缺陷假单胞菌HD13(Pseudomonas+diminuta)抗植物病原真菌及其活性组分的研究

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分类号：Q939.5密级：论文编号：2012021148贵州大学2016届硕士研究生学位论文缺陷假单胞菌HD13（Pseudomonasdiminuta）抗植物病原真菌及其活性组分的研究学科专业：微生物学研究方向：真菌学导师：康冀川教授研究生：唐远江中国﹒贵州﹒贵阳2016年5月 Studiesonanti-fungalpathogenfunctionfromadefectivestrainHD13ofPseudomonasdiminutaanditsbioactivecomponentsByYuan-JiangTangADissertationSubmittedtoGuizhouUniversityInPartialFulfillmentoftheRequirementforMaster’sDegreeofScienceSupervisedbyProfessorJi-ChuanKangCompletedinMay2016CommencementinJune2016GuizhouUniversity 贵州大学硕士研究生论文目录摘要.................................................................................................................................IAbstract........................................................................................................................III第一章前言..................................................................................................................51.1缺陷假单胞菌概况...........................................................................................51.2植物致病真菌病害...........................................................................................51.3微生物及其生物防治.......................................................................................61.3.1植物根际促生细菌(PGPR)....................................................................61.3.2生物防治.................................................................................................71.4假单胞菌假单胞菌产生的抗生素类型及其生防机制...................................81.4.1假单胞菌产生的抗生素类型.................................................................81.4.1.1吩嗪类...........................................................................................91.4.1.22,4-二乙酰藤黄酚........................................................................91.4.1.3硝吡咯菌素.................................................................................101.4.1.4藤黄绿脓菌素.............................................................................111.4.1.5环状脂多肽.................................................................................121.4.1.6其它抗生素.................................................................................121.4.2假单胞菌产生抗生素的特点...............................................................121.4.3抗生素的作用机制...............................................................................131.4.3.1作用于细胞膜.............................................................................131.4.3.2抑制细胞壁的合成.....................................................................131.4.3.3作用于蛋白质合成系统.............................................................141.4.3.4抑制核酸的形成.........................................................................141.4.3.5干扰细胞能量代谢和电子传递体系.........................................141.5抗生素的提取分离方法.................................................................................151.5.1有效成分分离原理...............................................................................151.5.2发酵液的预处理...................................................................................161.5.3抗生素分离纯化技术...........................................................................17 贵州大学硕士研究生论文1.5.3.1萃取法.........................................................................................171.5.3.2色谱法.........................................................................................171.5.3.3吸附法.........................................................................................171.5.4纯化.......................................................................................................181.6论文设计思想.................................................................................................191.6.1立体依据...............................................................................................191.6.2研究内容...............................................................................................20第二章材料与方法....................................................................................................212.1供试材料.........................................................................................................212.1.1菌种.......................................................................................................212.1.2主要药品和试剂...................................................................................222.1.3主要仪器...............................................................................................222.1.4主要培养基...........................................................................................232.2实验方法.........................................................................................................232.2.1主要培养基的优化...............................................................................232.2.1.1菌株活化.....................................................................................232.2.1.2菌株HD13对不同植物病原真菌抗菌活性的影响.................232.2.1.3初始培养基的筛选.....................................................................232.2.1.4最佳碳源的筛选.........................................................................242.2.1.5最佳氮源的筛选.........................................................................242.2.1.6无机盐对抑菌活性的影响.........................................................242.2.1.7K2HPO4与抑菌活性..................................................................242.2.1.8氯化钠与抑菌活性....................................................................252.2.1.9发酵培养基主要成分的正交试验.............................................252.2.2培养条件的优化...................................................................................252.2.2.1培养基初始pH值的考察..........................................................252.2.2.2接种量对抑菌活性的影响.........................................................252.2.2.3菌株HD13最佳吸收波长的测定.............................................262.2.2.4菌株HD13最佳发酵时间的测定.............................................26 贵州大学硕士研究生论文2.2.2.5不同培养方式的考察.................................................................262.2.3发酵液抑菌活性的稳定研究...............................................................262.2.3.1分泌类型的检验.........................................................................262.2.3.2发酵液热稳定性的考察.............................................................262.2.3.3pH对发酵液抑菌活性的影响...................................................272.2.3.4不同硫酸铵饱和度对发酵液抑菌活性的影响.........................272.2.3.5紫外光对发酵液抑菌活性的影响.............................................272.2.3.6储存时间对发酵液抑菌活性的影响.........................................272.2.3.7不同浓度发酵液对抑菌活性的影响.........................................272.2.3.8发酵液OD值与生物量的关系.................................................272.2.3.9OD值与发酵产物抑菌活性的关系..........................................282.2.4活性组分的分离纯化...........................................................................282.2.4.1技术路线.....................................................................................282.2.4.2发酵产物的累积.........................................................................292.2.4.3不同有机试萃取发酵液的活性.................................................302.2.4.4提取物效价的测定.....................................................................302.2.4.5硅胶柱层析分离.........................................................................302.2.4.6葡聚糖凝胶LH-20分离............................................................312.2.4.7活性组分的TLC层析...............................................................322.2.4.8活性组分的HPLC检测............................................................322.2.4.9活性组分及其抑菌活性的初步分析.........................................322.2.5组分A抗植物病原真菌的活性初探..................................................332.2.5.1组分A对不同植物病原真菌的抑菌活性................................332.2.5.2组分A水稻纹枯病菌丝体形态的影响....................................332.2.5.3水稻纹枯病菌丝体生长曲线的确定.........................................332.2.5.4组分A对水稻纹枯病菌丝体生长的影响................................332.2.5.5组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞壁的影响............................342.2.5.6组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞膜的影响............................342.2.5.7组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞核DNA的影响.................35 贵州大学硕士研究生论文2.2.6菌株HD13抑菌活性的稳定遗传.......................................................362.2.6.1菌株HD13传代培养对抑菌活性的影响.................................362.2.6.2菌株HD13传代培养对目标物质的影响.................................36第三章结果与分析....................................................................................................373.1主要培养基的优化.........................................................................................373.1.1菌株HD13对不同植物病原真菌抗菌活性的影响...........................373.1.2初始培养基的筛选...............................................................................373.1.3最佳碳源的筛选...................................................................................383.1.4最佳氮源的筛选...................................................................................383.1.5无机盐对抑菌活性的影响...................................................................393.1.6K2HPO4与抑菌活性............................................................................403.1.7氯化钠与抑菌活性...............................................................................403.1.8发酵培养基主要成分的正交试验.......................................................413.2发酵条件的优化.............................................................................................423.2.1培养基初始pH值的考察....................................................................423.2.2接种量对抑菌活性的影响...................................................................433.2.3菌株HD13最佳吸收波长的测定.......................................................443.2.4菌株HD13最佳发酵时间的测定.......................................................443.2.5不同培养方式的考察...........................................................................453.3发酵液抑菌活性的稳定研究.........................................................................463.3.1分泌类型的检验...................................................................................463.3.2发酵液热稳定性的考察.......................................................................463.3.3pH值对发酵液稳定性的影响.............................................................473.3.4不同饱和度硫酸铵对发酵液抑菌活性的影响...................................483.3.5紫外光对发酵液抑菌活性的影响.......................................................483.3.6储存时间对发酵液抑菌活性的影响...................................................493.3.7不同浓度发酵液对抑菌活性的影响...................................................503.3.8发酵液OD值与生物量和抑菌活性的关系.......................................503.3.8.1OD值与生物量的关系..............................................................50 贵州大学硕士研究生论文3.3.8.2OD值与抗菌活性的关系..........................................................513.4活性组分的分离纯化.....................................................................................523.4.1不同有机试剂萃取发酵物后的抑菌活性...........................................523.4.2提取物效价的测定...............................................................................533.4.3硅胶柱层析...........................................................................................533.4.4分子筛层析...........................................................................................543.4.5活性组分的分析...................................................................................543.4.5.1活性组分的处理.........................................................................543.4.5.2活性组分的TLC层析...............................................................553.4.5.3活性组分的HPLC检测............................................................553.4.5.4活性组分的初步分析.................................................................563.4.5.5组分的抑菌活性评价.................................................................573.5组分A抗植物病原真菌的活性初探............................................................573.5.1组分A对不同植物病原真菌的抑菌活性..........................................573.5.2组分A水稻纹枯病菌丝体形态的影响..............................................583.5.3水稻纹枯病菌丝体生长曲线的确定...................................................593.5.4组分A对水稻纹枯病菌丝体生长的影响..........................................603.5.5组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞壁的影响......................................603.5.6组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞膜的影响......................................623.5.7组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞核DNA的影响...........................633.6菌株HD13抑菌活性的稳定遗传.................................................................643.6.1菌株HD13传代培养对抑菌活性的影响...........................................643.6.2菌株HD13传代培养对目标物质的影响...........................................64第四章小结与讨论....................................................................................................664.1发酵条件的优化............................................................................................664.2发酵液抑菌活性的稳定研究.........................................................................674.3活性组分的分离纯化.....................................................................................684.4组分A抗植物病原真菌的活性初探............................................................684.5菌株HD13抑菌活性的稳定遗传.................................................................69 贵州大学硕士研究生论文第五章结论与展望....................................................................................................715.1结论.................................................................................................................715.2展望.................................................................................................................72参考文献......................................................................................................................73附录..............................................................................................................................82致谢..............................................................................................................................83 贵州大学硕士研究生论文缺陷假单胞菌HD13（Pseudomonasdiminuta）抗植物病原真菌及其活性组分的研究摘要随着人们对植物保护和可持续农业观念的不断加强，开发无污染、无公害的生物农药并应用于农业生产显得尤为重要，所以生防微生物抗植物病原菌的研究已成为一大热点。生防细菌种类繁多，分布广泛，是各种天然活性产物的重要来源途径。缺陷假单胞菌PseudomonasdiminutaHD13是贵州大学生化工程中心真菌室从微生物菌剂中分离得到的一种拮抗细菌，本实验以该菌株为材料，初步对菌株HD13抑菌稳定性以及其抑菌机理进行了研究。采用菌饼法，得知菌株HD13对几种植物病原真菌具有广谱抑菌活性，其中对水稻纹枯病、烟草黑胫病的抑制效果最好；通过单因素试验和正交试验，获得HD13菌株最佳培养基成分为：蔗糖20.0g/L、牛肉膏7.0g/L、氯化钠2.0g/L、K2HPO44.0g/L；菌株HD13的最佳吸收波长是460nm；对其发酵条件优化表明，把菌株HD13的培养基初始调节为中性，接种量为8%，在30℃下110r/min培养4.5d，其抑菌效果最好，但摇床培养3d再静置培养15d，该培养方式更有利于发酵滤液中抗菌物质产生。菌株HD13的抗菌活性物质主要是胞外物，理化特性分析结果表明，发酵液稳定性高，对热、酸碱度紫光均不敏感，能长时间储存稳定，用50％~90％硫酸铵处理后，沉淀部分有较强的抑菌活性。初步探讨了发酵液OD值与生物量变化和抑菌活性的关系，建立了OD值与生物量变化和抑菌活性变化的直线回归方程：OD值与菌液中活菌数（y）：y＝1.5856x＋0.0605，R²＝0.9919；OD值与菌液湿重（y）：y＝7.2232x＋1.0802，R²＝0.9919；OD值与菌液干重（y）：y＝0.951x＋0.0722，R²＝0.9158；OD值与病原真菌抑制率（y）：y＝84.166x-3.9601，R²=0.9482。缺陷假单胞菌HD13发酵经过浓缩，正丁醇萃取所得粗提物的毒力回归方程为y2=0.66x+5.01，R=0.95，IC50为1.25g/L。提取物分离纯化后得到两种具有强烈抑制水稻纹枯病的活性组分A、B，其中组分A的成分较单一，初步分析表明，组分A主要是脂肽或蛋白质类物质，组分B包含小分子物质。I 贵州大学硕士研究生论文抑菌实验表明，组分A对4种植物病原真菌具有一定的抑制效果，其中对水稻纹枯病的抑制效果最好；组分A的IC50值为124μg/mL，MFC值是215μg/mL；组分A对水稻纹枯病菌丝形态具有致畸作用，可以破坏病原真菌细胞壁完整性和增大膜系统通透性；采用凝胶阻滞实验表明，组分A可与水稻纹枯病DNA在体外非特异性结合，说明组分A不仅作用于细胞质膜并且还可能作用于胞内其它目标物质。菌株连续培养7代后，其抑菌活性有所降低，并且产生本实验分离的主要物质不稳定，表明菌株连续培养多次后，抑菌活性以及产物受到明显影响。关键词：抗菌活性；发酵工艺；稳定性；分离纯化；机理II 贵州大学硕士研究生论文Studiesonanti-fungalpathogenfunctionfromadefectivestrainHD13ofPseudomonasdiminutaanditsbioactivecomponentsAbstractWiththeincreasingawarenessofplantprotectionandsustainableagriculture,itisveryimportanttodeveloppollution-freeandnuisance-freebiologicalpesticides.Therefore,thestudyonbacteriaproducingantibioticshasbeenahottopic.Biocontrolbacteriaarediverseandwidelydistributed,whicharevitalsourcesformanykindsofnaturalproducts.PseudomonasdiminutaHD13isanantagonisticbacterialstrainisolatedfrommicrobialagentsbythefungalresearchteamofBiochemicalEngineeringCenterofGuizhouProvince.ThestudypreliminarilyexploredtheantifungalstabilityandmechanismofHD13.HD13showedbroad-spectrumantibacterialactivityinconfrontationexperiment.ThebestinhibitoryeffectsareonThanatephoruscucumeris(A.BFrank)DonkandPhytophthoranicotianaeBredadeHaan.Throughsingle-factortestandorthogonalexperiment,thebestmediumcomponentsforHD13consistof:sucrose20.0g/L,beefextracts7.0g/L,NaCl2.0g/L,K2HPO44.0g/L.TheoptimumabsorbwavelengthforHD13is460nm.Theoptimalfermentationconditionresultsindicatethattheinhibitoryeffectcanbethebestwhenkeepingprimaryalkalinityacidityneutral,inoculationquantityis8%,inoculatingfor4.5dayswith110r/minunder30℃.Itisbetterfortheaccumulationofantifungalcompoundswhenshakingcultivationfor3daysandthenstaticculturefor15days.TheantifungalcompoundsofHD13meanlyconcentrateinextracellularsubstances,whichfermentationliquidholdshighstability,insensitivetohotandalkalinity,againstUVirradiation,storagetimeisstable.Theinhibitoryactivityisstrongerwhenprecipitatingitwith50%-90%ammoniumsulfate.ThestudypreliminarilyexploredtherelationshipbetweenODvalueinfermentationliquidandinhibitoryactivity.TheIII 贵州大学硕士研究生论文linearregressionequationofODvalueandtheamountoflivebacteria(y)is:y＝1.5856x＋0.0605，R²＝0.9919;ODvalueandwetweight(y):y＝7.2232x＋1.0802，R²＝0.9919;ODvalueanddryweight(y):y＝0.951x＋0.0722，R²＝0.9158;ODvalueandinhibitoryratestofungalpathogen(y):y＝84.166x¬-3.9601，R²=0.9482。Thelinearregressionequationofthen-butanolextractsofHD13fermentationliquidandvirulencetoThanatephoruscucumeris(A.BFrank)Donkis:y=0.66x+25.01，R=0.95,IC50is1.25g/L.Theantifungalextractsareisolatedintotwofractions:AandB.Throughprimaryanalysis,fractionAisrelativelysingular,whichmaybelipopeptideorprotein,Bcontainsmallmolecules.TheinhibitoryresultshowedthatfractionAhadcertaininhibitoryeffecttofourplantpathogensespeciallytoThanatephoruscucumeris(A.BFrank)Donk,whichIC50was124μg/mL,MFCvaluewas215μg/mL.FractionAcouldleadtoteratogenicmorphologyinThanatephoruscucumeris(A.BFrank)Donk,whichdestroyedtheintegrityoffungalpathogencellwallandincreasedthepermeabilityofmembranesystem.ThegelshiftassaydemonstratedthatfractionAcouldcombinenon-specificallywiththeDNAofThanatephoruscucumeris(A.BFrank)Donk,whichmanifestedthatfractionAcouldnotonlytakeeffectonmembranesystembutalsotargetotherintracellularsubstances.After7generation,theinhibitoryratedecreasedandtargetcompoundswerenotstable,whichrevealedthatthereareprobablymanykindsofbioactivecompoundsproducedbythestrainHD13.Keywords:antifungalactivity;fermentation;stability;isolated;mechanismIV 贵州大学硕士研究生论文第一章前言1.1缺陷假单胞菌概况根据《伯杰细菌鉴定手册》LippincottWilliams&Wilkins.1994），假单胞属于假单胞杆菌科，假单胞杆菌属。假单胞菌属于球菌类型，是一种常见的革兰氏阴性好氧杆菌，该类群种类繁多，在生产实践中具有重要作用的有5个科，20个属。假单胞菌的一个共同特性是它们能够利用多种有机物，为自身提供碳源和能源。假单胞菌分步广泛，丰富资源，该微生物类群能有效防治由植物病原真菌引起的病害，在植物病害的生物防治方面具有重要的研究价值。1.2植物致病真菌病害植物病害中最重要的一类是真菌病害，约3万种，能占到整个植物病害的80％以上，导致发展中国家的农作物损失超过了12%(AgriosG,1997.Al-RezaSMetal.2010)。植物主要的病害有纹枯病、稻疫病、白粉病、灰霉病、黑胫病和赤霉病等都由真菌引起，如水稻纹枯病、水稻稻疫病、小麦白粉病、小麦赤霉病、烟草黑胫病和玉米黑粉病等不同作物真菌病，这严重影响农作物生产。历史上由真菌引起的植物流行病害危害了许多国家，如1943年，孟加拉流行的稻胡麻斑病引起饥慌，死亡人数超过200万人；1970年，美国流行的玉米腐烂病，某些地区损失高达50%~100%，约40亿美元(RichardN.Srange,2006)。真菌流行病害也影响我国农业生长：1950年我国北方的小麦产量因小麦锈病的侵害而减少60亿千克；1952年真菌病害致使棉籽的产量减少800万千克。真菌既危害生长期的作物，又危害采摘后的作物产品(FernándezAceroFJetal,2011)，如植物的根和其它部位很容易受到镰刀菌属感染，灰葡萄孢菌不仅能引起200多种植物的绿色组织病变而且可以使储存中的水果变质。中国作为一个农业大国，农业是解决人民生活的基础产业，也是我国的第一大产业，但一系列的农业病害使我国的农业生产构成遭受到很大的威胁，尤其是病原真菌引起的植物病害，它能严重影响农作物的稳产、高产、优产，对我国人民生活和经济发展造成了巨大的影响。因5 贵州大学硕士研究生论文此，如何使防治植物真菌病害显得更为重要。1.3微生物及其生物防治1.3.1植物根际促生细菌(PGPR)根际细菌(plantgrowthpromotingrhizosphere,PGPR)(BurrTJ,1984)是当前农业微生物的研究热点之一，植物根际土壤中存在着两大类促进植物生长的根际细菌：根际自生细菌和共生细菌。它们大部分分布于伯克次氏菌(Burkholderia)，芽胞杆菌(Bacillus)，醋杆菌属(Acetobacter)，固氮螺菌(Azospirillum)，固氮菌属(Azotobacter)和假单胞杆菌(Pseudomonas)等种属中。这些促生细菌主要通过间接和直接的促生作用影响植物的生长，间接促生作用是指一些细菌能减轻甚至避免对一种或多种病原微生物的有害作用，直接促生作用是指PGPR能合成直接供植物利用的某些化合物，并且这些化合物还能有助于植物从环境中吸收有益的营养物。PGPR主要分泌抗病原物质，抑制土壤中植物病原菌的生长繁殖，进而控制植物病害发生。PGPR的生防机制主要有以下几种（LucyM,2004;VesseyKJ,2003）：(1)分泌铁载体；(2)产生抗病物质；(3)多种植物在PGPR的诱导下，可以产生针对对病原微生物的系统抗性；(4)通过竞争，PGPR与病原菌争夺根表面的营养物质以及适宜的生态；(6)PGPR合成对细胞有水解作用的氢氰酸，萎焉酸，分泌酶类，破坏真菌细胞。根际生态中PGPR的主要作用模式图如下（HaasD,2005）。6 贵州大学硕士研究生论文图1植物、土壤、病原菌以及PGPR间的关系Figure1Interactionsbetweenbiocontrolplantgrowth-promotingrhizobacteria(PGPR),plants,pathogensandsoil.1.3.2生物防治利用有益微生物和微生物代谢产物对植物病害进行有效防治，是微生物防治的主要技术与方法（邱德文，2007），该方法主要向被破坏了的植物自然生态系中引入对有益于植物的外源拮抗菌，或者调节环境促使自然的有益微生物群体增长，使其表现出生防活性，通过微生物之间的相互作用达到防病效果(MathreDE,1999)。7 贵州大学硕士研究生论文长期以来，化学防治一直在植物保护中占有重要地位，特别是有机杀虫剂、杀菌剂的问世给植物保护带来了巨大的变化，但要注意的是化学农药长期大量使用已经出现了一系列的副作用，农药引起的中毒问题已经引起重视，据不完全统计，已知农药中毒的事件约为3000万件以上，特别是农副产品中的农药残留问题(张连第，1977)。同时有许多的问题也日益凸显，主要表现为抗药性问题的日益严重、现有农药毒性过高、农药残留产品令人关注，农药的实用技术急需改进等许多问题(王光亮等，2004)。因此，人们竭力寻求其它安全有效的植物病害控制新途径，微生物防治正日趋受到重视。生防微生物的应用，是植物病虫害综合治理的重要手段，是保护生态环境，实现农业可持续发展的重要保证。目前研究较多的生防细菌主要有假单胞杆菌(Pseudomonas.spp.)、土壤放射杆菌(Agrobacteriumradiobacter)、芽孢杆菌(Bacillus.spp.)等(ThomashowLS,1995)。1.4假单胞菌假单胞菌产生的抗生素类型及其生防机制1.4.1假单胞菌产生的抗生素类型微生物在发酵过程中，抗生素是最重要、应用最为广泛的次生代谢产物。抗生素不仅可以使用于植物病原微生物的生物防治，还可以对人类和动物的相关疾病进行化学治疗。PGPR能通过合次级代谢产物成抗生素以及合成抗生素的前体化合物等生防因子，抑制植物病原菌的生长、促进植物生长。拮抗微生物产生的抗生素是一个重要的生防因子，在抑制各种土壤植物病原中起着关键的作用。假单胞菌Psewcfomonas专性需氧，在疏松的土壤及植物根系中具有较多株系，可在植物根系内部建立种群抑制其它微生物的生长，其次级代谢产物对其他微生物具有抑制作用。Burr等(1978)报道荧光假单胞菌(P.fluorescens)对甜菜、马铃薯等作物具有增产作用；Weller等(1988)通过种子包衣的处理方法，利用焚光假单胞菌(P.fluorvsccns:)防治小麦全蚀病；Thomasshow等(1990)利用恶臭假单胞菌抑制镰刀菌厚垣孢子的萌发；王远山等(2002)报道绿针假单胞菌(Rchlororaphis)对烟草疫霉菌丝体及游动孢子有抑制作用。此外假单胞菌属对棉花幼苗粹倒病、水稻鞘腐病、烟草黑胫病、小麦全蚀病、小麦根霉病等均有较好的防治效果（HowelCR,1980;邱晓,1990;MaurhoferM,1994）。8 贵州大学硕士研究生论文目前已经鉴定假单胞菌产生的抗生素类型主要有2,4-二乙酰滕黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPGorPhl)、藤黄绿菌素(Pyoluteorin,Plt)、吩嗪类(Phenazine)、脂多肽(Lipopeptides)、硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin,Prn)和氢氰酸(HCN)等。1.4.1.1吩嗪类吩嗪是由Brevibacterium,Burkholderia,Pseudomonas和Streptomyces等生物合成的一类含氮杂环色素（StevansAM,1994），由两分子分支酸对称化合而成，杂环分子中的氮来源于谷酰胺中的氨基氮。吩嗪是一类含氮的杂环分子(图2)，无色或浅黄色针状结晶，溶于乙醚、苯等，几乎不溶于水。目前已报道的生物合成的吩嗪化合物有100多种，一种生物有时可出现多达10种不同的吩嗪衍生物（SmirnovVV,1990;MavrodiDV,1998）。已报道假单胞菌产生的吩嗪类抗生素主要有吩嗪-1-甲酰胺(phenazine-1-carboxamide,PCN)，吩嗪-1-羟基(phenazine-1-hydroxy)，吩嗪-1-羧酸(phenazine-1-carboxylicac-id,PCA)。许多植物根部病原体能够被吩嗪类抗生素抑制，如荧光假单胞菌2-79RN10产生的PCA能抑制由真菌病原体(禾顶囊壳菌小麦变种)引起的小麦全蚀病(ThomashowLS,1988)；铜绿假单胞菌GC-B26分泌的吩嗪-1-羧酸能够防治黄瓜炭疽病菌、辣椒疫霉，其最小抑制浓度为5μg/mL，药效仅次于商业化的甲霜灵和百菌清（LeeJY,2003）。图2吩嗪类化合物结构图Fig2Structureofphenazines1.4.1.22,4-二乙酰藤黄酚2,4-二乙酰藤黄酚(2,4-diacetylphloroglucinol,DAPG或Phl,图3)是一种酚类化合物，由三分子乙酰CoA和一分子丙二酰CoA浓缩成Phl的前体单乙酰藤黄酚，随后加乙酰化合成Phl。Phl是一种具有广谱抗真菌活性、抗细菌的抗生素9 贵州大学硕士研究生论文还有杀蠕虫、植物毒素活性、活性（CookRJ，1995）。有研究表明，荧光假单胞菌CHA0产的Phl能够抑制黄瓜猝倒病、小麦全蚀病、番茄根腐病烟、烟草黑根腐病（IsnansetyoA,2003），荧光假单胞菌F113能够抑制甜菜猝倒病和马铃薯软腐病（LandaBB,2002），荧光假单胞菌Q2-87和Q8r1-96可以抑制小麦全蚀病（VanPe´eKH,1982）。Isnansetyo等（2003）的研究表明，DAPG能够抑制革兰氏阴性菌和阳性菌的生长。图32,4-二乙酰藤黄酚结构图Fig3Structureof2,4-diacetylphloroglucinol1.4.1.3硝吡咯菌素硝吡咯菌素(Pyrrolnitrin,Prn)的化学名称为3-氯-4-(2.-硝基-3.-氯-苯基)吡咯(图4)，是一种氯化苯基吡咯抗生素，最初从Burkholderiapyrrocinia中分离得到的（ArimaK,1964）。后来从P.fluorescens,P.chlororaphis,P.aureofacns,B.cepacia,Enterobacteragglomerans,Myxococcusfulvus和Serratia种类的微生物中也分离得到了这种抗生素（HammerPE,1999;DeSouzaJT,2003）。荧光假单胞菌Pf-5,BL915,CHA0产生的硝吡咯菌素对相应的真菌病害抑制作用显著，如终极腐霉（SchniderU,1995）、水稻纹枯病菌(LigonJM,2000)等。，关于的生防机理，一般认为是硝吡咯菌素在在高浓度下则是阻止了参与呼吸作用的黄素蛋白和细胞色素C的电子运输路径；低浓度情况下则破坏氧化磷酸化的偶联机制。由于硝吡咯菌素见光易分解，不是最佳的农用杀真菌剂。如果用氰基团取代吡咯环上的氯原子，就可以使该物质在光照下的稳定性增强，并且保持着稳定的抗真菌活性。以硝吡咯菌素为模板和先导物化学合成的两种吡咯衍生物拌种咯(fenpiclonil)和咯菌腈(fludioxonil)，光照稳定，具有良好的抑菌活性，现以10 贵州大学硕士研究生论文作为环境安全性农用杀菌剂新药上市（LigonJM，2000）。图4硝吡咯菌素的结构图Fig4StructureofPyrrolnitrin1.4.1.4藤黄绿脓菌素藤黄绿脓菌素(Pyoluteorin,Plt)是一种芳香族聚酮类抗生素，化学名称为2,3-二氯-5-[2,6-二羟基苯甲酰基]吡咯(图5)，由一个间苯二酚环(起源于聚酮生物合成)连着一个二氯吡咯所组成，具有芳香族气味，常温下为黄色晶体，溶于环季胺、甲醇、乙酸乙酯等有机溶剂，微溶于水，紫外吸收峰大约为310nm。Plt具有广谱活性，能够有效地抑制植物黑根腐病（YuanZ,1988）和终极腐霉病等（SchniderU,1995）。已有研究表明：P.fluorescens菌株Pf-5与CHA0(BenderCL,1999)和P.aeruginosa菌株S10B2(OhmoriT,1978)均能合成藤黄绿脓菌素。有报道指出，若在棉花种子表面涂上10μg/seed的Plt，就可以有效抑制由终极腐霉病引起的植物枯萎衰退（Howell,1980）。图5藤黄绿脓菌素的结构图Fig5StructureofPyoluteorin11 贵州大学硕士研究生论文1.4.1.5环状脂多肽由荧光假单胞菌DR54产生的环状脂多肽(cycliclipopeptides,CLPs,图6)—粘质酰胺(Vscosinamide)，能够显著抑制立枯丝核菌和终极腐霉病等植物病原真菌（NielsenTH,2003）。粘质酰胺的生防机理是其能够在真菌细胞膜上形成离子通2+2+道，增大细胞内有的Ca浓度，Ca可以引起真菌产生胞囊，进一步抑制真菌的生长(Thrane,1999)。图6粘质酰胺的结构图Fig6StructureofVscosinamide1.4.1.6其它抗生素有人曾在19世纪90年代,发现一种铜绿假单胞菌能够产生水溶性蓝色物质绿脓菌青素(pyocyanin)（BlankenfeldtW,2004）,能显著拮抗原生动物、细菌和真菌的生长。假单胞菌分泌产生N-butylbenzenesulphonamide,APP(2-acetamidophenol),OomycinA,DDR(2,3-de-epoxy-2,3-didehydro-rhizoxin)等物质具有抗菌活性，对多种真菌病原菌拮抗有良好的拮抗作用（HuangX,2004；KimKK,2000;SliningerPJ,200）。1.4.2假单胞菌产生抗生素的特点生防假单胞菌产生的抗生素主要有3个特点:(1)同一生防假单胞菌能产生多种不同的抗生素。例如荧光假单胞菌CHA产生的2,4-二乙酰藤黄酚、硝吡咯菌素、藤黄绿脓菌素等，能不同程度抑制不同12 贵州大学硕士研究生论文病原菌。(2)生防假单胞菌分泌的抗生素大多具有广谱抗菌活性，既能拮抗原生动物、细菌，同时对许多植物病原真菌具有抑菌活性。如绿脓菌素能有效抑制原生动物、细菌、真菌的生长（BaronSS,1981）。(3)能够产生抗生素的生防假单胞菌种类繁多。目前发现的有绿针叶假单胞菌、荧光假单胞菌、致金色假单胞菌、铜绿假单胞菌等。还有许多如PseudomonasM18（王灿华,2004）;Pseudomonassp.AMSN（SnansetyoA,2003）等未定种名的假单胞菌。1.4.3抗生素的作用机制由于作用靶位的不同，抗真菌物质的作用机制主要有抑制细胞膜合成、抑制细胞壁合成、抑制核酸合成、抑制蛋白质合成和抑制电子传递。1.4.3.1作用于细胞膜抗真菌物质主要以下几种方式作用于细胞膜(蒙显英,2004)：(1)细胞膜中鞘磷脂是作用靶位，抗生素通过调节鞘磷脂对信号传导造成影响，进一步控制细胞的分裂、增殖及凋亡；(2)细胞膜中甾醇是作用靶位，进入植物体内的抗生素与真菌细胞膜结合（结合程度与膜内甾醇含量成整相关）生成膜棗抗生素复合物，在膜脂质双层中由于细胞质膜结构被改变从而构成亲水通道，致使胞内物质向胞外流动，因此产生了杀菌作用；(3)真菌细胞表面结构是作用靶位，真菌细胞表面结构很容易被活性强烈的抗真菌肽类化合物干扰。1.4.3.2抑制细胞壁的合成抗生素主要以下几种方式作用于细胞壁(张鹏,2005)：(1)细胞壁中几丁质合成酶是作用靶位，多种抗生素均能抑制真菌细胞壁中特殊几丁质的生物合成；(2)细胞壁中甘露聚糖是作用靶位，真菌细胞壁中含量最大的多糖是甘露聚13 贵州大学硕士研究生论文糖，它通过共价键与蛋白质形成的甘露蛋白在真菌细胞壁的外周含量最高，甘露蛋白是真菌细胞的主要抗原，抗生素通过干扰甘露聚糖的合成使真菌细胞抗原的合成受到影响；(3)细胞壁中葡聚糖合成酶是作用靶位，α-和β-葡聚糖等物质是真菌细胞壁中含有特殊的成分，抗生素能调节这些特殊物质的合成酶的活性，从而实现使植物细胞能够拮抗病原抗真菌。1.4.3.3作用于蛋白质合成系统很多抗生素都能干扰蛋白质合成过程，例如四环素类、氨基环醇类、大环内酯类和其它一些抗生素，这些抗生素主要作用于蛋白质合成的起始、延长、终止各个阶段的不同环节，能干扰氨基酸代谢的调节，干扰氨基酸的传输或者两种作用方式并存而实现拮抗植物病原真菌的目的。例如中生菌素主要是通过抑制菌体蛋白的合成，进而能有效抑制白菜软腐病菌生物大分子合成中DL-(4,5-3H)亮氨酸嵌入蛋白质这一过程(蒋细良,谢德龄,1997)。1.4.3.4抑制核酸的形成抗生素通过竞争的方式阻碍真菌细胞DNA的合成，进一步抑制植物病原真菌生长，另外一种方式是抗真菌物质能调节DNA来减小RNA多聚酶的活14性，最后抑制蛋白质的合成。例如灰黄霉素不影响C-氨基酸掺入蛋白质，但能14有效抑制胸腺嘧啶和C-尿嘧啶掺入核酸，因此有人认为灰黄霉素通过阻碍核酸的生物合成进而抑制真菌生长(Banic,Lunder.1989)。病毒RNA的合成被嘧啶霉素抑制，从而使嘧啶霉素达到抗病毒的作用(朱春玉,2006)。1.4.3.5干扰细胞能量代谢和电子传递体系抗生素进入真菌细胞内，通过阻碍线粒体呼吸链的电子传递，致使线粒体的有氧呼吸受到抑制，导致真菌细胞的死亡而达到拮抗植物病原真菌的目的(LiuY,ChenZ,2007)。如呼吸链电子传递体系的抑制剂抗霉素(Antimycin)A可使细胞色素b变成还原状态，细胞色素c1变成氧化状态，使细胞色素b和细胞色素c1间的电子传递受到抑制。14 贵州大学硕士研究生论文1.5抗生素的提取分离方法微生物的发酵过程具有遗传操作简便、易于培养和工艺简单等优点，但发酵液的成分比较复杂，不仅存在未知的蛋白质、多种成分复杂等大分子物，而且有些微生物还能产生两种及两种以上的活性物质。为了分离纯化发酵液中的有效成分，现在抑菌活性物质主要的分离纯化手段有:离子交换层析、有机溶剂沉淀、盐析、等电点沉淀、电泳法、凝胶分子筛层析以及反相高效液相色谱等。在发酵产物的混合体系中，目前还没有完整的分离方法把任何一种大分子物质从复杂的混合物中分离出来，抑菌活性物质的分离纯化需要根据具体的研究工作而定。在常规的分离技术中，几种分离方法通常联合使用(TamehiroN,2004)，但对分子量较小和性质特异性的环肽、脂肽等物质，电泳技术、蛋白质层析并不能达到分离效果，需要做进一步改进。伴随化学分析技术的提高和生物化学的进展，天然产物中的许多抗真菌活性物质有效成分的提取、分离纯化和结构鉴定等技术日益多样化、简单化和成熟化。1.5.1有效成分分离原理溶剂萃取法：根据相似相溶原理，由于一种溶质组分（如发酵产物、植物组织粉末）在两个互不相混溶的液相中（如水相和有机溶剂相）中的溶解性不同以及分配性质上的差异，从而使有效成分得到分离。色谱分离法：色谱分离是一种物理的分离方法，由于混合物中各组分物理化学性质（分子亲和力、分配系数、分子形状和大小、吸附力、分子极性等）不同，各组分以不同程度分布在流动相和固定相两个相中。根据固定相与溶质相互作用的机理的差异，色谱分离主要分为5大类(刘国诠,2003)：凝胶色谱、吸附色谱、亲和色谱、分配色谱、离子交换色谱。（1）凝胶色谱：凝胶色谱是根据各物质分子大小不同而使物质分离，它以凝胶为固定相，因此又称为空间排阻色谱、分子筛色谱(姚新生,2001)；（2）吸附色谱：由于固定相对不同物质的吸附能力不同，当混合物随流动相通过固定相（吸附剂）时，混合物中各组分能得到有效分离（王福来,2001)；（3）亲和色谱：生物分子间存在专一结合能力即亲合力，这些大分子化合15 贵州大学硕士研究生论文物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性，利用这种亲合力致使分离(周乐2000)；（4）分配色谱：此分离技术的固定相和流动相均是液体，主要利用混合物中各组分在两液相中的分配系数不同，使不同的组分得到分离(盛龙生2003)；（5）离子交换色谱：由于混合物中不同的溶质对交换剂的亲合力存在差异，利用流动相中具有相同电荷的溶质离子和离子交换树脂上可电离的离子进行可逆交换，最终将混合物分离(李春香等2001)。1.5.2发酵液的预处理通过对微生物发酵液的预处理，既可以分离菌体和其他悬浮颗粒，还可除去一些可溶性杂质，并且能改变滤液的性质，保证提取和精制后继分离工作的顺利进行。大部分有用的代谢产物是于胞外产物，预处理发酵液后应大限度使目的产物转移到液相，再通过经固液分离除去固相；胞内产物的收集方法则是先收集菌体，再细胞破碎，使目标产物进入液相，后将细胞碎片分离(毛忠贵,1999;俞俊棠,等,2003)。通过添加凝聚絮凝剂、添加反应剂、添加助滤剂、添加表面活性剂、调酸（等电点）、热处理、冷冻解冻及电解质处理等方法可以提高发酵液过滤速度。2+2+通过发酵液预处理，可除去的可溶性杂质主要有高价无机离子（Fe、Mg+和Ca2等）、多糖和蛋白质。这些杂质的存在使得发酵液的粘度增大，减小液固分离速度，最重要的是能影响到后续的提取与纯化工作和产品质量。因此发酵液的预处理尤为重要。不同离子和杂质有不同去除方法，如通常使用草酸、草酸钠2+2+2+与Ca形成草酸钙沉淀而除去Ca；三聚磷酸钠可以和Mg形成可溶性络合物，2+2+从而可消除Mg对离子交换的影响；向发酵液中加入黄血盐，使Fe形成普鲁士蓝沉淀而将其除去。通过吸附法、沉淀法和变性法可以除去发酵液中的杂质蛋白。对于糖部分，可用酶将其转化为单糖，降低发酵液的粘度，从而提高提高过滤速度。16 贵州大学硕士研究生论文1.5.3抗生素分离纯化技术1.5.3.1萃取法萃取法主要包括超临界萃取、液固萃取（浸取）、双水相萃取和有机溶剂萃取等。在假单胞菌产生的抗生素的分离中，有机溶剂萃取法和有机溶剂浸取法应用较广泛。有机溶剂萃取原理是在水和有机溶剂（与水互不相溶）中，不同目标产物的溶解度不同；有机溶剂浸取法原理是不同固体物质在有机溶剂溶液中的溶解度不同(田瑞华,2008)。蛋白质在有机溶剂中不稳定，因此通过有机溶剂浸取法和有机溶剂萃取法仅能对有机溶剂稳定的物质，如多肽、生物碱、抗生素等。1.5.3.2色谱法色谱法又称为层析法，其原理是利用物质在流动相和固定相之间的平衡系数或吸附系数存在差异，实现目标物质最终的分离纯化。常规色谱法主要包括干柱色谱法、柱色谱法、和纸色谱法薄层色谱法4种类型。薄层色谱法既能可鉴定活性物质化学成分，又可为柱色谱法摸索最优条件。纸色谱法的支持物是滤纸片，是一种液液分配色谱过程，可用于分离纯化核苷酸、核苷、糖类、氨基酸等成分。分离纯化最为常用的方法是柱色谱法，主要是凝胶过滤柱色谱法、分配柱色谱法、离子交换柱色谱法和吸附柱色谱法，分别利用排阻原理、固液相分配数差异、离子交换反应和吸附剂吸附能力达到活性物质的分离纯化。目前在抗生素、蛋白质、肽等物质分离与分析中频繁使用的色谱法凝胶色谱法，此方法被广泛应用于分离纯化假单胞菌产生的抗真菌物质。干柱色谱法是把干的填充剂装柱，直接分离化合物，此方法适用于制备型的分离纯化。1.5.3.3吸附法大孔树脂吸附法应用比较多，大孔吸附树脂（Adsorbentresin）是一种非离子型有机高聚物吸附剂，原理是通过有机质之间与吸附剂的范德华力使有机质吸附在吸附剂上，从而达到分离物质的目的(MlotC,2009;LiuY,2007)。大孔吸附树脂的主要特点是操作简单，可反复使用，适用范围广，最早主要的应用领域是分析化学、化学工业、医药工业、临床检定和治疗废水处理等，目前工业生产和实17 贵州大学硕士研究生论文验室中多采用打孔树脂分离与纯化天然化学成分，但主要用于提取等小分子物质。根据抗生素的化学结构，一些大孔吸附剂分离纯化抗生素的应用实例如表1(张文娟,2013)。表1大孔吸附剂在抗生素分离纯化上的应用Table1MacroreticularadsorbentapplicationonisolationandPurificationofantibiotics名称分离方法α-内酰胺类抗生素DiaionHP-20柱吸附，水、50%丙酮、100%丙酮次洗脱16-hydroxyadipoyl-7-ADCA头孢氨苄国产H-103吸附，50%丙酮解吸多肽类抗生素SterinADiaionHP-20柱吸附，30%甲醇淋洗，70%甲醇洗脱WAP-8294ADiaionHP-20柱吸附，水洗涤丙酮洗两次，80%丙酮：0.05%TFA洗脱EchinoserineAmberliteXAD-16吸附，正丁醇提取排阻色谱层析，制备性HPLC纯化，甲醇水梯度洗脱AureobasidinesDiaionHP-40柱吸附，50%乙醇洗涤，乙醇洗脱糖苷类抗生素FattiviracinA1DiaionHP-10柱吸附，80%乙醇洗涤，甲醇洗脱BE-31405DialonHP-20柱吸附，50%、70%甲醇分别洗涤，甲醇洗脱BrasilicardinADiaionHP-20柱吸附，50%甲醇洗涤，甲醇洗脱1.5.4纯化经过萃取法和色谱法初步分离后得到的样品量损失大，且纯度不高，需进一步纯化。此时在纯化假单胞菌产生的抗真菌物质的过程中多采用色谱分离。主要色谱的原理与应用举例如表1。18 贵州大学硕士研究生论文表2主要色谱的原理与应用举例Table2TheprincipleandapplicationofmainChromatography名称原理应用举例凝胶色谱分子的大小和形状分子量为37kDa、40kDa的蛋白离子交换色谱电荷与解离度脂肽、环肽、环状脂肽反相键合相色谱疏溶剂作用伊枯草菌素正相色谱范德华力、诱导力或氢键分子量为10~20kDa的抗生素、缩酚酸肽疏水色谱特定的生物亲和力分子量为1476.7Da的肽，分子量为377.0kDa的蛋白反相高效液相疏溶剂作用丰原素、子量为7367.4Da的多肽除了上述色谱法外，分离纯化假单胞菌产生抗真菌物质的方法还包括以下几种，电泳法、真空快速色谱法和吸附色谱法等。1.6论文设计思想1.6.1立体依据由于社会的发展，人类不断提高对环境和生态认识，人们发现大量农药累积在土壤中，使土壤板结，不仅污染生态系统，影响农业的可持续发展，且残留在农产品中的农药对人类的身体健康不利。随着人们对植物保护和可持续农业观念的不断加强，在农业生产发展中急需解决这些难题，开发无污染、无公害的生物农药显得尤为重要。生物农药的优点是对人畜的毒性较小、不污染环境、不易产生抗药性以及安全可靠等，已成为解决农业生态环境问题的重要突破口之一。植物保护中广泛应用农用抗生素，使其成为农药市场中重要的一部分，世界许多国家都很重视高效低毒的农用抗生素的开发研究。拮抗细菌的研究与应用是生物防治最多的一方面，虽然它可以有效克服化学农药副作用，但环境因子等容易影响其防治效果。拮抗细菌能分泌抗生素直接杀死或抑制植物病原菌。由前文所述，假单胞菌已成为生防微生物的研究热点，它能分泌不同种类的对植物病原具有拮抗活性的抗生素，其主要的生物防治的机理19 贵州大学硕士研究生论文是它能通过分泌一种或几种抗菌物质来抑制植物病原菌的生长，进一步实现其生物防治的功能。缺陷假单胞菌HD13是贵州省生化工程中心真菌室从微生物菌剂的一种拮抗细菌。初步研究表明，该菌株的发酵产物稳定性好，且对多种植物病原菌具有光谱抑菌活性，显示了广阔的应用环境。本实验从此目的菌株出发，对菌株进行了培养条件的优化和发酵产物的稳定性研究，并对活性组分进行分离纯化，同时对得到的活性组分进行机理初探，以期利用该菌株分离活性物质提供有效的参考价值，希望其对环境保护、保护农作物免受病害的威胁有积极意义。1.6.2研究内容本文的主要研究内容如下：（1）菌株HD13发酵条件的优化。（2）菌株HD13发酵产物的研究。（3）活性组分的分离与纯化。通过固体和液体（发酵罐，静置）发酵的方法积累大量的发酵产物，摸索适合的分离纯化方法，得到纯度较高的活性组分。（4）活性组分抑制植物病原真菌的机理初探。（5）菌株HD13抑菌活性的遗传稳定性。20 贵州大学硕士研究生论文第二章材料与方法植物病害是农业生产的大敌。据联合国粮农组织(FAO)统计，每年因植物遭受病害造成的减产平均损失为总产量的10%~15%（刘志俊等，2003）。我国作为一个农业生产大国，每年因病虫害造成的粮食损失大约为1500万吨，其中80%以上的农作物病害是由真菌侵染引起的(霍治国等,2000)。目前化学农药是控制真菌对植物病害的主要方法，然而化学农药的大量和长期使用，不仅引起环境污染、食品不安全及人类健康遭受危害等问题，还诱发了植物病原真菌对多数农药产生抗药性（SchallmeyM,etal,2004）。而生物防治以其无残留、成本低、不易产生抗药性等特点，日益受到了人们的青睐。目前，研究得最多、最具生防潜能的微生物为木霉菌(Trichoderma)（LisaH,2001）和芽孢杆菌(Bacillus)(WangSLetal，2002)，而有关于其他菌株报道相对较少。微生物经过最佳培养基在最佳发酵条件下得到的发酵产物，必须对发酵产物的稳定性进行考擦，从而才能分离纯化有效的活性物质。生防细菌产生的抗生素多为脂肽类物质，而光、热、pH、有机试剂、紫外线等均能影响此类物质的活性，甚至引起它们变性失活。另外，存储时间也对发酵产物的活性造成很大的影响。研究表明，菌株HD13对几种植物病原真菌具有光谱抑菌活性，且分离出一个具有抑菌活性的组分。距今为止，脂肽类抗真菌的机制仍不确定（RaaijmakersefaZ,2010)。本章拟利用前章从菌株HD13发酵产物中分离得到的组分A，研究其拮抗几种植物病原真菌的影响，并研究其对水稻纹枯病菌丝体、细胞膜、细胞壁以及DNA的影响，初步探讨组分A对植物病原真菌的拮抗机理。2.1供试材料2.1.1菌种缺陷假单胞菌PseudomonasdiminutaHD13，保藏于贵州省生化工程中心；植物病原真菌：小麦赤霉病菌Gibberellazeae(Schwein)PetchCM、水稻稻瘟病菌Magnaporthegrisea(T.T.Hebert)M.E.BarrDWB、水稻纹枯病菌Thanatephorus21 贵州大学硕士研究生论文cucumeris(A.B.Frank)DonkWB、烟草黑胫病菌PhytophthoranicotianaeBredadeHaanHJB、辣椒灰霉病菌BotrytiscinereaPersHM、番茄黑斑病Alternariaalternata(Fr)KeisslF588、番茄早疫病菌AlternariasolaniSorauer.PflschutzF788.和辣椒炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides(Penz)Penz.&SaccCP，由贵州大学生化工程中心提供。2.1.2主要药品和试剂琼脂、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母浸膏、尿素、硫酸铵、MgSO4、K2HPO4、氯化钠、CaCl2，石油醚、二氯甲烷、正丁醇、异丙醇、乙丙酮、氯仿、乙腈、正己烷、甲醇、DMSO、刚果红、结晶紫、鞣酸、棉蓝、石英砂均为分析纯，购于贵州赛兰博科技有限公司；薄层层析硅胶GF254、羧甲基纤维素钠、茚三酮、层析硅胶（200-300目）、葡聚糖凝胶SephadexLH-20均为化学纯，购于贵州赛兰博科技有限公司，色谱级甲醇、乙腈、TFA（TEDIA）；两性霉素B、Tris-HCL、BSA购于北京索莱宝科技有限公司；真菌基因组DNA提取试剂盒，购于北京天恩泽基因科技有限公司。2.1.3主要仪器MULISKANGO酶标仪百乐科技有限公司立式压力表灭菌锅上海博讯实业有限公司医疗设备厂PQX型多段可编程人工气候箱宁波东南仪器有限公司SFAT-8000C液体发酵自动控制系统江苏大学-镇江市江大科技有限公司Agilent1100系列高效液相色谱分析仪美国安捷伦公司WFH-203B三用紫外光分析仪上海精科实业有限公司BSZ-160F自动部分收集器上海之信仪器有限公司CX41RF型OLMPUS显微镜重庆奥特光学仪器有限公司DDS-307电导率仪上海佑科仪器公司赛多利斯0.01mg天平赛多利斯科学仪器（北京）有限公司22 贵州大学硕士研究生论文2.1.4主要培养基PDA培养基：称取去皮后马铃薯200g，将其切成小块，加水煮沸30min，四层纱布过滤，将滤液加蒸馏水补足至1L，加葡萄糖20g，琼脂20g，pH值自然。灭菌条件：121℃灭菌30min。LB固体培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母浸膏5g，琼脂粉20g，NaCL2.0g，KH2PO40.03g，MgSO40.02g，CaCl20.02g，蒸馏水至1L，pH自然，121℃灭菌30min。2.2实验方法2.2.1主要培养基的优化2.2.1.1菌株活化将植物病原菌接种于9cm培养皿中，28℃培养，使菌丝体长满平培养皿，保存备用。将菌株HD13接种于LB平板培养基中，30℃培养24h。2.2.1.2菌株HD13对不同植物病原真菌抗菌活性的影响将活化后的菌株接种于置于250mL发酵瓶中，30℃120r/min振荡培养72h，发酵液经4000r/min离心10min，上清液用细菌滤器过滤(滤膜孔径0.22μm)，采用菌饼法（何爱莲,2014）测定其抑菌活性，即在无菌条件下，按1:4将发酵滤液和培养基倒入直径为9cm的培养皿中，制成相应的含药培养基，设加等量无菌水作空白对照，3次重复（下同）。用直径5mm的打孔器在培养好的植物病原真菌自菌落边缘切取菌饼，把菌饼放置于平板中央，菌丝面朝上，28℃培养箱中培养7d。通过十字交叉法测定菌落直径，按下列公式计算发酵滤液对菌丝生长的抑制率。抑制率＝（空白对照组菌落直径[-处理后菌落直径）（空白对照组直径/-5）]×100%2.2.1.3初始培养基的筛选用以下五种培养基的发酵滤液进行抑菌试验，指示菌为微水稻纹枯病。23 贵州大学硕士研究生论文（1）PDB培养基：称取去皮后马铃薯200g，将其切成小块，加水煮沸30min，四层纱布过滤，将滤液加蒸馏水补足至1L，加葡萄糖20g，pH值自然。（2）LB液体培养基：葡萄糖10g，蛋白胨5g，酵母浸膏5g，NaCL2.0g，KH2PO40.03g，MgSO40.02g，CaCl20.02g，pH值自然。（3）基础培养基：葡萄糖5g，硫酸铵2g，K2HPO40.4g。（4）培养基1：柠檬酸钠0.1g，硫酸镁2g，K2HPO40.4g。（5）培养基2：K2HPO40.6g，柠檬酸钠0.1g。2.2.1.4最佳碳源的筛选在已经确定抑菌活性较好的培养基中，分别以蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、乳糖、甘露醇、淀粉6个物质代替培养基中的碳源，28°C下120r/min摇瓶培养7d，比较不同碳源对菌株HD13抗水稻纹枯病菌活性的影响。2.2.1.5最佳氮源的筛选在已经确定的最佳碳源的培养基中，分别以0.5%的蛋白胨、(NH4)2SO4、尿素、牛肉膏和酵母浸膏共5个物质替代基础培养基中的氮源，28°C下120r/min摇瓶培养7d，比较不同氮源对菌株HD13抑菌活性的影响，指示菌是抗水稻纹枯病菌。2.2.1.6无机盐对抑菌活性的影响根据筛出的最佳碳源、最佳氮源，去除掉基础培养基中单一的无机盐，分别加入等量的MgSO4、NaCl、K2HPO4、(NH4)2SO4和CaCl2，比较不同无机盐对菌株HD13抑菌活性的影响，指示菌是水稻纹枯病。2.2.1.7K2HPO4与抑菌活性根据已经确定的碳源和氮源的培养基，分别加入2g/L,4g/L,5g/L,6g/L的K2HPO4，菌饼法检验抑菌活性，比较不同浓度K2HPO4对抑制水稻纹枯病的影响。24 贵州大学硕士研究生论文2.2.1.8氯化钠与抑菌活性根据已经确定最佳碳源和氮源的培养基，分别加入2g/L,4g/L,5g/L,6g/L的氯化钠，菌饼法检验抑菌活性，比较不同浓度氯化钠对水稻纹枯病的影响。2.2.1.9发酵培养基主要成分的正交试验通过上述的培养基成分的优化获得最佳的碳源、氮源、无机盐离子，再通过正交实验获得最佳的培养基中各组分的最适浓度，从而获得利于菌株HD13产生较高抗菌活性物质的培养基。具体因素水平表见表1。表1正交试验因素水平表Table1Thefactorsandlevelsorthogonaltest因素(g/L)水平蔗糖牛肉膏K2HPO4氯化钠空白115.05.03.01.01220.06.04.01.52325.07.05.02.03430.08.06.02.542.2.2培养条件的优化2.2.2.1培养基初始pH值的考察在以上最佳培养基（下同）灭菌前，将其pH分别调节为5、6、7、8、9，灭菌后各自接入1mL培养过夜的菌悬液，28°C下120r/min摇瓶培养7d，比较不同初始pH对菌株Hd13抗水稻纹枯病菌活性的影响。2.2.2.2接种量对抑菌活性的影响种子液的制备：将最佳培养基28°C下120r/min后接入缺陷假单胞菌HD13，28°C下120r/min培养1d，保存备用。将灭菌后的最佳培养基分别接入1%、2%、4%、6%、8%、10%的种子液，28°C下120r/min培养7d，比较不同接种量25 贵州大学硕士研究生论文对菌株HD13抑菌活性的影响。2.2.2.3菌株HD13最佳吸收波长的测定取刚开始浑浊的发酵液和原始培养基，用去离子水作为对照调零，分别在300～600nmUV波长下，用酶标仪测定OD值，从而确定菌体的最佳吸收波长并用于后续试验中OD值的读取。2.2.2.4菌株HD13最佳发酵时间的测定将拮抗菌株活化后用接种环挑取一个单菌落接种到250mL三脚烧瓶中，30℃120r/min振荡培养18h，即得种子液。按5%接种量接种于250mL发酵瓶中，同样条件下培养7d，每隔12h检测发酵液的OD值并检验抑菌活性，指示病原菌为水稻纹枯病。2.2.2.5不同培养方式的考察本实验采取摇床培养，静置发酵，以及摇床后静置培养三种培养方式。摇床培养500mL三角瓶装液量200mL，转速110r/min，温度28℃，发酵7d；静置培养500mL三角瓶装液量200mL，温度28℃，发酵30d；另外培养500mL三角瓶装液量200mL，温度28℃，发酵3d，然后静置培养30d。采用菌饼法探究这三种培养方式对菌株HD13抗水稻纹枯病菌活性的影响。2.2.3发酵液抑菌活性的稳定研究2.2.3.1分泌类型的检验菌株HD13的发酵液4000r/min离心15min，收集上清液；向离心管中加入灭菌过的蒸馏水，超声清洗沉淀20min，得到菌株HD13的菌体裂解液，菌饼法检验上清液和菌体裂解液的抑菌活性，指示菌为水稻纹枯病。2.2.3.2发酵液热稳定性的考察将发酵滤液分别在30℃、50℃、70℃、100℃水浴中处理30min，121℃高26 贵州大学硕士研究生论文温高压灭菌30min。设未处理的发酵滤液作对照(下同)，菌饼法检验不同处理组发酵液对水稻纹枯病的抑菌活性。2.2.3.3pH对发酵液抑菌活性的影响将发酵滤液用36%盐酸和5moL/L氢氧化钠分别调至pH1.0、3.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0，置于4℃冰柜中过夜，用盐酸和氢氧化钠将各pH值调回中性，检测对水稻纹枯病的抑菌活性。2.2.3.4不同硫酸铵饱和度对发酵液抑菌活性的影响在20℃下将培养的无菌发酵滤液分别加入饱和度为10％、30％、50％、70％和90％的硫酸铵，保持1h，然后将饱和液在4000r/min下离心20min，收集上层沉淀物，50℃下烘干，用20mmol/L的磷酸缓冲液(pH6.8)悬浮至浓度20mg/mL，用菌饼法测定其抑菌活性并比较其活性差异。2.2.3.5紫外光对发酵液抑菌活性的影响将发酵滤液分别放置在距离10cm的20W紫外灯下照射1h、2h、3h、4h、5h和6h后，检测其对水稻纹枯病抑菌活性的影响。2.2.3.6储存时间对发酵液抑菌活性的影响将发酵滤液于4℃下分别储存3d、5d、10d、15d、30d、45d和60d后分别测定其抑菌活性，指示菌为水稻纹枯病。2.2.3.7不同浓度发酵液对抑菌活性的影响将培养72h的发酵液过滤除菌，用无菌水稀释成20%、40%、60%、80%和100%，分别测定各稀释液的OD值，菌饼法检验活性，指示菌为水稻纹枯病。2.2.3.8发酵液OD值与生物量的关系OD值与发酵产物的关系：摇床培养过程中每隔30min检测三角瓶中菌液的27 贵州大学硕士研究生论文OD值，当OD值达0.9～1.0时（乔军,孟庆龄,1996），取5个250mL的三角烧瓶，分别以菌液:原始培养基＝4:1，3:2，2:3，1:4进行稀释，每个浓度菌液各150mL，另取150mL发酵液进行一下操作：（1）用原始培养基调零，测定各稀释液的OD值；（2）记录不同离心管的重量，分别向离心管中加入不同稀释度的菌液，4300r/min离心20min，收集沉淀，用吸水纸除去离心管表面的水分并称重，差量法计算沉淀的湿重。55℃烘干沉淀，差量法计算沉淀的干重。－4－5－6OD值与活菌数的关系：将各浓度的菌液进行梯度稀释（10、10、10），分别吸取100μL涂布LB平板培养基，30℃培养24h后统计菌落数，取平均数按下式计算菌液中的活菌数（沈萍,陈向东,2007）。每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）＝同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×52.2.3.9OD值与发酵产物抑菌活性的关系根据不同发酵时间的发酵液OD值和对植物病原真菌的抑制率，建立反应OD值与抗菌活性变化的回归方程。2.2.4活性组分的分离纯化2.2.4.1技术路线活性组分纯化的主要技术路线如下：28 贵州大学硕士研究生论文菌株HD13发酵物2倍体积正丁醇萃取3次提取物效价测定正己烷初步除杂游离脂肪酸不溶物氯仿：甲醇（V:V）=10:1~1：1层析柱硅胶（200~300目）糖类、小分子物质活性组分ⅠSephadexLH-20甲醇LH-20活性组分Ⅱ2倍体积乙酸乙酯浸提2次活性组分A活性组分BTLC,HPLC检测组分分析抑菌活性评估图1HD13发酵提取物的分离流程Fig1Theflowchartofcompoundseparationfromtheextractsoffermentationbroth2.2.4.2发酵产物的累积种子液的制备：将活化好的HD13菌株接种于种子液培养基中（200mL/500mL），置于28℃恒温摇床（120r/min）培养3d，作为种子液备用。固体发酵：将制备好的种子液按8%（v/v%营养液）接种于固体发酵培养基中，并用玻璃棒充分搅拌混匀，置于28℃恒温培养30d，本试验共发酵82瓶。发酵后将分离开的固体发酵产物置于50℃烘箱内烘干，尽可能大的把发酵产物平铺开，增大受热面积，烘干后的发酵产物用高速粉碎机处理后，再用甲醇（料液比1g:3mL）浸提2～3次，合并浸提液，于40℃浓缩至浸膏状，保存在4℃29 贵州大学硕士研究生论文冰箱中，备用。发酵罐发酵：将活化好的3瓶（共计450mL）种子液在无菌条件下加入到发酵罐培养基中，设置发酵温度35℃，电机转速100r/min，通气量600mL，发酵3～4天，本试验共使用10L发酵罐发酵2次，100L发酵罐发酵2次。将过滤后的发酵液经旋转蒸发器50℃旋蒸，浓缩至原体积的1/10左右，保存在4℃冰箱中，备用。2.2.4.3不同有机试萃取发酵液的活性取200mL的发酵产物，分别加入不同极性的有机试剂萃取发酵液（体积比1:2，浸提2～3次），合并相同有机试剂的萃取液，35℃挥发干后溶于少量DMSO，配制成提取物水溶液，菌饼法检验活性，对照组为DMSO水溶液。2.2.4.4提取物效价的测定按照正丁醇：发酵液=2:1萃取（超声清洗仪震荡20min）发酵液2～3次，合并萃取液，于40℃浓缩至浸膏状；另外再用正丁醇（料液比1g:3mL）浸提甲醇浸提的固体发酵物浸膏2～3次，合并浸提液，于40℃浓缩至浸膏状，合并两种浸膏。将浸膏溶于少量DMSO，再配制成0.25g/L，0.5g/L，1.0g/L，2.0g/L，4.0g/L的浸膏溶液，检验对水稻纹枯病的抑菌活性，对照组为DMSO水溶液。2.2.4.5硅胶柱层析分离硅胶柱层析色谱主要操作方法如下：（1）装柱：根据层析柱的规格称取适量的硅胶，置于烘箱中110℃活化1～2h，取出后加入一定量的试剂（洗脱剂中极性最小的）浸没硅胶并搅拌均匀，超声30min除去气泡，然后缓慢地加入到层析柱中，打开下方的活塞，保持最大流速。当硅胶层达到整个柱体积的2/3时，停止装柱。更换洗脱剂冲洗3～5个柱体积，待到硅胶层析柱平衡完毕，在硅胶层上方加满洗脱剂，沉降12h左右，使硅胶层夯实、紧密。（2）上样：由于本实验的样品在洗脱剂中溶解性较差，因此采用干拌法上样，即称取一定量的硅胶（通常为样品干重的1～2倍）装入蒸发皿中，置于50℃的30 贵州大学硕士研究生论文恒温水浴锅上将溶解好的样品滴加到硅胶上，并不断搅拌混匀，使样品均匀的吸附在硅胶颗粒表面，待溶剂挥发完全后，即完成干法拌样。将处理后样品均匀缓慢地加入到硅胶柱中，待到样品层沉降下来后，再加入少量脱脂棉作为保护层（图4.2）。（3）洗脱与收集：洗脱系统为氯仿：甲醇梯度洗脱（10:1～1:1，V:V），逐份收集，将所得馏分浓缩至小体积，保存在4℃冰箱中，备用。（4）检测：再用菌饼法以水稻纹枯病进行抑菌活性跟踪测定，合并有抑菌活性的组分。脱脂棉固态干样柱层析硅胶图2硅胶柱层析柱示意图Fig2Diagramofthesilicagelcolumnchromatography2.2.4.6葡聚糖凝胶LH-20分离SephadexLH-20层析色谱主要操作方法如下：装柱：在室温下将葡聚糖凝胶LH-20甲醇溶液中溶胀12h，除去上层溶剂中较小粒径的LH-20,剩下的凝胶作为填充介质。将凝胶用甲醇溶液配制成悬浮液，其余处理同硅胶一致。31 贵州大学硕士研究生论文上样与洗脱：将硅胶柱层析得到的组分溶于尽量少的甲醇溶液中，缓慢加入层析柱中，充分吸附后用甲醇溶液洗脱，分布收集，每10mL收集一管。检测：将每管液体挥发干，每隔5管检验活性，合并有抑菌活性的组分，并进行HPLC检测。检测条件如下(林青荣，2012)：波长210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，流动相乙腈（0.1%TFA）：水（0.1%TFA）=75：25。2.2.4.7活性组分的TLC层析活性组分的处理：向葡聚糖凝胶层析后有抑菌活性的组分加入两倍体积的乙酸乙酯，震荡提取20min，萃取2～3次，挥发干后进行TLC和HPLC检测。薄层板的制备：（1）试剂：0.5%羧甲基纤维素钠溶液。称取5g羧甲基纤维素钠，加入1000mL蒸馏水，煮沸，过滤，收集过滤液，保存备用。（2）制板：取3g硅胶加入8mL0.5%羧甲基纤维素钠溶液，调匀，涂布平板，室温放置12h，110℃活化30min。点样：用铅笔在距薄层板底边2cm水平线均匀确定2个点，再用毛细管点样，样点直径不超过2cm自然干，可重复一次。展开：将点样后的板放入盛有展开剂的层析缸中，展开剂(吕应年,2005)为氯仿：甲醇：水=65:25:4，待展开剂前沿离薄层板边缘2cm时，取出薄层板，35℃挥发干，分别在254nm和365nm紫外光下观察。2.2.4.8活性组分的HPLC检测将获得的样品溶于少量的色谱甲醇，HPLC检测，检测条件为：波长210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，流动相乙腈（0.1%TFA），水（0.1%TFA），探索最佳流动相比例，以得出最佳的HPLC检测条件。2.2.4.9活性组分及其抑菌活性的初步分析双缩脲反应：甲醇溶解少量活性组分，加入双缩脲试剂，pH8.04的磷酸缓冲液作为对照组，观察溶液颜色的变化。茚三酮反应：甲醇溶解少量活性组分，加入2%茚三酮溶液，pH8.04的磷酸32 贵州大学硕士研究生论文缓冲液作为对照组，水浴锅加热，观察溶液颜色的变化。抑菌活性的评价：将所得的活性组分溶于少量DMSO，配制成水溶液，菌饼法检验抑菌活性，相同浓度的DMSO水溶液作为对照组。2.2.5组分A抗植物病原真菌的活性初探2.2.5.1组分A对不同植物病原真菌的抑菌活性组分A溶于微量DMSO，配制成1mg/mL的溶液，菌饼法检验组分A对水稻纹枯病、水稻稻疫病、烟草黑胫病菌、辣椒灰霉病菌等病原菌的抑菌活性，相对应的DMSO溶液作为对照组，每个处理设3个平行。2.2.5.2组分A水稻纹枯病菌丝体形态的影响分别挑取正常生长和生长被抑制的水稻纹枯病菌丝体于载玻片上，尽量使菌丝体展开，放在酒精灯外焰上微热5min，使其菌丝体固定在载玻片上，用棉蓝染色5min，蒸馏水洗去多余的染液，显微镜下观察菌丝体的形态。2.2.5.3水稻纹枯病菌丝体生长曲线的确定采用干重法确定水稻纹枯病菌丝体的生长曲线。将保藏的水稻纹枯病活化后接种于PDA平板中央，28℃培养7d，使其菌丝体铺满平板，用灭菌后的打孔器打出直径为5mm的菌饼，接入PDB培养基中，28℃环境中120r/min培养，过滤去除培养液，蒸馏水清洗3次，55℃烘干后称量菌丝体的重量。以时间为横标，菌丝体重量为纵坐标，绘制不同培养时间内水稻纹枯病菌丝体的生长曲线。2.2.5.4组分A对水稻纹枯病菌丝体生长的影响分向灭菌后的PDB培养基中加入50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL组分A溶液，接种活化后的水稻纹枯病菌丝体，28℃环境中120r/min培养4d，过滤后55℃烘干称量菌丝的重量。以0.5μg/mL、1μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、15μg/mL、20μg/mLPDB菌丝体溶液作为阴性对照，以加等量无菌水的PDB菌丝体溶液作为对照组，每个处理设定3个平行，33 贵州大学硕士研究生论文从而确定组分A对水稻纹枯病的半数抑制浓度IC50和最小抑菌浓度MFC。半数抑制浓度是指目标菌受到50%抑制时药物的浓度，即此时水稻纹枯病菌丝体的干重为对照组的一半。最小杀菌浓度表示水稻纹枯病菌丝体的生长完全受到抑制时组分A的最低浓度。2.2.5.5组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞壁的影响植物真菌细胞壁中含有多糖，与刚果红结合形成红色复合物,从而使细胞壁染色。由于结晶紫是一种碱性染料，和细胞核中的DNA结合后把细胞核染成深紫色。鞣酸是一种酸性媒染剂，真菌细胞壁中的蛋白质等大分子物质遇到鞣酸变成沉淀；鞣酸与染色剂结合后形成不易溶解的化合物，增强细胞与染色剂的结合能力，降低了细胞壁和结晶紫结合能力以及通透性，从而使细胞壁染色更加清晰。经过染液处理后，在显微镜下可以观察到完整菌体细胞中无色或淡紫色的细胞质和完整的细胞壁，而对于细胞壁被破坏的菌体细胞，由于染液能进入细胞质使整个细胞都被染成的深紫色，从而不能观察到细胞壁。利用这种染色原理，本实验采用2%刚果红酒精溶液和2%结晶紫酒精溶液作为为染色剂，10%鞣酸溶液作为固定液，显微镜观察组分A对水稻纹枯菌菌丝体细胞壁的影响。向灭菌后的PDB培养基中接种水稻纹枯病菌丝体后，28℃环境中120r/min培养24h，加入215μg/mL的组分A溶液，以不作任何处理的培养基作为对照组，相同条件下分别培养0.5、1、2、3h后，过滤后用PBS缓冲液洗涤菌丝体3次，挑取正常生长和生长受抑制的菌丝体，加10%的鞣酸溶液使其固定在载玻片上，放在酒精灯外焰上微热5min，加2%结晶紫酒精溶液染色5min，用无菌水洗去残余的染液，再滴加2%刚果红酒精溶液染色5min，无菌水洗去残余的染液，待干，显微镜下观察菌丝体的形态。2.2.5.6组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞膜的影响采用M.Ashraf等（2008）人的方法，收集处于对数生长期的水稻纹枯病的菌丝体，用无菌水洗涤3次，称取2g菌丝体湿重放入15mL的离心管中，再加入215μg/mL的组分A溶液，分别测定每个处理组的电导率底值J0，然后在28℃环境中120r/min分别培养60、120、180、240、300、360min后，3000r/min离34 贵州大学硕士研究生论文心10min，测定上清液电导率J1；然后把上清液和菌丝体煮沸15min，待菌丝体和上清液冷却后3000r/min离心10min，测定上清液电导率J2。以无菌水处理作阴性对照，14μg/mL的两性霉素B溶液处理作为阳性对照，每组处理设3个平行。按下面的公式计算每段时间内上清液的相对渗透率。相对渗透率(%)=（J1-J0)/(J2-J0)×100%2.2.5.7组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞核DNA的影响本实验采用凝胶阻滞实验（GelShiftAssay）来探索组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞核DNA的影响(Munozetal,2006)。凝胶阻滞实验主要是研究DNA与特异性蛋白的相互作用，其原理是通常是放射性标记的DNA片段与纯化蛋白或者含蛋白质的混合物相结合，然后在非变性凝胶中分析该产物。与游离的DNA相比，蛋白质-DNA复合物的迁移率降低，且条带模糊。因此，与游离DNA相对应，可以观察到条带中的“阻滞”。水稻纹枯病菌丝体DNA的提取，用无菌刀片轻轻从铺满水稻纹枯病菌丝体的平板上刮取新鲜菌丝，注意尽量不要将培养基一起刮下。将菌丝置于无菌滤纸片上吸干水分，收集到一个1.5mL的离心管中备用。参照Biomiga公司的GD2416-01型真菌DNA提取试剂盒说明书，菌株基因组DNA的提取方法如下：（1）向有菌丝的离心管加少量石英砂和600μLFG1，充分研磨；注：FG1于60℃提前预热，石英砂、研磨棒、离心管等需提前灭菌。（2）于65℃水浴20min，期间充分摇晃两次；（3）加140μLFG2，充分混匀，冰浴5min；（4）10000r/min室温离心10min；（5）取上清液于新的离心管，加入0.5倍体积的FG3溶液和1体积的无水乙醇，充分混匀；注：切勿吸到沉淀，无水乙醇提前要冰冻。（6）将混合液转移到带收集管的吸附柱中（分两次加），10000r/min室温离心1min，弃收集管和废液，留吸附柱，换新的收集管；（7）加650μLDNAWashBuffer，10000r/min室温离心1min，并且重复一次，弃收集管和废液；35 贵州大学硕士研究生论文（8）开盖离心2min，目的让乙醇充分挥发，弃收集管，留吸附柱；（9）更换新的1.5mL离心管，加60μLElutionBuffer，于65℃水浴5min，10000r/min室温离心5min；并重复一次；注：ElutionBuffer需提前于60℃水浴锅预热。（10）弃吸附柱，离心管内即为真菌DNA溶液，于-20℃保存待用。Binding缓冲液的配制：5%甘油、l0mMTris-HClpH8.0、1mMEDAT、1mMDTT、20mMKCl、50μg/mLBSA。Binding缓冲液溶解组分A，配制成100μg/mL、400μg/mL、600μg/mL的组分A溶液，取等量不同浓度的组分A溶液与等量的DNA相结合；配制2μg/mL、40μg/mL、60μg/mL的两性霉素B溶液，等量不同浓度的两性霉素B溶液与等量的DNA相结合作为阳性对照；等量的无菌水与等量的DNA结合作为阴性对照。3个处理组均在室温下孵育1h，跑1%琼脂糖电泳检测。2.2.6菌株HD13抑菌活性的稳定遗传2.2.6.1菌株HD13传代培养对抑菌活性的影响菌株HD13活化后，接种于LB平板培养基中进行传代培养，每次培养24h，将不同转接次数的菌株接种于发酵培养基中，在30℃下120r/min培养4.5d，将发酵液进行活性检验，指示菌为水稻纹枯病，考察不同培养代数菌株对水稻纹枯病的抑制率变化。2.2.6.2菌株HD13传代培养对目标物质的影响本实验从菌株HD13发酵液中分离得到的具有抑菌活性的组分A，其主要成分是一种物质，HPLC检测条件为：波长210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，流动相为乙腈（0.1%TFA）：水（0.1%TFA）=15:75。将不同培养次数的菌株，接种于发酵培养基后30℃下120r/min培养4.5d，正丁醇萃取发酵液，50℃浓缩后将提取物溶于色谱甲醇，HPLC检测，考察培养次数对目标物质的影响。36 贵州大学硕士研究生论文第三章结果与分析3.1主要培养基的优化3.1.1菌株HD13对不同植物病原真菌抗菌活性的影响由表1可知，发酵滤液对8株植物病原真菌均有明显的抑制效果，其中发酵液对水稻纹枯病的抑制效果最好，抑制率为80.00%，对水稻稻疫病和小麦赤霉病的抑制率较低，分别为47.94%和48.58%，故选水稻纹枯病作为指示菌用于后续试验。表1菌株HD13对不同植物病原真菌的抗菌活性Table1ResistanceofHD13fermentfiltrateplantpathogenicfungi项目ABCDEFGH对照组直径/nm7581837978758276菌落直径/nm1926393743413334抑制率/%80.0072.3656.4156.7647.9448.5863.6459.15注：A为水稻纹枯病菌，B为烟草黑胫病，C为辣椒灰霉病，D为番茄黑斑病，E为水稻稻疫病,F为小麦赤霉病，G为辣椒炭疽病，H为番茄早疫病。Notes:A,Magnaporthegrisea(T.T.Hebert)M.E.Barr,BGibberellazeae(Schwein)Petch,C，BotrytiscinereaPers,D，AlternariasolaniSorauerZ.Pflkrankh.Pflschutz,E，Magnaporthegrisea(T.T.Hebert)M.E.Barr,F，hytophthoranicotianaeBredadeHan,G，Colletotrichumgloeosporioides(Penz)Penz.&Sacc,H，Alternariaalternat(Fr)Keissl.3.1.2初始培养基的筛选由表2可知，用不同培养基培养HD13菌株，结果表明，LB培养基和基础培养更利于菌株HD13抗菌物质的生产，其次为PDB培养基和基础培养基1，最后为培养基2，故选择基础培养基进行优化。37 贵州大学硕士研究生论文表2不同培养液对HD13菌株发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Table2AntifungaleffectofdifferentmediumtostrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris菌落直径变异系数培养基抑制率/%95%置信度/%/nmC•V/%LB2569.91±1.86a65.2874.542.66基础培养基甘露醇3162.19±3.15b53.1171.275.87PDB3361.79±1.85b57.1766.403.00培养基13456.91±2.53c50.6063.224.46培养基2757.65±2.44d1.5613.7332.013.1.3最佳碳源的筛选6种碳源配制的培养基接种菌株HD13发酵7d后，其发酵滤液均对水稻纹枯病菌有一定抑制作用(表3.1.3)，每种碳源对HD13抗水稻纹枯病菌活性有显著性影响（P<0.05），蔗糖、葡萄糖和麦芽糖较有利于抗菌物质的产生，其中以蔗糖为碳源的培养基抑制率最佳，乳糖、甘露醇和淀粉配制的培养基不利于活性物质的产生，因此选择蔗糖作为最佳碳源。表3不同碳源对HD13菌株发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Table3AntifungaleffectofcarbonsourcetostrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris菌落直径变异系数碳源抑制率/%95%置信度/%/nmC•V/%CK73蔗糖2566.67±2.16a63.9672.375.54葡萄糖3461.32±2.01a55.6760.624.01甘露醇麦芽糖3355.98±2.56ab52.0461.293.07乳糖3139.23±5.43b31.2147.1913.24甘露醇5526.78±5.87c17.8635.7321.25淀粉6024.33±2.13d18.0925.6417.433.1.4最佳氮源的筛选7种氮源配制的培养液发酵7d后，其发酵滤液均对水稻纹枯病菌有一定抑38 贵州大学硕士研究生论文制作用(表4)。各氮源对HD13抗水稻纹枯病菌活性有显著性影响（P<0.05），其中以牛肉膏为氮源的培养液抑制率最佳，因此选择牛肉膏作为最佳氮源。表4不同氮源对HD13菌株发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Table4AntifungaleffectofnitrogensourcetostrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris菌落直径变异系数氮源抑制率/%95%置信度/%/nmC•V/%CK63牛肉膏1280.42±5.57a38.1969.7411.76酵母膏1575.66±4.84a63.6187.706.40甘露醇蛋白胨3753.97±6.35b66.5794.266.93尿素3642.32±8.14b22.0862.5619.25硫酸铵4921.16±1.83c16.6125.708.643.1.5无机盐对抑菌活性的影响表5无机盐离子对HD13菌株发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Table5EffectofinorganictostrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris菌落直径变异系数无机盐抑制率/%95%置信度/%/nmC•V/%CK73K2HPO42368.46±3.40a60.0176.914.97NaCl2763.51±3.57b54.6272.405.63MgSO43059.01±2.81bc52.0265.994.76CaCl23256.76±1.35cd53.4060.112.38(NH4)2SO43454.05±1.35d50.6854.582.51由表5可知，选取MgSO4、氯化钠、K2HPO4、(NH4)2SO4和CaCl25种无机盐的培养基，其发酵滤液均对水稻纹枯病菌有一定抑制作用，其中抑菌活性最好的是K2HPO4和氯化钠，其次是MgSO4、(NH4)2SO4和CaCl2，且加入各种无机盐的发酵液对水稻纹枯病的抑菌活性差异明显（P<0.05），故选择K2HPO4和氯化钠作为菌株HD13培养基的最佳无机盐。39 贵州大学硕士研究生论文3.1.6K2HPO4与抑菌活性807570/%6560抑制率555045400123456K2HPO4浓度（g/L)图1不同浓度K2HPO4对抑菌活性的影响Fig1EffectofK2HPOonstrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris不同浓度的K2HPO4对菌株HD13抗水稻纹枯病的活性影响（图1），培养基+2-中K2HPO4的浓度过低，菌株HD13因生长所需的K、PO4不足而不能有效的繁殖，但无机盐的浓度过高，也能抑制菌株HD13的生长，但高浓度的无机盐改变菌体细胞的渗透压，从而对细胞造成影响，进一步抑制菌体的生长。从图中可以得出，菌株HD13培养基的最佳K2HPO4浓度为4g/L3.1.7氯化钠与抑菌活性钠盐是细菌生长所必需的无机盐离子，但氯化钠的浓度过低或过高都不利于菌体的生长。由图2可知，低浓度时，抑菌活性随着氯化钠浓度的增加而增大，但当氯化钠的浓度超过2g/L时，发酵液对水稻纹枯病的抑菌活性不断下降，经过方差分析，发现不同浓度氯化钠的发酵液拮抗水稻纹枯病的差异性显著（P<0.05），因此确定氯化钠的最佳浓度是2g/L。40 贵州大学硕士研究生论文807060%5040抑制率302010000.511.522.533.544.555.56NaCl浓度图2不同浓度氯化钠对抑菌活性的影响Fig2EffectofNaCLonstrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris3.1.8发酵培养基主要成分的正交试验由均值可以确定最佳培养基成分是蔗糖20.0g/L、牛肉膏7.0g/L、K2HPO4为4g/L，NaCl为2g/L（表6），从极差值得出，影响HD13抗菌活性因素依次为牛肉膏＞氯化钠＞K2HPO4＞蔗糖，牛肉膏对菌株HD13的抗菌活性起主导作用，其次为氯化钠（表2.8）。表6正交试验结果Table6Theresultsoforthogonaltest处理蔗糖牛肉膏K2HPO4NaCl空白抑制率/%11111151.87±1.0221222258.76±1.7531333365.65±1.3441444455.77±0.7752123454.64±0.6562214359.23±0.8772341271.32±1.4382432161.12±1.4641 贵州大学硕士研究生论文93134261.15±2.46103243157.69±0.99113312455.65±2.75123421367.43±0.98134142368.54±1.02144231448.56±1.32154324154.23±1.31164413260.43±0.12k158.0153.0558.1958.7757.88k261.5754.9159.7658.9962.91k360.4861.7157.1162.6065.21k457.9459.7755.2957.6953.66R5.298.664.474.7311.55最佳组2323合合表7有重复观测值正交试验结果方差分析表Table7Analysisofvarianceoforthogonalresults变异来源SS离均差平方和自由度DF均方MSFP校正模型7899.44113635.6499.1230.000截距93717.459195695.4591679.8070.000蔗糖161.074358.0250.7950.654牛肉膏5432.67831870.425**26.4590.000K2HPO4568.8493198.9502.3600.085氯化钠1890.4093659.200*9.5680.0013.2发酵条件的优化3.2.1培养基初始pH值的考察42 贵州大学硕士研究生论文7060/%50抑制率40302010045678910PH图3不同初始pH对HD13菌株发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Fig3EffectofinitialpHonstrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris由图3可以看出，培养基初始pH过高过低都能降低菌株HD13发酵液的抑菌活性，当初始pH为7.0时，其发酵滤液抗水稻纹枯病菌抑制率最高，说明中性条件下更有利于HD13发酵滤液中抗菌物质的累积。3.2.2接种量对抑菌活性的影响757065/%60抑制率555045400246810接种量/%图4接种量对抑菌活性的影响Fig4EffectofvolumeofinoculumonHD13fermentfiltrateonT.cucumeris本实验在装液量为100/250ml培养基的三角瓶中，分别接入1%、2%、4%、43 贵州大学硕士研究生论文6%、8%、10%的种子液，置于摇床120r/min，28℃恒温培养7d，比较不同接种量发酵液对水稻纹枯病抑制活性的影响。由图4可以看出，当接种量为8%时，发酵液的抑菌活性达到最大；接种量大于8%时，发酵液的抑菌活性变化不大，经过显著性分析，不同接种量发酵液的抑菌活性差异明显（P＜0.05），所以选择8%作为最佳接种量。3.2.3菌株HD13最佳吸收波长的测定由图5可见，当波长在300～440nm时，菌液的OD值较大，但有大部分透过酶标仪中96孔板的光束被培养基吸收，以至于培养基的OD值也比较大，影响了菌液的吸光度值。虽然在此波长范围内，菌液与培养基OD值的差值最大，但不是最佳吸收波长。波长在450～470nm，培养基的OD值趋于零，两者的吸光度差值达到最大，平均为0.56。当波长超过480nm时，虽然培养基的吸光度值接近零，但菌液的吸光度值也在减小，两者的差值液在减小，平均为0.49。因此，选用460nm为菌株HD13的最佳吸收波长。2.52值OD1.5原始培养基1菌液0.50300350400450460470480490500550600波长/nm图5培养基和菌液在不同UV波长下的OD值Fig5TheODvalueofmediumandbacterialliquid3.2.4菌株HD13最佳发酵时间的测定44 贵州大学硕士研究生论文1001.290180700.860%值500.6OD抑制率抑制率400.4OD值30200.2100000.511.522.533.544.555.566.57培养时间/d图6不同发酵时间的OD值和抑菌活性Fig6AntifungalactivityandODvalueofdifferentculturingtime由图6可知，在发酵过程中，发酵液的OD值和对水稻纹枯病菌的抑制率不断增大。在0～2d内发酵液的OD值迅速提高，在第2天时OD值达0.8以上，此时培养液中营养物质丰富，有利于细菌的生长。在2～7d时OD值增长缓慢，OD值变化平稳，在第7天达1.01。在0～4d时，HD13菌株发酵液中抗菌物质产生较快，抑制率达72.41%。在4.5d时抑制率达79.31%。此后由于营养物质的消耗和有害代谢产物的积累，抑制率提高缓慢，趋于平稳，保持在80%左右。菌株HD13在30℃下的最佳发酵时间为4.5d3.2.5不同培养方式的考察9080706050/%4030抑制率20100摇床培养静置培养摇床静置培养方式图7不同培养方式对HD13菌株发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Fig7EffectofcultureonstrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris45 贵州大学硕士研究生论文由图7可以看出，110r/min摇床发酵3d后再静置培养的发酵滤液抗水稻纹枯病菌抑制率明显高于摇床培养和静置发酵30d的，静置培养的抑菌活性最小，说明摇床后静置发酵更有利于菌株HD13发酵滤液中抗菌物质的累积，其原因可能是HD13菌株在摇床时氧气充足，再静置培养条件下更有利于次级代谢产物的累积。3.3发酵液抑菌活性的稳定研究3.3.1分泌类型的检验由图8可知，发酵液经过离心后，上清液对水稻纹枯病的抑菌活性明显大于菌体裂解液的抑菌活性。经过相关分析，上清液对水稻纹枯病的抑制率为79.64%，而菌体裂解液的抑制率仅为25.87%，且两者之间差异性明显（P<0.05），说明菌株HD13的抑菌活性物质主要是胞外物。90807060%5040抑制率3020100上清液菌体裂解液图8分泌方式对抑菌活性的影响Fig8Antifungalactivityofsecretionmode3.3.2发酵液热稳定性的考察发酵滤液经30℃、50℃、70℃、90℃水浴处理及121℃高温高压灭菌处理后，其对水稻纹枯病菌抑制率分别为62.66%、61.33%、58.00%、58.66%、54.66%，对照组为66.82%（表8）。经方差分析P值为0.089（P＞0.05，n=3），说明发酵滤液经这些高温处理对其抑菌活性没有受到影响，由此可见发酵滤液中的抗菌物质对热不敏感。46 贵州大学硕士研究生论文表8不同温度对HD13发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Tale8AntifungaleffectofdifferenttemperaturetoHD13fermentfiltrateonT.cucumeris温度菌落直径变异系数抑制率/%95%置信度/%/℃/nmC•V/%CK5001966.82±0.08a55.0770.254.87301862.66±3.05a50.1675.168.03502161.33±5.03ab48.8373.838.20702058.00±5.29ab44.8571.149.12902158.66±3.05ab51.0766.255.201212354.66±3.05b47.0762.255.583.3.3pH值对发酵液稳定性的影响8075706560/%5550抑制率45403530252001234567891011121314PH图9不同pH值对HD13发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Fig9AntifungaleffectofdifferentpHtoHD13fermentfiltrateonT.cucumeris由图9可知，pH为4～10时抑菌率较高，为发酵滤液中抗菌物最适pH范围，说明发酵液中的抑菌物对酸碱的耐受范围较宽。pH为7～8时其对水稻纹枯病菌抑制率最高。pH值在5以下，抑制率随着pH值的减小而降低，说明过酸条件下对发酵滤液中的抑菌物活性有明显影响。pH值在10以上，抑制率随着47 贵州大学硕士研究生论文pH值的加大而降低，说明过碱条件下对发酵滤液中抗菌物质活性有明显影响。3.3.4不同饱和度硫酸铵对发酵液抑菌活性的影响由于菌株HD13发酵液含有蛋白质类物质，且菌株产的抗生素多为脂肽类物质，用不同饱和度的硫酸铵或不同浓度的盐酸均能使这些物质分级沉淀，使脂肽或蛋白质类物质与发酵液分开。由表9可知，不同硫酸铵饱和度分级沉淀，当硫酸铵饱和度达到10％时，观察到有一些不明显絮状沉淀，达到30％及以后絮状沉淀明显，其中50％硫酸铵沉淀得率最高。采用菌饼法测定抑菌活性，结果表明，50％~90％硫酸铵沉淀对水稻纹枯病均有较强的抑菌活性，各级沉淀抑菌活性没有显著差异。表9不同硫酸铵饱和度对HD13菌株发酵滤液抗水稻纹枯病菌活性的影响Table9Antifungaleffectofdifferentsaturationof(NH4)2SO4tostrainHD13fermentfiltrateonT.cucumeris菌落直径变异系数硫酸铵%抑制率/%95%置信度/%/nmC•V/%CK76104828.94±1.85d12.2345.656.42304735.96±2.01c30.9740.965.59504339.03±2.18bc34.0344.025.15704241.66±2.01ab36.8849.956.05904143.42±2.63a35.4541.4213.433.3.5紫外光对发酵液抑菌活性的影响紫外光照射0h、1h、2h、3h、4h、5h和6h后检验其活性，发现其对水稻纹枯病菌抑制率分别为62.06%、59.29%、60.35%、56.68%、64.35%、59.84%和65.79%(图10)。经方差分析得到P值为0.49（P<0.05，n=3），说明随着紫外光照射时间的增长，发酵滤液中活性物质对水稻纹枯病拮抗性差异不显著，表明发酵滤液中抗真菌物质对紫外光不敏感。48 贵州大学硕士研究生论文706050%40抑制率302010001234567时间图10紫外线对HD13发酵滤液抗水稻纹枯病活性的影响Fig10AntifungaleffectofUVtoHD13fermentfiltrateonT.cucumeris3.3.6储存时间对发酵液抑菌活性的影响706050/%4030抑制率201000102030405060708090100时间图11不同储存时间对HD13发酵滤液抗水稻纹枯病活性的影响Fig11AntifungaleffectofdifferentstoragetimetoHD13fermentfiltrateonT.cucumeris发酵滤液于4℃下分别储存10d、30d、50d、70d和90d后，检验其对水稻纹枯病菌抑制率分别为52.95%、52.85%、55.26%、54.82%和53.35%，对照组对水稻纹枯病的抑制率为54.76%，试验组比对照组的抑制率略有下降趋势49 贵州大学硕士研究生论文（图11），经方差分析P值为0.118（P＞0.05，n=3），说明随着储存时间的增长，发酵滤液中抗真菌物质的抑菌活性差异不显著，表明发酵滤液中抗真菌物成分比较稳定。3.3.7不同浓度发酵液对抑菌活性的影响为探究发酵液浓度与OD值和抗菌活性的关系，通过对不同浓度发酵液OD的测量值以及拮抗水稻纹枯病抑制率的检测，其结果如表10，发酵液的浓度与OD值、抑制率基本呈正相关，发酵液的浓度为60%以上时，OD值均大于0.8，抑制率均大于50%。经过相关分析，发酵液的毒力回归方程为y＝0.4621x＋4.2336，R²＝0.9755，半抑制浓度(IC50)为48.63%。表10不同浓度发酵液的抗菌活性Table10ResistanceComparisonfermentfiltrateonplantpathogenicfungi浓度菌落直径95%置信度OD值抑制率/%变异系数/%/%/nm/%CV0076000———200.284341.32±1.21c38.3244.322.91400.613749.00±1.01b46.9152.072.22600.833552.33±0.98ab49.8654.471.72800.993751.45±1.03a47.8952.961.981001.093454.45±0.54a52.1256.781.653.3.8发酵液OD值与生物量和抑菌活性的关系3.3.8.1OD值与生物量的关系建立反应OD值与各种生物量和抗菌活性变化关系的直线回归方程y=kx＋b。根据图12得出，OD值与菌液中活菌数（y）的直线回归方程：y＝1.5856x＋0.0605，R²＝0.9919；OD值与菌液湿重（y）的直线回归方程：y＝7.2232x＋1.0802，R²＝0.9919；OD值与菌液干重（y）的直线回归方程：y＝0.951x＋0.0722，R²＝0.9158。50 贵州大学硕士研究生论文91.28y=7.2232x+1.08021y=0.951x+0.07227R²=0.9278R²=0.915860.8g/L)g/L)50.64干重（湿重（30.420.210000.10.20.30.40.50.60.70.80.9100.10.20.30.40.50.60.70.80.91OD值OD值1.61.4y=1.5856x+0.0605R²=0.99191.2/个）18100.80.6活菌数（0.40.2000.10.20.30.40.50.60.70.80.91OD值图12OD值与生物量的关系Fig12TherelationshipbetweenODvalueandbiomass3.3.8.2OD值与抗菌活性的关系由于菌株HD13在不同的发酵时间内发酵液都有特定的OD值和与之对应的抑制率，可得出反应OD值与抑菌率的关系式。根据图13可知，OD值与病原真菌抑制率（y）的回归方程为：y＝84.166x-3.9601，R²=0.9482。根据此关系式，利用OD值可以初步了解菌株HDI3发酵液对植物病原真菌的抗菌活性。51 贵州大学硕士研究生论文1009080y=84.166x-3.9601%70R²=0.948260抑制率5040302010000.10.20.30.40.50.60.70.80.911.1-10培养时间/d图13OD值与抗菌活性的关系Fig13TherelationshipbetweenODvalueandantifungalactivity3.4活性组分的分离纯化3.4.1不同有机试剂萃取发酵物后的抑菌活性发酵滤液经不同极性的有机试剂处理后对其抗菌活性有影响。由表11可知，正丁醇、二氯甲烷、异丙醇萃取液对水稻纹枯病的抑制率较高，其次是乙酸乙酯、丙酮、乙腈、氯仿，抑菌效果最差的是石油醚和正己烷，经方差分析表明，与对照组相比，不同有机溶剂对发酵滤液中抗真菌物存在差异极显著（P<0.05），说明发酵液中抗菌物质对有机溶剂敏感。因此确定选用正丁醇萃取发酵液。表11不同有机溶剂对HD13发酵滤液抗水稻纹枯病活性的影响Table11AntifungaleffectofdifferentorganicsolventtoHD13fermentfiltrateonT.cucumeris菌落直径变异系数有机试剂抑制率/%95%置信度/%/nmC•V/%CK73正丁醇2071.68±4.81a59.7383.636.71二氯甲烷甘露醇2467.12±1.37b63.7170.522.04异丙醇2664.38±2.74bc57.5771.184.2652 贵州大学硕士研究生论文乙酸乙酯2860.72±3.13c52.8469.826.62丙酮2860.72±4.81cd48.7772.677.92氯仿3255.70±4.85ad48.6162.785.12乙腈4735.16±5.70e20.9949.3316.22石油醚669.13±4.18f1.2619.5345.83正己烷669.13±2.85f2.0416.2131.233.4.2提取物效价的测定表12不同浓度浸膏溶液的抑菌活性Table12ResistanceComparisonextractonplantpathogenicfungi菌落直径变异系数浓度(g/L)抑制率/%95%置信度/%/nmC•V/%CK710.254930.98±4.22a20.4941.4813.63甘露醇0.504338.50±2.15b33.1443.855.591.003846.01±3.54c37.1954.827.712.003253.99±2.51d48.6359.343.994.002366.66±3.54e57.8675.465.31正丁醇萃取发酵液和甲醇萃取固体发酵物的浸膏，合并两种萃取液，50℃浓缩至浸膏，得到提取物649.29g。对不同浓度的浸膏溶液抑菌检测表明（表12），随着浸膏浓度的增大，其对水稻纹枯病的抑制率也不断增大，方差分析表明，各梯度浓度溶液的抑制率差异明显（P<0.05），浸膏溶液的毒力回归方程为y=0.66x2+5.01，R=0.95，IC50为1.25g/L。3.4.3硅胶柱层析根据Kajimura等(1996)的方法，将浸膏利用硅胶柱层析后，对不同组分进行抑菌试验，结果表明，氯仿：甲醇=4:1~2:1的洗脱液收集到的组分有抑菌活性，10:1~6:1的组分主要是一些没有抑菌活性的色素，1:1洗脱下来的组分主要是一些小分子物质、盐类等。通过4次硅胶柱层析，可以除去浸膏中的色素和一些小53 贵州大学硕士研究生论文分子物质，收集有活性的组分，50℃浓缩至浸膏，得到10g有抑菌活性的组分，记为活性组分Ⅰ。3.4.4分子筛层析DAD1A,Sig=210,4Ref=off(ZSG2015-12-204728.D)mAU80070060050040030020010000246810121416min图14活性组分Ⅱ的HPLC分析Fig14TheHPLCanalysisofextractⅡ乙睛的最大紫外吸收波长是190nm，小于脂肽类的吸收波长(214nm)；TFA对脂肽类和蛋白有良好的溶解性，具有较强的离子对作用，这两个原因有利于脂肽类HPLC分析。参照BeattyPH等人的方法（2000），将活性组分1经过SephadexLH-20柱层析，检验活性后，合并有抑菌活性的组分，得到活性组分Ⅱ。经过HPLC分析表明，活性组分Ⅱ成分较复杂，存在不同极性的物质（如图14所示），还需进一步处理。3.4.5活性组分的分析3.4.5.1活性组分的处理活性组分Ⅱ经过乙酸乙酯萃取后，分别浓缩处理沉淀和上清液部分，称重，得到两个活性组分，沉淀部分记为活性组分A（2.21g），上清液部分活性组分B。组分A为黄色粉末，组分B为油状液体。54 贵州大学硕士研究生论文3.4.5.2活性组分的TLC层析将展开后的薄层板分别在自然光、254nm、365nm紫外荧光下观察两个组分的层析结果，如图15所示，组分A的成分较单一，组分B的成分较复杂。注：a为自然光，b为254nm紫外光，c为365nm紫外光Notes:a,naturallight;b,254nmUV;c,365nmUV图15活性组分A和B的TLC分析Fig15TheTLCanalysisofextractAandB3.4.5.3活性组分的HPLC检测HPLC分析表明（图16），组分A的成分较单一，HPLC图中只有一个主要峰形，记为物质A，多次检测分析表明，组分A中物质A的纯度达到78%；组分B的成分比较复杂，存在许多极性大小不一的物质。两个组分的HPLC检测条件为：波长210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，流动相为乙腈（0.1%TFA）：水（0.1%TFA）=15:85。55 贵州大学硕士研究生论文DAD1A,Sig=210,4Ref=off(ZSG2015-12-274794.D)mAU17515012510075502500123456789minDAD1A,Sig=210,4Ref=off(ZSG2015-12-264793.D)淀的mAU10080604020002468101214min图16组分A和B的HPLC分析Fig16TheHPLCanalysisofextractAandB3.4.5.4活性组分的初步分析观察两个活性组分与茚三酮溶液和双缩脲试剂反应的颜色变化，其结果发现，组分A与双缩脲反应时，颜色变为紫红色，对照组没有颜色变化；与茚三酮反应时，颜色没有变化，但加入水浴锅加热后，颜色很快变成紫色，对照组无颜色变化，说明组分A中有部分分子分解，产生游离N端，因此组分A可能是多肽或蛋白质。组分B与双缩脲反应时，颜色为淡紫色，与茚三酮反应没有颜色56 贵州大学硕士研究生论文变化，说明组分B主要是非蛋白类物质。3.4.5.5组分的抑菌活性评价对组分A和B的抑菌效果表明（图17），组分A和B对水稻纹枯病都有一定的抑制效果，且组分A的抑菌效果比组分B的好。组分A的成分主要是一种，可能是其中的物质A起抑菌作用；而组分B的成分有多种，可能是多种的物质联合抑菌作用。图17组分A和B对水稻纹枯病的抑制效果Fig17AntifungaleffectofextractAandB3.5组分A抗植物病原真菌的活性初探3.5.1组分A对不同植物病原真菌的抑菌活性组分A对4种植物病原真菌的抑制效果如图18，由图可以看出，组分A对水稻纹枯病的抑制效果最明显，其次是烟草黑胫病和水稻稻疫病，对辣椒灰霉病没有明显抑制作用。经过计算得出，组分A对4种病原菌的抑制率分别为73.28%、64.09%、45.54%、9.81%。57 贵州大学硕士研究生论文注：a,b为水稻纹枯病；c,d为水稻稻疫病；e,f为辣椒灰霉病；g,h为烟草黑胫病。Notes,a,b:Thanatephoruscucumeris(A.B.Frank)Donk;c,d:Magnaporthegrisea(T.T.Hebert)M.E.Barr;e,f:OtrytiscinereaPers;g,h:PhytophthoranicotianaeBredadeHaan.图18组分A对不同病原真菌的抑制效果Fig18ResistanceofextracteAtoplantpathogenicfungi3.5.2组分A水稻纹枯病菌丝体形态的影响组分A溶液处理水稻纹枯病菌丝体后，菌丝体和细胞质都发生明显的变化，如图19所示，与对照组（图a）相比，组分A处理后水稻纹枯病的菌丝体弯曲、膨大（图b）；有些菌丝体产生了畸形囊泡，菌丝体细胞内原生质体浓缩，菌丝体顶端产生了大量无规则分支（图c,d）。58 贵州大学硕士研究生论文注：a为对照组，b、c、d为试验组Notes:aiscontrolgroup;b,canddaretreatmentgroup图19组分A对水稻纹枯病菌丝体的影响Fig19AntifungaleffectofextracteAtoplantpathogenicfungalmycelium3.5.3水稻纹枯病菌丝体生长曲线的确定采用干重法来探讨水稻纹枯病菌丝体与生长时间的关系，如图20所示，在生长时间内，水稻纹枯病菌丝体的生长曲线呈“S”型，在0-2d内，水稻纹枯病菌丝体生长缓慢，此时是该菌的生长延滞期；菌株在2-6d内进入生长期，此时菌株生长迅速；6d后菌株在生长趋势平缓，开始出现下降趋势，进入生长衰退期。由于水稻纹枯病在快速生长期内快速生长，新陈代谢代谢旺盛，因此，本实验选择培养4d的水稻纹枯病菌丝体为后续实验的研究对象。59 贵州大学硕士研究生论文32.52/g干重1.510.50012345678时间/d图20水稻纹枯病菌丝体的生长曲线Fig20ThegrowthcurveofThanatephoruscucumeris3.5.4组分A对水稻纹枯病菌丝体生长的影响分别用不同浓度的组分A溶液和两性霉素B溶液处理后，水稻纹枯病菌丝体的生长明显受到抑制，且两个物质的浓度越高，水稻纹枯病的生长受到的抑制越明显。由表13可知，当组分A的浓度达到124μg/mL，两性霉素B的浓度为1.6μg/mL时，菌丝体生长的抑制率达到50%；当组分A的浓度为215μg/mL，两性霉素B的浓度为14.0μg/mL时，PDB液体培养基中没有菌丝体生长。由此得出，组分A和两性霉素B的IC50值分别为124μg/mL和1.6μg/mL，MFC值分别是215μg/mL和14.0μg/mL，可见组分A的杀菌能力不如两性霉素B的杀菌能力。表13组分A对水稻纹枯病的生长抑制Fig13GrowthinhibitionofextracteAandamphotericinBtoThanatephoruscucumerisIC50(μg/mL)MFC(μg/mL)组分A124±2.12215±1.23两性霉素1.6±3.4214.0±1.453.5.5组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞壁的影响组分A处理水稻纹枯病菌丝体后，显微镜观察细胞壁的形态，如图21所示，60 贵州大学硕士研究生论文注：a为未处理组;b为0.5h;c为1h;d为2h;e为3h.Notes:a,0h;b,0.5h;c,1h;d,2h;e,3h.图21组分A对菌丝体细胞壁的影响Fig21AntifungaleffectofextracteAtofungalcytoderm61 贵州大学硕士研究生论文处理30min后，水稻纹枯病菌丝体整体呈淡紫色，与对照组相比没有明显变化，说明此时细胞壁还未破损；处理1h后，由于细胞壁开始破损，染料进入细胞内部，水稻纹枯病菌丝体细胞核被染成淡紫色；处理2h和3h后，由于水稻纹枯病菌丝体细胞壁破损严重，染料能够进入菌丝体，菌丝体细胞核被染成紫色，可以看见清晰的细胞核。本实验得出组分A对水稻纹枯病菌丝体的细胞壁和细胞膜都有严重的破坏作用，说明组分A对水稻菌丝体细胞壁有一定的影响。3.5.6组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞膜的影响100908070/%60渗透率50两性霉素B40组分A30水20100060120180240300360时间/min图22渗透率的变化曲线Fig22Themutativecurveofpermeability组分A和两性霉素B处理水稻纹枯病菌丝体后，测定菌丝体浸出液的电导率，相应的渗透率如图22所示，处理30min后，两者浸出液中电解质的相对渗透率无明显变化，且两者间的差异较小；处理60~80min后，两者浸出液中电解质的相对渗透率显著升高，但两性霉素B处理后的浸出液相对渗透率变化大于组分A；处理180min后，两者浸出液中电解质的相对渗透率变化相等，无明显变化。在整个处理之间，处理组浸出液中电解质的相对渗透率始终大于阴性对照，说明组分A与水稻纹枯病菌丝体相互作用时，在处理后60~80min内对水稻纹枯病菌丝体的细胞膜产生了一定的破坏作用。62 贵州大学硕士研究生论文3.5.7组分A对水稻纹枯病菌丝体细胞核DNA的影响图23组分A和两性霉素B与水稻纹枯病DNA的结合作用Fig23AnalysisofDNA-bindingpropertiesofextracteAandamphotericinBbygelretardingassa采用凝胶阻滞实验，通过组分A和两性霉素B与水稻纹枯病菌丝体DNA的体外结合情况，研究组分A对水稻纹枯病细胞核DNA的影响。如图5.6所示，与对照组相比，随着组分A浓度增大，菌丝体细胞核DNA迁移率降低且条带模糊，说明组分A与水稻纹枯病DNA在体外可以非特异性结合；与对照相比，随着两性霉素B的浓度增加，菌丝体DNA的条带未发生明显变化，说明两性霉素B与水稻纹枯病菌丝体DNA在体外不能非特异性结合，表明组分A与两性霉素B对水稻纹枯病菌丝体的作用机制不同。这种现象也许与两者的结构不同有关，组分A中含有蛋白质或者脂肽类物质，可能是其与水稻纹枯病菌丝体DNA体外结合的主要原因之一。试验结果表明，组分A可能穿过细胞膜后与细胞核内的DNA等其它胞内目标物质发生了相互作用。63 贵州大学硕士研究生论文3.6菌株HD13抑菌活性的稳定遗传3.6.1菌株HD13传代培养对抑菌活性的影响菌株HD13连续培养7次，每培养一次进行活性检测，结果表明（图23），连续培养7次后，菌株HD13对水稻纹枯病的抑制率不断下降；第1、2次对水稻纹枯病的抑菌变化不明显，从第3次开始，菌株的抑菌活性缓慢降低，第7次得到最低。不同培养次数对水稻纹枯病的抑制率分别为78.12%、76.38%、74.54%、69.36%、65.21%、59.09%、54.98%、43.63%，且不同培养次数之间的差异明显（P<0.05），说明菌株HD13培养多次后的抑菌活性明显降低。908070/%6050抑制率40302010001234567传代次数图23菌株HD13传代培养对抑菌活性的影响Fig23AntifungalactivityofsubcultureonT.cucumeris3.6.2菌株HD13传代培养对目标物质的影响表14菌株HD13传代培养对目标物质的影响Table14Effectsofsubculturetoobjectivesubstance培养次数1234567物质A+++++++--注：“++”表示产生大量目标物质，“+”表示产微量目标物质，“-”表示不产目标物质Notes:“++”ismassobjectivesubstance,“+”isshadowobjectivesubstance,“-”isnobjectivesubstance.64 贵州大学硕士研究生论文菌株HD13多次培养后，HPLC检测组分A中的目标物质，其结果如表14所示，第1、2次培养菌株均能产生大量的目标物质，第3、4、5次菌株只能产生微量的的目标产物，第6、7次培养菌株没有产生目标产物。不同培养次数对主要目标物有明显的影响，说明菌株HD13传代培养多次后，不能稳定产生本实验分离得到的主要物质。65 贵州大学硕士研究生论文第四章小结与讨论4.1发酵条件的优化通过一系列试验，首先发现缺陷假单胞菌HD13对不同植物病原真菌具有广谱抗菌活性，对其最佳培养基进行优化，培养基的最佳组合是蔗糖2g/L、牛肉膏7g/L、K2HPO4为4g/L，NaCl为2g/L。菌株HD13的最佳吸收波长是460nm；对其发酵条件优化表明，把菌株HD13的培养基初始调节为中性，接种量为8%，30℃下110r/min培养4.5d，其抑菌效果最好，但摇床培养3d在静置培养15d，该结果有利于发酵滤液中抗菌物质产生，为进一步分离纯化该抗菌物质提供保障，从而为生物农药和新抗生素的应用奠定基础。据文献报道缺陷假单胞菌(B.bullata)因其可以产生有机磷酸酯水解酶，能有机磷酸酯类物质进行水解，现主要被用于降解有机磷类药物（廖敏等,2009；GillI.etal,2000）。有关其对多种植物病原菌广谱抑菌活性的报道相对较少。有报道指出缺陷假单胞菌能产生抗肿瘤代谢产物（吴燕杰，2014），说明缺陷假单胞菌作为一种生防微生物，在农业、医药上具有很大的生防价值和研究意义。不同的物质都有最佳的UV波长吸收值，李学贵等曾在470nm波长下测定假单胞菌液的吸光度值，乔军等(1996)人也在470nm波长下测定枯草芽孢杆菌的吸光度值，本试验也通过研究在不同波长下测定缺陷假单胞菌HD13的吸光度值，最终确定假单胞菌的最佳吸收波长在460～480nm。不同发酵时间对于细菌次级代谢产物的积累具有较大的影响，菌株HD13的发酵时间在4～5d。发酵时间过短，菌体尚未大量繁殖，主要以营养生长为主，此时产生的代谢产物较少；随着发酵时间的延长，菌体代谢产物逐渐积累，产生相应活性物质；发酵时间过长，培养基营养物质消耗殆尽，菌体老化，代谢产物合成能力下降，产生大量有毒物质，抑菌活性可能会出现下降趋势。菌株HD13进行发酵的第3天，发酵液的抑菌活性迅速增大，4.5d后趋于平稳，此时代谢产物累积量大，在生物农业和抗生素生产中具有较好的开发应用价值，值得进一步深入研究。66 贵州大学硕士研究生论文4.2发酵液抑菌活性的稳定研究微生物经过最佳培养基在最佳发酵条件下得到的发酵产物，必须对发酵产物的稳定性进行考擦，从而才能分离纯化有效的活性物质。生防细菌产生的抗生素多为脂肽类物质，而光、热、pH、有机试剂、紫外线等均能影响此类物质的活性，甚至引起它们变性失活。另外，存储时间也对发酵产物的活性造成很大的影响。本节实验利用不同浓度菌株HD13B.bullata发酵滤液水稻纹枯病进行抑菌活性研究。结果表明不同浓度发酵滤液对水稻纹枯病均有明显的抑制效果，发酵滤液的浓度为40%时，其对水稻纹枯病的抑制率都在50%以上，半抑制浓度(IC50)为48.63%，说明发酵滤液中具有丰富的抗菌成分，发酵液的浓度与OD值、抑制率基本呈正相关。发酵滤液中抗菌物质对植物病害具有很大的生防价值和研究意义，值得进一步研究与开发。其它试验也表明，菌株HD13发酵产物中抗植物病原真菌的活性稳定，温度、紫外线、储存时间等条件对活性物质的影响不大，尤其121℃高温高压灭菌处理后其抑菌活性没有明显变化；强酸强碱对它的活性有一定的影响。这些性质表明发酵滤液中抗菌物质在恶劣的环境下，稳定性好、活性高，在生物农业和抗生素生产中有良好的应用前景，具有一定的开发应用价值，值得进一步加强研究，为进一步防制水稻纹枯病菌乃至植物病原真菌提供基础，尤其开发高效微生物生防制剂。在探究OD值与生物量和抑菌活性的关系中，各种低浓度溶液吸光度值的测定都依据于朗伯比耳(LambertBeer)定律，浓度过低或过高都影响测定结果的准确性（曹晖，2004），根据该定律，选择OD值在0.9～1.0的菌液进行研究，结2果表明，菌液的OD值与生物量变化的回归方程R均大于0.9，证明在460nm波长下，菌株HD13的OD值与其在发酵过程中生物量变化呈正相关性。微生物在发酵过程中可以产生丰富的酶系和大量的次生代谢产物，在温和条件下有非常强大的分解转化物质的能力，能合成和制备许多包括医药、农药及中间体在内的复杂的功能化合物（HerbertHolland，1998）。因此，通过微生物发酵，实时监控转化菌的数量以及次级代谢产物的累积量，而得到所需的物质，但如何简化检测方法来检测和优化发酵过程，是微生物发酵过程优化控制技术研究的一67 贵州大学硕士研究生论文个方面，目前人们对微生物发酵过程优化控制技术研究较多（王建林,2008；李晓红,2005），如郭庆强等（2012）通过细胞密度仪得出微生物发酵过程中OD值与细胞数的关系。对菌株HD13进行发酵时，取不同发酵时间的发酵液（高浓度时可以稀释至一定范围内），在460nm波长下测定OD值，运用四个方程，可以快捷、准确地获取发酵过程中各种生物量的相关数据，随时检测发酵过程中生物量和抗菌活性的变化情况，指导微生物发酵的生产过程。4.3活性组分的分离纯化本节对菌株HD13进行液体发酵和固体发酵，浓缩发酵液体，先用甲醇萃取固体发酵物粉末，再用正丁醇萃取发酵液和甲醇萃取物，浓缩后得到649.29g浸膏，对浸膏的抑菌活性表明，浸膏对水稻纹枯病有强烈的抑制率，毒力回归方2程为y=0.66x+5.01，R=0.95，IC50为1.25g/L。经过硅胶柱和葡聚糖凝胶层析后得到具有抑菌活性的组分A和B，组分A成分较单一，主要成分是脂肽类或蛋白质类物质，HPLC检测条件为：波长210nm，柱温35℃，流速0.8mL/min，流动相为乙腈（0.1%TFA）：水（0.1%TFA）=15:85。组分B的成分比较复杂，但对水稻纹枯病有一定的抑制作用。细菌发酵液初步处理方法有硫酸铵沉淀，酸沉淀，有机试剂萃取等，再经过大孔树脂、葡聚糖凝胶、硅胶柱层析、离子交换层析等层析色谱，最后用制备型HPLC分离得到所需要的抗生素物质(Chenetal,2008;Yuanetal,2012)。在对活性组分进行分离纯化时，通常是根据TLC层析和HPLC检测结果或者紫外吸收峰合并相同组分，制备型HPLC分离不同梯度的流动相洗脱，这样有利于脂肽类抗生素的分离纯化。本章对活性组分的分离纯化时，都是根据抑菌活性合并组分，HPLC检测时，也是采用单一梯度的流动相，致使分离的到的组分比较复杂，得不到纯品，这是本章实验的不足之处。4.4组分A抗植物病原真菌的活性初探本节试验表明，从菌株HD13发酵液中分离得到的组分A对几种植物病原真菌具有一定的拮抗作用，但对水稻纹枯病的抑制效果最好。关于脂肽类抗生素的抗菌机制，目前认为主要是以“Barrel-Stave”作用机制68 贵州大学硕士研究生论文结合于细胞膜形成跨膜孔道（YunB-S,YooI-D,KimYH,etal.2000），裂解细胞膜导致细胞部分内容物的外泄而致使致细胞畸形或死亡，本实验中组分A对病原真菌菌丝体形态影响研究结果表明，菌丝体弯曲、膨大、产生畸形囊泡、菌丝体原生质体浓缩，产生大量无规则分支，表明组分A对水稻纹枯病抑制机理与“Barrel-Stave”作用机制相符合。一般认为，脂肽类抗生素对病原真菌的拮抗机理主要通过产生细胞壁降解酶、抗生素、诱导植物抗性，与寄主展开空间和营养的竞争等多种机制抑制植物病原菌的生长。其中脂肽类抗生素进入植物病原真菌后，诱导产生多种具有拮抗性的次生代谢产物，从而影响不同途径中病原真菌的生理生化特征，不易使病原真菌产生抗药性（潘顺，2013）。因为不同作用方式之间的协同作用，一些抗生代谢产物抑制菌丝体的生长，进一步通过细胞膜，破坏寄主细胞膜完整性，有利于抗生素进入寄主细胞发挥拮抗作用。本研究比较了组分A和两性霉素B对水稻纹枯病菌丝体DNA的体外结合情况。实验结果表明，两性霉素B不能与水稻纹枯病DNA在体外非特异性结合，而则组分A则可以，可能是组分A与两性霉素B的结构不同造成的，组分A中含有可与DNA中的碱基结合的极性氨基酸，而两性霉素B没有这些结构。同时表明，组分A引起细胞膜通透性改变后，可以进入细胞内部与核酸结合从而抑制DNA等分子的合成，对其它胞内物质造成影响，这与抗生素iturinA抑制酵母细胞生长的结果相符(Thimonetal,1995)。4.5菌株HD13抑菌活性的稳定遗传许多微生物在多次培养后，会出现生理生化活性的变化，甚至相应的生物活性也发生变化。在前面的研究中，组分A对几种植物病原真菌都有一定的抑制效果，且组分A的成分单一，主要包含一种物质。本章对菌株HD13传代培养后进行抑菌试验，同时对主要物质进行检测，探究了不同培养次数后菌株HD13的抑菌变化。本节实验简单探讨了缺陷假单胞菌HD13拮抗植物真菌的遗传稳定性，根据本实验分离得到的主要物质以及其HPLC检测条件，检验不同培养次数后对目标物质的产量的影响。结果表明，菌株HD13多次培养后，其抑菌活性不断降低，69 贵州大学硕士研究生论文且也不能稳定产生目标物质。菌株HD13产生的活性物质很多，本实验只是分离到了其中的一个组分，并对其中的主要成分进行分析，这对菌株HD13抑菌活性的稳定遗传分析有很大的局限性。第3、4次培养的菌株产生微量的目标产物，但有很大的抑菌活性。第6、7次培养的菌株没有产生目标物质，但对植物病原真菌有一定的抑制，说明还存在其它抑菌活性物质。70 贵州大学硕士研究生论文第五章结论与展望5.1结论本文对缺陷假单胞菌PseudomonasdiminutaHD13进行发酵条件的优化和发酵产物进行稳定研究，对其所产的脂肽类物质进行分离纯化，得到了一个具有抑菌活性的组分，且主要物质的纯度达到78%，同时初步探讨了组分A抗植物病原真菌的机理和菌株抑菌活性的稳定遗传，得到了一下研究成果：(1)采用菌饼法，得知菌株HD13对几种植物病原真菌具有广谱抑菌活性，其中对水稻纹枯病、烟草黑胫病的抑制效果最好；通过单因素试验和正交试验，获得HD13菌株最佳培养基成分为：蔗糖20.0g/L、牛肉膏7.0g/L、氯化钠2.0g/L、K2HPO44.0g/L；菌株HD13的最佳吸收波长是460nm；对其发酵条件优化表明，把菌株HD13的培养基初始调节为中性，接种量为8%，在30℃下110r/min培养4.5d，其抑菌效果最好，但摇床培养3d在静置培养15d，该结果有利于发酵滤液中抗菌物质产生。（2）菌株HD13的活性物质主要是胞外物，理化特性分析结果表明，发酵液稳定性高，对热、酸碱度不敏感，能抗紫外照射，储存时间稳定、50％~90％硫酸铵沉淀均有较强的抑菌活性，在食品防腐和植物生物防治方面有巨大的应用潜力。初步探讨了发酵液OD值与生物量变化和抑菌活性的关系，OD值与菌液中活菌数（y）的直线回归方程：y＝1.5856x＋0.0605，R²＝0.9919；OD值与菌液湿重（y）的直线回归方程：y＝7.2232x＋1.0802，R²＝0.9919；OD值与菌液干重（y）的直线回归方程：y＝0.951x＋0.0722，R²＝0.9158；OD值与病原真菌抑制率（y）的回归方程为：y＝84.166x-3.9601，R²=0.9482。（3）缺陷假单胞菌HD13发酵经过浓缩，正丁醇萃取所得粗提物，再经过硅胶柱层析、Sephadexm-20凝胶层析、乙酸乙酯分离纯化后，得到两种具有强烈抑制水稻纹枯病的活性组分A、B，其中组分A的成分较单一；对两个组分的初步分析表明，组分A主要是脂肽或蛋白质类物质。（4）组分A进行抑菌实验表明，组分A对4种植物病原真菌具有一定的抑制效果，其中对水稻纹枯病的抑制效果最好，组分A的IC50值为124μg/mL，MFC值是215μg/mL；观察被抑制的菌丝体形态，发现菌丝体弯曲，膨大产生畸71 贵州大学硕士研究生论文形囊泡，原生质体浓缩，产生了大量无规则分支。对菌丝体染色后发现，组分A对菌丝体细胞壁有一定的破坏；电导率法也测出组分A处理后，提取浸出液的电导率不断增大，表明组分A对菌丝体细胞膜有一定的破坏；采用凝胶阻滞实验表明，组分A可与水稻纹枯病DNA在体外非特异性结合，说明组分A不仅作用于细胞质膜，还可能作用于胞内其它目标物质。（5）不同培养次数的菌株，其抑菌活性有所降低，并且产生目标物质不稳定，表明菌株HD13连续培养多次后，其生防活性有所降低。5.2展望（1）通过对植物病原真菌拮抗菌株的筛选及其抗菌活性研究，为有效控制植物病害、促进植物生长、生产优质、无毒、健康的有机产品提供有力保障。本论文研究HD13拮抗不同植物病原真菌活性进行研究，初步掌握了其对每种病原真菌抗菌作用的效果及发酵滤液中抗菌物质的稳定性，但仍需进一步分离纯化发酵滤液中抗菌物质并明确抑菌机制和机理，从而为生物农药和新抗生素的应用奠定理论基础。（2）应用制备型C18反相高效液相色谱对组分A、B进一步分离纯化，希望得到具有一定量的具有抑菌活性的纯品，鉴定其结构，从而阐明缺陷假单胞菌PseudomonasdiminutaHD13所产生抗生素类型。（3）通过分子生物学、结构生物学等手段探讨组分A对植物病原真菌的拮抗机理，例如组分A中的脂肽类物质与DNA等胞内目标的相互作用机制；运用新的蛋白质组学技术，如iTRAQ等技术研究组分A对水稻纹枯病膜蛋白质(特别是膜蛋白质)的表达变化。（4）通过分子生物学、遗传学等手段探讨缺陷假单胞菌PseudomonasdiminutaHD13抑菌活性的稳定遗传机制。72 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贵州大学硕士研究生论文致谢转眼间，三年的硕士研究生生活即将结束，至此十分感谢关心我，以及为我的成长付出的人。感谢我的导师老师康冀川教授，康老师对本研究课题的建立、设计与实施，成文撰写都给予了很大的帮助。康老师学识渊博、治学严谨，热衷于科学研究，使我获益匪浅，将影响我的一生。感谢贵州省生化工程中心的雷帮星、文庭池、钱一鑫、王鲁、唐青、黄英、何珺、李洪庆老师的帮助，感谢他们在实验困难时给予的建议与帮助。感谢实验室师兄师弟，师姐师妹的帮助，感谢他们在实验上给予的帮助以及在生活上给予的关心。感谢家人一直以来对我的关心与谅解，有了他们的后盾，我才有战胜各种艰难困苦的信心。唐远江贵阳-花溪2016年5月83 原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在球师的指巧得的成果。除文中已经注明引用的内容外独立进行研巧所取，本论文不包含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科硏巧栗。对本文的研究在做出重耍巧献的个人和巧化，均己在义中Ｕ明确方式标明。本人在导师指导下所完成的学位论文及相乂的职务作品。本人完全意识到本声明的法律责巧，知识产权归属贵州大学由本人承祖。＞论文作者签名：日期：心（年／ｎ占关于学位论文使用授权的声明了解贵州大学有关保留、使用学位论文的规定本人完全，同悉学校保留或向国家有关部口或机构送交论文的复印件和电子化，允许论文被查阅和借阅；本人授权责州大学可从将本学位论文的全部或部分内容编入有关教据库进行检索ｋ乂采用、，可影印缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。本学位论文属于：保密（），在年解密后适用授权。不保密（？／）＂，／（请在从上相屋方框内打Ｖ）為Ｊ、论文作者签違：导师签違：［＼日期：年月－＾８４