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分类号：S855.3单位代码：10086密级：公开学号：20152200399趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用EffectsofChemokinesinPorcineEpidemicDiarrheaVirusInfection学位申请人：孙立旦指导教师：宋勤叶教授学科专业：预防兽医学学位类别：农学硕士授予单位：河北农业大学答辩日期：二〇一八年六月一日 摘要猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV)引起猪的一种急性、接触性肠道传染病，以腹泻、呕吐、脱水、急性肠炎为特征。近年来PEDV导致大批仔猪死亡，给养猪业造成了巨大经济损失，但目前对其感染免疫机制的了解尚不深入。趋化因子是募集白细胞至感染部位的一类低分子量蛋白质，其趋化作用是炎症发生过程中重要的起始步骤，也是机体天然免疫功能的一个重要方面。本研究围绕PEDV感染免疫选题，通过体内外试验，探索趋化因子在PEDV感染中的作用，旨在为深入阐明PEDV的感染免疫机制提供科学依据。将6头21日龄健康仔猪随机分为PEDV强毒株感染组和阴性对照组。感染组每6.6TCID头口服接种1.5×1050的PEDV；对照组接种等体积的细胞维持液。感染后3d应用基因表达谱芯片技术和FQ-PCR检测回肠组织中趋化因子mRNA的表达量。结果表明，感染猪回肠组织中趋化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的mRNA表达水平显著上调（P<0.05）。为了验证PEDV强毒株感染宿主细胞后趋化因子表达水平的变化，将IPEC-J2细胞分为HBQY2016强毒株感染组、CV777弱毒株感染组、LPS阳性对照组和阴性对照组。两个病毒感染组分别接种0.5MOI的HBQY2016强毒株和CV777弱毒株，阳性对照组用10μg/mL的LPS刺激，阴性对照组加入等体积的维持液。感染后18~20h收集细胞，两个病毒感染组的MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9和CXCL13mRNA的表达水平显著上升（P<0.05），细胞上清中MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13水平显著升高（P<0.05）。为了进一步阐明趋化因子在PEDV感染中的作用，设计合成并筛选了分别对MCP-1、CXCL9、CXCL13具有较高抑制活性的siRNA，并将IPEC-J2细胞分为PEDV感染组（强/弱毒株）、siRNA干扰-（强/弱毒株）感染组、siRNA阴性（NC）-PEDV（强/弱毒株）感染对照组和阴性对照组。通过Transwell趋化试验和流式细胞术分析，与病毒感染组相比，MCP-1干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组细胞下室内CD14+单核细胞的个数分别下降400个细胞（P<0.05）和1152个细胞（P<0.05）；CXCL9干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群分别平均下降677、258、718、207个细胞和2605、533、2729、949个细胞（P<0.05）；CXCL13干扰-HBQY2016强毒株和CV777弱毒株感染组的CD19+B细胞亚群分别平均下降279个细胞和164个细胞（P<0.05）。上述实验证明，PEDV强毒株感染引起趋化因子（MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13）表达量显著上调。强/弱毒株诱导产生的MCP-1对CD14+单核细胞，CXCL9对CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群，CXCL13对CD19+B细胞具有趋化作用。关键词：猪流行性腹泻病毒；仔猪；趋化因子；IPEC-J2细胞 EffectsofChemokinesinPorcineEpidemicDiarrheaVirusInfectionAuthor:SunLi-danAdvisor:ProfessorSongQin-yeMajor:PreventiveVeterinaryMedicineAbstractPorcineepidemicdiarrhea(PED),causedbyporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV),isanacuteandhighlycontagiousintestinadiseaseofswinecharacterizedbydiarrea,vomiting,acuteenteritis.Inrecentyears,PEDVhascausedamassivedeathofpigletsandcausedeconomiclossestothepigindustry.However,aninsightintoimmunemechanismonthisdieaseisnotenough.Chemokinesarethelowmolecularweightproteinsthatrecruitleukocytestothesiteofinfectionandplayanimportantroleintheinitialstepofinflammatoryresponseandininnateimmunity.ThisstudyfocusedonthetopicofPEDVinfectionimmunitytoexploretheroleofchemokinesinPEDVinfectionthroughinvitroandinvivoexperiments,toprovideascientificbasisforfurtherelucidatingtheimmunemechanismsofPEDVinfection.Six21-day-oldhealthypigletsweredividedintovirulentPEDVinfectiongroupandnegativecontrolgrouprandomly.Eachpigletintheinfectedgroupwasinoculatedorallywith1.5×106.6TCID50ofvirulentPEDV;thecontrolgroupwasinoculatedwiththesamevolumeofcellmaintenancemediums.Thenondaypostinfection(dpi)3,microarrayanalysisandFQ-PCRwereusedtodetectmRNAexpressionlevelsofchemokinesintheilealtissue.TheresultsshowedthatthemRNAexpressionlevelsofchemokinesMCP-1,MIP-1β,IL-8,CXCL9,CXCL10andCXCL13intheilealtissueofinfectedpigsweresignificantlyupregulated(P<0.05).InordertoverifythechangeofchemokinesexpressionlevelinthehostcellsinfectedwithPEDV,IPEC-J2cellsweredividedintoHBQY2016virulentstraininfectiongroup,PEDVattenuatedstrainCV777infectiongroup,LPSpositivecontrolgroupandnegativecontrolgroup.Twoviralinfectiongroupswereinoculatedwith0.5MOIPEDVoftheHBQY2016virulentstrainandtheattenuatedstrainCV777,respectively,thepositivecontrolgroupwasstimulatedwith10μg/mLLPS,andthenegativecontrolgroupwasaddedwithsamevolumeofmaintenancesolution.Thecellswerecollected18to20hafterinfection.ThemRNAexpressionslevelsofMCP-1,MIP-1β,IL-8,CXCL9andCXCL13inthetwoinfectiongroupsweresignificantlyincreased(P<0.05).ThelevelsofMCP-1,MIP-1β,IL-8,CXCL9,CXCL10andCXCL13inthecellsupernatantsweresignificantlyincreased(P<0.05).TofurtherelucidatetheroleofchemokinesinPEDVinfection,theinhibitoryactivity siRNAstochemokineMCP-1、CXCL9、CXCL13weresynthesizedandsieved.IPEC-J2cellsweredividedintoPEDVinfection（strainvirulentHBQY2016orattenuatedCV777）group,siRNAinterference-PEDV（strainvirulentHBQY2016orattenuatedCV777）infectiongroup,siRNA-NC-PEDV（strainvirulentHBQY2016orattenuatedCV777）infectioncontrolgroupandnegativecontrolgroup.ComparedwithPEDVstrainvirulentHBQY2016andattenuatedCV777infectiongroups,thenumbersofCD14+monocytesinthetranswellunderlayerintheMCP-1-siRNAinterference-PEDVstrainHBQY2016andattenuatedstrainCV777infectiongroupdecreasedsignificantlybyanaverage400cellsand1152cells,respectively,throughtranswellchemotaxisassayandflowcytometry(FCM)detection;significantreductionsofCD3+CD4-CD8-γδT,CD3+CD4-CD8+Tc,CD3+CD4+CD8-ThandCD3+CD4+CD8+Tmsubsetsexhibitedat677,258,718,207and2605,533,2729,949cells,respectively,intheCXCL9-siRNAinterference-PEDVstrainHBQY2016andattenuatedCV777infectiongroups;andthenumbersofCD19+BcellsdropedremarkablyintheCXCL13-siRNAinterference-PEDVstrainHBQY2016andattenuatedCV777infectiongroupsdecreasedby279cellsand164cells,respectively.Insummary,thisstudydemonstratedthatPEDVvirulentstraininfectioncausedasignificantup-regulationoftheexpressionlevelsofchemokinesMCP-1,MIP-1β,IL-8,CXCL9,CXCL10,CXCL13.MCP-1inducedbystrainHBQY2016orattenuatedCV777playedachemotacticeffectonCD14+monocytes,CXCL9hadachemotaxistoCD3+CD4-CD8-γδT，CD3+CD4-CD8+Tc，CD3+CD4+CD8-ThandCD3+CD4+CD8+Tmsubsets,andCXCL13toCD19+Bcells.Keywords:Porcineepidemicdiarrheavirus;Piglets;Chemokines;IPEC-J2cells 英文缩略表缩略词英文全称中文全称AmpAmpicillin氨苄青霉素bpBasepair碱基对BSABovineserumalbumin牛血清白蛋白CXCL9Chemokine(C-X-Cmotif)ligand-9趋化因子-9CXCL10Chemokine(C-X-Cmotif)ligand-10趋化因子-10CXCL13Chemokine(C-X-Cmotif)ligand-13趋化因子-13CXCL8/IL-8Chemokine(C-X-Cmotif)ligand-8/Interleukin-8趋化因子-8/白细胞介素-8DAB3,3’-diaminobenzidine3,3ˊ-二氨基联苯胺EDTAEthylenediaminetetraacetaticacid乙二胺四乙酸ELISAEnzymelinkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附试验FCMFlowcytometry流式细胞术FQ-PCRFluorescencequantitativePCR荧光定量PCRMIP-1βMacroPhageinflammatoyrProtein-1β巨噬细胞炎性蛋白-1βMCP-1MonoeyteehemoattractantProtein-1单核细胞趋化蛋白-1TGF-β3Transforminggrowthfactor-β3转化生长因子-β3RT-PCRReal-timequantitativePCR实时荧光定量PCRHEPESN-2-hydroxyethylpiperazine-N’-ethanesulfonicacidN-2-羟乙基哌嗪-N’-2乙磺酸IIFAIndirectimmunofluorescenceassay间接免疫荧光IPMAImmunoperoxidasemonolayerassay免疫过氧化物酶单层细胞试验LPSLipopolysaccharide脂多糖minMinute分钟moLMole摩尔MOIMultiplicityofinfection感染复数ODOpticaldensity光密度PProbability概率PBLCPeripheralbloodleukocytecell外周血白细胞PEDVporcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻RNARibonucleicacid核糖核酸TCID5050%tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量μLMicroliter微升 目录1引言.....................................................................................................................................................11.1猪流行性腹泻病毒.....................................................................................................................11.1.1病毒粒子结构和理化特性..............................................................................................11.1.2编码的蛋白及其功能......................................................................................................21.1.3PEDV的培养特性...........................................................................................................31.1.4PED的流行......................................................................................................................31.1.5PEDV的遗传变异...........................................................................................................41.1.6致病性..............................................................................................................................51.2PEDV的靶细胞..........................................................................................................................51.2.1IPEC-J2/IPEC-1细胞.......................................................................................................51.2.2IECs..................................................................................................................................61.3PEDV诱导的免疫应答..............................................................................................................61.3.1全身性免疫应答..............................................................................................................61.3.2固有黏膜免疫应答..........................................................................................................71.4趋化因子....................................................................................................................................71.5研究目的与意义..........................................................................................................................81.6研究内容和技术路线.................................................................................................................81.6.1研究内容..........................................................................................................................81.6.2技术路线........................................................................................................................101.7研究目标..................................................................................................................................102材料与方法.........................................................................................................................................122.1材料..........................................................................................................................................122.1.1细胞及毒株.....................................................................................................................122.1.2实验动物.........................................................................................................................122.1.3主要试剂与试剂盒........................................................................................................122.1.4流式用抗体....................................................................................................................132.1.5主要试剂的配制............................................................................................................132.1.6主要设备........................................................................................................................162.2方法...........................................................................................................................................172.2.1引物合成.........................................................................................................................172.2.2病毒培养与TCID50测定..............................................................................................192.2.3FQ-PCR标准曲线的建立..............................................................................................202.2.4PEDV感染仔猪回肠组织中差异表达基因的检测.....................................................222.2.5趋化因子mRNA表达水平的FQ-PCR检测...............................................................232.2.6体外PEDV感染试验最佳细胞系的筛选....................................................................232.2.7趋化因子对仔猪外周血白细胞趋化作用的检测........................................................25 3结果与分析..........................................................................................................................................273.1FQ-PCR标准曲线.....................................................................................................................273.1.1趋化因子FQ-PCR标准曲线........................................................................................273.1.2PEDVN基因FQ-PCR标准曲线..................................................................................303.2感染仔猪回肠组织中趋化因子差异表达基因.......................................................................303.2.1RNA的质量...................................................................................................................303.2.2样品主成分分析............................................................................................................313.2.3火山图............................................................................................................................323.2.4GO分析..........................................................................................................................323.2.5KEGGPathway富集分析..............................................................................................343.2.6趋化因子差异基因.........................................................................................................363.3仔猪回肠组织中趋化因子mRNA的表达量..........................................................................373.3.1FQ-PCR检测..................................................................................................................373.3.2FQ-PCR检测结果与表达谱芯片检测结果对比..........................................................393.4PEDV体外最佳感染细胞系的确定.........................................................................................403.4.1病毒核酸载量................................................................................................................403.4.2病毒抗原........................................................................................................................413.4.3TCID50.............................................................................................................................443.4.4趋化因子mRNA的表达水平.......................................................................................443.4.5感染细胞上清中的趋化因子浓度.................................................................................493.5MCP-1、CXCL9、CXCL13对白细胞的趋化作用................................................................513.5.1趋化因子高抑制活性siRNA........................................................................................513.5.2MCP-1、CXCL9、CXCL13对仔猪外周血白细胞的趋化作用.................................544讨论....................................................................................................................................................604.1PEDV感染仔猪后回肠组织中趋化因子mRNA的表达水平...............................................604.2PEDV体外感染最佳细胞系的选择.........................................................................................604.3趋化因子对仔猪外周血白细胞的趋化作用...........................................................................626结论....................................................................................................................................................63参考文献..................................................................................................................................................64在读期间发表的学术论文与获得的研究成果......................................................................................71作者简介..................................................................................................................................................72致谢........................................................................................................................................................73 1引言猪流行性腹泻（PorcineEpidemicDiarrhea,PED）是由猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）引起的一种急性和高度接触性的肠道传染病，主要以呕吐、水样腹泻、急性肠炎和脱水为临床特征[1-3]。出生仔猪对PEDV的易感性最高，1周龄以内的哺乳仔猪发病后死亡率可达100%。成年猪感染后症状相对较轻，仅表现为食欲下降、腹泻、消瘦等症状，死亡率相对较低[4-6]。PDE在世界范围内广泛流行，20世纪70年代初，该病在英国首次暴发[7]，随后在世界多个国家相继出现。2010年，由PEDV变异株引起年我国南部多个省份暴发PED，给我国养猪业造成巨大经济损失，深入了解PEDV与宿主免疫系统之间的相互作用机制，对于有效控制PED具有重要指导意义。1.1猪流行性腹泻病毒1.1.1病毒粒子结构和理化特性2008年国际病毒分类委员会（TheInternationalCommitteeonTaxonomyofViruses，ICTV）第8次报告，将PEDV划为尼多病毒目（Nidovirales）、冠状病毒科（Coronaviridae）、冠状病毒亚科（Coronavirinae）、α-冠状病毒属（Alphacoronavirus）成员[8-9]。PEDV具有囊膜，遗传物质为单股正链RNA，病毒粒子大多呈球形，直径为95~190nm，其表面的纤突蛋白向四周呈现放射状分布，长度在18~23nm[10]。PEDV全基因组大小为28kb，与其他冠状病毒相似，整个基因组由5ˊ端非翻译区（UTR）、7个开放阅读框以及3ˊ端非翻译区（UTR）组成（图1-1）[1,6]。从5ˊ到3ˊ依次为5ˊUTR→Replicase（ORF1a、ORF1b）→S→ORF3→E→M→N→3ˊUTR，其中ORF1a/1b编码非结构复制多聚酶1a/1b（polyprotein1a/1b，pp1a/b），大小约占病毒全基因组的2/3。位于ORF1a、1b下游的基因主要编码结构蛋白，分别为纤突蛋白（Spike，S）、膜蛋白（Membrane，M）、小膜蛋白（Envelope，E）和核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）。ORF3是位于编码S蛋白和E蛋白基因之间的附属基因，编码辅助蛋白Nsp3[10-11]。PEDV在蔗糖中的悬浮密度为1.18g/mL，其热敏感性较差，在50℃以下的环境可稳定存活，但在高于60℃环境中30min，病毒即完全丧失感染力[12]。PEDV对一些有机溶剂，如三氯甲烷（CHCL3）和乙醚（C4H10O）等较为敏感。PEDV的活性pH较窄，在pH小于4.0或大于9.0的环境下会很快失活，因此多种酸性及碱性的消毒剂很容易将其灭活。1 图1-1PEDV基因组和病毒粒子的结构示意图[13]Fig.1-1SchematicrepresentationsofPEDVgenomeorganizationandvirionstructure[13]A:ThestructureofPEDVgenomicRNA；B:ThestructureofPEDVstructure1.1.2编码的蛋白及其功能冠状病毒复制酶ORF1a、ORF1b是由PP1a和PP1ab经3个病毒编码蛋白酶加工而成，这三个蛋白酶分别是Nsp1编码木瓜样蛋白酶1、磷酸酯酶和Nsp2编码3C样蛋白酶。PEDV至少包含有16个非结构蛋白[14]。其中已知功能的三个非结构蛋白分别是Nsp7（编码生长因子样蛋白），Nsp9（编码RNA依赖性RNA聚合酶）和Nsp10（编码金属离子结合域和解旋酶）[11]。Nsp1的大小与冠状病毒种类有关，α-冠状病毒的Nsp1约有110aa组成，β-冠状病毒245aa组成。Nsp3即ORF3蛋白，分子量为25.3kD，与病毒的毒理力有关。对适应Vero细胞的PEDV弱毒株与野毒株ORF3的限制性片段长度的多态性分析发现，致弱毒株均有17个氨基酸缺失[15]。PEDV基因组编码的四个结构蛋白及其主要功能如下：S蛋白，由S基因（4152nt）编码。该蛋白由1383aa组成，分子量为180~220kD。S蛋白属于Ⅰ型膜蛋白，是PEDV的主要结构蛋白，由信号肽序列（1~24aa）、细胞外区域（25~1333aa）、单一跨膜区（1334~1356aa）和细胞质尾巴（1357~1383aa）4个部分组成[16]。根据冠状病毒科病毒S蛋白的同源性，PEDVS蛋白也可分为S1（1~735aa）区和S2（735~1383aa）区[17]。病毒感染过程中，S蛋白发挥着重要作用，包括介导病毒入侵和病毒与细胞表面的受体结合[18-19]。研究表明，抗原表位主要集中在S基因的S1区域。位于S1区域的中和表位(COE，499~638aa)可刺激机体产生中和抗体，S1蛋白的S1D区域（636~638aa）包含一个抗原表位（679~742aa）[20]和2个B细胞表位（744~759aa，756~771aa）[21]。另外，S基因C端的“GPRLQPY”序列也可诱导机体产生针对PEDV的特异性抗体[22]。PEDV的S基因的Nˊ端存在较高变异性，常因核苷酸插入、突变或缺失而导致氨基酸的序列发生改变，同时肽链的疏水性、糖基化位点以及病毒的2 原始抗原特性也会随之而变。因此，基于PEDVS蛋白的特征，很多学者在研究PED的实验室诊断和疫苗研制时将S蛋白作为研究的靶蛋白[23-26]。M蛋白由M基因由（681nt）编码，包含226aa，分子量为20~30kD。M蛋白是一种跨膜蛋白，主要位于病毒粒子表面，并参与病毒粒子的合成过程。可诱导机体产生特异性抗体的重要抗原，能够诱导机体IFN-α应答[27]。M基因具有高度保守性，使用M蛋白制备的单克隆抗体能够识别重组及天然的M蛋白。因此，M蛋白可以作为实验室诊断和研究亚单位疫苗的重要结构蛋白[28-29]。N蛋白基因全长为1326nt，含有441aa，大小为55~58kD。N蛋白与基因组RNA相互缠绕形成核衣壳来保护病毒的基因组，因此，N蛋白又称核衣壳蛋白。N蛋白可通过抑制机体IFN的产生，而扰乱宿主的免疫应答[30]。研究表明，N蛋白可诱导猪小肠上皮细胞（IECs）的NF-κB信号通路的激活，且具有剂量的依赖性[31]。另外，将N蛋白稳定转入到IECs后，发现N蛋白不仅能延长细胞生长周期，而且还能激活NF-κB，促使细胞产生IL-8[32]。在PEDV感染的早期，可诱导机体产生大量抗N蛋白抗体。再之，N蛋白具有较强的保守性，故该蛋白可作为早期诊断的靶蛋白[33]。E蛋白是PEDV最小的结构蛋白，E蛋白基因大小为231nt，编码76aa，蛋白分子量为7kD。E蛋白是组成病毒囊膜的小包膜蛋白，主要参与病毒包膜的合成以及病毒粒子的释放。有关PEDVE蛋白的研究相对较少，在对其他冠状病毒的研究中发现，鼠肝炎病毒（murinehepatitisvirus,MHV）的E蛋白在细胞中过表达后诱导细胞凋亡。SARS-CoV的E蛋白与抗凋亡因子Bcl-xL之间相互作用能引起T细胞凋亡[34]。在病毒的感染和复制过程中，大部分冠状病毒的E蛋白可引起IL-8的上调，诱导细胞发生内质网应激反应，进而激活核转录因子NF-κB[35]。1.1.3PEDV的培养特性相对于其他冠状病毒，PEDV的细胞培养比较困难，这在一定程度上限制了PEDV研究进程。直到1988年，在培养基中加入胰酶培养的Vero细胞上连续盲传首次成功获得PEDV细胞毒[36]。目前，Vero细胞是分离培养PEDV公认的细胞系，但不同来源的Vero细胞和毒株以及培养条件的差异，对PEDV的分离培养也具有一定的影响。研究发现，猪氨基肽酶（Porcienaminopeptidase,pAPN）被认为是PEDV感染的受体，由963aa组成，该蛋白主要分布在猪小肠上皮细胞[37]，另有学者利用免疫共沉淀技术，通过将不同区段S1蛋白与pAPN孵育，确定PEDV的受体结合域位于S基因的25~88aa。Li等进一步通过构建表达pAPN的MDCK细胞系，证明pAPN的表达可使MDCK细胞获得PEDV感染和增殖的能力，同时用pAPN抗体可阻断PEDV感染MDCK细胞[38]，进一步证明pAPN是PEDV的受体，也是重要的PEDV培养和鉴定材料。1.1.4PED的流行PED一年四季均有流行，但主要以冬季和早春寒冷的季节发病率较高。自然感染条件下，PEDV感染的其潜伏期一般为5~8d，人工感染为8~24h。粪-口途径为该病的主要传播途径，病猪和带毒猪是主要传染源，污染的水源、饲料和运输车辆均可将病原带给健康猪群。3 据报道，该病自1971年首次在英国爆发，除5日龄以下的仔猪不发病外，其他日龄的猪均出现类似传染性胃肠炎的症状[7]。随后，该病蔓延至欧洲其他国家，当时被命名为“1型流行性病毒性腹泻（Epidemicviraldiarrhea,EVD）”。1976年，英格兰报道各个年龄段的猪群均出现了急性病毒性腹泻的症状[39]，由于该病毒可使各个年龄的段猪群发病，因此将该病毒命名为“2型EDV”。1978年，比利时根特大学分离得到该病毒并将其命名为CV77株7[40-41]。从此EDV更名为猪流行性腹泻病毒（PEDV），并成功研制了基于CV777毒株的疫苗，使的PEDV在欧洲的流行得到一定的控制。自二十世纪90年代至今，PEDV在欧洲的报道逐渐减少。1982年日本首次爆发由PEDV引起猪群急性腹泻[42]，造成当地养猪业巨大经济损失。随后在亚洲其他国家（如中国、越南、韩国和泰国和菲律宾等）相继报道流行，与欧洲国家不同的是，该病在亚洲流行更为广泛，主要感染哺乳仔猪，且病程急、病情严重，死亡率有时高达100%，而对稍大日龄的猪危害相对较小。2010年冬季，由PEDV变异株引起中国南部多省区的猪场爆发以呕吐、腹泻、新生仔猪发病、死亡率高为主要症状的流行新腹泻[43]。由于针对毒株变异前生产的疫苗保护效果不理想，随后蔓延至全国，给我国养猪业造成了巨大的经济损失。直到目前该病仍然未得到有效控制，在我国多个地区常有报道，正严重制约着我国养猪业的发展。有学者将18株台湾毒株和国内外毒株对比发现，台湾流行的18个毒株与美国流行毒株处于同一个分支上，而与之前的台湾流行毒株不同[44]。2013年至2014年8月份，PED最初在美国的部分地区的猪场突然暴发，随后扩散至30个州，8200多个猪场，并很快波及全国以及墨西哥、加拿大等周边国家[37]。美国在暴发PED疫情的一年内共造成了800多万新生仔猪的死亡[45-48]。目前，多地变异型PEDV的暴发已给世界各国养猪业造成了重大的经济损失。1.1.5PEDV的遗传变异PEDV只有一个血清型，但在不同地区分离出的毒株之间的基因序列存在差异。可通过分析PEDV的S、M、ORF3及其它结构基因的遗传进化来区分PEDV的基因型。根据PEDVS和M基因序列的不同特征，可将毒株分为G1、G2和G3三个类群，其中G1又分为G1-1、G1-2和G1-3三个亚群[49]。通过对PEDVS基因分析，G1群中三个亚群的毒株之间其核苷酸序列的相似性在95.1~100%，G1与G2、G3两个群的毒株序列对比分析表明，其同源性分别为93.5~96.7%和88.7~91.5%[49]。Chen等人将我国南方分离的12株PEDV的ORF3基因进行遗传进化分析表明，与国内使用的CV777疫苗株的关系较远，与韩国株的关系较近[50]。遗传进化分析表明，2010年以前，亚洲流行的毒株跟欧洲20世纪70~80年代流行的毒株属于同一个亚群，与经典毒株CV777同在PEDVG1亚群[51-52]。2010年10月，我国南方出现以高发病率和高死亡率为特征的PED，大约以广东为中心并快速蔓延至南方多个省份，给养猪业造成巨大损失。随后的调查发现，许多使用了疫苗的猪场也爆发了PED，2月龄以内的仔猪死亡率高达40~98%，由此说明疫苗株对流行的PEDV保护作用较弱。测序结果表明，2010年10月份以后分离的毒株与G1相比其同源性在96~98%之间[53]，又形成了一个新的亚群，即PEDVG2。2013年，美国首次报道PEDV毒株在全美的流行，该毒株与中国2010年流行的强毒株的同源性为4 99.5%[54]。由于PEDV毒株的遗传进化的复杂性，使得同一地区流行的毒株存在一定差异性，这可能是在研究该病的防治方面最为棘手问题之一。1.1.6致病性哺乳仔猪感染PEDV后的发病率和死亡率高，1周龄以内仔猪死亡率高达100%，育肥猪症状为轻度腹泻、厌食，一般病程3~4d即可恢复。发病仔猪临床表现为严重腹泻、脱水，个别出现呕吐现象，消瘦、营养不良，体温升高，多为整窝仔猪发病。剖检病变主要集中在小肠组织，可见小肠鼓气、肠壁变薄、呈半透明状，肠内充满淡黄色粘液，肠内混杂有黄白色未消化的凝乳块及大小不等的气泡。小肠肠壁和肠系膜血管明显充血，肠系膜淋巴结红肿出血。病理组织学检查，可见小肠组织特别是空肠中、后部和回肠绒毛萎缩、断裂，肠上皮细胞脱落、坏死，胞核浓缩、胞浆呈嗜酸性等[55-56]。病变小肠组织营养物质吸收功能发生障碍，肠内晶体渗透压升高而造成渗透性腹泻、脱水，最终导致病猪机体严重衰竭而死[57-58]。本实验室前期研究表明，人工口服感染3日龄和21日龄仔猪HBMC2012株PEDV细胞毒后2~3d，均出现不同程度腹泻、呕吐。病理学检查可见3日龄仔猪小肠绒毛严重脱落，肠壁变薄等病变，21日龄仔猪相比于3日龄仔猪病变较轻，3d左右逐渐好转[59]，由此可见，感染仔猪日龄越小，其临床症状和病理变化越严重。1.2PEDV的靶细胞猪的上皮细胞（IECs）是PEDV感染的靶细胞，因此，PEDV引起的病变主要集中在小肠。病毒破坏肠道上皮细胞，造成肠绒毛萎缩、脱落，而其它组织器官未见病变[60]。朱卫霞（2015年）采用免疫组化方法检测了感染仔猪小肠各段和淋巴结中的PEDV，结果显示，在空肠后段和回肠组织中抗原含量最高，而且主要在小肠上皮细胞中[59]。PEDV主要侵染猪小肠绒毛上皮细胞，这可能与小肠上皮细胞表面的猪APN有关，现已证明APN是猪流行性腹泻病毒的细胞受体[33,61]，国外已从未吃初乳新生仔猪空肠分离培养获得猪源小肠上皮细胞有IPEC-J2[62]和IPEC-1[63]，为PEDV感染机制研究提供了实验材料。1.2.1IPEC-J2/IPEC-1细胞1989年IPEC-J2细胞由北卡罗来纳大学的HelenBerschneider等人从新生仔猪空肠中分离出来[64]。1996年Gonzalez-VallinaR等人又分离得到IPEC-1细胞[65]。IPEC-J2和IPEC-1均是未转化的猪小肠上皮细胞系，来源于新出生12h内未吃初乳的仔猪，是目前公认研究肠道病原和肠粘膜特征的体外模型[64,66]。猪小肠上皮细胞多用于研究肠道的机能和致病机制，如营养物质输送、氧化应激、肠道致病菌和毒素[67]。相比于啮齿类动物细胞系（例如IEC-6或IEC-18），IPEC-J2和IPEC-J更接近于人类，可以有效地模拟人类生理等，故对于人畜共患病病原的研究更具有意义。此外，对猪源的一些肠道传染病的研究也提供了便利。IPEC-J2细胞在含有5%胎牛血清、1%胰岛素/转铁蛋白/亚硒酸钠培养基补充物的50%DMEM和50%Ham'sF12营养培养液，5ng/ml表皮生长因子和1%青霉素/链霉素的培养液中稳定传代5 培养[63]。因此越来越多地用于病原微生物研究，以检查各种动物和人类病原体，包括肠炎沙门氏菌和致病性大肠杆菌等与肠上皮细胞的相互作用。大量研究表明，IPEC-J2细胞的病原识别受体的表达，如Toll样受体（TLR）2,3,4,5,6,8,9和10的表达[68-72]。Schierack等人（2006年）的研究证实，鼠伤寒沙门氏菌和霍乱沙门氏菌口服接种猪获得的回肠组织或感染IPEC-J2细胞均可诱导白介素（IL）-8和巨噬细胞炎症蛋白（MIP）-3α分泌[73]。Devriendt等人（2010年）通过蛋白质印迹分析，证实了并证明从纯化的大肠杆菌分离出的鞭毛蛋白，可以诱导IPEC-J2细胞TLR-5蛋白表达和IL-6和IL-8的分泌[70]。另有研究证实，IPEC-J2细胞对一些引起哺乳动物腹泻病毒，如猪轮状病毒、TGEV和PEDV等易感[74-75]。IPEC-J2细胞系与猪的原代小肠上皮细胞具有极强的相似性。因此，IPEC-J2细胞系是良好的猪肠上皮模型细胞。1.2.2IECsIECs来源于出生12h仔猪的回肠组织，由王静等人于2010年分离[76]，该细胞可以在体外连续传代培养而不失去上皮样特征。曹丽艳等（2015年）在研究PEDV感染IECs抑制IFN-β激活NF-κB机理时，建立了PEDV体外感染IECs模型，并发现PEDV感染IECs后并不产生明显细胞病变，但用免疫荧光方法可检测到病毒在细胞内增殖。PEDV编码的N蛋白可以诱导IECs的NF-κB信号通路的激活，且具有剂量依赖性，进一步通过沉默Toll-样受体信号通路证实，PEDVN蛋白通过TLR激活NF-κB信号通路[31]。1.3PEDV诱导的免疫应答肠道是人体与外界环境接触的最大边界，胃肠道长期暴露于大量的外来抗原（包括致病菌、毒素和病毒等）刺激下，除了处理和运输各种营养物质外，同时也是机体重要的免疫器官。肠道黏膜上皮屏障是仔猪抵御病毒侵入的第一道防线，局部肠粘膜免疫在机体抗感染免疫防御中发挥重要作用。1.3.1全身性免疫应答PEDV可以诱导机体产生特异性抗体和系统细胞因子免疫应答。21日龄仔猪感染PEDV后，血清特异IgM、IgA和IgG抗体水平分别于3、7和14dpi上升至最高值，并且PEDVS蛋白诱导机体产生的抗体高于N蛋白；血清中IL-6、IL-12、MIP-1α、MIP-1β、CXCL9、CXCL11、TGF-β1、TGF-β3以及干扰素-α的水平显著升高[77]；仔猪的外周血淋巴细胞的特异增殖活性增强，并且CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th、CD3+CD4-CD8-γδT和CD3-CD4-CD8+细胞亚群的含量显著升高[59]。母猪接种PEDV灭活苗或弱毒苗，可诱导母猪产生保护性抗体，并通过乳汁将特异性抗体传递给仔猪，对新生仔猪起到被动保护作用[78-79]。6 1.3.2固有黏膜免疫应答参与机体固有免疫应答的细胞有吞噬细胞、NK细胞和抗原提呈细胞。吞噬细胞包括单核/巨噬细胞、中性粒细胞，对侵入体内的病原微生物应答极为迅速，在固有免疫中发挥重要作用。NK细胞不同于T、B细胞，且无须预致敏，对靶细胞具有直接杀伤作用，NK细胞与T细胞有许多相似特征，在IL-2刺激下增殖，活化的NK可分泌IFN-γ等因子。在高水平趋化因子（CCL2、CCL3和CXCL10）作用下可募集NK细胞。肠道抗原提呈细胞主要指黏膜树突状细胞（dendritescell,DCs），黏膜DCs是一类可摄取、加工处理抗原，并以抗原肽分子复合物的形式将抗原信息表达于细胞表面。黏膜DCs具有其它组织DCs所不具备的两个特性[80]，其一，在体外倾向性诱导Th2型反应；其二，具有独特的选择性标记胃肠道归巢T细胞的能力，CD8+T淋巴细胞被DCs预处理之后可以获得消化道趋向性。使得它们能够与T细胞、B细胞、肠道上皮细胞和基质细胞相互作用，从而促进黏膜免疫系统的稳定性[81]。IECs作为固有层免疫细胞与外环境之间的天然屏障构成肠道的第一道免疫防线，IECs除了具有转运SIgA功能，还可作为抗原提呈细胞（APC）。IECs可感知肠道局部环境的变化和刺激，进而表达及分泌多种天然免疫分子，如抗原提呈相关分子、炎性细胞因子、趋化因子等，通过信号转导，诱导固有层中T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和DC等免疫细胞，从而启动一系列的局部免疫防御反应来维持微环境的免疫稳定性[82]。另外，肠道内潘氏、杯状及其他上皮细胞可分泌防御素和多种抗菌肽，而抗菌肽和防御素是肠道抵抗病原微生物侵袭的重要免疫因子。PEDV感染仔猪后，病毒主要在小肠局部增殖，破坏肠粘膜上皮细胞，造成肠道局部炎症反应。在肠道炎症的刺激下，巨噬细胞数量增加，高表达T细胞共刺激分子，同时TLR2、TLR4表达上调，共表达CD14、CD89和髓系细胞触发受体-1（triggeringreceptor,TR-1）[83]。TR-1可触发促炎因子IL-1β、IL-6、IL-8和TNF等的合成与分泌，造成局部组织破坏。本实验室前期研究发现，PEDV感染仔猪后第3天，在回肠和十二指肠中可检测到IgA、IgG、IgM的分泌。小肠各段及肠系膜淋巴结中肥大细胞和单核-巨噬细胞增多，MUC2的分泌水平显著下调[59]，说明上述免疫分子和免疫细胞均参与了免疫过程。利用基因芯片和FQ-PCR可检测到仔猪回肠组织中炎性因子（IL-1β、IL-6）趋化因子（IL-8、MCP-1、MIP-1β）显著上调，而肠系膜淋巴结细胞因子表达水平不显著[75]。通过分泌炎症因子和募集炎症细胞，刺激机体快速的启动炎症反应，进而调节后续适应性免疫应答，抵抗入侵的病原体[84]。1.4趋化因子趋化因子(chemokines)是指具有趋化白细胞聚集于病原侵害部位作用的一大类低分子量（多为8~10kD）的蛋白质。趋化因子与靶细胞膜上特异性受体结合，在机体炎症反应、免疫应答、组织修复和造血中发挥重要调节作用[85-87]。已发现50多种趋化因子及20多种受体，是迄今为止发现的最大的细胞因子家族。根据靠近分子氨基端（N端）的前两个C间是否插入其它氨基酸，分为4个亚类[88]，即C-X-亚族、C-C亚族、C型亚家族和s类趋化因子。C-X-亚族，又称a类趋化因子，主要趋化中性粒细胞和淋巴细胞，如CXCL9对T细胞具有趋化作用，CXCL13对B细7 胞具有趋化作用；C-C亚族，又称β类趋化因子，是以单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）位代表的单核-巨噬细胞趋化因子；C型亚家族，氨基端仅有1个c，又称Y类趋化因子，代表有淋巴细胞趋化蛋白、淋巴细胞趋化因子；s类趋化因子，对单核-巨噬细胞、T细胞及NK细胞有趋化作用[89]。趋化因子是依赖于其在细胞上的受体而起作用的。关于趋化因子及其受体和病毒感染的研究证实，趋化因子及其受体可通过趋化、活化免疫细胞或抑制血管增殖等起到抗病毒感染后的组织损伤的作用，又可促进血管生长。故而趋化因子及其受体在病毒入侵机体的生物学行为中发挥双重作用[90-91]。PEDV感染仔猪，其血清中的趋化因子（MIP-1α、MIP-1β、CXCL9、CXCL11、TGF-β1、TGF-β3）的水平显著上调。感染仔猪回肠组织中趋化因子（如IL-8、MCP-1、MIP-1β、CXCL9、CXCL13）mRNA的表达水平显著上调，整个趋化因子信号通路的富集程度P=1.65×10-6，由此说明PEDV感染引起了及肠道局部趋化因子免疫反应。目前有关趋化因子在宿主抗PEDV感染中的研究报道很少。因此，本实验拟在探索PEDV感染后诱导的趋化因子对仔猪外周血白细胞的趋化作用，以期完善PEDV的感染免疫调节机制。1.5研究目的与意义PEDV是导致仔猪腹泻的主要原因，目前国内外学者针对PEDV的研究，主要集中在病原分离鉴定、结构蛋白的功能分析、特异性诊断以及疫苗研制等方面，而关于PEDV感染免疫机制的研究相对较少。为了更有效地防控PED的流行，有必要深入探索该病毒与宿主免疫系统之间的相互作用机制。趋化因子在联系天然免疫、获得性免疫应、抑制病毒感染和炎性反应等方面起着重要的作用，不同来源的细胞受到细菌或病毒的刺激后可分泌不同类型的趋化因子。病原感染机体后，机体所产生的组织损伤、炎性反应等与趋化因子在此过程中所起的作用是众多学者研究的热点之一。而鲜见PEDV感染与趋化因子之间的免疫机制的研究报道，本研究旨在探明在PEDV感染过程中，趋化因子在炎性反应和宿主抗感染过程中的调节作用，为深入阐明PEDV的感染免疫机制奠定基础，同时为该病毒的有效防控提供科学指导。1.6研究内容和技术路线1.6.1研究内容1.6.1.1PEDV感染仔猪回肠组织中差异表达的基因的分析PEDV感染21d仔猪后第3d采取回肠组织，利用基因表达谱芯片技术，大规模筛选PEDV感染仔猪后回肠组织中差异表达基因，通过基因本体（GO）、KEGGPathway富集分析。筛选出趋化因子（MCP-1/CCL2、MIP-1β、TGF-β3、IL-8/CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL13），并通过FQ-PCR方法进行验证。明确宿主参与免疫应答的细胞信号通路以及显著上调的趋化因子，可为本课题后续的研究提供指导。8 1.6.1.2体外用于PEDV感染免疫分析的最佳细胞系的筛选5.6/mL）和CV777株PEDV（TCID6.5分别使用HBQY2016株（TCID50=1050=10/mL）感染Vero细胞和IPEC-J2细胞，采用IFA和FQ-PCR方法检测病毒对细胞的感染情况；FQ-PCR和ELISA方法检测Vero和IPC-J2细胞趋化因子的分泌情况，从而确定用于体外感染实验的最佳细胞系。1.6.1.3MCP-1、CXCL9、CXCL13对仔猪外周血白细胞趋化作用的分析为了进一步解析趋化因子在PEDV感染中的作用，将12孔板内的IPEC-J2细胞（1.5×105个细胞/孔）分为PEDV感染组（0.5MOI）、趋化因子（MCP-1、CXCL9、CXCL13）siRNA干扰-PEDV感染组、siRNA阴性对照NC-PEDV感染组和空白对照组，每组3个重复。感染后20h收集细胞上清液，分别加到24孔Transwell下室，上室内加入分离的SPF仔猪外周血白细胞（PBLC）（1×106个细胞/孔），孵育24h后，收集下室内的细胞，采用流式细胞术（FlowCytometry，FCM）测定单核细胞、T和B淋巴细胞的含量。9 1.6.2技术路线PEDV流行株CV777疫苗株21日龄仔猪IPEC-J2Vero细胞基因表达谱FQ-PCR检测FQ-PCR检测IFA检测FQ-PCR、芯片分析感MCP-1、HBQY2016株HBQY2016株ELISA方法染仔猪回肠MIP-1β、IL-8、和CV777株和CV777对检测体内感组织基因表TGF-B3、分别在IPEC-J2和染实验中验达谱CXCL9、IPEC-J2和Vero细胞的证的趋化因CXCL10、Vero细胞上感染情况子CXCL13验证的增殖动态芯片结果GO和PEDV感染IPEC-J2KEGG趋化因子信后分泌的趋化因子对Pathway号通路仔猪外周血白细胞的富集分析趋化作用siRNA干扰IPEC-J2MCP-1、CXCL9和CXCL13的表达PEDVIPEC-J2流式细胞术检流式细胞术测CD3、CD4、检测CD3CD4CD8、CD14、CD8CD14CD19分离仔猪外CD19周血白细胞1.7研究目标1.7.1利用基因表达谱芯片技术大规模筛选PEDV感染仔猪第3d回肠组织中表达差异基因，通过GO和KEGGPathway富集分析，筛选参与免疫应答和炎症反应过程的显著差异基因以及显10 著富集的细胞信号通路，FQ-PCR方法验证显著上调的趋化因子，为PEDV感染免疫研究提供重要信息资源。1.7.2选用HBQY2016株和CV777株分别感染Vero细胞和IPEC-J2细胞，通过检测趋化因子的表达水平，结合体内感染仔猪的差异表达基因分析结果，筛选体外研究PEDV感染免疫的最佳细胞系。1.7.3通过Transwell趋化实验、利用siRNA干扰技术和流式细胞术方法，揭示PEDV后诱导产生的趋化因子（MCP-1、CXCL9、CXCL13）对仔猪外周血白细胞中单核巨噬细胞、T细胞和B细胞的趋化作用。11 2材料与方法2.1材料2.1.1细胞及毒株非洲绿猴肾（Vero）细胞由本实验室保存；猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）北京农学院赠送；CV777弱毒株，本实验室保存；HBQY2016强毒株（GeneBankID：MH244927）由本实验分离鉴定。2.1.2实验动物6头21日龄健康仔猪：PEDV、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和轮状病毒(RV)均为阴性，PEDV、TGEV、RV特异性抗体均为阴性，购自某规模化猪场，用于PEDV感染实验。3头21日龄SPF仔猪，购自北京市SPF猪育种管理中心，用于分离仔猪外周血白细胞。2.1.3主要试剂与试剂盒MEM、DMEM、Opti-MEMI®培养基购自Gibco公司Lipofectamine™2000购自invitrogen公司胰酶购自MULTICELL公司新生牛血清购自MULTICELL公司LPS购自Solarbio公司DyLight488-labeledGoatAnti-mouseIgG购自美国KPL公司TRIZOLLSReagent、dNTPs购自北京天根生化科技有限公司随机引物购自上海生工生物工程有限公司2×TaqMasterMix购自CWBIO公司反转录酶MLVReverseTranscriptase购自Promega公司RibonucleaseInhibitor购自全式金公司100bpDNAladderMaker购自全式金公司HRP-羊抗兔IgG购自Solarbio公司SYBR®GreenqPCRMasterMix购自Promega公司BSA购自Solarbio公司BisbenzimideH33258购自Solarbio公司琼脂糖凝胶纯化试剂盒购自BIOMIGA公司抗PEDVN蛋白单克隆抗体本实验室制备和保存总RNA提取试剂盒质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司胰蛋白胨及酵母粉购自德国OXOID公司PMD18-T载体购自TaKaRa公司猪全基因4×44K芯片（designID：026440）AgilentTechnologiesInc.12 2.1.4流式用抗体MouseAnti-PorcineCD4a-FITC购自SouthernBiotech公司MouseIgG2b-FITC购自SouthernBiotech公司MouseAnti-PorcineCD3e-PE购自SouthernBiotech公司MouseIgG1-PE购自SouthernBiotech公司MouseAnti-PorcineCD8a-SPRD购自SouthernBiotech公司MouseIgG2a-SPRD购自SouthernBiotech公司MouseAnti-PorcineCD14:FITC购自Bio-rad公司Mouseanti-mammaliaCD19FITC购自Thermo公司MouseAnti-PorcineCD5FITC购自AbDSerotec公司MouseIgG1ControlIsotypeControl购自Thermo公司2.1.5主要试剂的配制2.1.5.1细胞培养基及相关试剂10%血清DMEM营养液：DMEM/F12(1:1)基础培养液178mL，灭活犊牛血清20mL，2×104U/mL青、链霉素2mL，混匀后用7.5%NaHCO3溶液调pH至7.2，4℃备用。1×DMEM细胞维持液：1×DMEM/F12(1:1)基础培养液198mL，2×104U/mL青、链霉素2mL，1μg/mL胰酶100μL，混匀后用7.5%NaHCO3溶液调pH至7.2，保存于4℃备用。4×MEM细胞培养液：参照说明配制，用高压灭菌超纯水溶解，过滤除菌，保存于4℃备用。1×MEM细胞培养液：高压灭菌的超纯水123.5mL，经灭活的新生牛血清20mL，4×MEM50mL，500mmoL/LHepes2mL，2×104U/mL青、链霉素4mL，5mmoL/L，5×10-3mol/Lβ-Me4mL，混合均匀后，用含7.5%NaHCO3调节pH至7.4左右，4℃保存备用。1×MEM细胞维持液：363mL高压灭菌的超纯水，200mL4×MEM，2.4mL1μg/μL胰酶，4mL500mmoL/LHepes，4mL2×104U/mL青、链霉素，4mL5mmoL/Lβ-Me，混匀后，最后用灭菌的7.5%NaHCO3溶液调pH至7.4左右，于4℃保存备用。7.5%NaHCO3：称取7.5gNaHCO3溶于100mL超纯水中，高压灭菌，保存于4℃备用。2×104U/mL青、链霉素：青霉素4×106U、链霉素4×106U都溶于200mL高压灭菌的三蒸水中，使用孔径为0.22μm的滤器过滤除菌，保存于-20℃。1µg/µL胰酶溶液：0.2g胰酶，溶于200mL已高压灭菌的0.01moL/LPBS中，使用0.22μm孔径的滤器过滤除菌，分装后，于-20℃保存备用。500mmoL/LHepes贮存液：称取12gHepes粉末溶于100mL的超纯水，高压灭菌，保存于-20℃备用。10×EDTA-胰酶溶液：称取胰酶6.25g，EDTA-Na20.5g，Na2HPO4·12H2O7.23g，KCl0.5g，KH2PO40.5g，NaCl20.0g，溶于250mL高压灭菌的三蒸水中，过滤除菌，分装，-20℃保存，使用时用高压灭菌的三蒸水做1:10倍稀释。5×10-3mol/Lβ-巯基乙醇（β-Me）：在200mL的1×MEM培养基中加入60µLβ-Me，混匀并13 分装，于-20℃保存备用。0.01moL/L磷酸盐缓冲液（PBS）：分别称取Na2HPO4·12H2O3.63g、NaCl8.00g、KH2PO40.24g、KCl0.20g充分溶解后，加入超纯水定容至1000mL，10M的NaOH调节pH至7.4左右，高压灭菌后常温保存。2.1.5.2组织RNA和质粒DNA提取用试剂0.1%DEPC水（W/V）：称取1gDEPC，加入1000mL的三蒸水中，置于37℃，待完全溶解后，高压灭菌，保存于4℃备用。75%乙醇（V/V）：量取750mL无水乙醇，加入250mL0.1%DEPC水，混合均匀后保存于4℃备用。RNaseA(10mg/ml)：0.1gRNaseA溶于10mLTE(pH8.0)溶液中，100℃煮沸10min，分装0.5mL离心管中，-20℃保存。SolutionI：50mMTris·HCl(pH8.0)，5mMEDTA(pH8.0)，50mM葡萄糖，高压灭菌。(称取葡萄糖4.5g，量取125mL0.1MTris·HCl和10mL0.5MEDTA，定容到500mL)SolutionII：配制2%SDS和0.4MNaOH贮存液，使用前根据用量等体积混合，此溶液一般现用现配。SolutionIII：在120mL5mol/L的乙酸钾溶液中加入23mL冰乙酸，用蒸馏定容至200mL高压灭菌后于4℃保存备用。氯仿：饱和酚：异戊醇(24:25:1)：量取120mL氯仿，5mL异戊醇，125mLTris饱和酚，充分混匀，于4℃保存备用。TE缓冲液(pH8.0)：0.01mol/L的EDTA溶液(pH8.0)，0.1mol/L的Tris·Cl溶液(pH8.0)，加蒸馏水100mL容量瓶定容，高压灭菌后常温保存。2.1.5.3电泳用试剂50×TAE储存液：称取121gTris碱，量取28.55mL的冰乙酸和0.5mol/L的EDTA（pH8.0）50mL，充分溶解后用三蒸水定容至500mL，于常温保存备用。1×TAE电泳缓冲液：量取20mL的50×TAE储存液，用三蒸水定容至1000mL,混匀后于常温保存。1.5%琼脂糖凝胶：量取50mL1×TAE溶液，加入750mg琼脂糖加热至完全溶解，为防止EB挥发，一般等溶液凉至40~50℃时加入EB溶液（10mg/mL），使EB终浓度为0.5µg/mL。2.1.5.4感受态细胞制备用试剂LB液体培养基：称取2.5g蛋白胨，1.25g酵母粉，2.5gNaCl，加入250mL蒸馏水，加热溶解，待冷却至室温后用10mol/L的NaOH调节pH至7.2左右，高压灭菌后于4℃保存备用。Amp+LB液体培养基：使用高压灭菌后的LB液体培养基，待温度降至40~50℃时，加入10014 mg/mL的Amp浓缩液250µL，于4℃保存备用。Amp+LB固体培养基：称取酵母粉1.25g，蛋白胨2.5g，琼脂粉3g，NaCl2.5g，加入蒸馏水定容至250mL，加热溶解，用10mol/L的NaOH调pH至7.2，120℃20min高压灭菌，待温度降至40~50℃时，加入Amp至终浓度为100µg/mL，倒入无菌培养皿，待冷却凝固后于4℃保存。100mg/mL氨苄青霉素储存液：取1g氨苄青霉素粉末加入到10mL高压灭菌后的三蒸水中，充分溶解后，用0.22μm孔径的滤器过滤除菌并分装于1.5mL离心管，于-20℃保存备用。1mol/LCaC12：称取27.75g无水CaCl2加入蒸馏水定容至250mL，高压灭菌，保存于4℃备用。2.1.5.5免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）用试剂固定液：量取40mL丙酮加入至60mL含0.2%BSA的PBS溶液中。洗涤液（PBST）：取250µLTween-20加入至500mL的PBS溶液。抗体稀释液：称取2gBSA溶于100mL的PBST中。H2O2甲醇混合液：取5mL30%的H2O2加入到250mL甲醇溶液中混匀。0.1mol/L，Tris·HCl缓冲液（pH7.4）：称取Tris碱2.42g溶于蒸馏水，用浓盐酸调pH至7.4，加入三蒸水定溶至200mL，保存于4℃备用。10×DAB贮存液：量取40mLTris·HCl缓冲液（0.1mol/L，pH7.4）加入0.2gDAB，待完全溶解后分装于1.5mL离心管，避光保存于-20℃备用。DAB显色液（现用现配）：取9mLTris·HCl缓冲液（0.1mol/L，pH7.4），加入30μL的30%的H2O2混匀。2.1.5.6其他试剂10%EDTA抗凝剂：5gEDTA-Na2溶于50mL生理盐水中，用10MNaOH调pH至8.0，高压灭菌，室温保存备用，工作浓度为（0.2%）。0.5%台盼蓝溶液：向50mL生理盐水中加入0.25g台盼蓝，充分溶解后，6000r/min，离心10min，取上清备用。红细胞裂解液：准确称取0.04gEDTANa2·2H2O，8.29gNH4Cl，1.00gNaHCO3溶于1000mL的三蒸水中，过滤除菌后，于室温保存。1mg/mLLPS母液：超净台中配制，在盛有10mgLPS粉末的瓶中加入1mL灭菌的PBS（pH7.2~7.4），将混悬液移到无菌15mL离心管中，用3~5mLPBS洗涤瓶内剩余LPS，一并转移溶液到15mL离心管中，漩涡振荡15min充分溶解，分装后于-20℃保存。15 2.1.6主要设备倒置显微镜OLYMPUSTOKYO荧光显微镜购自Zeiss公司Kadakr凝胶成像分析系统美国Kodak公司SyrergyHTX全波长酶标仪GeneCompanyLimite实时荧光定量PCR仪RocheDiagnostics(Shanghai)LtdPCR仪Biometra公司SIGMA3-18K台式高速冷冻离心机SIGMA公司高压灭菌器SANYOElectricCO.CO2INCUBATORMCO-15ACSANYOElectricCO.苏净安泰超净工作台苏州安泰有限公司普通离心机购自上海安亭科学仪器厂EPICSTMElite研究型流式细胞仪美国Beckman-coulter公司产品DYY-28C稳压稳流电泳仪购自北京六一仪器厂DYYIII-31A/31B电泳槽购自北京六一仪器厂SPX智能型生化培养箱宁波市科技园区新江南仪器有限公司恒温振荡器上海智城分析仪器制造有限公司SP-2102UV紫外分光光度计上海光谱仪器有限公司16 2.2方法2.2.1引物合成2.2.1.1RT-PCR用引物RNA反转录用随机引物：由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。根据GeneBank收录的PEDV（KM604665）、TGEV（AF302264）和RV（L35054.1）序列，使用Oligo6.0软件，设计扩增相应病毒核酸的特异性检测引物，送往生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物序列见表2-1。表2-1扩增PEDV、TGEV和RV部分基因片段的引物和PCR条件Table2-1ConditionsandprimersofPCRtoamplifypartialgenesofPEDV、TGEVandRV扩增基因引物序列(5′→3′)退火温度℃产物(bp)GenesPimersequence(5′→3′)Annealingtemperature/℃Prouducts/bpForward:TCTGCATTCCAGTGCTTGPEDV54316Reverse:TGCTAAACTGGCGATCTGForward:CTTGGTAGTCGTGGTGCTAATAATGTGEV55374Reverse:CCATAAAATCTTGTCACATCACCForward:CAATAACTGGTTCTATGGACACGCCRV55221Forward:TGGTTCCACAGAAAATGACGCAATA2.2.1.2FQ-PCR用引物参考GeneBank中收录的猪趋化因子序列，采用Oligo6.0软件，设计扩增趋化因子MIP-1β、MCP-1、IL-8、TGF-β3、CXCL9、CXCL10、CXCL13以及管家基因β-actin引物，送往由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。引物如表2-2所示。17 表2-2扩增趋化因子部分基因片段的引物和PCR条件Table2-2ConditionsandprimersofPCRtoamplifypartialgenesofchemokinesis退火温度℃扩增基因引物序列(5′→3′)产物(bp)GenBank登录号AnnealingGenesPimersequence(5′→3′)Prouducts/bpGenBankaccessionNo.temperature/℃Forward:CTGGCATTGTCATGGACTCTβ-actin61.2276U07786Reverse:GCGATGATCTTGATCTTCATForward:CTCCTGTGCCTGCTGCTMCP-155282X79416Reverse:TTCAAGGCTTCGGAGTTTForward:CTCTCCTCCAGCAAGACCAMIP-1β58299AJ311717Reverse:GCTCAGTTCAGTTCCAAGTCAForward:AGCACAATGATCTGGCCGTTTGF-B358.4354NM-214198Reverse:GCTGAAAGGTGTGACACGGAForward:AACTGGCTGTTGCCTTCTTGIL-854.2299M99367Reverse:CTGCTGTTGTTGTTGCTTCTCForward:TAAACAATTCGCCCCAAGCCCXCL952244NM-001114289Reverse:CATGGTCCCTCATGTCATCTTCForward:ACTGTTCGCTGTACCTGCATCXCL1052233NM-001008691Reverse:GCTTCTCTTTGTGTTCGAGGAForward:TGAAGTGTCAATGCCTCCGACXCL1354245ENSSSCT00000026571Reverse:GCGTCAGGCAATGCTTTTCT2.2.1.3siRNA干扰分子根据GeneBank登入的猪趋化因子MCP-1、CXCL9、CXCL13的基因序列，分别设计3条相应的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA）分子，同时设计一条与所干扰目的基因无同源性的阴性对照（NC）。siRNA分子由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。siRNA序列相关信息见表2-3。18 表2-3本实验所用的siRNA序列Table2-3SequencesofsiRNAsusedinthisstudy基因名称序列干扰序列GenesSenseAnti-squencesCXCL9-77UCAUCUUCCUGACUCUGAUTTAUCAGAGUCAGGAAGAUGATTCXCL9-107GAACCCUACUAAUGAGGAATTUUCCUCAUUAGGAAGAUGATTCXCL9-153CCAAAGGAUGCACCAUUUATTUAAAUGGAUCAUCCUUUGGTTCXCL13-156GGAGACCAAUGACACAAAUTTAUUUGUGUCAUUGGUCUCCTTCXCL13-254GGAAUGGAUGUCCAACCAGTTCUGGUUGGACAUCCAUUCCTTCXCL13-318CCCUCAAAGCAAACUGUUATTUAACAGUUUGCUUUGAGGGTTMCP-1-69CCAGCCAGAUGCAAUUAAUTTAUUAAUUGCAUCUGGCUGGTTMCP-1-104GCUAUACACUUACCAGUAATTUUACUGGUAAGUGUAUAGCTTMCP-1-164CCAGCAGCAAGUGUCCUAATTUUAGGACACUUGCUGCUGGTTNCUUCUCCGAACGUGUCACGUTTACGUGACACGUUCGGAGAATT2.2.2病毒培养与TCID50测定2.2.2.1病毒培养取生长状态良好的Vero细胞，待细胞达90%汇合时，将1mLHBQY2016株毒和1mLCV777毒分别接种到细胞单层上，37℃、5%CO2吸附1h，加入10mLMEM细胞维持液，培养72h收毒，取出细胞瓶，反复冻融3次，收集培养物，转移至15mL离心管，1500r/min离心10min，收取上清，-80℃保存备用。2.2.2.2TCID50测定（检测类似下标是否有误）采用免疫过氧化物酶单层细胞实验（IPMA），测定PEDV的TCID50，具体实验步骤如下：取生长状态良好的Vero细胞，弃去营养液，加入0.01moL/LPBS3mL，轻洗细胞2次，加入胰酶消化细胞，用含10%FBS的MEM营养液终止消化，1000r/min离心10min，弃去上清，加入5mL含10%FBS的MEM营养液重悬细胞并计数，以1.6×104个细胞每孔接种到96孔细胞培养板，将细胞培养板置于37℃、5%CO2条件下培养至细胞达90%汇合（约24h）。分别将HBQY2016毒和CV777毒用MEM维持液做10倍梯度稀释（即10-1~10-9倍稀释）。从培养箱取出96孔细胞培养板，弃去培养板的营养液，加PBS轻洗一次，100μL/孔；接种稀释好的病毒液，100μL/孔，每个稀释度重复8个孔，同时设立未感染病毒的阴性对照，将接种病毒的细胞培养板置于37℃、5%CO2条件下培养1h；弃去病毒液，用PBS洗一次，加入MEM维持液100μL/孔，37℃、5%CO2条件下培养72h；弃去孔内液体，PBS洗涤细胞3次，加入固定19 液，200μL/孔，室温固定20min；弃去固定液，PBS洗涤细胞3次，280μL/孔，5min/次；加入30%H2O2和甲醇的混合液，100μL/孔，室温作用20min；弃去孔内液体，PBST洗涤3次，280μL/孔，5min/次；加入封闭液，200μL/孔，37℃作用30min；弃去封闭液，加入兔抗PEDV阳性血清（1:100倍稀释）50μL/孔，置于37℃作用1h；弃去孔内液体，PBST洗涤3次，280μL/孔，5min/次；加入HRP-羊抗兔IgG（1:100倍稀释）50μL/孔，置于37℃作用30min；弃去孔内液体，用PBST洗涤3次280μL/孔5min/次；加入DAB溶液显色，50μL/孔，室温作用15~30min；用蒸馏水冲洗数次终止反应，在倒置显微镜下观察，判定结果。判定依据：细胞浆呈棕色或棕褐色着色为判为阳性，细胞浆呈无色的判为阴性，记录结果，最后采用Reed-Muench法计算TCID50。2.2.3FQ-PCR标准曲线的建立2.2.3.1感受态细胞的制备挑取生长状态良好的大肠杆菌DH5α单个菌落接种于3mL液体LB培养基，37℃、200r/min过夜摇菌培养，1/100转接入100mL液体培养基37℃、200r/min培养2.5~3h；当菌液OD600nm值在0.3~0.5时，将菌液转入50mL离心管冰浴10min，4℃下6000r/min离心10分钟；弃掉上清，加入冰冷的75mMCaCl240mL重悬沉淀的菌体，冰浴20min，4000r/min4℃离心5min，弃上清；加入6mL冰预冷的甘油-CaCl2溶液重悬菌体，无菌分装至1.5mL离心管，100μL/支，保存于-80℃备用。感受态细胞的质量检测：将待有Amp抗性的质粒转入到所制备的感受态细胞中，再将转入质粒的感受态细胞和未转入质粒的感受态细胞分别接种到Amp抗性的固体LB培养基，置37℃恒温箱内过夜培养，转入质粒的培养基有菌生长，未转质粒的培养基无菌生长，说明感受态细胞制备成功。2.2.3.2趋化因子FQ-PCR标准曲线的建立采用PCR方法从PEDV感染仔猪回肠组织中扩增趋化因子TGF-β3、CXCL9、CXCL10和CXCL13的目的片段，用DNA琼脂糖凝胶纯化、回收试剂盒回收目的片段，并将目的片段与pMD-18T载体相连，建立10μL链接体系，β-actin、IL-8、MCP-1、MIP-1β参考本实验室。连接体系如下：SolutionI5μLpMD-18T载体1μLcDNA4μL瞬时离心混匀，16℃30min连接。取5μL连接产物加入到100μL感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴30min，42℃热击45~90s，冰浴1min，加入895μL的液体LB补齐1mL，37℃200r/min摇菌1h，取出后6000r/min离心5min，收集菌体涂布于Amp抗性LB琼脂板，37℃过夜培养，挑取生长状态良好的菌落于Amp抗性液体LB中37℃200r/min过夜摇菌。将经菌液PCR鉴定20 为阳性的菌液1:1加入甘油LB（或提取质粒）送往测序公司测序。测序结果与GeneBank数据库基因进行序列比对，将测序正确的趋化因子回收片段用NanoDrop2000分光光度计测定核酸浓度及纯度，OD260/OD280值在1.8~2.0之间，可以用于标准曲线的建立，按照下文公式计算出拷贝数。根据核酸拷贝数计算公式计算回收片的拷贝数，将已知拷贝数的回收片段用Nucleotides-FreeWater做10倍梯度倍比稀释，即10-2~10-9或10-3~10-108个稀释度，以梯度稀释好的回收片段作为模板，做荧光定量PCR，根据模板拷贝数和循环阈值得出标准曲线方程。拷贝数计算公式：回收片段拷贝数（copies/μL）=[cDNA浓度（ng/μL）×10-9×（6.02×1023）]/[总片段长度（bp）×660g/moL.bp]。FQ-PCR反应体系以及扩增条件如下：15μLPCR反应体系：SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix7.5μL25pmoL/μL上游引物0.3μL25pmoL/μL下游引物0.3μL梯度稀释的目的片段1.5μLddH2O5.4μL反应程序：95℃5min预变性；94℃20s，54℃~62℃20s，72℃30s，共40个循环；72℃5min延伸，62℃~95℃过程中全程读板收集荧光。2.2.3.3PEDVFQ-PCR检测标准曲线的建立使用PEDVN基因扩增出病毒核酸目的条带并回收片段，将回收片段与pMD-18T载体相连，连接体系、方法同2.2.3.2，将测序正确的质粒用NanoDrop2000分光光度计测定浓度，OD260/OD280的比值在1.8~2.0之间，说明质粒DNA的纯度较好，可以用于荧光定量标准曲线的建立。根据质粒DNA拷贝数计算公式将已知拷贝数的质粒用Nucleotides-FreeWater做10-3~10-9倍梯度稀释，以梯度稀释好的质粒作为模板，做荧光定量PCR，根据拷贝数和循环阈值计算出标准曲线方程。用以下公式计算其拷贝数：质粒拷贝数（copies/μL）=[质粒浓度（ng/μL）×10-9×（6.02×1023）]/[总片段长度（bp）×660g/moL.bp]具体反应体系和扩增条如下：15μLPCR反应体系：SYBR®GreenRealtimePCRMasterMix7.5μL25pmoL/μL上游引物0.3μL25pmoL/μL下游引物0.3μL梯度稀释的质粒1.5μLddH2O5.4μL反应程序：95℃5min预变性；94℃20s，54℃20s，72℃30s，共40个循环；72℃5min21 延伸，62℃~95℃过程中全程读板收集荧光。2.2.4PEDV感染仔猪回肠组织中差异表达基因的检测2.2.4.1PEDV感染仔猪将6头21日龄健康仔猪随机分为空白对照组和感染组，每组3头。感染组：每头仔猪口服6.6TCID途径接种1.5×1050的PEDV强毒株；对照组：每头仔猪口服与野毒等量的细胞维持液。感染组和对照组的仔猪分别在独立的动物房内饲养，其他饲养管理条件相同，感染后第3d解剖，观察病变，分别采取感染组和对照组仔猪回肠组织装入-80℃预冷的冻存管，立即放入液氮冻存，用于提取组织总RNA，分析回肠组织中的差异表达基因。2.2.4.2基因表达谱芯片检测使用4×44KAgilent猪的全基因表达谱芯片检测试剂盒检测感染仔猪回肠组织中差异基因表达谱。按照TAKARARNAisoPlus#9109试剂说明书操作步骤，提取样品总RNA，并通过AgilentBioanalyzer2100电泳检测提取RNA的完整性。使用RNeasymini试剂盒和RNase-FreeDNaseSet纯化总RNA。使用NanoDrop-2000分光光度计和AgilentBioanalyzer2100对纯化的总RNA进行质量检测，根据28S/18S和A260/A280的比值判断所提取样品中总RNA的完整性及纯度，质检合格方可进行下一步实验。按照Agilent表达谱芯片试剂盒操作说明，将得到的总RNA样品进行放大和标记，并用RNeasymini试剂盒纯化标记后的cRNA；纯化标记后的cRNA用于表达谱芯片杂交，杂交cRNA上样量1.65μg，在滚动杂交炉HybridizationOven中65℃，10rpm，滚动杂交17小时，杂交完成后使用GeneExpressionWashBufferKit在stainingdishes洗缸中洗片；采用AgilentMicroarrayScanner对杂交后的芯片进行扫描，用FeatureExtractionsoftware10.7读取数据。以上实验步骤均由上海伯豪生物技术有限公司完成。2.2.4.3数据分析表达差异基因的筛选：对6张基因芯片进行数据分析，将得到原始数据用GeneSpringSoftware11.0进行归一化处理后，样本间进行比较，通过主成分分析（PrincipalComponentAnalysis，PCA）来评价分组的合理性，采用表达差异倍数（Flod-change）以及T检验（Student'st-test）统计学方法筛选差异基因，即：Foldchange≥2，P＜0.5判定为显著基因差异。并将差异基因通过绘制火山图展示，应用DAVIDBioinformaticsResources6.8网站(https://david.ncifcrf.gov)对差异基因进行GO、和KEGGPathway富集分析。22 2.2.5趋化因子mRNA表达水平的FQ-PCR检测2.2.5.1总RNA提取根据总RNA提取试剂盒说明，提取仔猪小肠组织总RNA，具体实验步骤如下：称取20mg小肠组织于1.5mL无菌、无RNA酶的离心管，加入300μL裂解液RL，用研磨杵将样品彻底研磨后加入590μL无RNA酶水，再加入10μL的蛋白酶K混匀，56℃处理10~20min；12000r/min离心2~5min，取上清，缓慢加入于上清0.5倍体积的无水乙醇，轻轻混匀，一并转入吸附柱，12000r/min离心1min，弃去收集管内的废液；将350μL去蛋白液加入到吸附柱中，12000r/min，离心1min，弃掉废液，将吸附柱放回收集管中，滴加80μLDNaseⅠ工作液于吸附柱中央，室温静置15min；加入350μL去蛋白液于吸附柱内，12000r/min，离心1min，弃去收集管内液体，将吸附柱放回收集管中，滴加500μL漂洗液于吸附柱中，室温静置2min，12000r/min离心1min，弃去收集管液体，重复漂洗一次，12000r/min离心2min，弃去废液，室温放置3~5min分钟，使吸附柱晾干；将吸附柱放到一个新的RNase-Free离心管中，吸附膜的中央滴加30~100uLRNase-FreeH2O，室温放置2min，12000r/min，离心2min，得到RNA溶液。反转录体系：取9.5µLRNA溶液和1µL随机引物加入到离心管中，70℃水浴5min，冰浴3min，再加入4µL5×ReactionBuffer，4µLdNTPs，0.5µL2000URNA酶抑制剂，1µL10000UM-MLVRT，37℃水浴90min，75℃水浴15min，终止反应。即得到cDNA，采用FQ-PCR检测趋化因子mRNA的。2.2.5.2FQ-PCR检测趋化因子将2.2.5.1提取的感染仔猪回肠组织总RNA并反转录的cDNA作为模板，采用Real-timeFQ-PCR方法检测趋化因子（MIP-1β、MCP-1、TGF-β3、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL13）及管家基因β-actin的表达量。根据3.3.2.2所述FQ-PCR方法及建立的相应趋化因子标准曲线方程计算出样品中各趋化因子的拷贝数，CXCL8、MIP-1β、MCP-1以及管家基因β-actin参考本实验室建立的标准曲线。计算各差异基因拷贝数与管家基因β-actin拷贝数的比值，即各基因表达水平。分析感染组与对照组差异基因表达水平的差异倍数（即感染组差异基因表达水平/对照组差异基因表达水平）。2.2.6体外PEDV感染试验最佳细胞系的筛选2.2.6.1FQ-PCR检测取生长状态良好的Vero和IPEC-J2细胞各一瓶，弃去营养液，PBS轻洗2次；加入胰酶消化细胞，Vero以含10%FBS的MEM的营养液终止消化，IPEC-J2以含10%FBS的DMEM的营养液终止消化，1000r/min离心10min，弃上清，用5mL营养液重悬细胞并计数，以1.5×105个/孔铺于12孔板，至于37℃5%CO2培养；待细胞单层生长至90%汇合时弃去营养液，加PBS23 轻洗1次，500μL/孔，弃去，分别加入0.5MOIPEDV毒（HBQY2016株TCID5.6/mL，CV77750=10株TCID6.5/mL），轻晃培养板使病毒液覆盖整个孔内细胞，同时设立未接毒的维持液阴性对50=10照。将培养板置于37℃5%CO2吸附1h，弃去病毒液，Vero细胞每孔加入1mLMEM维持液，IPEC-J2细胞每孔加入1mLDMEM维持液，将培养板置于37℃5%CO2，分别在接毒后的12h、24h、48h、72h和96h收集细胞，提取RNA并反转录成cDNA，采用FQ-PCR检测PEDV分别感染Vero和IPEC-J2细胞后不同时间点病毒核酸的拷贝数。2.2.6.2免疫荧光检测将生长状态良好的Vero细胞和IPEC-J2细胞以1.6×104个/孔铺于96孔板，待细胞单层生长达90%汇合时，弃去营养液，用PBS轻洗1次，100μL/孔，分别加入0.1MOI、0.5MOIPEDVHBQY2016株或CV777株，同时设立未接毒阴性对照；将培养板至于37℃、5%CO2孵育1h；弃去病毒液，Vero细胞加入MEM维持液，IPEC-J2细胞加入DMEM维持液，100μL/孔；将培养板置37℃、5%CO2培养箱培养；接毒后的12h、24h和48h应用IFA检测病毒的增殖情况。IFA具体步骤：取出培养板，弃去培养液，用PBS轻洗2次280μL/孔；加入冰冷的无水甲醇固定细胞，50μL/孔，将细胞培养板至于-20℃孵育10min；用PBS轻洗1次280μL/孔；加入1:50倍稀释的鼠抗PEDV-N单克隆抗体，50μL/孔37℃孵育1h，PBS轻洗2次280μL/孔；每孔加入1:500倍稀释的DyLight488-标记的山羊抗小鼠IgG，50μL/孔37℃45min，PBS轻洗2次280μL/孔；每孔加Bisbenzimde10μg/mL，50μL/孔，室温20~30min，PBS轻洗2次，280μL/孔；荧光显微镜观察，在镜下观察阳性结果呈绿色荧光，阴性孔无荧光信号，拍照记录。2.2.6.3TCID50测定采用免疫过氧化物酶单层细胞实验（IPMA），分别使用Vero细胞和IPEC-J2细胞测定HBQY2016株和CV777株TCID50，具体步骤同2.2.2.2。2.2.6.4趋化因子表达水平的检测将IPEC-J2或Vero细胞分别接种到12孔细胞培养板内，每孔1.5×105个细胞，待细胞90%汇合时，将细胞分为CV777株感染组（感染剂量0.5MOI）、HBQY2016株(感染剂量0.5MOI)感染组、LPS阳性对照组(终浓度10μg/mL)和阴性对照组(同等剂量细胞维持液)4个组，组内做3个重复。感染后18~20h，收取各组细胞及上清液于离心管内，1500r/min离心10min，分别收集细胞及上清，应用FQ-PCR和ELISA检测趋化因子mRNA和蛋白表达水平。FQ-PCR检测提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，应用2.2.3.2和2.2.5.2所述的FQ-PCR方法，检测细胞中MIP-1β、MCP-1、TGF-β3、IL-8、CXCL9、CXCL10和CXCL13的mRNA的表达水平，计算差异基因表达水平，分析感染组与对照组差异基因表达水平的差异倍数。24 ELISA检测细胞上清中分泌的趋化因子取各处理组的细胞上清，用ELISA检测试剂盒分别检测细胞上清中MIP-1β、MCP-1、TGF-β3、IL-8、CXCL9、CXCL10和CXCL13等趋化因子浓度。检测方法按照ELISA检测说明操作。具体操作步骤如下：首先将待检样品3000r/min离心10min，去除沉淀、颗粒性物质；将试剂盒内提供的不同浓度的标准品加入样品孔，50μL/孔，将样品加入到样品孔，10μL/孔，将样本稀释液加入到样本孔中，40μL/孔（标准品孔除外）；加入HRP-标记的抗体，100μL/孔，轻微震荡混匀，37℃孵育60min；弃去孔内液体，拍干，加入洗涤液，300μL/孔，室温放置1min，弃去，拍干，重复洗涤5次；加入底物A和B各50μL，37℃避光孵育15min；加入终止液，50μL/孔，测定OD450nm。结果判定：应用Excel办公软件，以标准品浓度为Y轴，检测出的标准品OD值为X轴，绘制标准曲线，生成标准曲线方程，依据标准方程计算每个样本中相应趋化因子的浓度。2.2.7趋化因子对仔猪外周血白细胞趋化作用的检测2.2.7.1干扰效果最佳siRNA的筛选取生长状态良好的IPEC-J2铺于12孔板，1.5×105个/孔。待细胞单层生长达90%汇合时，分别转染针对不同靶点的3条siRNA分子，通过检测趋化因子的表达水平，确定干扰效果最佳的siRNA分子。具体实验过程如下：将IPEC-J2分为PEDV感染阳性对照组、脂质体-PEDV感染组、siRNA-NC-PEDV感染组、siRNA（MCP-1、CXCL9、CXCL13）PEDV感染组和维持液的阴性对照组，每组3个重复，其中PEDV感染组分为HBQY2016株感染组和CV777株感染组。提前将合成的每条siRNA干粉用DEPC水溶解，配置成20μM的溶液；invitrogenLipofectamine™2000转染试剂说明，取灭菌的无RNA酶的1.5mL离心管2支，每管加入50μL（12孔板/孔的量）Opti-MEM®I培养基；向A管中加入4μLLipofectamineTM2000高效真核转染试剂，轻轻混匀，室温静置5min；期间，向B管中加入2μgsiRNA，轻轻混匀；将AB管混合后，室温静置20min，以形成复合物；将培养板内营养液弃去，用无血清、无抗生素DMEM轻洗细胞2次500μL/孔，弃去；并将复合物分别滴加到IPEC-J2细胞单层上，轻晃动培养板，使液体覆盖整个细胞单层；加入400μLOpti-MEM®I培养基，将细胞板置于37℃5%CO2培养箱中培养，每隔30min轻晃细胞板一次；转染后4h，弃去培养液；在siRNA转染-PEDV感染组和PEDV感染阳性对照组的每孔内接种0.5MOI的HBQY2016株或CV777株，将细胞板置于37℃、5%CO2培养箱1h；每孔加500μLDMEM细胞维持液，培养18~20h，取出培养板，1500r/min离心10min，收取细胞提取总RNA，FQ-PCR检测趋化因子mRNA表达量；收取细胞上清于1.5mL离心管，冻存于-80℃，用于ELISA检测细胞上清中的趋化因子。通过计算对靶趋化因子的抑制率，确定干扰效果相对较好的siRNA分子。靶趋化因子的抑制率%=1-(siRNA干扰组平均值-阴性对照组平均值）/（PEDV阳性对照组平均值-阴性对照组平均值）×100%。25 2.2.7.2仔猪外周血白细胞的分离应用红细胞裂解方法，分离仔猪外周血白细胞（peripheralbloodleukocytescell，PBLC）。无菌采取21日龄SPF仔猪的前腔静脉血5mL加入到盛有EDTA-Na2抗凝剂（工作浓度0.2%）的50mL离心管，按照1:5加入无菌红细胞裂解液，混匀，室温静置5min，期间混匀几次，2000r/min离心10min，弃掉上清，如沉淀中有红细胞，再次加入红细胞裂解液，待细胞沉淀为纯白色，说明红细胞已裂解完全。细胞沉淀用8mL1×DMEM洗涤2次1500r/min离心10min，收集管底的白细胞，用2mL1×DMEM重悬细胞，取10μL细胞悬液，加入90μL0.5%的台盼蓝溶液混匀，计数并测定细胞活力，细胞活力应大于95%。2.2.7.3趋化实验为了进一步解析趋化因子在PEDV感染中的作用，将IPEC-J2细胞以1.5×105个细胞/孔铺于12孔细胞培养板；待细胞生长达90%汇合时，分别使用HBQY2016株和CV777株感染IPEC-J2细胞，具体将IPEC-J2细胞分PEDV感染组、趋化因子（MCP-1、CXCL9、CXCL13）siRNA干扰-PEDV感染组、siRNA阴性对照NC-PEDV感染组和空白对照组，共11个组，每组3个重复；PEDV感染组分别接种HBQY2016株和CV777株0.5MOI，感染后20h收集细胞上清液；将培养板置于水平离心机1500r/min离心10min，收取细胞上清转移至24孔Transwell下室，500μL/6个细胞/孔），置于37℃5%CO孔；上室内加入300μL仔猪PBLC（1×102培养孵育24h，吸去小室内液体，用棉签擦去小室内细胞，将Transwell培养板用水平离心机离心2000r/min离心10min，并将下室的培养基和细胞一并收于1.5mL离心管1500r/min离心10min，弃去上清，加入100μL的DMEM重悬细胞，应用FCM测定单核（CD14+）细胞、T亚群（Th、Tc和γδT等细胞）和CD19+B淋巴细胞的含量。26 3结果与分析3.1FQ-PCR标准曲线3.1.1趋化因子FQ-PCR标准曲线从仔猪回肠组织扩出TGF-β3、CXCL9、CXCL10和CXCL13以及管家基因β-actin的基因片段，纯化回收目的基因，使用NanoDrop2000测定浓度并计算拷贝数。用TE缓冲液将回收的已知拷贝数的趋化因子片段做8~10个倍比稀释梯度（103~1010copies/μL），进行FQ-PCR扩增，确定扩增条件和反应体系，从而获得了TGF-β3、CXCL9、CXCL10和CXCL13以及管家基因β-actin的FQ-PCR标准曲线和直线回归方程（图3-1~图3-5），曲线以浓度为横坐标，以反应的循环阈值（Ct值）为纵坐标，两者呈线性反比关系。以上趋化因子标准曲线经线性回归分析表明，相关系数均大于0.99，表明不同稀释度的目的片段的扩增与Ct值之间存在良好的线性关系，可根据标准曲线的方程计算待检样品的Cq值及拷贝数。图3-1β-actin实时荧光定量PCR标准曲线。Fig.3-1ThestandardcurvegraphaboutReal-timeFQ-PCRforβ-actin注：A：数据图；B：标准曲线图Note:A:Datagraph;B:Standardsgraph.27 图3-2CXCL9实时荧光定量PCR标准曲线Fig.3-2ThestandardcurvegraphaboutReal-timeFQ-PCRforCXCL9.注：A：数据图；B：标准曲线图A:Datagraph;B:Standardsgraph.图3-3CXCL10实时荧光定量PCR标准曲线Fig.3-3ThestandardcurvegraphReal-timeFQ-PCRforCXCL10注：A：数据图；B：标准曲线图A:Datagraph;B:Standardsgraph.28 图3-4CXCL13实时荧光定量PCR标准曲线Fig.3-4ThestandardcurvegraphaboutReal-timeFQ-PCRforCXCL13注：A：数据图；B：标准曲线图A:Datagraph;B:Standardsgraph.图3-5TGF-β3实时荧光定量PCR标准曲线Fig.3-5ThestandardcurvegraphaboutReal-timeFQ-PCRforTGF-β3注：A：数据图；B：标准曲线图A:Datagraph;B:Standardsgraph.29 3.1.2PEDVN基因FQ-PCR标准曲线将已知拷贝数的带有PEDVN基因的重组质粒用BufferTE做10-3~10-9（Copies/μL）倍梯度稀释，以稀释好样品的作为模板，进行PCR，以反应的Cq值为纵坐标，绘制标准曲线，得出回归方程。结果显示，回归方程的相关系数R=0.99，说明不同浓度质粒的扩增与Cq值存在良好的线性关系，可以用于相应基因的定量分析（图3-6）。图3-6PEDVN基因荧光定量PCR标准曲线的建立Fig.3-6TheestablishmentofstandardcurveaboutFQ-PCRforPEDVNgene注：A：数据图；B：标准曲线图Note:A:Datagraph;B:Standardsgraph3.2感染仔猪回肠组织中趋化因子差异表达基因3.2.1RNA的质量通过琼脂糖凝胶电泳检测所提取的仔猪回肠组织总RNA的完整性。电泳时样品中28S、18S条带清晰可见（图3-7）。结果显示除了样品K-5外，其他样品的28S:18S接近2:1，说明提取的总RNA的完整性良好，可用于下一步实验。重提样品K-5的RNA，再次电泳检测，也达到了进一步实验标准。30 图3-7总RNA电泳图Fig.3-7TheelectrophoresisimageoftotalRNA注：K表示对照组；I表示PEDV感染组Note:K,Controlgroup;I,PEDVinfectedgroup.3.2.2样品主成分分析对所检测的样品进行主成分分析（principlecomponentanalysis,PCA）。如图3-8所示，感染组距对照组较远且组内样本比较集中，说明两组差异明显且组内样品近似，重复性良好，实验数据可信度高，可用于进一步分析。图3-8样品主要成分分析Fig.3-8Principalcomponentanalysisofsample.注：K表示对照组；I表示PEDV感染组31 Note:K,Controlgroup;I,PEDVinfectedgroup.3.2.3火山图对芯片数据进行组间比较，将感染组与对照组的差异表达基因进行分群。通过计算差异倍数（Foldchange值）以及t检验得到的P值来筛选显著差异的基因。如图3-9所示，火山图（Volcanoplot）在同一平面内显示出与对照组（g1）与感染组（g2）之间有43603个基因mRNA表达量发生变化，其中上调基因23348个，下调基因20254个。差异表达基因（FlodChange≥2且P<0.05）共有1913个。g2VSg1volcanoplot图3-9回肠组织基因芯片检测火山图（3dpi）Fig.3-9Thevolcanodrawingofileumtissuesplotofgenechip(3dpi)注：g1表示仔猪回肠组织对照组；g2表示仔猪回肠组织PEDV感染组，纵坐标为-lg(P-value)值；横坐标为log2(FoldChange)Note:g1representsileumtissueofpigletsincontrolgroup,g2representsileumtissueofpigletsinPEDVinfectedgroup，Theordinateisthe-lg(P-value)value，Theabscissaislog2(FoldChange)3.2.4GO分析采用DAVIDBioinformaticsResources6.8对基因芯片检测差异基因进行GO功能注释和聚类分析。发现差异基因（P<0.05且FlodChange≥2）主要参与免疫反应、白细胞的趋化性、白细胞的趋化正向调控等生物学过程。其中趋化因子CCL2（MCP-1）、CCL4(MIP-1β)、IL-8(CXCL8)、CXCL9、CXCL10、CXCL13均参与免疫与炎症过程、趋化作用以及白细胞的趋化的正向调控等生物学过程条目（表3-1和图3-10）。32 表3-1回肠组织内趋化因子参与的生物过程中差异基因GO富集Table3-1GOenrichmentofdifferentialgeneinbiologicalprocessesinvolvedinchemokinesisinileumtissue富集检测生物过程基因名称EnrichmenttestGOIDBiologicalprocessGenename(Pvalueandfalsediscoveryrate)SLADQB1/PCD1B/TNFSF13B/FFAR2/CXCL9/STX11/TRAF3IP2/CCL8/CXCL13/IL1B2/IRF1/CCR7/CCL4/KLRK1/CXCL8/FCN2/AMCFII/IL12B/TGFBP=7.36E-09GO:0006955Immuneresponse1/IL1A/IL1B1/SFTPD/VNN1/CTLA4/CD59/TLR8/FDR=2.44E-05CD40/CCL2/LTF/APOA1/IL6/CYP3A29/TEC/CCR5/CCR1/CXCL2/C2/IL27/CXCL10/CCL3L1/CCL19/CD274/SNCA/CCR10CALCB/FFAR2/PDE6C/CXCL9/PBK/RARRES2/TSPAN2/CCL8/CXCL13/IL1B2/CCR7/CCL4/CHI3L1InflammatoryP=5.39E-13GO:0006954/CXCL8/AMCFII/CD163/IL12B/TGFB1/IL1A/GGTresponseFDR=1.79E-091/GP91PHOX/IL1B1/VNN1/CD59/TLR8/CCL2/APOA1/IL6/CCR5/CCR1/CXCR6/CXCL2/IL27CALCB/FFAR2/EFNB3/CXCL9/EFNA4/EPHA4/CCL8/CXCL13/CCR7/CCL4/CXCL8/AMCFII/TGFBP=4.13E-09GO:0006935ChemotaxisFDR=1.37E-051/SPP1/CCL2/FGF1/CCR5/CCR1/CXCR6/CXCL2/BMP7/CXCL10/CCL3L1/CCL19/CCR10/CMKLR1CALCB/FFAR2/CXCL9/CCL8/CXCL13/CCR7/CCP=4.62E-08GO:0030595LeukocytechemotaxisL4/CXCL8/AMCFII/SPP1/CCL2/CCR1/CXCL2/CXFDR=0.000153CL10/CMKLR1PositiveregulationofCXCL9/CXCL13/CCR7/CXCL8/AMCFII/CCL2/CCP=1.51E-06GO:0002690leukocytechemotaxisR1/CXCL2/CXCL10/CMKLR1FDR=0.004984TNFSF13B/FFAR2/CXCL9/CD83/CXCL13/IRF1/CPositiveregulationofCR7/KLRK1/CXCL8/FCN2/AMCF-II/IL12B/TGFBP=1.27E-06GO:0002684immunesystem1/VNN1/CD59/TLR8/CD40/CCL2/TEC/CAV1/CCRFDR=0.0042process1/CXCL2/C2/CXCL10/CD274/CMKLR1Chemokine-mediatedCXCL9/CCL8/CXCL13/CCL4/CXCL8/AMCFII/CCP=3.43E-06GO:0070098signalingpathwayL2/CXCL2FDR=0.01135833 图3-10回肠组织中差异表达基因GO功能富集分析Fig.3-10GOenrichmentanalysisofdifferentialexpressiongenesinileumtissue3.2.5KEGGPathway富集分析采用DAVIDBioinformaticsResources6.8对基因芯片检测筛选出的差异基因（即P<0.05且FlodChange≥2）进行KEGGPathway富集分析。在富集程度较高的前30个信号通路中涉及免疫和炎症相关、抗原递呈相关、类固醇的合成、氨基酸和核苷酸的代谢、三大营养物质的消化和吸收、疟疾、类风湿、破骨细胞因子等信号通路。与免疫和炎症相关的信号通路包括趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路、Toll-样受体信号通路、NOD-样受体信号通路等。其中以趋化因子信号通路和细胞因子与细胞因子受体相互作用信号通路富集程度最高，P值分别为1.65E-06和7.20E-05（表3-2和图3-13）。说明在PEDV感染仔猪过程中，宿主在抗PEDV感染过程中启动这些信号通路。34 表3-2PEDV激活的部分免疫信号通路及相关免疫分子Table3-2PartialimmunepathwaysandassociatedimmunemoleculesactivatedbyPEDV富集检测Kegg-通路基因名称EnrichmenttestPathwayIDPathwayGenename(Pvalueandfalsediscoveryrate)Toll-likereceptorLY96/CXCL9/CXCL8/IL12B/SPP1/IL1B1/CD40/CP=0.02812ssc04620signalingpathwayXCL10FDR=0.1622IKBKB/IKBKG/CHUK/RELA/PSTPIP1/NLRP3/MENOD-likereceptorP=0.001796ssc04621FV/IL1B2/CXCL8/HSP90AA1/IL18/TNF/IL1B1/HSsignalingpathwayFDR=0.0124P90B1/CASP1/CCL2/IL6SLA-3/SLA-DQB1/SLA-8/SLA-DRA/SLA-DMB/CAntigenprocessingTSS/SLADQA1/NFYB/IFI30/CALR/RFX5/LOC100P=0.000699ssc04612andpresentation519722/LOC106504143/CD8A/CD74/HSP90AA1/TFDR=0.005794NF/CREB1/PSME2/PSME3/CD4/SLA-DMANCF1/CXCL9/GNB5/CCL8/CXCL13/CCR7/CCL4/ChemokinesignalingP=1.65E-06ssc04062CXCL8/AMCFII/STAT2/CCL2/CCR5/CCR1/CXCRpathwayFDR=0.000266/CXCL2/CXCL10/CCL3L1/CCL19/CCR10TNFSF13B/CXCL9/CXCL13/CCR7/CCL4/BMPR1Cytokine-cytokineP=7.20E-05ssc04060B/CXCL8/IL12B/TGFB1/IL1A/IL1B1/CD40/CCL2/receptorinteractionFDR=0.00384CCR5/CCR1/CXCR6/CXCL10/CCL3L1/CCR10IntestinalimmuneSLA-DQB1/TNFSF13B/LOC396781/TGFB1/CD40P=0.001479ssc04620networkforIgAICOS/CCR10FDR=0.023666productionSLA-DQB1/SLA-DRA/SLA-DMB/RELA/IFNGR1/InflammatorybowelSLA-DQA1/RORC/STAT6/LOC100736717/IL1B2/P=0.004179ssc05321diseaseIL18/IL12B/TGFB1/TGFB2/TNF/IL1A/IL1B1/FDR=0.000436IL2RG/NFATC1/IL6/SLA-DMA/STAT335 图3-11回肠组织差异表达基因的KEGGPathway富集分析Fig.3-11DifferentialexpressiongenesinileumtissuesofKEGGPathwayenrichmentanalysis3.2.6趋化因子差异基因利用基因表达谱芯片技术检测仔猪感染PEDV后3d回肠组织的差异表达基因。差异基因涉及细胞代谢与合成、炎症反应、抗原递呈、趋化反应等。与对照组比，感染组中趋化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的差异倍数≥2（Foldchange≥2）且P<0.05（表3-3）。36 表3-3仔猪回肠组织的部分趋化因子mRNA表达水平Table3-3PartofchemokinesmRNAexpressionlevelinileumofpigletsGeneGenbankFoldProbeNameRegulationDescriptionSymbolAccessionchange"Susscrofachemokine(C-Cmotif)A-72-P675364MCP-INM-2142142.80upligand2(CCL2),mRNA[NM-214214]""Susscrofachemokine(C-Cmotif)A-72-P223332MIP-1βNM-2137797.18upligand4(CCL4),mRNA[NM-213779]"SusscrofatransforminggrowthA-72-P621617TGF-B3NM-2141981.63invariantfactor,beta3(TGFB3),mRNA[NM-214198]"Susscrofachemokine(C-X-CIL-8/A-72-P232367NM-2138673.63upmotif)ligand8(CXCL8),mRNACXCL8[NM-213867]"Susscrofachemokine(C-X-Cmotif)A-72-P442032CXCL9NM-0011142899.62upligand9(CXCL9),mRNA[NM-001114289]Susscrofachemokine(C-X-Cmotif)A-72-P509208CXCL10NM-0010086916.70upligand10(CXCL10),mRNA[NM-001008691]chemokine(C-X-Cmotif)ligand13A-72-P372543CXCL13AK-23724930.15up[ENSSSCT00000026571]3.3仔猪回肠组织中趋化因子mRNA的表达量3.3.1FQ-PCR检测FQ-PCR检测仔猪回肠组织中趋化因子mRNA的表达量。与对照组相比，感染组回肠组织中MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的表达水平上调，且差异倍数大于2倍、P<0.05（表3-4a、表3-4b、表3-5和图3-12）。37 表3-4a仔猪回肠组织中趋化因子mRNACq值和拷贝数Table3-4aCqvaluesandcopiesofchemokinesismRNAinileumtissueofpiglets趋化因子Cq值/对照组感染组ChemokinesisCopies/1.5μLControlgroupPEDVgroupCq值16.0214.9813.6112.7713.2317.55β-actinCopies（Unit10^5）4418742160277037500.161Cq值27.5025.9826.8422.9423.4725.85MCP-1Copies（Unit10^5）0.0030.0070.0050.0430.0320.008Cq值30.7028.0527.4824.4626.4630.57MIP-1βCopies（Unit10^5）0.0020.0080.0110.0750.0220.002Cq值29.9023.9324.6020.0720.4924.26IL-8Copies（Unit10^5）0.1595.803.87059.3046.104.75表3-4b仔猪回肠组织中趋化因子mRNACq值和拷贝数Table3-4bCqvaluesandcopiesofchemokinesismRNAinileumtissueofpiglets趋化因子Cq值/对照组感染组ChemokinCopies/1.5μLControlgroupPEDVgroupesisCq值18.6223.1321.9219.5717.0716.06β-actinCopies722500359208007038380020270003956000Cq值33.6433.3533.3631.3628.6427.99TGF-β3Copies87808726011401616Cq值28.3327.8128.9822.2820.0720.31CXCL9Copies15822163104667050263400227600Cq值33.7932.4931.5225.9922.5521.15CXCL10Copies91428121512573245Cq值32.8735.9036.9626.0421.6019.78CXCL13Copies32.8735.9036.9626.0421.6019.78表3-5仔猪回肠组织趋化因子mRNA差异表达水平及表达水平差异倍数（表达水平单位10^-5）Table3-5DifferentialexpressionlevelanditsmultipleexpressionlevelofchemokinesmRNAinileumtissueofpiglets(Uniteofexpressionlevel10^-5)组别趋化因子GroupsChemokin平均值平均值差异倍数对照组感染组esisAverageAverageFoldControlgroupPEDVgroupvaluevaluechangeMCP-10.700.850.210.591.550.844.972.454.18MIP-1β0.340.910.530.592.710.571.021.432.42TGF-β312.13225.19109.13115.4867.6956.2440.8554.930.98IL-836.1066417929321401230295021107.19CXCL9218.966021.711306.362515.6817470.0412994.575753.2912072.634.80CXCL101.2640.5135.9125.89316.5762.0182.03153.545.93CXCL1312.7049.0512.6324.791042.73229.95321.79531.4921.44注：差异表达水平：差异基因拷贝数与管家基因β-actin拷贝数的比值；表达差异倍数：感染组差异基因表达水平与对照组差异基因表达水平的比值。38 Note:Differentialgenesexpressionlevel:Theratioofdifferentialgenecopiestohousekeepinggeneβ-actincopies;Foldchange:Theratioofdifferentialgeneexpressionrateininfectiongrouptothatofcontrolgroup.图3-12仔猪回肠组织趋化因子mRNA差异表达水平Fig.3-12DifferentialexpressionlevelofchemokinesmRNAinileumofpiglets注：差异基因表达水平为：差异基因拷贝数与管家基因β-actin拷贝数的比值。Note:Differentialgenesexpressionlevel:Theratioofdifferentialgenecopiestohousekeepinggeneβ-actincopies.3.3.2FQ-PCR检测结果与表达谱芯片检测结果对比将仔猪回肠组织FQ-PCR检测结果与表达谱芯片检测结果进行对比，趋化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13差异倍数均大于2倍且P<0.05；TGF-β3差异倍数均小于2倍且P>0.05。由此说明，FQ-PCR检测结果和芯片结果相符（图3-13）。39 趋化因子Chemokines图3-13仔猪回肠的荧光定量PCR与基因芯片结果对比Fig.3-13ThecomparisonoffluorescentquantitativePCRandmicroarrayresultsinileumtissueofpiglets注：差异倍数：感染组差异基因表达水平与对照组差异基因表达水平的比值。Note:Foldchange:Theratioofdifferentialgeneexpressionlevelininfectiongrouptothatofcontrolgroup.3.4PEDV体外最佳感染细胞系的确定3.4.1病毒核酸载量按照0.5MOI的感染剂量用HBQY2016株和CV777弱毒株分别感染Vero细胞和IPEC-J2细胞，接毒后12h、24h、48h、72h和96h，分别提取病毒RNA，并反转录成cDNA，采用FQ-PCR检测不同时间病毒核酸的拷贝数。从接毒后12h到72h病毒核酸的拷贝数逐渐增加，在接毒后72h达到高峰，96h有所下降；接毒后不同时间，Vero细胞内PEDV核酸的拷贝数均高于IPEC-J2细胞内的拷贝数，说明PEDV可感染IPEC-J2细胞并在细胞内增殖，但不如在Vero细胞上增殖效果好（图3-14）。ABAB图3-14HBQY2016株和CV777株在Vero细胞在IPEC-J2细胞上的增殖动态Fig.3-14ProliferationofHBQY2016andCV777straininVerocellsandIPEC-J2cells40 注：A：PEDV感染Vero细胞；B：PEDV感染IPEC细胞Note:A:VerocellsinfectedwithPEDV;B:IPEC-J2infectedwithPEDV3.4.2病毒抗原以0.1MOI和0.5MOI两个不同剂量，用HBQY2016株和CV777株分别感染Vero细胞和IPEC-J2细胞。感染后12h，以0.5MOI的HBQY2016株感染的Vero和IPEC-J2细胞内可见微弱的荧光信号，以0.1MOI和0.5MOI的CV777株感染的Vero和IPEC-J2细胞内均可见微弱的荧光信号。感染后24h，两个毒株的荧光信号均强于12h，感染后48h细胞的荧光信号均最强（图3-15~图3-18）。Neg.Control12hpi24hpi48hpi0.1MOI0.5MOI图3.15HBQY2016株感染Vero细胞后的免疫荧光检测结果(200×)Fig.3-15ThedetectionresultsbyimmunoflourescenceassaywhenVerocellswereinfectedwithHBQY2016strain(200×)41 Neg.Control12hpi24hpi48hpi0.1MOI0.5MOI图3-16CV777株感染Vero细胞后的免疫荧光检测结果(200×)Fig.3-16ThedetectionresultsbyimmunoflourescenceassaywhenVerocellswereinfectedwithCV777strain(200×)42 Neg.Control12hpi24hpi48hpi0.1MOI0.1MOI图3.17HBQY2016株感染IPE-J2细胞后的免疫荧光检测结果(200×)Fig.3-17ThedetectionresultsbyimmunoflourescenceassaywhenIPEC-J2cellswereinfectedwithHBQY2016strain(200×)Neg.Control12hpi24hpi48hpi0.1MOI0.5MOI图3-18CV777株感染IPEC-J2细胞后的免疫荧光检测结果(200×)Fig.3-18ThedetectionresultsbyimmunoflourescenceassaywhenIPEC-J2cellswereinfectedwithCV777strain(200×)43 3.4.3TCID50采用IPMA方法测定HBQY2016株和CV777弱毒株在不同细胞上的TCID50，HBQY2016株和CV777株在Vero细胞上TCID5.6/mL和106.5/mL，在IPEC-J2细胞上TCID50分别50分别为10为105.1/mL和105.8/mL（图3-19）。图3-19HBQY2016株和CV777弱毒株Vero细胞和IPEC-J2细胞上的TCID50Fig.3-19TCID50ofHBQY2016strainandCV777strainculturedinVeroandIPEC-J2cell3.4.4趋化因子mRNA的表达水平琼脂糖凝胶电泳检测提取细胞总RNA的完整性，电泳可见28S、18S条带清晰，说明提取总RNA的完整性良好，可用于下步实验（图3-20）。与对照组比，HBQY2016株感染IPEC-J2后，趋化因子IL-8、MCP-1、MIP-1β、CXCL13表达差异显著（P<0.05），CV777株感染IPEC-J2后趋化因子IL-8、MCP-1、MIP-1β、CXCL9、CXCL10、CXCL13、TGF-β3表达差异显著（P<0.05）（表3-6、3-7和图3-21）。HBQY2016株感染Vero细胞后仅MCP-1表达差异极显著（P<0.01），CV777株感染Vero细胞后MIP-1β、MCP-1、TGF-β3表达差异极显著（P<0.01）（表3-8、3-9和图3-22）。12328S18S5S图3-20部分样品总RNA的电泳图Fig.3-20TheelectrophoresisimageofpartsamplesoftotalRNA44 表3-6PEDV感染IPEC-J2细胞后趋化因子与管家基因的Cq值和拷贝数的FQ-PCR检测结果Table3-6CqvaluesandcopiesofchemokinesandhousekeepinggeneinPEDV-infectedIPEC-J2byFQ-PCR组别Cq值/趋化因子GroupsCopies/Chemokines阴性对照组HBQY-PEDV感染组CV777-PEDV感染组LPS刺激组1.5μLNegtiveControlgroupHBQY-PEDVgroupCV777-PEDVgroupLPSgroupCq值15.8715.4515.7915.3514.9615.4114.9815.3416.0415.9315.0315.80B-actinCopies5950781550628500846150107800077115010645008402005342005719501027000624450Cq值32.1232.1832.9031.4332.5233.0031.1632.5431.6431.3331.8731.70MCP-1Copies535233844235974382886369Cq值33.9833.0432.6330.7930.1129.0929.4128.5528.7628.8029.9528.47MIP-1βCopies223444.4182216417429584754512525611Cq值33.2333.1534.4333.4234.2633.4431.0531.4531.6931.8032.8132.54TGF-β3Copies909345795079295236209196113152Cq值31.2331.6532.1929.4029.6231.2127.6227.8628.0824.2426.7427.12IL-8Copies7757412382097673462954923067541188Cq值26.2226.4526.7227.3425.3725.2126.3825.5724.5125.1825.5325.53CXCL9Copies300261219330519573272455898665580898Cq值33.4833.8432.8232.8934.1933.1029.8033.3630.4434.2329.7628.76CXCL10Copies2682243613482113071786125876315821433881Cq值31.4232.0429.9329.2129.3329.1529.0629.1129.1029.6329.5729.66CXCL13Copies48399915814616617516916912412411745 表3-7PEDV感染IPEC-J2细胞后趋化因子基因表达水平及基因表达差异倍数（表达水平单位10^-5）Table3-7ExpressionanddifferentialfoldchangesofchemotacticfactorgeneinPEDV-infectedIPEC-J2cell(Uniteofexpressionlevel10^-5)趋化因子组别基因表达水平平均值差异倍数ChemokinesGroupsGenesexpressionlevelAveragevalueFoldchangeHBQY-PEDV感染组3.1413.5411.109.264.77CV777-PEDV感染组18.3722.132.3314.277.21MCP-1LPS刺激组15.406.1311.1710.905.61阴性对照组2.072.611.141.94-HBQY-PEDV感染组21.5320.0854.1431.926.24CV777-PEDV感染组40.3069.57141.2483.7016.37MIP-1βLPS刺激组89.6151.1897.8579.5415.56阴性对照组3.824.437.075.11-HBQY-PEDV感染组9.414.6610.348.140.71CV777-PEDV感染组27.7828.1539.2231.722.76TGF-β3LPS刺激组34.3811.0924.4523.312.03阴性对照组15.1911.937.2911.47-HBQY-PEDV感染组28.1719.449.8819.162.13CV777-PEDV感染组68.9574.90102.8082.229.15IL-8LPS刺激组203.2773.44190.38155.6917.33阴性对照组12.967.416.568.98-HBQY-PEDV感染组39.0253.1767.3353.841.35CV777-PEDV感染组84.3654.2351.05116.302.94CXCL9LPS刺激组116.3087.5092.97105.582.65阴性对照组36.8433.4147.8439.61-HBQY-PEDV感染组24.9932.3439.9032.410.74CV777-PEDV感染组167.77149.73142.83153.443.56CXCL10LPS刺激组208.71621.51286.00286.006.53阴性对照组45.1028.7857.4443.77-HBQY-PEDV感染组18.7513.6321.6018.002.25CV777-PEDV感染组16.4620.1731.7621.762.72CXCL13LPS刺激组12.1418.8717.5917.592.20阴性对照组8.185.0210.777.99-注：差异基因表达水平：差异基因拷贝数与管家基因β-actin拷贝数的比值；差异倍数：感染组差异基因表达水平与对照组差异基因表达水平的比值。Note:Differentialgenesexpressionlevel:Theratioofdifferentialgenecopiestohousekeepinggeneβ-actincopies;Foldchange:Theratioofdifferentialgeneexpressionlevelininfectiongrouptothatofcontrolgroup.46 表3-8PEDV感染Vero细胞后趋化因子与管家基因的Cq值和拷贝数的FQ-PCR检测结果Table3-6CqvaluesandcopiesofchemokinesandhousekeepinggeneinPEDV-infectedVerobyFQ-PCR组别Cq值/趋化因子GroupsCopiesChemokines阴性对照组HBQY-PEDV感染组CV777-PEDV感染组LPS刺激组/1.5μLNegtiveControlgroupHBQY-PEDVgroupCV777-PEDVgroupLPSgroupCq值16.8916.9816.2516.2316.0916.0318.0418.2717.7316.1416.4716.93B-actinCopies306450290250467500472250517500540600145050124850177950500750416950300700Cq值37.7741.7339.7038.1840.0739.1032.9334.6333.832.432.5632.50MIP-1βCopies6135231124176153139146Cq值31.2329.930.5024.5924.2924.4022.8622.0522.45528.4328.2928.36MCP-1Copies491107930623458326080221314010581269293281Cq值35.5933.5834.5836.0835.0035.5434.3635.0434.2035.2034.2634.73TGF-β3Copies520134862381571310.47 表3-9PEDV感染Vero细胞后趋化因子基因表达水平及基因表达差异倍数（表达水平单位10^-5）Table3-9ExpressionanddifferentialfoldchangesofchemotacticfactorgeneinPEDV-infectedVerocell(Uniteofexpressionlevel10^-5)平均值趋化因子组别基因表达水平差异倍数AverageCytokinesGroupsGenesexpressionlevelFoldchangevalueHBQY-PEDV感染组648.39668.21603.03639.8827.17CV777-PEDV感染组5530.5110524.635946.057333.73311.38MCP-1LPS刺激组53.7070.2293.4072.443.15阴性对照组15.9237.8016.9523.55-HBQY-PEDV感染组1.050.310.610.660.028CV777-PEDV感染组77.1532.6642.9050.902.16MIP-1βLPS刺激组30.5933.4148.6437.551.59阴性对照组15.9237.8016.9523.55-HBQY-PEDV感染组0.851.541.111.170.32CV777-PEDV感染组15.556.238.5210.102.69TGF-β3LPS刺激组1.403.063.292.580.688阴性对照组1.796.762.693.75-注：差异基因表达水平：差异基因拷贝数与管家基因β-actin拷贝数的比值；差异倍数：感染组差异基因表达水平与对照组差异基因表达水平的比值。Note:Differentialgenesexpressionlevel:Theratioofdifferentialgenecopiestohousekeepinggeneβ-actincopies;Foldchange:Theratioofdifferentialgeneexpressionlevelininfectiongrouptothatofcontrolgroup.46 图3-21PEDV感染IPEC-J2细胞后趋化因子mRNA的表达水平Fig.3-21ExpressionlevelsofchemokinesmRNAinIPEC-J2infectedwithPEDV注：mRNA表达水平指差异基因拷贝数与管家基因β-actin拷贝数的比值。Note:mRNAexpressionsindicatedtheratioofdifferentialgenecopiestohousekeepinggeneβ-actincopies.图3-22PEDV感染Vero细胞后趋化因子mRNA的表达水平Fig.3-22ExpressionlevelsofchemokinesmRNAinVeroinfectedwithPEDV注：mRNA表达水平指差异基因拷贝数与管家基因β-actin拷贝数的比值。Note:mRNAexpressionsindicatedtheratioofdifferentialgenecopiestohousekeepinggeneβ-actincopies.3.4.5感染细胞上清中的趋化因子浓度采用ELISA方法检测HBQY2016株和CV777株PEDV分别感染IPEC-J2和Vero细胞后，细胞上清中的趋化因子浓度。与空白对照组比，HBQY2016株感染IPEC-J2细胞后，CXCL9、CXCL10、CXCL13差异显著（P<0.05），MIP-1β、MCP-1、IL-8差异极显著（P<0.01）；CV777感染IPEC-J2细胞后CXCL9、TGF-β3差异显著（P<0.05），MIP-1β、MCP-1、IL-8、CXCL10、CXCL13差异极显著（P<0.01）（表3-10和图3-23）。该结果与体内感染实验结果一致。HBQY2016株感染Vero细胞后，仅MCP-1差异显著（P<0.05），MIP-1β差异极显著（P<0.01）；CV777株感染Vero细胞后，仅检测到MIP-1β、MCP-1差异极显著（P<0.01）（表3-11和图3-23）。此结果与体内实验的结果有明显差别。49 上述结果表明，IPEC-J2适合作为PEDV感染机制研究的体外感染模型，而Vero细胞不适合。表3-10PEDV感染IPEC-J2细胞后趋化因子的表达水平（pg/mL）Table3-10ThechemokinesexpressionlevelsinIPEC-J2infectedwithPEDV(pg/mL)趋化因子阴性对照组HBQYPEDV感染组CV777PEDV感染组LPS刺激组ChemokinesisNegativecontrolHBQYPEDVCV777PEDVLPSMCP-19.196±0.50511.176±0.602A11.871±0.265B12.802±0.449CMIP-1β406.799±3.870472.322±21.315A553.610±24.447B608.451±22.927CTGF-β3667.396±10.467672.839±13.279720.291±6.921a730.147±25.253bIL-836.848±1.25448.299±1.254A56.195±1.838B47.227±0.499CCXCL977.080±5.01887.232±2.453a81.208±10.621b86.877±1.109cCXCL1090.604±2.459104.963±1.762a116.893±5.916B108.562±18.652cCXCL13652.625±35.222712.565±17.398a730.536±33.018B774.435±4.707C注：趋化因子表达水平为各实验组（HBQYPEDV感染组、CV777PEDV感染组和LPS刺激组）趋化因子水平平均值与阴性对照组趋化因子水平平均值的比值；与阴性对照组比，上标字母大写表示差异极显著（P<0.01），小写表示差异显著（P<0.05）Note:chemokinesexpressionlevels：TheratioofHBQYPEDVgroup、CV777PEDVgroupandLPSgrouptocontrolgroup;ComparedwithNegativecontrolgroup,Superscripts(majusculesorminuscules)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05）表3-11PEDV感染Vero细胞后趋化因子的表达水平（pg/mL）Table3-11ThechemokinesexpressionlevelsinVeroinfectedwithPEDV(pg/mL)趋化因子对照组HBQYPEDV感染组CV777PEDV感染组LPS刺激组chemokinesisControlgroupHBQYPEDVgroupCV777PEDVgroupLPSgroupMCP-18.566±0.1849.672±0.345a11.270±0.403B10.851±0.497CMIP-1β372.442±21.988455.725±11.161A463.442±19.639B505.106±15.554CTGF-β3741.613±29.177745.515±6.511744.863±27.189764.578±15.069aIL-832.153±2.45736.458±2.75933.304±1.74042.664±2.837BCXCL982.743±5.16387.342±1.90183.363±2.5990.850±3.290aCXCL1098.904±7.664101.668±2.078107.156±2.369124.877±0.647ACXCL13696.451±23.552740.632±27.188754.661±5.953741.464±32.295注：趋化因子表达水平为各实验组（HBQYPEDV感染组、CV777PEDV感染组和LPS刺激组）趋化因子水平平均值与阴性对照组趋化因子水平平均值的比值；与阴性对照组比，上标字母大写表示差异极显著（P<0.01），小写表示差异显著（P<0.05）Note:chemokinesexpressionlevels：TheratioofHBQYPEDVgroup、CV777PEDVgroupandLPSgrouptocontrolgroup;ComparedwithNegativecontrolgroup,Superscripts(majusculesorminuscules)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05）50 图3-23PEDV感染Vero和IPEC-J2细胞后趋化因子的表达水平Fig.3-23ThechemokinesexpressionlevelsinVeroandIPEC-J2cellsinfectedwithPEDV3.5MCP-1、CXCL9、CXCL13对白细胞的趋化作用3.5.1趋化因子高抑制活性siRNA将针对趋化因子MCP-1、CXCL9和CXCL13mRNA的siRNA分子转染IPEC-J2细胞后，再分别感染PEDVHBQY2016株和CV777弱毒株后20h，应用FQ-PCR检测趋化因子MCP-1、CXCL9、CXCL13mRNA表达量。结果分别转染siRNA分子MCP-1-69、CXCL9-153、CXCL13-156的细胞内MCP-1、CXCL9与CXCL13mRNA的表达水平显著低于没有转染siRNA的病毒感染对照组的表达水平，其中对HBQY2016株和CV777弱毒株感染细胞MCP-1、CXCL9与CXCL13mRNA表达的抑制率分别为74.41%、86.71%、73.27%和88.17%、65.5%、89.02%。表明MCP-1-69、CXCL9-153、CXCL13-156siRNA分别对靶基因具有良好的抑制效果（表3-12、3-13和图3-24）。同时应用ELISA检测细胞上清中趋化因子MCP-1、CXCL9、CXCL13的浓度。结果转染siRNA分子MCP-1-69、MCP-1-104、MCP-1-164后对HBQY2016株和CV777弱毒株感染细胞内MCP-1的抑制率分别为49.88%、26.46%、15.76%和55.70%、22.92%、29.86%；转染CXCL9-77、51 CXCL9-107、CXCL9-153后对HBQY2016株和CV777弱毒株感染细胞内CXCL9的抑制率分别为28.06%、30.32%、45.80%和14.56%、0%、46.24%；转染CXCL13-156、CXCL13-254、CXCL13-318后对HBQY2016株和CV777弱毒株感染细胞内CXCL13的抑制率分别为46.98%、18.07%、6%和50.00%、26.50%、42.73%、（表3-14、3-15和图3-25）。通过综合分析不同siRNA对相应趋化因子mRNA和蛋白的抑制率，可知MCP-1-69、CXCL9-153和CXCL13-156分别对MCP-1-69、CXCL9-153和CXCL13-156的干扰效果最好。表3-12转染siRNA后HBQY2016株感染IPEC-J2细胞内MCP-1、CXCL9、CXCL13mRNA的表达水平Table3-12mRNAexpressionlevelsofMCP-1、CXCL9、CXCL13inIPEC-J2infectedwithHBQY2016strainfollowingsiRNAtransfectionMCP-1CXCL9CXCL13组别Copies组别Copies组别CopiesGroups/1.5μLGroups/1.5μLGroups/1.5μL空白对照11±1.705a空白对照28±5.642A空白对照125±11.883aPEDV78±8.155PEDV176±4.850PEDV618±257.350脂质体+PEDV41±10.885脂质体+PEDV189±24.725脂质体+PEDV511±43.930NC+PEDV54±9.643NC+PEDV171±13.225NC+PEDV559±225.175MCP-69+PEDV22±7.228bCXCL9-77+PEDV133±8.550CXCL13-156+PEDV237±129.628bMCP-104+PEDV24±7.645cCXCL9-107+PEDV130±29.150CXCL13-254+PEDV378±183.350MCP-164+PEDV25±3.775dCXCL9-153+PEDV47±0.080BCXCL13-318+PEDV241±90.725注：与PEDV阳性对照组比，上标字母大写表示差异极显著（P<0.01），小写表示差异显著（P<0.05）Note:ComparedwithPEDVpositivecontrolgroup,Superscripts(majusculesorminuscules)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05）表3-13转染siRNA后CV777株感染IPEC-J2细胞内MCP-1、CXCL9、CXCL13mRNA的表达水平Table3-13mRNAexpressionlevelsofMCP-1、CXCL9、CXCL13inIPEC-J2infectedwithCV777strainfollowingsiRNAtransfectionMCP-1CXCL9CXCL13组别Copies组别Copies组别Copies空白对照11±1.705A空白对照32±12.665A空白对照125±11.883APEDV134±2.125PEDV235±66.235PEDV875±106.725脂质体+PEDV110±5.580脂质体+PEDV136±41.992脂质体+PEDV864±63.350NC+PEDV104±32.450NC+PEDV148±0.225NC+PEDV595±49.700MCP-69+PEDV22±9.995ACXCL9-77+PEDV130±0.025CXCL13-156+PEDV186±26.203BMCP-104+PEDV72±37.685CXCL9-107+PEDV148±11.150CXCL13-254+PEDV224±5.625CMCP-164+PEDV57±14.015bCXCL9-153+PEDV72±1.378BCXCL13-318+PEDV261±130.375D注：与阳性对照组比，上标字母大写表示差异极显著（P<0.01），小写表示差异显著（P<0.05）Note:ComparedwithPEDVpositivecontrolgroup,Superscripts(majusculesorminuscules)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05）52 图3-24CXCL9CXCL13MCP-1mRNA的表达量Fig.3-24mRNAexpressionlevelsofCXCL9CXCL13MCP-1表3-14转染siRNA后HBQY2016株感染IPEC-J2细胞MCP-1、CXCL9、CXCL13的表达水平Table3-14ExpressionlevelsofMCP-1、CXCL9、CXCL13inIPEC-J2infectedwithHBQY2016strainfollowingsiRNAtransfectionMCP-1CXCL9CXCL13趋化因子浓趋化因子浓趋化因子浓组别组别组别度（pg/mL）度（ng/mL）度（ng/mL）空白对照15.072±1.089空白对照1.550±0.116空白对照0.540±0.032PEDV18.110±1.161PEDV1.840±0.113PEDV0.623±0.038脂质体+PEDV17.455±0.948脂质体+PEDV1.816±0.044脂质体+PEDV0.619±0.011NC+PEDV17.698±0.704NC+PEDV1.860±0.108NC+PEDV0.610±0.007MCP-69+PEDV16.388±0.281CXCL9-77+PEDV1.773±0.066CXCL13-156+PEDV0.584±0.013MCP-104+PEDV17.003±0.897CXCL9-107+PEDV1.766±0.022CXCL13-254+PEDV0.608±0.031MCP-164+PEDV17.284±0.534CXCL9-153+PEDV1.718±0.025CXCL13-318+PEDV0.618±0.041表3-15转染siRNA后CV777株感染IPEC-J2细胞MCP-1、CXCL9、CXCL13的表达水平Table3-15TheexpressionlevelsofMCP-1、CXCL9、CXCL13inIPEC-J2infectedwithCV777strainfollowingsiRNAtransfectionMCP-1CXCL9CXCL13趋化因子浓趋化因子浓趋化因子浓组别组别组别度(g/mL)度（ng/mL）度（ng/mL）空白对照16.059±1.889空白对照1.550±0.061空白对照0.532±0.047PEDV18.672±1.445PEDV1.804±0.145PEDV0.649±0.050脂质体+PEDV18.530±0.211脂质体+PEDV1.821±0.063脂质体+PEDV0.631±0.019NC+PEDV18.450±0.632NC+PEDV1.803±0.066NC+PEDV0.614±0.036MCP-69+PEDV17.118±0.368CXCL9-77+PEDV1.767±0.132CXCL13-156+PEDV0.573±0.009MCP-104+PEDV17.902±0.333CXCL9-107+PEDV1.810±0.052CXCL13-254+PEDV0.618±0.032MCP-164+PEDV17.736±0.415CXCL9-153+PEDV1.686±0.051CXCL13-318+PEDV0.599±0.01553 图3-25趋化因子CXCL9CXCL13MCP-1的表达水平Fig.3-25ExpressionlevelsofchemokinsCXCL9CXCL13MCP-13.5.2MCP-1、CXCL9、CXCL13对仔猪外周血白细胞的趋化作用3.5.2.1PEDV感染细胞分泌的MCP-1对CD14+细胞具有趋化作用收集Transwell小室下室内的细胞，采用FCM测定白细胞的类型。HBQY2016株和CV777株感染IPEC-J2细胞阳性对照组的细胞下室内仔猪CD14+细胞个数显著高于空白对照组（P<0.05），分别上调752和2184个细胞。MCP-1-69siRNA-HBQY2016株感染组和MCP-1-69siRNA-CV777株感染组下室内CD14+细胞的个数显著低于PEDV感染组（P<0.05），分别下调400和1152个细胞。该结果表明HBQY2016株和CV777株PEDV分别感染IPEC-J2细胞后分泌的MCP-1均对仔猪外周血单核细胞具有显著趋化作用（表3-16和图3-27）。PEDVMCP-1-69NCBlank图3-26流式细胞术检测CD14+细胞Fig.3-26TheresultsofCD14+detectedbyFCM54 表3-16CD14+细胞个数Table3-16ThenumberofCD14+cells组别HBQY感染CV777感染GroupsHBQYgroupCV777group空白对照组175±23.517a175±23.517AControlgroupPEDV感染组747±53.6472359±70.922PEDVgroupNC转染组358±44.9462648±104.752NCgroupMCP-1-69转染组347±120.681b1496±38.421BMCP-1-69group注：与PEDV阳性对照组比，上标字母大写表示差异极显著（P<0.01），小写表示差异显著（P<0.05）Note:ComparedwithPEDVpositivecontrolgroup,Superscripts(majusculesorminuscules)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05）图3-27CD14+细胞个数Fig.3-27NumberofCD14+cells3.5.2.2PEDV感染细胞分泌的CXCL9对T细胞亚群具有趋化作用HBQY2016株和CV777株感染IPEC-J2细胞阳性对照组的下室内CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th、CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群分别上调381、283、972、293个细胞和3451、746、4147、1515个细胞，显著高于空白对照组（P<0.05）。与PEDV阳性对照组比，CXCL9-153siRNA-HBQY株感染组和CXCL9-153siRNA-CV777株感染组的下室内CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th、CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群个数显著降低(P<0.05)，分别下调677、258、718、207个细胞和2605、533、2729、949个细胞，均显著下调（P<0.05）。由此说明，PEDV感染IPEC-J2细胞分泌的CXCL9对仔猪外周血55 CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群含量具有显著调节作用（表3-17、表3-18和图3-30）。PEDVCXCL9-153+PEDV图3-28流式细胞术检测T细胞亚群Fig.3-28TheresultsofTcellssubsetsdetectedbyFCM表3-17HBQY2016株感染IPEC-J2细胞后分泌的CXCL9对T细胞亚群的趋化作用Table3-17CytotoxemiaofCXCL9onTcellsubsetssecretedbyIPEC-J2cellsinfectedwithHBQY2016strain组别空白对照PEDV感染NC转染CXCL9-153转染GroupsControlgroupPEDVgroupNCgroupCXCL9-153groupCD3+CD4-CD8-167±4.760a998±221.509415±88.958321±6.999a(γδT)CD3+CD4-CD8+37±11.26b320±53.887145±23.64062±17.466b(Tc)CD3+CD4+CD8-348±27.843c1320±147.373798±64.714602±63.163c(Th)CD3+CD4+CD8+192±3.841d485±89.892268±54.615278±33.759d(Tm)注：与PEDV阳性对照组比，上标字母大写表示差异极显著（P<0.01），小写表示差异显著（P<0.05）Note:ComparedwithPEDVpositivecontrolgroup,Superscripts(majusculesorminuscules)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05）56 表3-18HBQY2016株感染IPEC-J2细胞后分泌的CXCL9对T细胞亚群的趋化作用Table3-18CytotoxemiaofCXCL9onTcellsubsetssecretedbyIPEC-J2cellsinfectedwithHBQY2016strain组别空白对照PEDV感染NC转染CXCL9-153转染GroupsControlgroupPEDVgroupNCgroupCXCL9-153groupCD3+CD4-CD8-167±4.760a3618±57.5352512±303.7691013±17.789a(γδT)CD3+CD4-CD8+37±11.26B783±199.163481±144.020250±51.379B(Tc)CD3+CD4+CD8-348±27.843C4495±162.0802906±28.7571766±56.417C(Th)CD3+CD4+CD8+192±3.841D1707±149.8081133±79.191758±6.727D(Tm)注：与PEDV阳性对照组比，上标字母大写表示差异极显著（P<0.01），小写表示差异显著（P<0.05）Note:ComparedwithPEDVpositivecontrolgroup,Superscripts(majusculesorminuscules)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05）CD3+CD4-CD8-CD3+CD4-CD8+*4000*1500Blank**BlankPEDV**PEDV3000NC+PEDVNC+PEDV1000CXCL9-153+PEDV*CXCL9-153+PEDV2000***细细细细细细细细5001000NumberofcellsNunmberofcells00YYHBQCV777HBQCV777组组组组GroupsGroupsCD3+CD4+CD8-CD3+CD4+CD8+****5000**2000**BlankBlank4000PEDVPEDVNC+PEDV1500NC+PEDV3000*CXCL9-153+PEDVCXCL9-153+PEDV*1000*2000*细细细细细细细细NumberofcellsNumberofcells500100000YV777V777HBQCHBQYC组组组组GroupsGroups图3-29T细胞亚群细胞个数Fig.3-29ThenumberofcellsinTcellsubsets3.5.2.3PEDV感染细胞分泌的CXCL13对对CD19+B细胞具有趋化作用HBQY2016株和CV777株感染IPEC-J2细胞阳性对照组的下室内CD19+细胞的个数显著高于空白对照组（P<0.05），分别上调531和644个细胞。与PEDV阳性对照组比，CXCL13-156siRNA-HBQY株感染组和CXCL13-156siRNA-CV777株感染组的下室内CD19+细胞个数降低57 (P<0.05)，分别下调279和164个细胞。该结果表明HBQY2016株和CV777株分别感染IPEC-J2细胞后分泌的CXCL13对仔猪外周血CD19+B细胞具有趋化作用（表3-18和图3-30）。PEDVCXCL13-156NCBlank图3-30流式细胞术检测CD19+细胞Fig.3-30TheresultsofCD19+cellsdetectedbyFCM表3-19CD19+细胞个数Table3-19ThenumberofCD19+cells组别HBQY感染组CV777感染组GroupsHBQYgroupCV777group空白对照组206±22.067A206±22.067AControlgroupPEDV感染组737±71.652850±53.073PEDVgroupNC转染组641±71.4971054±93.240NCgroupCXCL13-156转染组458±22.808b686±21.185bCXCL13-156group注：与PEDV感染阳性对照组比，上标大写、小写字母分别表示差异极显著（P<0.01）和差异显著（P<0.05）Note:ComparedwithPEDVpositivecontrolgroup,Superscripts(majusculeorminuscule)indicatessignificantdifferences(P<0.01orP<0.05)betweengroups58 图3-31CD19+细胞个数Fig.3-31ThenumberofCD19+cells59 4讨论在本研究中我们首先应用基因芯片表达技术检测了PEDV强毒株感染仔猪回肠组织中的差异表达基因，初步明确了PEDV感染引起的肠道黏膜免疫应答中的差异表达基因，分析了可能参与反应的免疫分子和激活的信号通路。这些结果为下一步研究提供了重要信息，鉴于趋化因子在机体炎症反应和特异性免疫应答启动过程中的重要作用，我们进一步聚焦于趋化因子，开展了体外进一步验证。首先筛选了体外研究的细胞IPEC-J2，进而应用该细胞证明了PEDV感染过程中趋化因子MCP-1、CXCL9、CXCL13趋化的细胞种类。4.1PEDV感染仔猪后回肠组织中趋化因子mRNA的表达水平基因表达谱芯片可直接检测样品中mRNA的转录水平，同时分析上万个基因的表达变化，具有高通量、高精度及可平行对照研究的特点，已被广泛应用人类和动植物基因表达差异的研究，其研究结果能够为进一步探索相关基因的功能、疾病发病机制、机体免疫机制等提供重要线索。根据仔猪对PEDV易感性更高以及PEDV主要侵害小肠，引起小肠病理变化的致病特征，本研究用近年国内流行的PEDV强毒株感染21日龄仔猪，在感染后3d，通过基因表达谱芯片技术检测仔猪回肠组织中差异表达基因。研究发现PEDV引起1913个基因显著变化，进一步对差异表达基因进行GO富集分析，发现差异表达基因主要参与白细胞的趋化和白细胞趋化的正向调节、免疫反应和炎症反应等生物过程；通过Pathway分析，富集到与免疫相关的细胞信号通路有趋化因子信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用、Toll-样受体、NOD-样受体信号通路、小肠中IgA合成过程、肠炎性疾病、抗原加工与提呈信号通路，其中以趋化因子信号通路、细胞因子和细胞因子受体信号通路富集程度最高。同时考虑到趋化因子在联系天然免疫、获得性免疫应、抑制病毒感染和炎性反应等方面起着重要的作用，但不同病原微生物诱导宿主产生的趋化因子种类存在差异。因此，本研究进一步通过FQ-PCR验证了趋化因子（MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13）mRNA水平，其结果与芯片检测趋势基本相符。由此说明，在猪抗PEDV感染过程中上述趋化因子参与了应答反应，并发挥着重要作用。该结果为本实验下一步研究提供了重要依据。4.2PEDV体外感染最佳细胞系的选择PEDV引起的病变主要集中在猪的小肠组织，病毒主要在猪小肠上皮细胞内增殖。因此，小肠上皮细胞作为固有层免疫细胞与外环境间的天然屏障构成肠道的第一道免疫防线[92]。但目前在体外培养中，Vero细胞是分离培养PEDV的最适细胞系。1988年，HofmannM和WylerR首次在培养基中加入胰酶的Vero细胞上连续盲传培养，成功获得PEDV细胞毒[36]。此后，Vero细胞主要用于PEDV的分离鉴定与病毒的扩繁。尽管Vero细胞是干扰素缺陷型细胞[93-94]，但由于其适合PEDV培养，所以有的学者用该细胞来研究PEDV[95]。然而Vero细胞是非猪源的细胞系，显然用其来研究PEDV感染与天然免疫之间相互作用不是最佳选择，不能真正反应PEDV与本动60 物猪之间的感染-免疫机制。猪小肠上皮细胞系IPEC-J2是从仔猪出生后12h内未吃初乳的仔猪空肠组织中分离得到的非至瘤的细胞系[64]。相比啮齿类动物细胞系（例如IEC-6或IEC-18）更接近于人类，可以有效地模拟人类生理等。此外，对猪源的一些肠道传染病的研究也提供了便利，是目前公认研究肠粘膜免疫的体外模型[68,96]。已知肠上皮细胞具有转运sIgA功能，还可感知肠道局部环境的变化和刺激，表达及分泌多种天然免疫分子，如抗原提呈相关分子、炎性细胞因子、趋化因子等，通过信号转导诱导固有层中T细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和DC等免疫细胞至炎症部位，从而启动一系列的局部免疫防御反应来维持微环境的免疫稳定性[80]。PaloÂczO等人的研究表明，用10μg/mlLPS处理IPEC-J2细胞后6h检测到IL-6表达水平具有显著差异，处理后24h检测到IL-8表达差异显著，但TNF-α表达差异不显著[97]。WanLY等通过将四种镰刀菌毒素（DON，NIV，ZEA和FB1）单独或混合作用于IPEC-J2细胞，检测到IL-1α，IL-1β，IL-6，IL-8，TNF-α和MCP-1的转录水平上调[98]。LiuF1等研究表明，IPEC-J2细胞可被PRV有效感染，并刺激MUC3粘液蛋白的分泌，以及IL-6、IL-8和TLR2，TLR3和TLR9的表达[74]。IPEC-J2感染PEDV后，上调病原相关模式的受体TLR3、TLR7、TLR9、TLR10和RIG-I3^-20倍的表达，表明TLRs上调和病毒复制正相关。PEDV感染上调趋化因子CXCL10表达超过200倍，CXCL10大量表达将趋化大量炎性细胞至肠道粘膜组织[99]。另有学者用猪萨佩罗病毒（porcineSapelovirus,PSV）感染IPEC-J2细胞后利用基因表达谱芯片分析，富集到相关通路有Toll-样受体信号通路、NOD-样受信号通路、RIG-I-样信号通路、Jak-STAT信号通路、小肠中IgA合成过程、抗原加工与提呈信号通路等，该研究表明，IPEC-J2细胞系是研究局部肠黏膜对肠道细菌的和病毒的先天性免疫反应有效模型[100]。HuixingLin研究表明PEDV强、弱毒株分别感染IPEC-J2细胞可激活JAK-STAT信号通路和NF-κB通路，并检测到IL-6、IL-8、TNF-α、IL-1β、MCP-1和CCL5表达均显著上调[101]。为了选择体外研究PEDV感染免疫机制的合适细胞感染模型，本实验选用HBQY2016株和CV777弱毒株分别感染IPEC-J2细胞和Vero细胞，感染后通过观察细胞病变，测定病毒核酸水平、抗原信号以及病毒增殖滴度（TCID50），比较PEDV在两个细胞中的增殖情况。同时检测细胞表达趋化因子，并与体内感染实验趋化因子表达谱进行比较，综合分析哪个细胞更适合作为本次研究的感染模型。本实验中，HBQY2016强毒株和CV777弱毒株在IPEC-J2上均可增殖，但均未观察到明显的细胞病变。感染后的12h、24h、48h、72h，两个毒株的拷贝数逐渐上升，于感染后72h的病毒核酸拷贝数最高，96h时开始下降。两个病毒的增殖趋势一致，但HBQY2016株的增殖量低于CV777弱毒株，这可能是由于CV777弱毒株已经适应体外培养有关。虽然本实验中没有观察到明显的细胞病变，但有研究表明，PEDV感染后可导致小肠上皮细胞的跨上皮细胞电阻(TEER)下降，提示细胞间紧密连接受到破坏[94]。此外，有学者使用PEDV和TGEV分别感染IPEC-J2，间接免疫荧光检测，感染PEDV后48h细胞内病毒含量最高，并且PEDV在IPEC-J2细胞上增殖效果优于TGEV[102]。该增殖动态与我们的结果一致，说明PEDV可以感染IPEC-J2细胞，并在细胞上增殖。HBQY2016株和CV777株感染的Vero和IPEC-J2细胞内趋化因子mRNA和分泌到细胞外的趋化因子蛋白检测结果表明，病毒感染IPEC-J2细胞后诱导的趋化因子表达谱与体内实验结果相似，而Vero细胞表达的趋化因子与体内实验结果存在明显差异。IPEC-J2细胞更适合作为研究61 PEDV致病机制的体外感染细胞系。4.3趋化因子对仔猪外周血白细胞的趋化作用体内外感染实验证明，PEDV感染可以引起趋化因子MCP-1、CXCL9、CXCL13显著上调。MCP-1是上皮炎性基因程序的关键组成部分，与巨噬细胞激活和募集有关[103]，另有研究表明，这种趋化因子的产生可能有利于肠上皮细胞增殖和生存[104]。CXCL9对T淋巴细胞和肿瘤浸润淋巴细胞具有趋化作用。CXCL13具有趋化B细胞至炎症部位的作用[105]。为了探明MCP-1、CXCL9、CXCL13对仔猪白细胞的趋化作用，本实验针对MCP-1、CXCL9、CXCL13基因的不同区域分别设计合成了3条siRNA。首先从中选取对每个趋化因子干扰效果相对较好的siRNA分子。然后通过趋化实验，结合流式细胞术测定，MCP-1对仔猪外周血中CD14+强阳性的细胞（即单核-巨噬细胞）具有显著趋化作用；CXCL9对仔猪外周血中CD3+CD4+CD8-Th、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4-CD8-γδT和CD3+CD4+CD8+Tm细胞具有趋化作用；CXCL13对仔猪外周血中CD19+B细胞具有趋化作用。该结果除了证明本次体内试验结果外，还与本实验室前期的体内试验研究的部分结果相符，在前期PEDV野毒株感染仔猪实验中，发现CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4-CD8-γδTCD3+CD4+CD8-Th和CD3-CD4-CD8+细胞亚群的含量与对照组比显著上调，感染仔猪小肠各段单核-巨噬细胞增多[59]。由此说明，在PEDV在与宿主相互作用过程中趋化因子的分泌可募集白细胞迁移和组织浸润，参与炎症反应，进一步启动和调控适应性免疫应答发挥抗感染的作用。62 6结论6.1PEDV感染仔猪回肠组织中差异表达的基因主要参与白细胞的趋化和白细胞趋化的正向调控、免疫反应和炎症反应等生物学过程；参与感染免疫的细胞信号通路中以趋化因子信号通路、细胞因子和细胞因子受体信号通路差异最为显著。6.2PEDV感染引起趋化因子（MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13）的表达水平显著上调，提示趋化因子在宿主抗病毒感染过程中发挥着重要作用。6.3猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）适合作为PEDV研究的体外感染模型，能够模拟体内小肠上皮细胞的对PEDV做出免疫应答。6.4证明了MCP-1对猪外周血中CD14+阳性细胞，CXCL9对CD3+CD4+CD8-Th、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4-CD8-γδT和CD3+CD4+CD8-Tm细胞，CXCL13对CD19+细胞具有趋化作用。63 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在读期间发表的学术论文与获得的研究成果1孙立旦#,陈立功,周双海等.猪流行性腹泻病毒IgA抗体间接ELISA方法的建立[J].中国兽医学报，录用编号：2018020005。2参加研究项目国家自然基金：猪流行性腹泻病毒感染免疫及其关键免疫调节机制，项目编号：31372441.河北省科技厅：猪流行性腹泻和传染性胃肠炎纳米金免疫层析抗原检测技术研（17226613D-2）。71 作者简介姓名：孙立旦性别：女出生年月：1991.06籍贯：河北省邢台市求学经历：2010.9-2014.6就读于河北北方学院动物科技学院2014.6-2015.9就职于北京通和生泰比较医学研究所2015.9-2018.6就读于河北农业大学动物医学院攻读预防兽医学硕士学位研究方向：动物传染病与寄生虫病学72 致谢在此，由衷的感谢我的恩师宋勤叶教授，在我就读研究生的三年间给予了我莫大的帮助。从论文的选题、立题、技术路线乃至硕士论文的撰写，每一步都凝结着老师的智慧和辛勤的汗水。宋老师渊博的专业知识，严谨的治学态度，精益求精的工作作风和对科学的献身精神给我留下了刻骨铭心的印象，是我今后学习的榜样。在攻读硕士的三年间，导师不仅为我创造了优越的科研和学习环境，同时也在思想上、意志品质上给予了我谆谆教诲，使我终身受益。在此，谨向导师表示崇高的敬意和衷心的感谢！感谢预防兽医学科的袁万哲教授、孙继国教授、秦建华教授、王家鑫教授、张铁教授、赵月兰教授、包永占教授、范京惠副教授、左玉柱副教授、李丽敏副教授、李潭清老师在实验过程和论文修改中给予的指导与帮助。在就读的三年里得到了师姐姚作俊、王海敏、邸晶美，师兄郝达仁、张石磊，师妹赵雪、刘京、贾泽、王亚文，师弟王一鹏以及同窗好友刘立元、刘宝京、罗尚星、徐环叶的大力帮助，在此对他们表示衷心感谢！同时衷心感谢河北农业大学动物医学院、研究生院的领导和老师三年来在我学习生活上的关怀、支持和帮助。最后，向所有帮助过我的老师、同学、朋友还有我的家人表示最真诚的感谢!孙立旦2018年6月73 74 趋化因子在猪流行性腹泻病毒感染中的作用学科专业：预防兽医学研究方向：动物传染病学与寄生虫病学研究生：孙立旦指导教师：宋勤叶教授猪流行性腹泻(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDvirus,PEDV)引起猪的一种急性、高度接触性肠道传染病，该病以腹泻、呕吐、脱水、急性肠炎为主要临床特征。初生仔猪对PEDV的易感性最高，1周龄以内的哺乳仔猪发病率和死亡率可高达100%。近年来由于PED的广泛流行导致大批仔猪死亡，给养猪业造成了巨大的经济损失。但目前对其感染免疫机制的了解尚不深入，趋化因子是募集白细胞至感染部位的一类低分子量蛋白质，其趋化作用是炎症发生过程中重要的起始步骤，也是机体天然免疫功能的一个重要方面。本研究围绕PEDV感染免疫选题，通过体内外试验，探索趋化因子在PEDV感染中的作用，旨在为深入阐明PEDV的感染免疫机制提供科学依据。将6头21日龄健康仔猪随机分为PEDV感染组和空白对照组，每组3头。感染组每头口服接种1.56.6TCID×1050的PEDV强毒株，对照组接种等体积的细胞维持液。感染后3d提取回肠组织总RNA，应用基因表达谱芯片技术检测回肠组织差异表达基因，实时荧光定量PCR（FQ-PCR）检测回肠组织中趋化因子mRNA的表达水平。结果表明：感染猪回肠组织中差异表达基因（P<0.05、差异倍数≥2）共有1913个。通过基因本体（GO）分析，差异表达基因主要参与白细胞的迁移和白细胞趋化正向调控、免疫反应和炎症反应等生物学过程；KEGG-Pathway富集分析，参与免疫的细胞信号通路中以趋化因子信号通路、细胞因子和细胞因子受体信号通路差异最为显著。基因芯片和FQ-PCR均检测到趋化因子MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13的mRNA表达水平显著上调（P<0.05）。为了验证PEDV感染宿主细胞后趋化因子表达水平的变化，首先筛选PEDV体外感染免疫试验用5.6/mL）和CV777弱毒株PEDV（TCID6.5的最佳细胞系。使用HBQY2016强毒株（TCID50=1050=10/mL）分别感染Vero细胞和IPEC-J2细胞，接毒剂量分别为0.1MOI、0.5MOI，IFA检测接毒后12h、24h和48h病毒在细胞上的增殖。FQ-PCR检测病毒在细胞上的增值动态。结果接毒后72h，HBQY2016强毒株和CV777弱毒株在Vero细胞和IPEC-J2细胞上的核酸拷贝数均最高，感染后48h的荧光信号均最强，且0.5MOI均强于0.1MOI，但两个毒株在Vero细胞内的增殖量更高。说明PEDV强毒和弱毒株均可感染IPEC-J2细胞，并在IPEC-J2细胞上增殖。进而将IPEC-J2细胞分为HBQY2016强毒株感染组、CV777弱毒株感染组、LPS阳性对照组和阴性对照组。两个病毒感染组分别接种0.5MOI的HBQY2016强毒株和CV777弱毒株，阳性对照组用10μg/mL的LPS刺激，阴性对照组加入等体积的细胞维持液。感染后18~20h收集细胞及细胞上清。提取细胞总RNA，采用FQ-PCR方法检测细胞因子mRNA的表达水平，ELISA方法检测细胞上清中细胞因子浓度。结果表明，HBQY2016强毒株和CV777弱毒株分别感染IPEC-J2细胞后，IL-8、MCP-1、MIP-1β、CXCL9和CXCL13mRNA的表达水平差异显著（P<0.05），与动物感染实验检测结果相符。但HBQY2016强毒株感染Vero细胞后仅MCP-1表达差异极显著（P<0.01），而CV777弱毒株感染Vero细胞后MIP-1β、MCP-1、TGF-β3表达差异极显著（P<0.01），提示两个毒株分别感染Vero细胞后，趋化因子表达谱存在差异。ELISA检测HBQY2016强株和CV777弱毒株分别感染IPEC-J2细胞的细胞上清中MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13水平显著升高（P<0.05）。HBQY2016强株和CV777弱毒株分别感染Vero细胞的细胞上清中MCP-1、MIP-1β的mRNA表达水平显著上升（P<0.05）。根据PEDV感染细胞后趋化因子的分泌情况，可知IPEC-J2细胞分泌的趋化因子图谱与体内PEDV感染结果相似，更适合本实验的进一 步研究。为了进一步阐明趋化因子在PEDV感染中的作用，设计合成并筛选了分别对MCP-1、CXCL9和CXCL13具有高抑制活性的siRNA。将IPEC-J2细胞分为PEDV（HBQY2016株/CV777弱株感染阳性对照组、siRNA干扰-HBQY2016株/CV777弱株感染组、siRNA阴性（NC）-HBQY2016株/CV777弱株感染（NC-PEDV）对照组和阴性对照组。PEDV感染组接毒剂量均为0.5MOI，处理后18~20h收取细胞上清加入到Transwell小室的下室，将分离的SPF仔猪外周血白细胞加入上室。24h收取趋化进入下室的白细胞，应用流式细胞术分析白细胞亚群。结果表明：与病毒感染组相比，MCP-1干扰-HBQY2016株和CV777弱毒株感染组细胞下室内CD14+单核细胞的个数分别下降400个细胞（P<0.05）和1152个细胞（P<0.05）；CXCL9干扰-HBQY2016流行株和CV777经典毒株感染组的CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8+Tm细胞亚群的个数分别下调677、258、718、207个细胞和2605、533、2729、949个细胞，均差异显著（P<0.05）；CXCL13干扰-HBQY2016流行株和CV777经典毒株感染组的CD19+B细胞亚群的分别下降279个细胞（P<0.05）和164个细胞（P<0.05）。提示PEDV引起IPEC-J2细胞分泌的MCP-1、CXCL9和CXCL13分别对CD14+单核细胞、T（γδT、Tc、Th和Tm）细胞亚群以及B细胞具有趋化作用。上述体内外实验证明，PEDV强株感染仔猪后，引起小肠组织内至少1913个基因差异表达。差异表达基因主要参与白细胞的迁移和白细胞趋化正向调控、免疫反应和炎症反应等生物学过程；参与免疫的细胞信号通路中以趋化因子信号通路、细胞因子和细胞因子受体信号通路差异最为显著。猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）适合作为PEDV研究的体外感染模型，可以模拟体内小肠上皮细胞的免疫应答特征。PEDV感染引起MCP-1、MIP-1β、IL-8、CXCL9、CXCL10、CXCL13mRNA转录水平显著上调，提示趋化因子在宿主抗病毒感染过程中发挥着重要作用。证明了PEDV强毒株和弱毒株诱导IPEC-J2细胞分泌的MCP-1对猪外周血中CD14+阳性细胞具有趋化作用，CXCL9对CD3+CD4-CD8-γδT、CD3+CD4-CD8+Tc、CD3+CD4+CD8-Th和CD3+CD4+CD8-Tm细胞亚群具有趋化作用，CXCL13对CD19+细胞具有趋化作用。关键词：猪流行性腹泻病毒；仔猪；趋化因子；IPEC-J2细胞
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