponse.Keywords:Qinghai,Tibetan,HannationalityTuberculosis,IL-12,SP-AIII 目录摘要...............................................................IAbstract............................................................II目录..............................................................IV主要符号对照表....................................................VI第1章引言.......................................................1第2章对象与方法.................................................42.1研究对象选择...............................................42.1.1研究对象来源及分组...................................42.1.2纳入标准.............................................42.1.3排除标准.............................................52.2试验方法...................................................52.2.1标本采集.............................................52.2.2血清IL-12、SP-A浓度测定..............................62.2.3主要试剂及耗材.......................................72.3统计学方法.................................................82.4技术路线图.................................................8第3章结果.......................................................93.1藏、汉民族病例组及对照组间血清IL-12浓度水平比较...........93.2病例组不同年龄间血清IL-12、SP-A浓度水平比较..............103.3病例组不同性别间血清IL-12、SP-A浓度水平比较..............10第4章讨论......................................................11第5章结论......................................................15参考文献..........................................................16致谢..............................................................19附录A综述.......................................................20IV 作者简介..........................................................23V 主要符号对照表英文缩写英文全称中文全称TBTuberculosis结核病IL-12Interleukin12白细胞介素-12SP-ASurfactantassociatedproteinA肺泡表面活性物质相关蛋白AEnzymelinkedimmunosorbentELISA酶联免疫吸附测定assayCRPC-reactiveproteinC反应蛋白MTBmycobacterialtuberculosis结核分枝杆菌APCAntigenpresentingcell抗原提呈细胞IFN-γInterferon-γγ－干扰素PPD试验Purifiedproteinderivative结核菌素试验TNFTumornecrosisfactor;肿瘤坏死因子SNPSinglenucletidepolymorphism核苷酸多态性VI 第1章引言结核病（tuberculosis）是人类历史上古老而悠久的传染病，具有传染性强、耐药性高、死亡率高等特点，全球结核感染者（包括潜伏期感染）约占世界总人数的三分之一。根据世界卫生组织（worldhealthorganization，WTO）发布的《2017全球结核病报告》。报告指出，2016年估计在世界范围内有1040万例结核病新发病例，全球估计有170万人死于结核病，虽然较2015年病死率有所下降，但仍不明显。总而言之，结核病的发病率在全球仍然不容乐观，而消除该疾病的进展仍然较缓慢，短时间内难以取得重大进展[1]。中国是患结核病的大国，患病率仅低于印度、印度尼西亚，位于世界第三。根据流行病学的抽样调查显示，我国成年人的活动性肺结核患病率约为459/10万，国家出台了多项加强结核病防治工作和落实措施，虽然对比2000年来我国的结核病疫情的发病率呈下降趋势，但结核病疫情在全国范围内仍较重。调查结果还显示全国结核病疫情的发病率各地区差异较大，流行状况与经济水平大致相关：1、我国西部地区发病率高于全国平均水平，明显高于我国中部及东部地区，与2000年全国第四次结核病流行病学的抽样调查比较，中部及东部地区肺结核患病率均较前减低，但西部地区肺结核患病率较前上升。2、农村地区活动性肺结核、痰涂片阳性、痰菌阳性肺结核患病率均高于城镇地区；10年间肺结核在城镇地区的患病率呈下降趋势，但在农村肺结核患病率呈升高趋势[2]。青海省地处西北地区，是一个多民族聚居地，以农牧业为主，经济发展落后，结核病发病率居于全国第四，是威胁健康人群、妨碍全省经济社会发展导致家庭经济困难的重大疾病之一。根据青海省疾病预防控制中心统计研究显示，青海省2006年至2015年10年间累积发病率479.75/10万，肺结核年均发病率108.93/10万，其中2015年青海省肺结核发病率124.62/10万，比2014年上升14.88%，结核发病率为上升趋势。其中肺结核患病率地区差异较大，牧区患病率明显高于农村，农村又高于城镇，藏区牧民发病率是城市、农业地区的3倍；藏区青海州、青海州报告的发病率最高，为其他地区的3-4倍。调查结果显示：青海地区牧区的藏族人群比青海地区其他民族患肺结核风险更高[3]。IL-12来源于活化的淋巴细胞，主要由巨噬细胞和单核细胞产生，是调节机1 体免疫反应的关键因子，具有多种免疫调节功能的促炎症细胞因子[4]。IL-12是由IL-12p35亚基及IL-12p40亚基组成的异源二聚体细胞因子，期间以二硫键相连接，并且在IL-12p35亚基与IL-12p40亚基结合后共同参与IL-12多种生物活性。IL-12受体（IL-12R）主要存在于T淋巴细胞、自然杀伤细胞（naturalkillercell，NK）表面，主要由β1、β2链组成：IL-12Rβ1为IL-12信号转导所必需；IL-12Rβ2与IL-12结合力强，决定对IL-12的反应性，与β1链结合时可提高受体亲和力。两条链同时参与信号传导的正常进行[5]。国内外许多文献表明，IL-12在结核分枝杆菌（mycobacterialtuberculosis，MTB）感染机体过中承担重要功能[6-8]：MTB感染机体的过程中产生抗原提呈细胞（antigenpresentingcell，APC），并通过APC提呈处理产生IL-12因子，在IL-12细胞因子的作用下，一方面激活CD4+初始辅助T细胞（Th0）向辅助T细胞1（Th1）分化，活化的Th1分泌IFN-γ、IL-2等因子，其分泌的IFN-γ可刺激巨噬细胞产生大量的一氧化氮，直接杀死MTB。另一方面抑制辅助T细胞2（Th2），Th2可以介导机体的体液免疫反应，且具有抑制细胞免疫反应作用，即可使Th1因子减少，使得体内IFN-γ的分泌减少，降低了体内T细胞、NK细胞及巨噬细胞，使得杀伤结核分枝杆菌的活性下降，导致结核病病情加重[9]。在正常情况下Th1细胞及Th2处于动态平衡，维持机体免疫功能。SP-A是早年间在肺组织内被发现的一种天然免疫分子，属于C型凝集素家族。主要是存在于肺泡表面的亲水性肺表面活性物质相关蛋白之一，可以有效降低肺泡表面张力，是维持肺泡功能的主要物质。SP-A在调节肺部的免疫反应及炎性反应方面起着重要作用[10-11]。SP-A具有六聚体结构，其中6个结构亚基结合形成18个链组成的630KDa分子，主要包含半胱氨酸的N端、重复Gly-XY三螺旋的胶原蛋白结构区域、颈区以及C型凝集素构成三聚体的四个结构域组成，其中C型凝集素也就是碳水化合物识别区域提供的C末端可以作为识别病原微生物的受体，再以三螺旋的胶原蛋白结构区域启动各种免疫细胞参与机体免疫过程[12]。国外文献表明，SP-A与结核分枝杆菌细胞壁上的甘露糖受体结合，直接刺激巨噬细胞及中性粒细胞趋化，并通过增加NO水平加强巨噬细胞的吞噬。随着人类基因组测定的发展，对于IL-12及SP-A基因多态性的研究，国外学者们已经进行了较深入的研究，发现了IL-12、SP-A基因许多基因位点存在多态性，许多学者认为这些基因位点的多态性与疾病的进展及易感性相关联2 [13-15]。通过全国第五次结核病流行病学抽样调查，我们发现肺结核的发病率在不同地区、不同民族之间相差甚大，故导致疾病易感性差别的重要因素也可能与各种族或各民族间的遗传背景有关。上诉IL-12、SP-A因子均与肺结核的发病有关，根据统计研究显示青海藏族肺结核病患病率明显高于青海其他民族。青海地区藏、汉民族肺结核与IL-12、SP-A因子水平是否存在差异性，这就是我们要做的研究，因此本研究拟通过分析IL-12、SP-A因子在藏、汉民族肺结核病患者血清浓度水平的差异性，以了解青海地区藏族肺结核患者易患结核的危险因素。3 第2章对象与方法2.1研究对象选择2.1.1研究对象来源及分组病例组：选自2017年1月起至2017年3月在青海省传染病院、青海大学附属医院收治的藏族肺结核病例50例、汉族肺结核病例32例。本研究为具有可比性，在收集病例之初严格控制、筛选研究对象，在病例组限定年龄、性别等一般情况。其中藏族肺结核病例组男性29例、女性21例，年龄范围在18-75岁之间，平均年龄为（41.37±13.45）岁；汉族肺结核病例组男性20例、女性12例，年龄范围在18-75岁之间，平均年龄为（44.28±10.58）岁。根据统计学分析藏、汉民族结核组间年龄、性别差异均无统计学意义（P＞0.05）。严格按照2001年中华医学会结核病学分会的《肺结核诊断和治疗指南》确诊的肺结核病例，并行影像学检查排除其他肺外结核。所有研究对象均告知试验内容并在知情同意书中签字。对照组：随机选取2017年1月起至2017年3月青海大学附属医院体检中心检测结果均正常的藏族健康对照组47例、汉族健康对照组40例。其中藏族健康对照组男性28例、女性19例，年龄范围在18-75岁之间，平均年龄为（39.27±11.34）岁；汉族健康对照组男性24例、女性16例，年龄范围在18-75岁之间，平均年龄为（38.14±12.41）岁。根据统计学分析藏、汉民族健康对照组在年龄、性别上均无统计学差异（P＞0.05）。所有研究对象均告知试验内容并在知情同意书中签字。2.1.2纳入标准（1）病例组4 ①根据《肺结核诊断和治疗指南》（中华医学会结核病学分会）确诊的肺结核病例；②长期居住于青海地区的藏族肺结核患者及汉族肺结核患者；③年龄在18~75岁之间；④自愿参加本研究者。（2）对照组①体检结果正常者；②长期居住于青海地区的藏族及汉族健康人群；③年龄在18~75岁之间；④自愿参加本研究者。2.1.3排除标准病例组①合并慢性支气管炎、支气管扩张等慢性肺部疾病者；②其他肺外结核者；③合并影响机体免疫状态的疾病（如肿瘤，急、慢性感染者，创伤，HIV感染等）；④合并遗传性疾病者；⑤罹患自身免疫性疾病者（如风湿、类风湿、系统性红斑狼疮、糖尿病等）；⑥免疫调节剂、激素等治疗其他慢性疾病的药物使用者；⑦不配合检查者。（2）对照组①体检结果不符合要求者；②有感染性疾病及其他慢性疾病；③不愿意参加此研究者。2.2试验方法2.2.1标本采集用促凝管采取研究对象晨起空腹外周血5ml，取血后1h内3000r/min离心5 15min分离血清，于EP管中保存，编号后放置于-80℃冰箱保存，用于IL-12、SP-A水平检测。2.2.2血清IL-12、SP-A浓度测定2.2.2.1主要试剂人白细胞介素12（IL-12）ELISA检测试剂盒中国科诺迪生物科技有限公司人表面活性蛋白A（SP-A）ELISA检测试剂盒中国科诺迪生物科技有限公司2.2.2.2外周血清IL-12、SP-A浓度检测步骤（1）测试前提前将待测样本从-80℃冰箱内取出，放置于室温（18℃~25℃）下融化解冻，取出保存冰箱的试剂盒（2℃~8℃保存）室温平衡20min。（2）设置标准孔及样本孔，并做标记。根据试剂盒设置标准孔6个，分别加入配制好的不同浓度标准品（IL-12依次加入1.5pg/mL、3pg/mL、6pg/mL、12pg/mL、24pg/mL、48pg/mL；SP-A依次加入0.625ng/mL、1.25ng/mL、2.5ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、20ng/mL）50μL。（3）在标记的待测样本孔，加入10μL待测样本，然后加入40μL的样本稀释液进行稀释。（4）再向各孔内（标准孔及样本孔）内加入辣根过氧化物酶（HRP）100μL进行检测抗体标记，将反应孔用封板膜封闭，放于37℃恒温箱静置60min。（5）配制洗涤缓冲液：蒸馏水与20×洗涤缓冲液按1:20稀释配制（即1份的20×洗涤缓冲液中加入19份蒸馏水）（6）洗板：将各孔内的液体甩尽，用配制好的洗涤缓冲液加满各孔，放置1min后用力甩尽各孔内液体，在吸水纸中反复拍干，如此洗板5次甩去洗涤液。（7）再将底物A、B液各50μL混匀，向各孔内（标准孔及样本孔）加入100μL，可见各孔内在底物TMB下显色为不同程度的蓝色，避光37℃孵育15min。（8）取出试剂盒，最后向各孔内加入终止液50μL，在酸性终止液的作用下显色为不同程度蓝色，在15min内尽快使用酶标仪测出在450nm波长下各孔6 对应的光密度（opticaldensity，OD）值。2.2.2.3外周血清IL-12、SP-A浓度计算及标准曲线在得出各孔内450nm波长下的OD值后，应用CurveExpert1.4软件，将横坐标设为标准品浓度，纵坐标设为标准品OD值，根据标准孔浓度及OD值绘制出标准曲线，计算各标准样本的浓度值。见图1至图2。图1病例组IL-12标准曲线图2病例组SP-A标准曲线电热恒温培育箱恒宇HH.B11.360Labofuge400R通用型台式离心机美国ThermoFisherScientific公司酶标分析仪中国雷杜RaytoRT-6100ThermoForma994超低温冰箱美国ThermoFisherScientific公司微量震荡仪中国WZS-IIIA型超纯水系统美国Millipore公司人IL-12ELISA检测试剂盒中国科诺迪生物科技有限公司7 人SP-AELISA检测试剂盒中国科诺迪生物科技有限公司2.3统计学方法所有数据均使用SPSS21.0软件（IBMCrop,USA）进行统计学分析，比较各组之间IL-12、SPA浓度水平差异；以及不同年龄组、性别间比较病例组的IL-12、SPA细胞因子浓度水平，计量资料符合正态分布，采用均数±标准差（⎯x±s）表示，采用两组间比较t检验以及多组间比较采用方差分析，P＜0.05差异具有统计学意义。检验水准α=0.05。2.4技术路线图严格按照纳入排除标准收集长期居住于青海地区的藏、汉民族肺结核病患者及健康对照组藏族肺结核患者组汉族肺结核患者组藏族健康对照组汉族健康对照组抽取清晨空腹血，并于3000r/min离心，取上清液获得血清，-20℃下保存待测ELISA法检测四组血清IL-12、SP-A的浓度统计分析，得出结论8 第3章结果3.1藏、汉民族病例组及对照组间血清IL-12浓度水平比较结果显示IL-12、SP-A因子浓度在四组中差异均有统计学意义(P<0.05)。两两比较结果显示：1.藏族肺结核病患者组的IL-12因子水平明显低于藏族健康对照组；汉族肺结核病患者组IL-12因子水平明显低于汉族健康对照组。差异有统计学意义(P<0.05)；2.藏族健康对照组IL-12因子的水平明显低于汉族健康对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；3.藏族肺结核病患者组IL-12因子的水平低于汉族肺结核病患者组，差异有统计学意义(P<0.05)。4.藏族健康对照组、汉族健康对照组SP-A因子水平明显低于藏族肺结核患者组和汉族肺结核患者组，差异有统计学意义(P<0.05)；5.藏族对照组与汉族对照组、藏族结核组与汉族结核组SP-A因子的浓度水平差异无统计学意义(P<0.05)。（见表1）表1四组IL-12、SP-A因子浓度比较(x±s)组别IL-12(pg/ml)SP-A(ng/ml)★★藏族结核组(n=50)34.61±10.1226.97±4.87藏族对照组(n=47)48.91±11.9615.44±7.96★☆★汉族结核组(n=32)40.59±12.4426.05±6.10☆汉族对照组(n=40)58.27±9.0313.97±5.79F8.72933.631P<0.001<0.001★☆注：与同民族对照组比较，P＜0.05；与藏族同组比较，P＜0.05；9 3.2病例组不同年龄间血清IL-12、SP-A浓度水平比较病例组血清IL-12、SP-A浓度水平在各年龄阶段差异均无统计学意义(P<0.05)。（见表2）表2病例组不同年龄间细胞因子浓度水平比较(x±s)年龄IL-12(pg/ml)SP-A(ng/ml)（岁）藏族结核组汉族结核组藏族结核组汉族结核组n浓度n浓度n浓度n浓度18~2337.45±11.121443.27±11.322332.25±6.321427.87±6.3245~1734.64±9.671040.36±10.411728.51±7.861026.38±5.5260-751029.36±12.86834.52±13.141027.87±4.71825.11±7.46F1.8851.4702.2630.496P0.1630.2470.1150.6143.3病例组不同性别间血清IL-12、SP-A浓度水平比较病例组血清IL-12、SP-A浓度水平在不同性别间差异均无统计学意义(P<0.05)。（见表3）表3病例组不同性别间细胞因子浓度水平比较(x±s)IL-12(pg/ml)SP-A(ng/ml)性别藏族结核组汉族结核组藏族结核组汉族结核组n浓度n浓度n浓度n浓度男2935.32±10.242037.19±9.982929.86±4.892027.23±5.72女2132.24±12.761241.36±12.462131.56±7.461224.93±6.97t0.9771.0420.9741.015P0.3340.3050.3350.31810 第4章讨论肺结核的感染是由结核分枝杆菌（mycobacterialtuberculosis，MTB）通过飞沫传播，进入机体后采用多种机制来激活、抑制先天性和适应性免疫反应从而建立慢性的持续性感染。全球约有三分之一人口感染了结核分枝杆菌，由于人体自身的免疫状态的不同，约5%-10%的人发展为活动性肺结核[16]。TB进入人体后，病原体通过识别特定的膜受体激活抗原提呈细胞（APC），在APC的加工处理、提呈抗原后启动适应性免疫应答，这一过程只有10%的病原体被机体清除吞噬，其余大多数的病原体可以抑制机体免疫应答，从而使得MTB从免疫细胞的杀菌机制中逃逸，进入休眠状态，当机体免疫力下降时，结核分枝杆菌再次复苏，使得机体再次复发感染。根据细胞膜的识别受体的不同，结核分枝杆菌在机体内的感染过程也不尽相同，其主要的膜受体包括：Toll样受体、C型凝集素以及核苷酸Nod样受体[17]。Toll样受体是参与MTB感染机体产生非特异性免疫中的重要组成部分。一般情况下，结核分枝杆菌与Toll样受体结合后不仅可以激活机体的非特异性免疫，还可以释放炎症反应信号，如：IL-12、IFN-γ、TNF-α等促炎症性细胞因子和IL-10等抗炎症性细胞因子[18]。其中，IL-12在MTB感染机体的过程中作为促炎症性细胞因子，在先天性和获得性免疫反应过程中其重要作用。C型凝集素受体是依赖钙离子参与的糖原结合蛋白家族，可以识别体内的蛋白质和脂质等非糖类配体，在免疫防御、免疫监视及维持机体稳态过程中发挥重要作用[19]。SP-A就属于C型凝集素超家族亚型，是最早发现于肺组织的一种天然免疫因子，不仅可以使得入侵的病原体快速清除，同时也可以抑制肺组织炎症的产生，维持肺组织局部的免疫稳态[20]。本研究通过测定青海地区藏、汉民族肺结核血清IL-12、SP-A因子浓度水平，分析其间各组浓度的差异性，为了解藏族肺结核易感性是否与民族间的独特的遗传背景有关。一、青海地区藏、汉民族肺结核血清IL-12因子浓度水平差异性分析1、本研究结果发现青海地区病例组IL-12因子浓度水平明显低于对照组：这一结果表明，IL-12参与了MTB感染机体的免疫过程。藏族肺结核病患者组血清IL-12细胞因子水平显著低于健康对照组，导致这一结果的原因可能是由11 IL-12的结构功能决定的，IL-12有p35及p40亚基构成，其中只有在IL-12p35亚基与IL-12p40亚基共同参与下，IL-12才能发挥多种生物活性。多种免疫细胞均能产生IL-12p35亚基，但IL-12p40亚基主要来源于活化的巨噬细胞。当肺结核在活动期时，细胞免疫功能减弱，巨噬细胞不能生成具有足够活性的IL-12p40亚基，故IL-12p35亚基与IL-12p40亚基不能生成有功能的IL-12，进一步导致Th0向Th1分化受阻，IFN-γ生成减少；导致Th2介导机体的体液免疫反应增强，更加降低了体内巨噬细胞杀伤活性，体内IL-12因子表达下调，从而清除MTB的能力下降，所以加重了炎症反应，从而使得肺结核病的病情加重。国内薛冰[21]、奚莹[22]等研究报道，在经过严格规范化的抗结核治疗后，病例组血清IL-12细胞因子浓度水平显著升高，印证IL-12与活动性肺结核关联密切。这提示：提高机体内的IL-12因子水平可能可以防治结核病的发生。但是在国内卓文基[23]、印度Abhimanyu[24]的研究发现病例组血清IL-12细胞因子浓度水平显著高于健康对照组，导致这一结果的差异可能是：（1）在机体MTB感染早期，一方面IL-12直接作用于NK细胞、T细胞上的IL-12Rβ受体，通过激活激酶JAK信号转导及转录活化因子STAT4的信号途径实现刺激NK细胞的增值、活化，诱导机体产生IFN-γ，使NK细胞毒性增强，抑制早期MTB复制；而随着炎症刺激时间的不断延长，IL-12通过对STAT信号通路的3个微小RNA（miR132、miR212和miR200a）的表达上调，使得负调控通路开放，以负反馈的机制其信号通路受阻，使得生成IL-12减少，分泌的IFN-γ减少，从而使得诱导NK细胞的凋亡[25]。所以两种结果可能对于研究对象的时间点处于肺结核活动的炎症反应的不同阶段、病情反应的严重程度的不同。（2）所选取的病例组研究对象的性别、年龄以及免疫状况的不同。这种情况下导致了病例组与对照组血清IL-12因子浓度的差别与本研究不同的情况。2、本研究结果还发现青海地区藏族结核组及对照组血清IL-12因子浓度水平均明显小于汉族结核组及对照组的血清IL-12因子浓度水平。导致这一结果的原因可能是：藏民族肺结核病发病率高与IL-12因子的水平较低有关，提示IL-12在藏族肺结核遗传易感性中可能具有关联性，且这种关联性存在种族间差异。查阅相关文献，国内外很多文献研究IL-12基因多态性与肺结核的易感性有关联，Liu[26]等研究发现IL-12B基因的3’-UTR的C等位基因使得肺结核患病风险在白种人增加，但是对亚洲人及非洲人的肺结核患病风险无影响。这提12 示了肺结核的发病风险可能在IL-12基因多态性上存在种族上的差异。国内有学者研究发现[27]，IL-12A基因5’-UTR位点的rs2243115的等位基因TG/GG，是可以降低中国人群易患肺结核的易感基因。3、青海地区藏族结核组血清IL-12因子浓度水平明显小于汉族结核组的血清IL-12因子浓度水平。导致这一结果可能的原因有：（1）IL-12基因多态性与藏族肺结核遗传易感性中可能存在种族间差异。（2）根据临床观察及文献报道，藏族肺结核患者一般临床症状较重，病变广泛，易合并结核性胸膜炎、结核性腹膜炎等肺外结核，且报道发现藏族结核病患者结核菌素试验（purifiedproteinderivative，PPD）皮试阳性率仅63.3%，而一般结核病人PPD试验皮试阳性率达90%以上，认为这一原因与藏族结核病患者病情重、自身免疫及变态反应受到抑制有关[28]。故如前所诉，藏族结核病患者因病情较重，自身免疫功能较差，巨噬细胞不能生成有效的IL-12，导致藏族结核病患者血清IL-12水平降低。二、青海地区藏、汉民族肺结核血清SP-A因子浓度水平差异性分析1、本研究结果发现青海地区病例组SP-A因子浓度水平明显高于对照组，这一结果表明SP-A参与的MTB感染机体后的炎症反应及免疫调节有重要的意义。病例组SP-A血清浓度高于健康对照组的原因可能有：（1）有假说认为：SP-A通过肺血管通透性改变从肺泡渗漏入血液循坏，SP-A主要由肺泡II型细胞分泌，其SP-A浓度在肺泡与肺血液存在一定浓度差。当机体感染MTB时，形成结核病灶产生肺损伤使得血管通透性增加、气-血屏障损伤，导致SP-A通过渗漏机制，从肺泡进入血液循环，从而引起血液中SP-A的浓度升高[29]。（2）在感染一般细菌时SP-A可增加吞噬细胞内的氧自由基含量、NO浓度增高，促进杀菌[30]；但是在MTB感染机体的过程中，SP-A只是促进肺泡巨噬细胞对MTB的摄取，却抑制其杀灭，在这种慢性感染中，SP-A通过剂量依赖的调节方式刺激机体单核细胞应激，产生多种炎症因子，如：IL-1、肿瘤坏死因子-α（tumornecrosisfactor，TNF-α）、IL-6等[31]，这些因子可刺激肺泡II型细胞合成SP-A增加，以维持SP-A的高水平状态，从而抑制炎症反应，维持肺组织免疫的稳态性。研究还发现IL-12、SP-A因子在各年龄组间、不同性别间差异无统计学意义，结果提示IL-12、SP-A因子在参与肺结核的发生发展过程中年龄和性别的影响可能不大。13 综上所述，肺结核的发病是由多种因素参与的复杂过程，不仅与MTB的数量、毒力等因素有关，与机体的免疫状态及某些因子的调控息息相关。而且肺结核的发病是环境、社会因素、遗传因素相互影响的结果。本研究通过对青海地区藏、汉民族肺结核患者以及其健康对照组之间IL-12、SP-A因子水平测定，发现IL-12及SP-A因子在肺结核的发病过程中发挥着重要作用，且IL-12因子可能是藏族肺结核发病率高的易感因子，藏族结核发病率高可能与其体内IL-12因子水平较低有关。14 第5章结论1.青海地区藏、汉民族肺结核IL-12的浓度水平具有差异性，提示：IL-12在藏、汉民族肺结核病易感性中具有关联性，且这种关联性存在民族间差异。2.青海地区藏、汉民族病例组IL-12因子浓度水平明显低于健康对照组，提示IL-12因子在肺结核的发病过程中起保护性作用。3.青海地区藏、汉民族病例组SP-A因子浓度水平明显高于健康对照组，提示结核分枝杆菌感染人体后刺激SP-A因子表达参与炎症反应。15 参考文献[1]世界卫生组织发布了《2017年全球结核病报告》:迫切需要为终止结核病作出更大政治承诺[J].中国卫生政策研究，2017,10(10):41.[2]王黎霞,成诗明,陈明亭,等.2010年全国第五次结核病流行病学抽样调查报告[J].中国防痨杂志，2012,34(08):485-508.[3]王朝才,刘燕,晁秀珍等.2006-2015年青海省肺结核流行特征分析[J].现代预防医学，2017,44(03):397-400.[4]CooperAM,KhaderSA.Theroleofcytokinesintheinitiation,expansion,andcontrolofcellularimmunitytotuberculosis[J].ImmunolRev,2008,226(2):191-204.[5]HoentjenF，SartorRB,OzakiM，etal．STAT3regulateNFKappaBrecruitmenttotheIL-12p40promoterindendriticcells[J].Blood，2005，105(2):689.[6]McnabFW,EwbankJ,etal.TypeIIFNinducesIL-10productioninanIL-27-independentmannerandblocksresponsivenesstoIFN-γforproductionofIL-12andbacterialkillinginMycobacteriumtuberculosis-infectedmacrophages.[J].JournalofImmunology,2014,193(7):3600-3612.[7]RayAA,FountainJJ,MillerHE,等.IL12Rβ1ΔTMisasecretedproductofil12rb1thatpromotescontrolofextrapulmonarytuberculosis[J].Infections&simmunity,2015,83(2):560.[8]LiL,JiangY,LaoS,等.Mycobacteriumtuberculosis-SpecificIL-21+IFN-γ+CD4+TCellsAreRegulatedbyIL-12[J].PlosOne,2016,11(1):e0147356.[9]HenryCJ，OrnellesDA，MitchellLM，etal．IL-12producedbydendriticcellsaugmentsCD8+TcellactivationthroughtheproductionofthechemokinesCCL1andCCL17［J］．JImmunol，2008，181(12):8576-8584.[10]KurokiY,TakahashiM,NishitaniC.Pulmonarycollectinsininnateimmunityofthelung[J].CellMicrobiol,2007,9(8):1871-1879.[11]WrightJR.Immunoregulatoryfunctionsofsurfactantproteins[J].NatRevImmunol,2005,5:58-68.[12]KishoreU.,GreenhoughT.,WatersP.,etal.SurfactantproteinsSP-AandSP-D:structure,functionandreceptors[J].Mol.Immunol.2006,43,1293–1315.[13]SahiratmadjaE,Baak-PabloR,deVisserAW,et,al.AssociationofpolymorphismsinIL-12/IFN-γpathwaygeneswithsusceptibilitytopulmonarytuberculosisinIndonesia[J].Tuberculosis(Edinb),2007,87(4)；303-311.16 [14]MorrisGA,EdwarsDR,HillPC,etal,Interleukin12B(IL-12B)GeneticVariationandPulmonaryTuberculosis:AStudyofCohortsfromTheGambia,Guinea-Bissau,UnitedStatesandArgentina[J].PLoSOne,2011,6(2):e16656.[15]GuoX,LinHM,LinZ,etal.SurfactantproteingeneA,B,andDmarkerallelesinchronicobstructivepulmonarydiseaseofaMexicanpopulation.EurRespirJ.2001;18(3):482-490.[16]FlynnJAL,ChanJ.Tuberculosis:LatencyandReactivation[J].Infection&Immunity,2001,69(7):4195-201.[17]王旭东,吴利先.结核分枝杆菌与巨噬细胞相互作用的研究进展[J].中国病原生物学杂志,2015,10(06):571-573.[18]CooperAM,KhaderSA.Theroleofcytokinesintheinitiation,expansion,andcontrolofcellularimmunitytotuberculosis[J].ImmunolRev,2008,226(2):191-204.[19]谢建辉,顾建新.C型凝集素[J].生命科学,2011,23(06):555-562。[20]KurokiY,TakahashiM,NishitaniC.Pulmonarycollectinsininnateimmunityofthelung[J].CellMicrobiol,2007,9(8):1871-1879.[21]薛冰,徐笛,张峰波,等.血清IFN-γ、IL-4、IL-12、IL-23对肺结核免疫的作用研究[J].新疆医科大学学报,2017,40(03):341-344.[22]奚莹,王莉.肺结核患者血清白细胞介素-12水平检测及临床意义[J].中国感染控制杂志,2012,11(2):109-111.[23]卓文基,钱明,陈燕梅等.肺结核患者血清IL-6、IL-12、IL-23、TNF-α、IFN-γ表达水平的临床意义分析[J].现代医院,2014,14(10):4-6.[24]Abhimanyu,MangangchaIR,JhaP,etal.DifferentialserumcytokinelevelsareassociatedwithcytokinegenepolymorphismsinnorthIndianswithactivepulmonarytuberculosis.[J].InfectionGenetics&Evolution,2011,11(5):1015-1022.[25]袁慧,叶冬青．JAK/STAT信号通路与系统性红斑狼疮[J].中华疾病控制杂志，2010，14(8):787790．[26]LiuG,LiG,XuY,etal.AssociationbetweenIL12Bpolymorphismsandtuberculosisrisk:ameta-analysis.[J].InfectionGenetics&Evolution,2014,21(1):401-407.[27]WangJTangS,ShenH.AssociationofgeneticpolymorphismsintheIL-12-IFNGpathwaywithsusceptibilitytoandprognosisofpulmonarytuberculosisinaChinesepopulation[J].EarJClinMicrobiolInfectDis,2010,29:1291-1295.[28]陈雪融,冯玉麟,唐晓燕等.藏族肺结核患者120例临床分析[J].华西医学,2006(04):793.[29]GoldJA,HoshinoY,TanakaN,etal.SurfactantProteinAModulatestheInflammatoryResponseinMacrophagesduringTuberculosis[J].Infection&Immunity,2004,72(2):645-50.17 [30]王方勇,陈政良.SP-A、SP-D与肺部天然免疫防御[J].免疫学杂志,2002(S1):75-77.[31]BorronP,McintoshJC,KorfhagenTR,etal.Surfactant-associatedproteinAinhibitsLPS-inducedcytokineandnitricoxideproductioninvivo[J].AmericanJournalofPhysiologyLungCellular&MolecularPhysiology,2000,278(4):L840.18 致谢时光荏苒，岁月如梭。三年的研究生学习阶段就要结束了，回首在研三年期间是我人生中收获最多的三年，在这里我遇到了学习、生活及工作上的良师益友；在这里我学会了如何成为一名有信念、有情怀、有担当的人；在这里我明白了成为一名医者不仅在专业知识上要有充实的储备，更是体现在人文关怀、换位思考的精神上。这里有苦有甜，临近论文完成之际要对所有支持我、帮助我的所有老师、同学表达我诚挚的谢意！首先由衷地感谢我最尊敬、最敬爱的导师冯喜英教授。无论在工作、学习及生活中的关怀和教导。老师在教学中严谨求实的治学态度、在工作中孜孜以求的工作作风对我产生了重要的影响；在生活中老师优雅、和蔼的人格魅力让我无限仰慕；感谢老师在我论文选题、试验操作、标本采集的各环节给予我的帮助。感谢呼吸科久太主任及刘洪千老师在工作学习上毫无保留的传授以及信任，是您们手把手的传授让我从一张白纸成长为一个具有临床思维能力的医生。虽然老师很严厉，但是正是因为这些严格，让我深刻的明白作为一名临床医生对待生命必须一丝不苟。老师传授的经验及教导我将终身受用。感谢实验室白振忠老师在我的实验过程中给予的指导和帮助。感谢父母在我上学期间的支持与鼓励，你们将是我奋斗的最大动力！19 附录A综述白介素-12在肿瘤治疗中研究青海青海X白介素12(Interleukin-12IL-12)是调节宿主免疫反应的关键分子，具有多种免疫调节功能的促炎症细胞因子。由美国的Kobayashi等[1]发现，主要由巨噬细胞产生，可诱导外周血细胞、T细胞、NK细胞产生γ－干扰素。近年来，IL-12基因多态性被认为是促成多种恶性肿瘤发生的危险因素，如宫颈癌、鼻咽癌、肝癌、大肠癌等。IL-12由p35和p40两个亚基连接的组成的异二聚体蛋白。IL-12与其受体IL-12R结合发挥生物学作用，IL-12R主要存在于T细胞与NK细胞表面，由β1、β2链组成：IL-12Rβ1为IL-12信号转导所必需；IL-12Rβ2与IL-12结合力强，决定对IL-12的反应性，与β1链结合时可提高受体亲和力。两条链同时参与信号传导的正常进行[2]。IL-12通过NK细胞及T细胞来发挥免疫作用：1、IL-12是激活NK细胞效应最强的细胞因子,在机体感染早期，一方面IL-12直接作用于NK细胞、T细胞上的IL-12Rβ受体，通过激活激酶JAK信号转导及转录活化因子STAT4的信号途径实现刺激NK细胞的增值、活化，诱导机体产生IFN-γ，使NK细胞毒性增强，抑制早期病毒复制。另一方面，IL-12可以促Th0细胞向Th1方向分化成熟,诱导Th1细胞分泌IL-2、IFN-γ等细胞因子，增强Th1型细胞因子应答及引起细胞免疫[3]。同时，Th1细胞通过CD40/CD40L途径诱导抗原提呈细胞（APC）分泌IL-12，形成高效的正反馈调节机制来增强Th1的应答，使得T淋巴细胞被激活，从而病情发展得以控制[6]。而随着炎症刺激时间的不断延长，IL-12通过对STAT信号通路的3个微小RNA（miＲ132、miＲ212和miＲ200a）的上调表达，特异性的使得其通路负调控表达使JAK/STAT4信号通路受阻，负反馈使得IL-12减少，产生IFN-γ减少，从而诱导NK细胞凋亡[4]。2、血管生成是肿瘤生长和转移的核心，随着肿瘤生长并变得缺氧，肿瘤细胞分泌大量的促血管生成生长因子，同时没有有效的抗血管生成因子，从而引20 起血管不受控制的生长并促进肿瘤进展。在多种临床前抗肿瘤动物模型实验中，证明IL-12不仅增强宿主免疫细胞的浸润和功能，更令人惊讶的是，抑制了肿瘤内新生血管的发展[5]。IL-12在肿瘤微环境中除延迟肿瘤生长外，还引起了脉管系统的深刻形态学变化，抑制肿瘤血管上的血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）。结果发现在肿瘤细胞内IL-12通过刺激T细胞免疫产生的IFN-γ以两种方式抑制VEGFR3的表达：直接作用于肿瘤血管内皮细胞和作用于肿瘤浸润淋巴细胞间接改变内皮细胞的VEGFR3表达[6]。基于这种能力，表明IL-12在抗肿瘤治疗中有巨大的潜能，对IL-12治疗肿瘤的研究热度从未停止过。在临床前研究和动物模型中IL-12治疗癌症的效果令人鼓舞，但其毒副作用阻碍了临床应用发展。上世纪90年代，旨在确定对IL-12治疗最易感的肿瘤、最大耐受剂量的以及最佳治疗方案。结果表明IL-12其治疗指数非常狭窄并且有严重的毒副反应。用初始安全剂量的IL-12可以后显著抑制肿瘤细胞，但随着时间以及剂量的增多，导致血液中IL-12诱导的IFN-γ浓度的适应性的逐渐下降，出现全身性类流感样症状，并且出现难以控制的骨髓、肝脏毒性。考虑到IL-12的高毒性，近年来修订其使用策略。通常IL-12的疗法可以分为三类：（1）活性非特异性免疫治疗，旨在激活主要抗原反应的先天机制，例如单独使用IL-12或与化疗联合应用或单克隆抗体；（2）主要针对刺激适应性抗肿瘤反应的活性特异性“疫苗”方法，例如，使用IL-12作为肿瘤细胞或肿瘤抗原衍生肽的佐剂；（3）基因治疗，包括细胞过滤治疗。现大多数临床试验仅限于IL-12在瘤内、局部治疗，这种做法不仅是避免毒性作用，更是诱导特异性抗肿瘤机制。鉴于上述临床研究的乐观结果，在改进的临床前试验IL-12的肿瘤免疫治疗可以在癌症患者中产生有意义的治疗效果。参考文献[1]SternAS,PodlaskiFJ,HulmesJD,etal,PurificationtohomogeneityandpartialcharacterizationofcytotoxiclymphocytematurationfactorfromhumanB-lymphoblastoidcells[J].ProcNatAcadSciUSA,2009,105(17):6808-6812.[2]HoentjenF，SartorRB,OzakiM，etal．STAT3regulateNFKappaBrecruitmenttotheIL-12p40promoterindendriticcells[J].Blood,2005,105(2):689.[3]SzabSJ,DigheAS,GublerU,etal.RegulationoftheIL-12Rbeta2subunitexpressionindevelopingThelper(Th1)andTh2cells[J].JExpMed,1997,185:187824.[4]袁慧，叶冬青．JAK/STAT信号通路与系统性红斑狼疮[J].中华疾病控制杂志,2010,21 14(8):787790．[5]ElizabethW,Sorensen,ScottA.Gerber,JohnG.Frelinger,andEdithM.Lord.IL-12SuppressesVascularEndothelialGrowthFactorReceptor3ExpressiononTumorVesselsbyTwoDistinctIFN-γ–DependentMechanisms[J].Immunol.2010Feb15;184(4):1858–1866.[6]FilhoA.Longatto,MartinsA,CostaSM,SchmittFC.VEGFR-3expressioninbreastcancertissueisnotrestrictedtolymphaticvessels[J].Pathol.Res.Pract.2005;201:93–99.22 作者简介一、基本情况姓名：冯斐出生日期：1990.03.26性别：女籍贯：陕西蒲城民族：汉族政治面貌：群众最后学历：硕士毕业学校：青海大学二、学习经历2009.09-2014.06延安大学医学院临床医学学士2015.09-2018.06青海大学内科学（呼吸系病）硕士三、发表论文[1]冯斐,冯喜英．白介素-12在肿瘤治疗中研究[J].医师在线.2017;20(4):24723