鸡贫血病毒突变体感染性克隆的构建及病毒拯救

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／ＡｎｈｕｉＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ硕士学位论文鸡贫血病毒突变体感染性克隆的构建及病毒拯救ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＭｕｔａｎｔＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＣｌｏｎｅｓｏｆＣｈｉｃｋｅｎＡｎｅｍｉａＶｉｒｕｓａｎｄＩｔｓＲｅｓｃｕｅ姓名陈良导师刘雪兰副教授专业预防兽医学二〇一七年五月 独创性声明本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研宄工作及取得的研究成果，，论文中。尽我所知除了文中特別加以标注和致谢的地方外不包含其他人己经发表或撰写过的研宄成果，也不包含为获得安徽农业大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。研宄生签名：时间：＾年ｗ月３日；丨７１关于论文使用授权的声明、：本人完全了解安徽农业大学有关保留使用学位论文的规定，即学校有权保留、送交论文的复印件和电子版，可，允许论文被查阅和借阅以采用影印缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文６同意安徽农业大学可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。□本论文不保密。□本论文保密，在年解密后适用本授权。“”（请在以上□内划Ｖ）研宄生签名：时间：年Ｍ月日．．．％．．ｉ＞丨了ｉｆ＂一第导师签名：Ｘ时间：＾年吖月曰；丨７５７ 中图分类号：S852.6单位代码：10364UDC：636.09密级：安徽农业大学硕士学位论文鸡贫血病毒突变体感染性克隆的构建及病毒拯救ConstructionofMutantInfectiousClonesofChickenAnemiaVirusandItsRescue研究生（学号）：陈良（14720152）导师：刘雪兰副教授申请学位：农学硕士所在学院：动物科技学院兽医微生物与免疫学专业（领域）：预防兽医学研究方向：答辩委员会主席：论文评阅人：王建业刘晓文二〇一七年五月 致谢时光过得很快，马上就要结束这三年的研究生生涯，在这三年里不仅学到了很多科研知识，更重要的是学到了很多宝贵的做人道理。不管以后会怎么样，这一段人生历程会是很美好并且让人难以忘怀的。在这个美好的学习历程中有很多事很多人值得我去感恩和感谢。生活和学习中给予我最多帮助和关心的就是我的导师刘雪兰副教授，感谢这三年来她一直督促和教导我，她总是细致地指导我的研究课题，及时纠正错误，耐心地讲解实验原理，帮助我完成论文实验。刘老师很刻苦，安排事情有条不紊，认真地完成每一件事情，她总是以身作则，她的这种独特的人格魅力深深感染了身边的人，她不仅是科研导师更是学生的人生导师。真心感谢刘老师对我们的悉心教诲以及无微不至的关心和爱护。谢谢研究生生涯中的同学朋友们，特别感谢李槿年老师、许发芝老师给予的帮助，其次感谢陈海云师兄、单文杰师兄、杨旭师姐、贾丽娟师姐对我的耐心教导和帮助。感谢储鸿蒙同学、蒋孝志同学、朱祥同学、葛梦雪同学以及赵文影同学的热心帮助。更重要的是要感谢他们这三年来给我生活带来的欢笑和鼓励。谢谢美丽的安农校园，在这里我度过了七年美好时光。衷心感谢安徽农业大学提供的美好教学环境，谢谢这里的老师同学。我相信在安农的大学和研究生生活一定是我人生中最美好的学习时光。最后谢谢一直以来为我劳心劳力的爸爸妈妈，是他们让我不怕黑暗，一直鼓励我勇敢前行，是他们无怨无悔的支持我追逐梦想。也许再多的语言也难以表达对父母的那种感激，我爱你们我可爱的爸爸妈妈。 摘要鸡贫血病毒(Chickenanemiavirus,CAV)是危害养鸡业的重要免疫抑制病病原之一，该病毒基因共编码VP1、VP2和VP3三个蛋白，每个蛋白在其感染过程中作用不同，且相互关联。本研究在课题组前期分离、鉴定CAV临床毒株及构建了病毒感染性克隆pcDNA-2CAV的基础上，对病毒的三个蛋白重要功能区的部分氨基酸进行定点突变，构建含点突变CAV基因的重组质粒进行体内和体外实验，并进行病毒拯救。（一）构建双拷贝CAV突变体感染性克隆参考本实验室分离的CAV基因序列，运用MegaprimerPCR突变方法分别对病毒VP1第394位氨基酸（决定病毒致病性氨基酸谷氨酰胺）、VP2第101位氨基酸（磷酸化基序中精氨酸）、VP3起始位点氨基酸（甲硫氨酸）和VP3第85位氨基酸（核定位信号内丝氨酸）进行定点突变。通过设计定点突变引物扩增出含点突变的全基因组序列，分别连接到pEASY-BluntZero载体上，转化大肠杆菌DH5α，利用载体携带的自杀基因和菌液PCR筛选阳性克隆，并送往生物公司测序；将含有正确突变的重组质粒，经KpnⅠ和XhoⅠ双酶切并胶回收纯化目的片段，与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接。再通过PCR获得两端含KpnⅠ酶切位点的CAV全基因组，与KpnⅠ单酶切的单拷贝感染性克隆突变体顺次连接、转化并鉴定。结果显示，本实验成功构建出双拷贝CAV突变体克隆，根据点突变的位置及功能不同将构建的突变体克隆分别命名为pcDNA-2CAV-VP1Q394、pcDNA-2CAV-VP2R101、pcDNA-2CAV△VP3和pcDNA-2CAV-VP3S85。（二）CAV突变病毒的拯救首先利用SPF鸡胚检测上述构建的突变重组质粒对于机体组织的侵染性。将7日龄SPF鸡胚随机分组，经卵黄囊接种不同突变重组质粒和对照样品，每组3个重复，将鸡胚继续孵化至第19天进行剖检，观察病变并采集胸腺等组织应用PCR方法分析病毒特异性基因。结果显示，仅有接种pcDNA-2CAV-VP1Q394实验组鸡胚腿肌有出血。病毒特异性基因检测发现实验组的突变CAV基因存在于SPF鸡胚组织内，说明这些突变重组质粒侵染鸡胚后可能复制增殖病毒。为了获得在MSB1细胞系上具有增殖能力的感染性突变体，将上述构建的四种质粒通过脂质体3000转染MSB1细胞，进行病毒拯救。通过荧光染色观察第5代细胞凋亡情况，并以PCR和Westernblotting方法分别检测病毒基因和蛋白在细胞内表达情况。结果显示，在细胞传代过程中除了VP3缺失实验组外都能检测到突变病毒基因，不同突变组发生凋亡情况存在差异，且在侵染后除VP3缺失突变组外均能检测到病毒相关蛋白的表达。以上结果证明，成功构建了CAV突变体感染性克隆，这些I 突变体克隆能够对MSB1细胞产生不同侵染效应。将拯救得到的病毒侵染正常细胞，并将细胞进行传代，通过标签检测发现只有pcDNA-2CAV-VP1Q394拯救病毒侵染组存在突变病毒，且将此拯救病毒命名为CAVVP1Q394。综上所述，本研究对CAV的VP1、VP2和VP3蛋白的氨基酸重要调控位点进行了定点突变，构建了4种双拷贝CAV突变体克隆，并通过接种细胞和鸡胚分析突变体的侵染性，最终拯救出CAVVP1Q394突变病毒，并初步观察了其对细胞的病变能力，这些结果为进一步探讨CAV致病机制奠定基础并为研究新型基因疫苗候选株提供参考。关键词：鸡贫血病毒；定点突变；感染性克隆；病毒拯救II AbstractChickenanemiavirus(CAV)isoneoftheimportantimmunosuppressivepathogensthatdamagethechickenindustry,thegeneofCAVencodesVP1,VP2andVP3proteins,eachproteinplaysadifferentroleinitsinfection,andtheyareinterrelated.ThestudybasedonthepreviousresearchofisolationandidentificationofCAVclinicalisolatesandtheconstructionofviralinfectiousclonepcDNA-2CAV,therecombinantplasmidswereidentifiedbysite-directedmutationsofsomeaminoacidsattheimportantfunctionalregionsofthethreeproteinsinvivoandinvitroexperimentsrespectively,andthencarriedoutvirusrescue.(1)Constructionofdouble-copyCAVmutantinfectiousclonesAccordingtothesequenceofCAVgeneisolatedfromourlaboratory,theaminoacid(aminoacidglutamine)atposition394ofVP1,aminoacidofVP2atposition101(arginineinphosphorylatedgroup)andVP385thaminoacid(nuclearlocalizationsignalwithintheserine)weredeterminedbyMegaprimerPCRmutationmethodtosite-directedmutations.ThewholegenomesequenceofpointmutationwasamplifiedbyPCR.TherecombinantplasmidwastransformedintoEscherichiacoliDH5α,andthepositivecloneswerescreenedbysuicidegeneandbacterialliquidPCR.ThepositiveclonesweresenttothebiotechnologycompanyTherecombinantplasmidscontainingthecorrectmutantsweredigestedwithKpnⅠandXholⅠandligatedwiththeeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(+).ThewholegenomeofCAVcontainingKpnⅠcleavagesitewasobtainedbyPCRandligatedwithKpnⅠsingle-copysingle-copyinfectiousclonemutant,andtransformedandidentified.TheresultsshowedthatthemutantcloneswereidentifiedaspcDNA-2CAV-VP1Q394,pcDNA-2CAV-VP2R101,pcDNA-2CAV△VP3andpcDNA-2CAV△VP3,respectively,accordingtothelocationandfunctionofthemutations.PcDNA-2CAV-VP3S85.(2)TherescueofCAVmutantvirusFirst,theSPFchickenembryowasusedtodetecttheinfectivityoftheconstructedrecombinantmutantplasmidtothebodytissue.The7-day-oldSPFchickenswererandomlydividedintothreegroups.Thechickenswereinoculatedwithdifferentmutantrecombinantplasmidsandcontrolsamples.Eachgrouphadthreereplicates.Thechickembryowasincubateduntilthe19thday.Thetumorwasobservedandthetissuesofthethymuswerecollected.Methodtoanalyzevirus-specificgenes.TheresultsshowedthatonlyinoculatedpcDNA-2CAV-VP1Q394experimentalgroupofchickenembryolegIII bleeding.Virus-specificgenedetectionrevealedthatthemutantCAVgeneintheexperimentalgroupwaspresentinthechickenembryotissueofSPF,indicatingthatthesemutantrecombinantplasmidscouldproliferateafterinfectingthechickenembryo.InordertoobtainaninfectiousmutanthavingaproliferativeabilityontheMSB1cellline,thefourplasmidsconstructedaboveweretransfectedintoMSB1cellsbyliposome3000forvirusrescue.Theapoptosisofthe5thgenerationcellswasobservedbyfluorescencestaining,andtheexpressionoftheviralgenesandproteinsweredetectedbyPCRandWesternblottingrespectively.Theresultsshowedthatthemutantvirusgenecouldbedetectedintheprocessofcellpassage,exceptfortheVP3deletiongroup.Theapoptosisofthemutantgroupwasdifferent,andthevirus-relatedproteincouldbedetectedafterVP3deletionmutationexpression.TheseresultsdemonstratethatCAVmutantinfectiousclonesweresuccessfullyconstructed,andthesemutantclonescouldproducedifferentinfectiveeffectsonMSB1cells.Theviruswasinfectedwithnormalcells,andthecellswerepassaged,andonlythepcDNA-2CAV-VP1Q394rescuevirusinfectiongroupwasfoundtohavemutatedvirus,andtheviruswasnamedCAVVP1Q394.Inthisstudy,fourmajorcopiesofthedouble-copyCAVmutantcloneswereconstructedandthemutationsofthemutantswereanalyzedbyinoculatingcellsandchickenembryos.WhichresultedintherescueofCAVVP1Q394mutantvirusandthepreliminaryobservationofitsabilitytotreatthecells.TheseresultslaidafoundationforfurtherstudyofthepathogenesisofCAVandprovideareferenceforthestudyofnewgenevaccinecandidatestrains.Keywords:chickenanemiavirus;Site-directedmutagenesis;infectiousclone;virusrescue.IV 目录摘要.......................................................................................................................................IAbstract.............................................................................................................................III插图和附表目录...........................................................................................................VII缩略词表.......................................................................................................................VIII文献综述............................................................................................................................1引言......................................................................................................................................71材料与方法....................................................................................................................81.1材料.............................................................................................................................81.1.1模板和实验动物来源...........................................................................................81.1.2质粒和菌株...........................................................................................................81.1.3工具酶与相关试剂...............................................................................................81.1.4主要实验试剂配置..............................................................................................81.1.5主要实验仪器....................................................................................................111.2方法..........................................................................................................................111.2.1引物设计与合成.................................................................................................111.2.2MegaprimerPCR定点突变方法扩增CAV基因组......................................121.2.3含点突变CAV基因与pEASY-BluntZreo连接..........................................141.2.4感受态细胞的制备............................................................................................141.2.5含点突变CAV基因组重组质粒pEASY-CAV转化大肠杆菌DH5α...........141.2.6含点突变CAV基因组重组质粒pEASY-CAV的鉴定..................................141.2.7含点突变重组质粒pEASY-CAV的抽提.........................................................151.2.8含点突变CAV基因组重组质粒pcDNA-2CAV的构建.............................151.2.9真核质粒的抽提和去内毒素.............................................................................171.2.10鸡胚接种检测...................................................................................................171.2.11重组质粒转染细胞及病毒拯救.......................................................................192结果与分析..................................................................................................................222.1MegaprimerPCR定点突变方法扩增结果..............................................................222.2含点突变CAV基因组重组质粒pEASY-CAV的构建和鉴定.............................222.3含点突变CAV基因组重组质粒pcDNA-CAV的构建.........................................232.4含点突变CAV基因组重组质粒pcDNA-2CAV的构建和鉴定........................242.5鸡胚卵黄囊接种及相关检测..................................................................................252.6细胞转染以及拯救病毒侵染细胞后的观察和检测..............................................26V 2.6.1重组质粒侵染细胞后电子显微镜观察.............................................................262.6.2重组质粒转染细胞后凋亡检测.........................................................................272.6.3重组质粒转染细胞后病毒相关性蛋白在细胞内表达检测.............................292.6.4拯救病毒侵染细胞及检测................................................................................303讨论................................................................................................................................314结论...............................................................................................................................33参考文献..........................................................................................................................34作者简介..........................................................................................................................42VI 插图和附表目录表1实验仪器名称............................................................................................................11表2扩增CAV不同基因片段的引物...............................................................................12图1CAV复制、转录和翻译示意图...................................................................................4图2MegaprimerPCR定点突变方法示意图....................................................................12图3CAV双拷贝感染性克隆构建示意图........................................................................15图4MegaprimerPCR方法扩增突变基因.........................................................................22图5阳性重组质粒的筛选和测序分析.............................................................................23图6pEASY-Blunt-CAV和pcDNA3.1(+)的双酶切........................................................23图7pcDNA-CAV菌液PCR鉴定.....................................................................................24图8pcDNA-2CAV等重组质粒的酶切鉴定....................................................................24图9鸡胚组织解剖病理变化.............................................................................................25图10引入的KpnI酶切位点检测....................................................................................26图11不同重组质粒转染细胞后观察结果.......................................................................27图12重组质粒转染细胞后凋亡检测...............................................................................28图13抗VP3兔血清抗体纯化检测..................................................................................29图14细胞内CAV的VP3蛋白表达检测........................................................................29图15CAVVP1Q394突变体对细胞凋亡的流式分析.......................................................30VII 缩略词表hHour时secSecond秒minMinute分μLMicroliter微升mLMilliliter毫升mgMilligram毫克gGram克BpBasepair碱基对SDSSodiumdodecylsulfate十二烷基磺酸钠AmpAmpicillin氨苄青霉素DABDiaminobenzidine二氨基联苯胺E.BEthidiumbromid溴化乙锭LBLuria-BertaniLB细菌培养基ODOpticaldensity光密度PBSPhosphaticbuffersolution磷酸盐缓冲液OPDO-Phenylenediamine邻苯二胺CIAChickeninfectiousanemia鸡传染性贫血CAVChickenanemiavirus鸡贫血病毒PAGEPolyacrylamidegelelectrophoresis聚丙烯酰胺凝胶电泳kDaKilo-dalton千道尔顿TAETrisaceticacidEDTA凝胶电泳缓冲液EDTAEthylenediaminetetraaceticacid乙二胺四乙酸TrisTri-(hydroxymethyl)-aminomethane三羟甲基氨基甲烷VIII 文献综述鸡传染性贫血病(Chickeninfectiousanemia,CIA)主要表现鸡再生障碍性贫血和免疫抑制，其病原为鸡贫血病毒（Chickenanemiavirus,CAV）。自从上个世纪70年代日本学者Yuasa等分离到该病毒以来，世界其他各地相继分离到该病毒，鸡贫血病毒基因机构较独特且抵抗力强，这使得该病毒分布广泛且难以防治[1-3]。国内在上世纪90年代才分离到CAV，该病毒在国内养殖场阳性检出率很高[4-5]。该病毒侵染后一般诱发2周龄左右的雏鸡发病，大量实验已经证明病毒存在鸡体内的不同器官中，其中，脾脏和胸腺中含病毒量相对较高，从而破坏感染鸡的造血和淋巴器官，使感染鸡对细菌和其他禽病的易感性增高，疫苗的免疫效果下降[6-8]，从而使鸡发病率和死亡率增高，造成较大经济损失[9-10]。1CAV病毒学分类和结构国际病毒分类委员会（ICTV）第8次分类报告认为鸡贫血病毒属于圆环病毒科（Circoviridae）圆圈病毒属（Gyrovirus）。而目前圆圈病毒属只有鸡贫血病毒这一种病毒[11]。电镜下CAV粒子呈球形或六面体，分子半径大小约为12nm，是现在已知最小的动物病毒之一[12]。2CAV基因组的复制和转录自然界中存在的CAV基因组长2289bp，为单股负链环状DNA，包括三个ORF，大小分别为1350bp、651bp、366bp[13]。除了ORF内的起始密码子外，CAV基因组还含有潜在的启动子-增强子原件等用于翻译和蛋白表达。Meehan等的研究结果表明，CAV的启动子-增强子原件开始于TATA盒，位于转录起始点上游。再往上游有几个长21bp的重复序列，这几个重复序列之间有一个长126bp的插入序列，对于其功能还不清楚[14-15]。CAV基因组上有300bp左右的非编码区，其非编码区有完整的启动子活性，这个300bp的非编码区不仅有10几个转录因子和调控因子结合区域，还有一个19bp序列的增强子[16]。由于CAV在感染的细胞中闭环和开环复制型基因中间体同时存在，由此推测CAV复制模式可能为滚环式复制，且类似于M13噬菌体复制形式[17]。CAV最常用的感染细胞是MDCC-MSB1细胞系[18]，用斑点杂交方法检测发现，在感染细胞中CAV会不断复制增殖，在48h左右达到最高值[19-20]。Myrna等对CAVcux-1株的转录研究表明，其转录的mRNA长约2.1kb且含poly（A）[21-22]。S1核酸酶酶切图谱和序列分析等结果表明，CAV只有一个转录起始和终止位点[23]。3CAV基因组编码产物及其特征CAV基因组的3个可读框分别编码病毒相关结构蛋白VP1、协助蛋白VP2、具有凋亡作用的VP3蛋白[24-25]。在CAV感染细胞后6h检测到VP3，12h检测到VP2，1 于30h才能检测到VP1[26-28]。VP1是CAV的结构蛋白，存在于游离病毒的表面，分子质量约为50kDa，VP1是CsCl密度梯度离心法纯化病毒中唯一可以见到的病毒结构蛋白[29-30]。Todd等研究表明CAV基因链可以与VP1的N端的组蛋白的前体结合，以此来保护病毒的基因[31]。病毒进化分析表明VP1蛋白基因在各CAV分离株之间保守性较低[32]。这也是CAV在农场中普遍存在且有很多种毒株的主要原因。由于VP1是病毒抗原性蛋白，其在不同CAV分离株之间的差异在一定程度上影响CAV的抗原性，利用单抗进行VP1的抗原表位分析发现其至少存在两种以上不同的抗原表位[33-35]。刘岳龙等人利用构建重组的载体在工程菌内大量表达VP1蛋白并进一步得到了大鼠抗VP1的血清，通过实验证实此血清可与感染细胞的鸡贫血病毒发生反应。因此，VP1是该病毒感染后的一个重要检测依据[36]。由于MDV-1（马立克1型）的VP22蛋白可促进病毒在细胞间传播，由此认为其也可促进变异的病毒疫苗在机体中更高效地发挥作用。所以研究人员将CAV的VP1和VP2蛋白以及MDV的VP22蛋白基因进行融合并构建新型表达载体，通过体内和体外实验证明这种融合多种蛋白基因的重组质粒能够提高机体对于CAV的免疫效应[37]。并且通过优化的原核表达系统以及重组的VP1基因，可大量获取VP1蛋白，为研究VP1提供基础[38]。研究者发现在组成VP1蛋白的氨基酸中，其第394位谷氨酰胺对于CAV致病性有关键作用[39]。进一步通过实验发现，当394位氨基酸是谷氨酰胺（Q）时，病毒具有较高致病性，突变为组氨酸（H）时，病毒致病性会降低，由此通过突变病毒此氨基酸可致弱病毒并进一步研制出CAV活疫苗。VP2为病毒辅助性蛋白，分子质量大小约为24kDa[40]。但其对于病毒的复制增殖以及病毒的组装是不可缺少的[41-42]。Noteborn利用重组病毒以及昆虫细胞表达系统发现，单独的VP1并不能使鸡体内产生病毒中和性抗体，只有与VP2共同表达的病毒产物才能促使鸡体内产生中和抗体。所以VP2是病毒中和抗原的重要组成部分[43]。为了研究VP2是否具有凋亡作用，研究者通过设计pCAT-VP2+VP3-（VP3缺失）进行细胞实验并进行凋亡检测发现VP2能在一定程度上诱导凋亡[44]，但其诱导凋亡的详细机制需要更深入的研究。Peters研究发现VP2具有DSPs（Noveldual-specificityproteinphosphatases）基序，为了研究VP2的功能，掌握DSP的活动在整个病毒致病性中影响，将VP2进行一系列突变并表达，确定突变的克隆都具有感染性前提下进行实验分析，结果表明VP2能够影响CAV在机体中复制以及其致病性。其第94位氨基酸到103位氨基酸内2个相邻的半胱氨酸残基的突变对VP2的磷酸酶活性有不同影响，但均可以导致病毒生长发生明显的抑制，并且下调被感染细胞的MHCI，在细胞培养时细胞病变减轻。实验还证明VP2第101位的精氨酸残基的突变可以延长病毒的潜伏期和释放到胞外。鸡胚实验也显示VP2的部分突变可影响病毒对鸡胚的致病力，由此部分研究者认为VP2的变异可能作为预防CAV的潜在疫苗[45-47]。Hassan2 Moeini等人通过构建pBudVP1和pBudVP2-VP1并进行体内和体外实验表明，感染性克隆pBudVP2-VP1能够诱导机体产生更多的抗体，进一步研究发现在pBudVP2-VP1感染的鸡体内Th1型免疫增强，IL-2和IFN-γ水平升高[48-49]。后来Pradeep等发现鸡的截短highmobilitygroupbox1(HMGB1△C)蛋白可作为VP1-VP2基因疫苗的佐剂刺激机体使其产生更高效的免疫效应[50]。这些成果对于研究CAV基因型疫苗是一个重要参考。VP3是病毒非结构蛋白，在病毒感染细胞中是CAV最早表达的蛋白。VP3是病毒的转录和复制环节中的关键蛋白[51-52]。VP3不仅是病毒复制的关键性蛋白，Noteborn等还发现VP3对鸡的单核细胞有凋亡作用[53-54]。其次鸡的HSC70蛋白可与VP3结合从而影响核转录因子中的RelA表达，导致宿主免疫功能下降[55]。有研究者发现VP3也可选择性凋亡膀胱癌细胞[56]。人们就将VP3命名为凋亡素[57]。研究发现其诱发凋亡的部分机制是首先PKCβ（proteinkinaseCbeta）促使VP3发生磷酸化作用为其凋亡肿瘤细胞做准备[58]。进入细胞后通过泛素连接酶PIR2破坏TAP73和△Np73亚型之间的平衡，VP3提高TAP73稳定性，并且促使PIR2降解△NP73，从而进一步活化凋亡前体如PUMA引起细胞凋亡[59]。为了研究其核定位功能，将VP3蛋白进行一系列的突变，并将截断的VP3基因与荧光蛋白基因融合，实验结果表明VP3的两个核定位信号对于病毒核定位非常重要且缺一不可。但是当凋亡素被外源核定位信号引导到正常细胞的细胞核内时，凋亡素也不能诱导其凋亡[60]。为了探讨VP3选择性凋亡肿瘤细胞的机制，通过构建VP3变体，如H6-Apop△△ProLeu来研究其核定位之外的不同氨基酸富集区对于VP3识别肿瘤细胞的作用[61]。结果发现VP3的前1-31位氨基酸组成了上游的多亮氨酸富集的疏水领域，是VP3进入肿瘤细胞的先决条件，而32-69位氨基酸是VP3识别癌细胞的必要条件[62]。最近研究者在人体中发现一种圆环病毒（HGyV）也存在与VP3相似的凋亡相关蛋白，这个发现为将来研究抗癌药物提供了基础[63]。由于VP3能够凋亡肿瘤细胞，很多学者想利用这一点来研究抗癌药物，例如新型的利用纳米技术研制出的Rb-Apo-Nps（repebody-apotionnanoparticles）药物不仅有高效的抗癌细胞作用且副作用低[64]。3 图1CAV复制、转录和翻译示意图4CAV抵抗力CAV对于80℃以下温度有抵抗力，在100℃作用15min可使CAV完全灭活。在肝脏悬液中，当酚的浓度达到50%并且处理5min以上才能使CAV灭活。一定浓度的戊二醛、甲醛、β-丙酸丙脂也可使病毒完全灭活。CAV对氯仿、乙醚和丙酮等有抵抗力（常用此特性来分离病毒）。CAV对于一些商业用消毒剂不敏感，用次氯酸盐或碘等在37℃处理2h才能完全灭活CAV，福尔马林和氧化乙烯等熏蒸消毒对CAV无效。5CAV的致病机理鸡淋巴组织萎缩和全骨髓萎缩是鸡感染CAV后主要病理变化，感染较严重的鸡群会出现血液稀薄，凝血慢，血浆不正常等。研究者已经发现CAV的致病根源主要是CAV具有凋亡细胞作用，从而导致一系列病理变化[65]。用该病毒侵染1日龄雏鸡，一段时间后可在在骨髓、胸腺和脾等检测到CAV抗原[66]。对感染鸡的不同组织器官进行病毒检测发现，除了早期胸腺和骨髓中含量高外，淋巴组织、腺胃、肺脏、法氏囊、十二指肠和直肠等都能检测到病毒抗原[67]。研究表明雏鸡发育过程中胸腺前体细胞的特性是抵抗CAV感染的关键。6CAV流行病学鸡是此病毒已知的唯一自然宿主，几乎所有种类的鸡群都可被此病感染，2周龄左右的雏鸡较易发病。CAV不仅可以水平传播也可垂直传播。由于传播效率以及鸡本身的免疫力差异，垂直传播会出现在感染后不同时期，一般在3周以后[68]。水平传播主要是通过口腔途径，病鸡通过呼吸和粪便排出病毒且很快在鸡群中扩散，一般需4 要2周以上才能出现CAV血清学阳性。CAV潜伏期较短，实验接种的病毒在8天后即可观察到明显的病理变化，12天后开始出现死亡。自然感染情况下17天后出现死亡高峰。病鸡最主要是发生严重贫血，若没有继发感染和其他因素，感染鸡一般在28天后会康复。CAV感染后，很多种原因会影响感染鸡的发病率和死亡率，如毒株毒力强弱、宿主自身因素、环境和感染途径等。一般水平感染不会引起高死亡率，在没有其他病毒的影响下被动免疫能够提供很好的保护作用[69]。毒株毒力的强弱和感染剂量是影响发病和死亡的一个重要因素。在免疫功能正常的情况下鸡对于CAV有很好的抵抗力，很难出现贫血等发病症状，当鸡群受到其他免疫抑制病毒感染时，鸡的免疫功能受到影响，鸡贫血会更加严重，鸡的死亡率会进一步提高。引起免疫抑制的原因有很多，例如免疫器官的损坏，年龄抵抗力的延迟，化学因素，环境影响的免疫功能下降等都可以导致鸡群免疫迟缓或抑制。肉鸡对于本病毒抵抗力较弱，较易发病和死亡，这可能跟遗传有关，但至今没有得到充分研究证明[70]。7CAV诊断（1）临床诊断病毒主要侵染日龄较小的鸡，且发病严重。剖检主要特征为胸腺萎缩，骨髓变黄，血细胞比容下降明显，全身点状出血、皮下出血。注意与IBDV、腺病毒、MDV和球虫等感染的鉴别诊断。（2）分离病毒采集感染鸡肝脏、脾脏或血液，接种（MDCC-MSB1）细胞并培养，如发现细胞肿胀且有凋亡小体可判为CAV感染阳性。也可利用1日龄SPF鸡来分离CAV[71]。（3）血清学检测到现在为止，检测CAV的方法较多，其中主要有病毒基因PCR检测、核酸探针、病毒抗体检测等[72-75]。近些年DaiQuangTrinh等人研究的新型b-LAT（blockinglatexagglutinationtest）能够快速地检测出血清中是否存在CAV抗体[76]。8CAV的综合防制措施此病没有特定的治疗药物。及时接种其他鸡病疫苗，治疗或淘汰病鸡，加强饲养管理和检疫措施以及维持环境卫生可减少混合感染和继发感染。9CAV疫苗研究国内张知良等[77]研制了CAV基因工程亚单位苗能使子代鸡获得CAV抗体，能够控制CAV的早期感染。但是到目前，国内CAV疫苗并没有形成规模生产。国外AnaPaulaMuterleVarela等人利用含有AGV2（禽圆环病毒2型）的CAV混合苗来提高CAV疫苗的免疫效应，发现能够在一定程度上提高抗体产生且降低疫苗副作用。Vielitz等[78]研究发现，直接利用晚期发病鸡的肝脏等组织制成的乳剂通过口服可在一5 定程度上防止本病在幼龄鸡之间爆发。Koch等[79]研究发现由重组载体在表达系统中获得的VP1和VP2重组蛋白很有可能成为CAV亚单位疫苗并防止本病快速传播。最近研究者发现有一种草药能够减弱CAV在机体的复制能力，从而降低病毒载量[80]。如果知道某种病毒的与致病相关的基因或片段，在体外进行遗传操作将致病基因删除或突变，这样有可能在很短的时间内获得致弱的病毒。早在1995年Todd等人就成功构建了CAV感染性克隆并验证了其感染性及致病性。国内的张恒等研究者通过突变病毒VP3的翻译起始子并构建相关突变体克隆，动物试验证实这种突变体作为DNA疫苗来使用对鸡群具有一定的免疫保护作用，因而可以作为DNA疫苗研制的一个方向[81-82]。迄今为止，研究者已经构建了不同病毒的相关感染性克隆且通过体内和体外实验证实了一些感染性克隆的感染性和致病性，为一些病毒的研究以及防治开辟了新道路。由于圆环病毒的基因较简单，很早就有研究者构建了猪的圆环病毒感染性克隆，并通过基因突变等得到了致弱病毒，为研究猪圆环病毒基因疫苗打下坚实基础[83-85]。由于利用常规手段研制的CAV疫苗比较困难，所做的常规苗不能为动物提供足够的保护。研究者通过分析不同毒株CAV基因以及病毒相关蛋白氨基酸功能，利用反向遗传学改变病毒基因并构建相关感染性克隆。CAV相关感染性克隆的成功构建为研制该病毒的基因疫苗带来了希望[86-87]。最近，HassanMoeini和Pradeep等人利用不同疫苗佐剂来提高包含VP1-VP2的CAV基因型疫苗的免疫效应并取得了一定进展。总之必须结合现代分子生物学技术和其他技术手段进行多方位研究，更好地促进CAV基因型疫苗投入到生产实践。10研究目的和意义综上，国内外对于CAV的研究取得了一定进展，但其商品化疫苗的研究依然没取得有效的突破，对于其可广泛使用的商品化疫苗研究迫在眉睫。由于CAV病毒基因的特殊性，其基因型疫苗一直是人们研究的重点，本次研究通过突变一株临床分离株CAV蛋白相关氨基酸并构建突变体感染性克隆，通过细胞和鸡胚实验探讨其致病性和抗原性，为以后研究CAV基因型疫苗候选株提供基础[88]。6 引言CAV在国内外农场分布广泛，但并没有引起人们的足够重视，目前还没有非常有效的治疗手段，虽然有活疫苗，但存在局限性。此外本病一旦发生混合和继发感染，就会导致很大损失，所以对于本病的防制不容忽视。自从1979年发现该病以来，国内外对此病的研究报道逐年增多[4-5]，近些年随着反向遗传学技术的不断发展，为一些疾病的弱毒苗以及亚单位疫苗等提供了很好的研究基础。CAV分子较小，是一种环状的DNA病毒，影响其蛋白发挥功能的氨基酸区域逐渐被研究者发现。所以研究人员尝试对该病毒致病关键氨基酸进行突变并由此获得致弱毒株，从而为研制CAV疫苗候选株奠定基础。20世纪以来，各个国家研究人员分出了不同CAV毒株，且这些CAV分离株对机体致病性存在一定差异，通过国内外不同CAV分离毒株的基因组序列对比发现病毒VP2和VP3蛋白基因较为保守，而VP1蛋白基因序列在各个毒株间差异较大。VP1是病毒结构蛋白，是主要抗原性蛋白，其在病毒感染机体的过程中发挥着重要作用。VP1存在多种抗原表位，研究其对机体的免疫效应一直是国内外学者热衷的课题，病毒的致病性强弱与VP1多种氨基酸相关，其中VP1的394位氨基酸是病毒具有高致病性的关键氨基酸[34-36]，突变病毒该氨基酸是研究CAV弱毒株的一个很好选择。VP2是病毒协助氨基酸，只有当VP1和VP2共同免疫时才会使机体产生中和性抗体，最近研究者发现VP2在一定程度上会影响病毒的复制[47]，且Kaffashi等[44]研究发现VP2对细胞也有一定的凋亡作用，其与VP3一起免疫机体会比VP1免疫机体产生更强的免疫反应[30]。而VP2的磷酸化基序内氨基酸对于VP2发挥功能至关重要，所以突变VP2磷酸化基序内氨基酸是研究CAV弱毒苗的一个重要方向。VP3蛋白是病毒侵染机体后的关键致病蛋白，其影响病毒的复制增殖，对鸡的单核细胞有凋亡作用，破坏鸡的免疫系统。VP3对细胞的识别依赖其核定位信号外氨基酸，而VP3功能的发挥依赖于其两个核定位信号，缺一不可[61]。研究人员通过突变以及重组等研究其致病机制，这些成果为研究CAV致病机理提供了很好的参考。综合以上研究，病毒致病依赖其蛋白发挥功能，本研究运用反向遗传学技术，在实验室前期分离CAV临床毒株基础上分析基因位点，定点突变病毒关键氨基酸，构建含突变位点的病毒基因组重组载体，通过体内和体外实验来研究突变体对机体和细胞的感染性，从而为进一步获得CAV弱毒疫苗株及其相关机理的研究奠定基础。7 1材料与方法1.1材料1.1.1模板和实验动物来源本实验室分离出的CAV毒株以及已构建好的重组质粒pcDNA-2CAV，SPF鸡胚。鸡淋巴细胞系MDCC-MSB1由扬州大学秦爱建教授惠赠。1.1.2质粒和菌株pEASY-BluntZero载体和Trans-T1感受态购自北京全式金生物公司，真核表达载体pcDNA3.1（+），本实验室储存。1.1.3工具酶与相关试剂高保真性PCR酶、DNA核酸连接酶、琼脂糖、胶回收试剂盒、AlkalinePhosphatase（碱性磷酸酶，去磷酸化酶）、DNA质粒抽提试剂盒、去内毒素小量质粒提取试剂盒（OMEGA公司）、LBBrothAgar培养基、青霉素、pierceECLWesternBlottingSubstrate、胎牛血清、1640细胞培养液、Hanks缓冲液、MarkerDL2000和5000、显色剂DAB和OPD（华美公司）、EDTA、Tris、SDS、EB、PBS、丙烯酰胺、无水乙醇、甲醇、N,N-亚甲基双丙烯酰胺、溴酚蓝、PVDF膜、HRP标记的羊抗兔IgG的抗体、蛋白Marker、OPTI-MEM培养基和脂质体LipofectamineTM3000等。1.1.4主要实验试剂配置1.1.4.1培养细菌相关试剂（1）LB细菌培养液（200mL）:分别称取2.0g胰蛋白胨，1.0g酵母抽提物，2.0g氯化钠，加入蒸馏水，混匀并调pH到7.6，用量筒定容到200mL，高压灭菌后放4℃冰箱保存备用，不可时间过长。（2）固体细菌培养基（100mL）：电子秤称取1.5g琼脂粉溶于100mL液体的LB培养基内即为LB固体培养基。（3）Amp青霉素（10mL）：将1gAmp青霉素溶于10mL双蒸水，使用时按1:1000稀释。1.1.4.2DNA电泳时所用试剂（1）TAE储存液50×（400mL）:称取96.8gTris，量取22.84mL冰乙酸和40mLpH值为8.0的EDTA，加去离子水定容至400mL，混匀，使用时注意稀释成工作液即可。（2）琼脂糖凝胶（1.0%）：0.15g琼脂糖加入15mL的TAE工作液中，加热溶解完毕且稍微冷却后加入0.75μL核算染料。8 1.1.4.3制备感受态CaCl2和甘油混合液（25mL）：用电子天平称取0.275g无水CaCl2，并吸取1.25mL甘油，加入去离子水定容到25mL，混匀后滤膜过滤除菌，然后置于冰箱保存。混合液MgCl2-CaCl2（25mL）：电子天平称取0.405gMgCl2、0.055gCaCl2，加入去离子水定容到25mL，待其完全混合均匀后，滤膜过滤除去细菌，置于冰箱保存。1.1.4.4提取细胞蛋白试剂RIPA裂解液和PMSF（10mg的PMSF溶于1mL的异丙醇，使用时使其终浓度为100μg/mL）。磷酸盐缓冲液（80mL）：称取NaCl0.68g，NaH2PO40.048g，Na2HPO4·12H2O0.464g，溶解于70mL去离子水中，调节pH值至7.4，定容至80mL，过滤除菌后置于冰箱储存。1.1.4.5SDS-PAGE电泳溶液（1）丙烯酰胺溶液29:1（40mL）：电子天平称取甲叉双丙烯酰胺0.4g，丙烯酰胺11.6g，加入约30mL去离子水，待其完全混合均匀后定容至40mL，再用滤膜进行过滤，冰箱避光保存备用。（2）Tris-HCl混合液（pH6.7，40mL）：电子天平称取4.844gTris溶于30mL去离子水中，用配好的盐酸将其pH值调至6.7，定容到40mL，冰箱保存。（3）Tris-HCl（pH8.9，40mL）：电子天平称取7.668gTris溶于30mL去离子水中，用浓盐酸将其pH值调至8.9，定容到40mL，冰箱保存。（4）10%SDS（20mL）：称取2gSDS置于10mL蒸馏水中，加热至65℃使其完全溶解，用配好的盐酸将其pH值调至7.2，定容至20mL，室温保存。（5）过硫酸铵（10%，3mL）：电子天平称取0.3g过硫酸铵溶于3mL去离子水中，冰箱保存备用。（6）SDS-PAGE样品结合液（2×，20mL）：Tris-HCl（pH6.7）2.0mL，β-巯基乙醇2.0mL，10%SDS8.0mL，0.1%溴酚蓝1.0mL，甘油4.0mL，蒸馏水3.0mL。（7）电泳缓冲液（400mL）：分别称取1.208gTris、7.52g甘氨酸、0.4gSDS，加入300mL去离子水中充分搅拌溶解，定容到400mL，室温保存。（8）15%(12%)SDS-PAGE分离胶（5mL）：蒸馏水1.1(1.6)mL30%丙烯酰胺2.5(2.0)mLTris-HCl（pH8.9）1.3mL10%过硫酸铵50μL10%SDS50μLTEMED2μL9 （9）5%SDS-PAGE浓缩胶（3mL）：蒸馏水2.1mL30%丙烯酰胺0.5mLTris-HCl（pH6.7）0.38mL10%过硫酸铵30μL10%SDS30μLTEMED3μL1.1.4.6WesternBlotting实验所用试剂（1）转移缓冲液（400mL）：称取1.16g甘氨酸、2.32gTris及0.148gSDS，加入约200mL蒸馏水使其完全溶解后定容至320mL，最后加入80mL甲醇液，置于室温保存备用。（2）TBST（PVDF膜清洗液，1L）：称取8.8gNaCl，量取浓度0.5MTris-HCl（pH8.0）40mL，溶解于约800mL蒸馏水中，加入600μLTween20，混合均匀后定容至1L。冰箱保存。（3）5%脱脂奶粉（10mL）将0.25g脱脂奶粉混入5mLTBST中，溶解均匀并过滤去除杂质。（4）A液（50mL，浓度0.1mol/L柠檬酸溶液）：称取0.96g柠檬酸，加去离子水至50mL并混匀。（5）B液（50mL，浓度0.2mol/LNa2HPO4溶液）：称取3.585gNa2HPO4·12H2O，加入去离子水至50mL并混匀。（6）底物液：分别量取2.43mLA液与2.57mLB液，混匀后加入2.5mgDAB，继续混匀，再加入25μL浓度为30%H2O2溶液混匀，最好10min内使用。1.1.4.7细胞培养和转染所需溶液1640细胞培养液（40mL）：1640培养基31.6mL+FBS4mL+TPB4mL+双抗400μL10 1.1.5主要实验仪器表1实验仪器名称仪器名称型号厂家电泳仪DYY-6D型北京六一仪器厂水平电泳槽DYY-Ⅲ北京六一仪器厂双开门冷冻冰箱BCD-539WT合肥华德利科学器材有限公司超低温冰箱902型赛默飞世尔生物化学制品有限公司培养箱SRT-P-A型合肥华德利科学器材有限公司核算蛋白检测仪NANODROP2000C赛默飞世尔生物化学制品有限公司CO2培养箱BB15赛默飞世尔生物化学制品有限公司立式压力蒸汽灭菌器DSX-280KB30上海申安医疗器械厂电热恒温水槽DK-8D上海一恒科技有限公司SL-N电子天平BSA2245赛多利斯科学器材有限公司超纯水RO-3.2G-2安徽久智电子科技有限公司电热鼓风干燥箱DHG-9070A上海一恒科技有限公司生物安全柜A2AirstreamESCO公司冷冻高速离心机TGL-18R珠海黑马医学仪器有限公司Veriti®PCR热循环仪9902AppliedBiosystems美国应用生物系统公司自动凝胶成像分析仪GS-680D上海培清科技有限公司倒置荧光显微镜LX73奥林巴斯（中国）有限公司多通道成像系统VersaDocTM4000MP美国伯乐公司1.2方法1.2.1引物设计与合成根据CAV基因序列，设计引物A1、A2、A3扩增全基因组，为了构建VP3缺失病毒，设计引物B2，将基因组VP3起始密码子中的碱基T替换为C；设计引物C2，将基因组739位的碱基C替换为A；为了将VP2双重特异性磷酸酶活性改变，设计引物D2，将基因组682位的碱基A替换为G;VP1蛋白394位谷氨酸是一个决定CAV致病性的主要决定因素，为了改变其功能设计引物E1，将其基因组2034位碱基G替换为C（谷氨酰胺突变为组氨酸）；同时设计扩增VP3基因引物作为后续CAV基因鉴定，使用引物F1和F2对突变体克隆进行PCR扩增CAV全基因组用于KpnⅠ酶切鉴定及测序分析。引物序列见表2：11 表2扩增CAV不同基因片段的引物引物名称引物序列突变位点目的蛋白A1F5'CGGGTACCCAGAAAGTCAAGATGGACGAAT3'A2R5'CGCTCGAGCTGTGTACAGGCTAGAATGGTG3'A3R5'CGGGTACCCTGTGTACAGGCTAGAATGGTG3'B2R5’TTGGAGAGCGTTCGTTTGAAAT3’A-G△VP3C2R5’ATCGCTTCTTCTAGGGAGGCT3’G-TVP3S85D2R5’AACCAGTGCTTCCTGAATTGTC3'T-CVP2R101E1F5'ATAAGTCGCAACACTACAAGTTCGG3'G-CVP1Q394F1F5'CGGGATCCTTCAGCCCCGTGGCGAGTCTT-3'F2R5'CGGGATCCCTCATTCTTAGTGGCAAGGAGC-3'VP3F5'ATGAACGCTCTCCAAGAAGAT3'R5'TTACAGTCTTATACACCTTCTTGC3'引物由生物公司进行合成。在无风条件下用无菌双蒸水释至100pmol/μL，-20℃保存，使用时稀释到工作浓度10pmol/μL。1.2.2MegaprimerPCR定点突变方法扩增CAV基因组以本实验室构建好的pcDNA-2CAV质粒为模板，利用上述设计的引物进行PCR扩增，全长引物为A1和A2，用第一轮PCR所得产物作为大引物和模板进行突变全长基因扩增。具体步骤和反应条件如下:图2MegaprimerPCR定点突变方法示意图12 第一轮PCR反应体系：反应程序：10xBuffer2.5μL952min℃dNTPmix2.0μL951min℃forwardprimer1.0μLTM30s30cycles72℃2minreverseprimer1.0μL725min℃质粒模板0.5μL4℃∞PfuDNA0.3μLddH2O17.7μLTotal25.0μL反应程序：第二轮PCR反应体系：952min℃10xBuffer2.5μL951min℃dNTPmix2.0μL68℃30s10cycles72℃4min30sforwardprimer0.75μL951min℃reverseprimer1.0μL5030s25cycles℃Megaprimer（含模板）6.25μL72℃4min30sPfuDNA0.3μL725min℃ddH2O12.2μL4℃∞取2.5μL第二轮PCR产物进行核酸电泳检测，并观察结果。全部的目的基因利用Axygen凝胶回收试剂盒进行回收：（1）在相关仪器中切下目的基因并放入干净的EP管中，吸取450mL缓冲液DE-A，使DE-A完全淹没凝胶，70℃水浴直至凝胶完全融化；（2）待EP管内没有块状凝胶后，加入225mL的缓冲液DE-B。（3）均匀混合EP管内的混合液待其完全变为黄色后，用移液枪移至回收纯化柱中，9000r/min离心1min，弃滤液；柱子放回EP管中，加入500μL洗涤液W1，12000r/min进行离心，弃掉管内滤液；（4）向柱子中加入650μL洗涤液W2，12000r/min离心，弃掉滤液，重复洗涤一次；将柱子放回2mLEP管中，10000r/min离心2min；（5）取一个新的1.5mLEP管，将回收纯化柱放入管中并在其制备膜上加入25-30μL洗脱液（使用前可置于65℃水浴以提高洗脱效率），室温静止放置2min后，13000r/min离心2min，收集目的DNA。13 1.2.3含点突变CAV基因与pEASY-BluntZreo连接将胶回收的CAV基因分别与pEASY-BluntZero载体进行连接，连接体系如下：纯化的目的基因3.5μLpEASY-BluntZerovector0.5μLddH2O1.0μLTotal5.0μL连接条件：25℃连接30min。1.2.4感受态细胞的制备（1）活化大肠杆菌：保存的甘油菌进行划板并过夜培养。挑取单菌落，进行扩大培养。（2）待菌液变浑浊后，1:100转接培养，10mL培养液37℃185r/min震荡培养4h，即对数生长期（OD630值为0.4-0.6）；（3）将上述菌液放入冰中，20min后进行4℃8000r/min离心收集菌体；菌体使用240μL预冷的CaCl2-MgCl2（0.1mol/L）混合液重悬，再次离心收集处理后的菌体；（4）用预冷的CaCl2-MgCl2溶液重悬菌体，冰浴，30min后4℃4000r/min离心3min，收集处理的菌体；（5）60μL预冷的CaCl2-甘油（0.1mol/L）混合液重悬上述处理菌体即为制备好的感受态，放入冰箱保存。1.2.5含点突变CAV基因组重组质粒pEASY-CAV转化大肠杆菌DH5α（1）超低温冰箱内拿出感受态细胞并低温慢慢融化后加入连接物2.5μL左右，轻轻混匀后放入冰上；（2）半小时后将混合液置于42℃水浴反应（90s），再次冰浴2min；将上述转化好的混合液进行活化培养（在离心管中加入新鲜LB液体培养基，置于温箱中，37℃165r/min培养45-60min）；（3）培养物经4000r/min离心3min，使用移液枪吸尽培养液，并加入50-80μL液体培养基重悬菌体，将混匀的细菌均匀涂布于Amp抗性固体培养基表面，置于37℃恒温培养箱中水平放置30min左右，后倒置过夜培养，不宜超过14h。1.2.6含点突变CAV基因组重组质粒pEASY-CAV的鉴定取出过夜培养板，扩大培养随机挑取的单克隆（不宜超过6个），待培养的菌液变浑浊后离心收集菌体(留少量菌液方便以后扩大培养)。用少量去离子水重悬菌体，经8min左右沸水浴，然后10000r/min离心1min，取上清液作为模板进行菌液PCR鉴定，鉴定引物为A1和B2。检测阳性结果送去生物公司测序，并对测序结果进行14 分析。1.2.7含点突变重组质粒pEASY-CAV的抽提试剂盒具体操作方法如下：（1）12000r/min离心菌液，收集扩大培养后的菌体；（2）吸取240μL缓冲液S1，并用移液枪将菌体与S1混匀；（3）移液枪吸取240μL裂解液S2加入上述混合液，再次亲轻混匀，待菌体与反应液充分混匀，裂解彻底，直至溶液变得清澈，但该步骤不宜时间过长；（4）吸取340μL裂解液S3加入混合液，轻轻使溶液混合均匀，静置1min，10000r/min离心10min以上；（5）此时管底有白色沉淀，用移液枪吸取上清（不要吸到沉淀）转移到专用质粒制备柱子中，12000r/min离心1min，弃掉滤液；（6）在柱子中加入500μL洗涤液W1，12000r/min离心，弃掉滤液；在柱子中加入650μL洗涤液W2，12000r/min离心1min，弃掉滤液，并重复洗一次；（7）将柱子放回2mL无菌的空EP管中，12000r/min再次离心2min；（8）室温放置3min左右，取一全新1.5mL管子并做好标记，将柱子置于其内，加入40~60μL洗脱液（使用前可置于60℃水浴以提高收集效率），13000r/min离心2min收集目的基因并-20℃保存。1.2.8含点突变CAV基因组重组质粒pcDNA-2CAV的构建构建策略如图3:图3CAV双拷贝感染性克隆构建示意图15 将1.2.7抽提的质粒用KpnⅠ和XholⅠ进行双酶切，同时双酶切pcDNA3.1(+)载体，回收并纯化目的基因，然后将目的基因与pcDNA3.1(+)连接。酶切和连接体系如下：酶切体系：连接体系：KpnⅠ1.0μL载体1.0μLXholⅠ1.0μL目的基因4.0μL10×Buffer2.0μLSolutionⅠ5.0μL基因片段/载体质粒8.0μLTotal10.0μLddH2O8.0μL混匀于4℃过夜反应Total20.0μL混匀于37℃水浴30min连接后转化到大肠杆菌，挑取单菌落，进行菌液PCR或酶切鉴定。其次利用引物A1和A3以上述构建好的pcDNA-CAV单拷贝突变质粒为模板，用PCR进行扩增并回收纯化目的基因，将目的基因进行KpnⅠ单酶切并回收纯化放-20℃备用。然后提取上述阳性菌质粒，利用KpnⅠ进行单酶切并进行去磷酸化处理（防止自连），进一步进行回收纯化放-20℃备用。最后将上述酶切的目的基因和单拷贝重组质粒进行连接并转化。具体体系如下：单酶切体系：DNA/pcDNA-CAV10μLKpnⅠ2.0μL10×Buffer2.0μLddH2O6.0μLTotal20.0μL混匀于37℃水浴30min。pcDNA-CAV单酶切后进行去磷酸化处理体系：单酶切pcDNA-CAV20.0pmol10×AlkalinePhosphataseBuffer5.0μLCIAP2.0μLddH2Oupto50.0μL混匀先于50℃反应30min，在于37℃反应15min后进行胶回收纯化。将最后回收纯化的pcD-CAV载体与纯化的目的基因进行连接并转化，过夜培养后挑取单菌落扩大培养，然后进行质粒抽提并酶切鉴定。16 1.2.9真核质粒的抽提和去内毒素按照OMEGA试剂盒的抽提步骤：（1）首先将保存的甘油菌进行划板（抗性板），然后在有抗性的液体培养基中活化所需的细菌。（2）活化的细菌1:100接种到新鲜液体培养基中，在震荡培养箱中振荡过夜培养。（3）进行12000r/min离心2min左右收集菌体。（4）吸取240µL4℃预冷的缓和液SolutionI重悬菌体。（5）吸取480µL裂解液SolutionII加入到上述混合液中，轻轻颠倒摇匀溶液，室温放置1min以上。（6）加入240µL4℃预冷的裂解液SolutionIII，混匀后12000r/min，4℃离心12min以上。（7）此时管底有白色沉淀，用移液枪吸取上清（不要吸到沉淀）转移到专用质粒制备柱子中，吸取0.1倍体积的的ETR加入上清，混匀后冰上放置一段时间。（8）一段时间后将混合液42℃处理6min并注意混匀，10000r/min室温离心4min。（9）溶液分层，全部的上清转移到新的管中，加入一半上清体积的无水乙醇，轻轻混匀并室温静止。（10）将上述混合液加入准备好的质粒收集柱子中，9000r/min室温离心1-2min。（11）吸取400µL缓冲液HB加入柱子，10000r/min离心1.5min。（12）吸取650µL洗涤液加入柱子，10000r/min离心1.5min。（13）吸取650µL洗涤液加入柱子，10000r/min离心1.5min。（14）将质粒收集柱放回离心管中，13000r/min离心2min彻底去除洗涤液。（15）弃去离心管，将离心柱子放置室温条件下约3-5min，使乙醇挥发完全。（16）取一全新1.5mL管子并做好标记，将柱子置于其内，加入65μL洗脱液（使用前可置于60℃水浴以提高收集效率），13000r/min离心2min收集目的基因。（17）吸取少部分进行浓度测定和鉴定，剩余质粒-20℃保存备用。1.2.10鸡胚接种检测（1）阳性病料的病毒液制备：采集阳性病鸡肝脏组织并注意无菌操作，按照1:2（V/V）加入pH7.2的PBS缓冲液进行研磨，待没有组织块后加入双抗并在水浴锅37℃内作用30min，然后反复冻融3-4次，4℃12000r/min离心4min，转移上清到一干净的离心管并加入一半体积的氯仿作用15min。最后将处理的混合液于70℃水浴5-6min，轻微离心后上清进行滤膜过滤除菌，滤过的上清即为制备好的阳性17 病毒液，超低温冰箱保存。（2）质粒的大型抽提：按照全式金试剂盒（HiPurePlasmidMaxiPrepKit）进行抽提并纯化（具体步骤与真核抽提类似）。将质粒进行鉴定并测定浓度，为以下实验做准备。（3）将SPF鸡胚气室向上，放入孵化箱（提前消毒孵化箱），孵育过程中每天翻蛋两次，翻转角度小于45°，每天观察保证湿度和温度，每隔3-5天照蛋一次。取孵化第7天的鸡胚，随机分为6组并按1-6编号，每组3个鸡胚。找出气室和胚胎位置并做好标记，将鸡胚垂直放置在卵架上，进行消毒除菌等。在鸡胚的气室找出胚体头部对面的某处打孔，用注射器将样品沿胚的纵轴刺入3cm左右，注入卵黄囊100µg准备好的样品，随后用石蜡封孔，消毒。选取编号为1的一组鸡胚注射100µL制备的病毒液作为阳性对照，2号组鸡胚注射100µLPBS作为阴性对照，其余四组鸡胚注射100µg（抽提的质粒浓度均大于1000ng/µL，四组全用PBS补齐到100µL）抽提的重组质粒，所有鸡胚置于孵化箱继续培养，每天翻蛋1-2次，照蛋并剔除24h内死亡的鸡胚。培养到19日龄进行剖检并检测。（4）鸡胚相关组织DNA提取根据天根生化科技有限公司基因组提取试剂盒操作步骤：1.充分研磨鸡胚肝脏组织20mg，然后加180μL的GA，混合均匀。2.吸取18μL蛋白酶K溶液加入混合液中。54℃水浴处理直至组织完全溶解，待完全溶解后离心以去除水珠，然后进行下一步。3.吸取180μL的GB加入混合液并混匀，70℃左右水浴10min，待溶液变清亮后离心去除管壁的水珠。4.吸取200μL乙醇并混匀20sec，同样离心去除管壁的水珠。5.上述混合液转移到一个收集柱CB3中（吸附柱放入收集管中），12000r/min离心30sec，将收集柱CB3放回离心管中。6.吸取400μL的GD加入收集柱CB3中，10000r/min离心30sec，将吸附柱CB3放入离心管中。7.吸取600μL的PW加入收集柱CB3中，10000r/min离心30sec，将吸附柱CB3放入离心管中。8.重复洗涤柱子一次。9.洗过的收集柱CB3放回离心管，13000r/min离心2min彻底去除乙醇。将收集柱CB3室温放置2min以保证去除乙醇10.DNA收集柱CB3转入一个新的离心管中并做好标记，向吸附膜缓慢加入50-100μL洗脱液TE，室温放置4-5min，13000r/min离心2min，收集得到溶液即含有所提DNA并-20℃冰箱内保存。18 使用引物F1和F2将上述提取的DNA进行PCR扩增CAV基因组，并使用KpnⅠ酶切鉴定。1.2.11重组质粒转染细胞及病毒拯救1.2.11.1复苏MSB1细胞将本实验室液氮冻存的MSB1细胞取出，快速置于37℃水浴，并轻轻摇晃，遵守“慢冻速溶”原则，使其融化。将细胞转入无菌EP管，于1000r/min离心3min。弃上清，加入10%FBS的1640培养基，重悬细胞并转入T25细胞瓶，补足培养液，放入CO2培养箱，37℃培养。1.2.11.2转染准备6孔细胞培养板，加入1mL含有10%FBS的培养基于每个孔内，每孔接0.25×106个细胞并做好标记，继续培养待细胞融合度达到80-90%时进行转染。LipofectamineTM3000转染步骤：根据质粒浓度来确定转染量以及转染试剂的使用量。如：a.质粒：pcD-2CAV浓度：1362ng/µL使用量（3µg/孔）：2.5µLb.P3000（2µL/µgDNA）：1.362×2.5×2=6.81µLc.A．125µLOpti-MEM+使用量+P3000量进行充分混匀。d.B.125µLOpti-MEN+5µLLip3000进行充分混匀。e.A+B进行混匀并室温孵育5min后加入6孔板。f.转染质粒细胞和对照细胞继续放入37℃培养箱培养。1.2.11.3病毒拯救由于CAV只在鸡的肿瘤细胞中复制增殖，并且复制速度较慢，加上实验中普通的转染方法转染效率低，而肿瘤细胞繁殖较快，所以在转染前期，将细胞进行1:3传代，其余细胞离心后用200µL培养基（不加血清）悬浮，冻融三次后，进行离心，将上清接回到同一细胞培养瓶中，对照组离心传代。反复传5代左右，再收集细胞制作病毒液。1.2.11.4侵染及传代将上述拯救得到的病毒液加入正常细胞并在无血清培养液中孵育3h左右后换液，以后将细胞按1:3传代，收集剩余细胞。做好标记，用预冷的PBS洗2-3次，放-80℃保存待用。保存细胞用于WesternBlotting分析和病毒DNA检测（按照天根生化科技有限公司悬浮细胞基因组提取试剂盒方法进行DNA抽提并进行实验，下面实验中会具体介绍DNA抽提方法）。1.2.11.5凋亡检测利用凋亡检测试剂盒AnnexinV-EGFP/PICellApoptosisDetection进行细胞凋亡检测。具体步骤如下：（1）细胞完成凋亡刺激后，4℃离心1000r/5min，收集2.0×105-106个细胞。19 （2）用预冷的PBS洗涤细胞两次，再次4℃离心收集细胞。（3）吸取100µL预冷的1×AnnexinV结合缓冲液，重悬细胞。（4）加入5.0µLAnnexinV-EGFP和5.0µLPI，轻轻混匀。（5）室温（20-25℃）条件下避光反应15min。（6）加入400µL预冷的1×AnnexinVBindingBuffer，轻轻匀样品，于冰上避光放置，1h内用倒置荧光显微镜或流式细胞仪检测细胞凋亡。1.2.11.6WesternBlotting检测提取侵染后的细胞全蛋白，步骤如下：（1）4℃离心机1000r/min离心收集细胞。（2）用预冷的PBS洗涤细胞三次并收集细胞。（3）按索莱宝说明书要求，配置细胞裂解液，在冰上操作，每1mL细胞裂解液加入10µLPMSF。混匀后冰上保存数分钟。（4）将配置好的裂解液加到上述细胞中，吹打混匀，冰上裂解20min。（5）4℃离心机12000r/min，离心10min，上清为全蛋白。取适量全细胞蛋白，加入等体积的2×SDS上样缓冲液并混匀，沸水浴5min，12000r/min，离心3min。VP3多克隆抗体的纯化：取出-80℃冰箱内本实验室已经制备好的兔抗VP3血清放于4℃融化备用。（1）用配好的10mL洗脱液洗树脂，再用5mL平衡液对树脂进行再生。（2）摇匀树脂，在新的层析柱中缓慢加入1mL平衡缓冲液。（3）让树脂自然沉降，流出平衡液。（4）再次加入5mL平衡液至层析柱中，缓慢流出平衡液。（5）将预先用平衡液稀释好的血清样品上样至层析柱中，透析过夜。（6）用30mL的平衡液重悬并洗涤树脂，流速维持约2mL/min左右。（7）用13mL洗脱液进行抗体洗脱，收集洗脱液，并及时加入1/10洗脱液体积的中和液，注意调节pH至7.4。取15µL蛋白样品进行SDS-PAGE电泳，然后以纯化的多克隆抗体为一抗进行westernblotting。具体步骤如下：检测蛋白浓度进行上样，上样量在50µg左右，根据实验要求来。（1）电泳缓冲液可先在冰箱内预冷（提前制冰）。（2）样品加好后先75V左右跑浓缩胶，跑到分界线后换115V进行分离胶，待溴酚蓝跑到离底部大概1cm左右关掉电源进行下一步转膜。（3）确定膜和滤纸的大小，PVDF膜进行甲醇激活1min，然后转入预冷的转膜液中，滤纸也放入转膜液中，浸湿5min以上。20 （4）进行转膜操作，先放三层滤纸，再放胶（胶是先去离子水冲洗再放入转膜液中），再放膜，最后再放三层滤纸，每一步注意驱赶气泡。（5）根据膜的面积1.5A/cm2左右进行转膜，根据蛋白分子大小以及电压大小掌握好转膜时间，防止转过或转膜不完全。（6）5%过滤脱脂奶粉37℃封闭2h，结束后用TBST洗涤膜3次，每次10min。（7）孵育一抗：将洗涤后的PVDF膜放入用5%脱脂奶粉稀释好的一抗中，37℃孵育1h，同时注意摇晃。结束后用TBST洗涤膜三次，每次10min。（8）孵育二抗：将PVDF膜加入到稀释好的酶标二抗中，37℃摇晃孵育45min。结束后用TBST洗涤膜3次，每次10min。（9）DAB显色或ECL发光。a.DAB显色：加A液2.43mLB液2.57mL混匀加入DAB2mg充分混匀后加入25µL30%过氧化氢溶液。进行避光显色5min左右，然后用水冲洗终止。b.ECL发光：常规洗膜后分别取等体积的A，B液混匀，再加C液，现配现用。将膜浸入发光液，孵育1min，准备立即压片曝光（不宜孵育时间过长）；取出膜将膜贴在保鲜膜上，用保鲜膜包裹好含蛋白膜，无气泡和褶皱，用胶带固定在暗盒内，最好蛋白面朝上；在黑暗中放入Multi-channelimagingsystem（VersaDocTM4000MP）中曝光观察蛋白条带，分别曝光不同时间（数秒到数分钟）。21 2结果与分析2.1MegaprimerPCR定点突变方法扩增结果以本实验室分离出的CAV毒株感染性克隆pcD-2CAV为模板，用设计的全长引物（A1、A2、A3）和含点突变引物（B2、C2、D2、E1）进行PCR扩增，第一轮PCR扩增得到含点突变的大引物片段，第二轮PCR获得含点突变的CAV全长基因（根据点突变位置命名：CAV-VP1Q394，CAV-VP2R101，CAV△VP3和CAV-VP3S85）。对第一轮PCR和第二轮PCR产物进行电泳检测，结果如图4所示，扩增条带大小与预期目的条带相符。AB图4MegaprimerPCR突变方法扩增目的片段A:M:DL2000Marker;1:CAV-VP2R101第一轮PCR目的片段；2:CAV-VP1Q394第一轮PCR目的片段；3:CAV△VP3第一轮PCR目的片段；4:CAV-VP3S85第一轮PCR目的片段；B:M:DL2000Marker;1,2:CAV△VP3第二轮PCR目的片段；3,4:CAV-VP1Q394第二轮PCR目的片段;5:CAV-VP2R101第二轮PCR目的片段;6:CAV-VP3S85第二轮PCR目的片段Fig.4MegaprimerPCRamplifystargetedfragmentsA:M:DL2000Marker;1:ThefirstPCRtargetedfragmentofCAV-VP2R101;2.:ThefirstPCRtargetedfragmentofCAV-VP1Q394;3.:ThefirstPCRtargetedfragmentofCAV△VP3;4:ThefirstPCRtargetedfragmentofCAV-VP3S85;B:M:DL2000Marker;1:ThesecondPCRtargetedfragmentofCAV△VP3;3,4:ThesecondPCRtargetedfragmentsofCAV-VP1Q394;5:ThesecondPCRtargetedfragmentofCAV-VP2R101;6:ThesecondPCRtargetedfragmentofCAV-VP3S852.2含点突变CAV基因组重组质粒pEASY-CAV的构建和鉴定对上述电泳的目的条带进行回收纯化并与平端载体pEASY-Blunt连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α后进行（利用引物A1和B2进行菌液PCR）阳性重组质粒筛选，结果如图5A。将筛选得到的阳性重组质粒送往生物公司测序，对测序结果进行分析并与实验室分离的CAV毒株基因测序结果对比，如图5B所示，在预期位置发生点突变：22 AB图5阳性重组质粒的筛选和测序分析A.M:DL2000Marker;1-8:pEASY-Blunt-CAV△VP3转化后随机8个单克隆菌液PCR鉴定;9:空白对照B.:1:pEASY-Blunt-CAV△VP3中CAV点突变；2:pEASY-Blunt-CAV-VP3S85中CAV点突变；3:pEASY-Blunt-CAV-VP2R101中CAV点突变；4:pEASY-Blunt-CAV-VP1Q394中点突变Fig.5IdentificationandsequencinganalysisofpositiverecombinantplasmidA.M:DL2000Marker;1-8:BacterialfluidPCRidentificationofpEASY-Blunt-CAV△VP3;9:BlankcontrolB.1:pEASY-Blunt-CAV△VP3mutation;2:pEASY-Blunt-CAV-VP3S85mutation;3:pEASY-Blunt-CAV-VP2R101mutation;4:pEASY-Blunt-CAV-VP1Q394mutation2.3含点突变CAV基因组重组质粒pcDNA-CAV的构建利用KpnⅠ和XholⅠ酶切pEASY-Blunt-CAV△VP3等重组质粒和pcDNA3.1(+)载体，酶切如图6：pEASY-Blunt-CAV△VP3等重组质粒和pcDNA3.1(+)载体切出预期目的条带。回收纯化酶切的基因，连接并转化大肠杆菌后进行（利用引物A1和B2进行菌液PCR）阳性重组质粒筛选，如图7为其中一个重组质粒转化后随机挑取8个细菌克隆进行菌液PCR鉴定结果（引物为A1和B2），出现目的条带。图6pEASY-Blunt-CAV和pcDNA3.1(+)双酶切目的片段M:DL5000Marker;1,2,3,4:含不同突变的pEASY-Blunt-CAV双酶切片段;5,6:pcDNA3.1(+)载体双酶切片段Fig.6TargetedfragmentsofpEASY-Blunt-CAVandpcDNA3.1(+)doubleenzymedigestionM:DL5000Marker;1,2,3,4:differentpEASY-Blunt-CAVdoubleenzymedigestion;5,6:pcDNA3.1(+)doubleenzymedigestion23 图7pcDNA-CAV菌液PCR鉴定M：DL2000Marker;1-8:重组质粒pcD-CAV△VP3随机8个克隆菌液PCR鉴定Fig.7IdentificationofpcDNA-CAVmonoclonalbacteriaM：DL2000Marker;1-8:BacterialfluidPCRidentificationofpcD-CAV△VP32.4含点突变CAV基因组重组质粒pcDNA-2CAV的构建和鉴定将A1、A2扩增得到的含点突变的CAV全长基因与含同一点突变的CAV基因组重组质粒pcDNA-CAV分别用KpnⅠ酶切，酶切纯化后的pcDNA-CAV重组质粒用小牛碱性磷酸酶去磷酸化处理，然后与相对应的单酶切CAV基因组连接转化大肠杆菌DH5α，筛选阳性质粒并进行BamHⅠ酶切鉴定（软件分析发现在CAV全基因组中含有BamHⅠ酶切位点，若两段基因为顺次连接则酶切目的基因应为2289bp，而反向连入酶切基因应为1462bp）CAV全基因组是否成功顺次插入pcDNA3.1中，结果如图8，酶切出现与预期结果相符的条带。将鉴定为阳性的重组质粒进行测序，进一步确定为顺次连入pcDNA3.1的重组质粒进行保存。图8pcDNA-2CAV等重组质粒的单酶切鉴定M:DL5000Marker;1：pcDNA-CAV酶切片段;2:.pcDNA-2CAV酶切片段;3:pcDNA-2CAV△VP3酶切片段;4:pcDNA-2CAVVP3S85酶切片段;5:pcDNA-2CAVVP2R101酶切片段;6:pDNA-2CAVVP1Q394酶切片段Fig.8IdentificationofdualcopyplasmidscontainingmutationssingleenzymedigestionM:1.identificationofpcDNA-CAVenzymedigestion2.identificationofpcDNA-2CAVenzymedigestion3:identificationofpcDNA-2CAV△VP3enzymedigestion；4:identificationofpcD-2CAVVP3S85enzymedigestion；5:identificationofpcDNA-2CAVVP2R101enzymedigestion；6:identificationofpcDNA-2CAVVP1Q394enzymedigestion24 2.5鸡胚卵黄囊接种及相关检测将上述构建好的重组质粒进行大量抽提和纯化并与对照样品同时接种孵化到第7日的SPF鸡胚，培养到第19天后进行剖检观察，并采集其胸腺组织进行基因组DNA提取，通过PCR方法扩增病毒特异性基因片段和酶切鉴定。结果如图9，CAV分离株对照鸡胚发育明显缓慢，而pcDNA-2CAVVP1Q394组鸡胚的腿肌出现出血，胸腺和个体大小与阴性对照无明显差别；pcD-2CAVVP2R101、pcDNA-2CAV△VP3和pcDNA-2CAVVP3S85实验组鸡胚没有出现明显病理变化。图9鸡胚组织解剖病理变化a,c:pcDNA-2CAVVP1Q349接毒组腿肌和胸腺;b,d:阴性对照;Fig.9Anatomyofthechickenembryosa,c:thighmuscleandthymusofpcDNA-2CAVVP1Q349injection;b,d:negativecontrol利用引物F1和F2（含BamHⅠ酶切位点）扩增CAV基因组，然后利用KpnI酶切所得基因组，KpnI酶切检测结果如图10，pcD-2CAV△VP3接毒组PCR基因条带较弱，pcD-2CAVVP1Q394、pcD-2CAVVP2R101、pcD-2CAVVP3S85实验组均能25 检测到含KpnⅠ酶切位点的病毒基因。图10引入的KpnⅠ酶切位点检测M:DL2000Marker;不同接毒组扩增全长片段以及KpnI酶切片段Fig.10DetectionofKpnIenzymedigestionsiteM:DL2000Marker;theCAVtargetedfragmentandKpnIenzymedigestion2.6细胞转染以及拯救病毒侵染细胞后的观察和检测2.6.1重组质粒侵染细胞后电子显微镜观察将纯化的pcDNA-2CAV△VP3等重组质粒转染正常细胞并进行病毒拯救，培养到第4代时用电子显微镜观察细胞变化（如图11）。结果显示：临床分离毒株侵染细胞后细胞出现肿胀明显，且细胞死亡较多；pcDNA-2CAVVP1Q394和pcDNA-2CAVVP2R101转染组少量细胞出现肿胀；pcDNA-2CAV△VP3和pcDNA-2CAVVP3S85转染组几乎不出现细胞病变。26 图11不同重组质粒转染细胞后观察结果a：阳性;b:阴性;c:pcDNA-2CAVVP1Q394转染;d:pcDNA-CAV△VP3转染;e:pcDNA-2CAVVP2R101转染;f:pcDNA-CAVVP3S85转染Fig.11Observationofrecombinantplasmidtransfectcellsa:positivecontrol;b:negativecontrol;c:pcDNA-CAVVP1Q394transfection;d:pcDNA-CAV△VP3transfection;e:pcDNA-CAVVP2R101transfection;f:pcDNA-CAVVP3S85transfection2.6.2重组质粒转染细胞后凋亡检测利用凋亡检测试剂盒对转染的第5代细胞进行凋亡检测。绿色荧光为AnnexinV-EGFP作为探针标记早期凋亡（细胞早期凋亡细胞内侧的磷脂酰丝氨酸发生外翻，暴露于细胞质膜的外侧，而AnnexinV是一种与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力的Ca+依赖性磷脂结合蛋白，利用这种结合性质，检测细胞早期凋亡）。碘化丙啶（PI）是一种核酸染料，能够检测凋亡晚期和坏死细胞，在特定的激发光下呈现红色。首先对实验组和对照细胞利用细胞计数仪（江苏卓微生物科技有限公司）进行细胞计数，然后每组均匀稀释到1.0×106个细胞进行凋亡实验。染色结束后每组吸取10μL样品均匀涂布于玻片上用荧光显微镜进行观察。结果如图12:A图是普通光观察细胞状态，B和C分别是荧光观察的细胞状况。在此基础上对不同细胞组进行凋亡检测，结果显示：阴性对照组（G）几乎不发生凋亡，pcDNA-2CAVVP1Q394转染细胞组（H）出现较多早期凋亡，pcDNA-2CAV△VP3（I）、pcDNA-2CAVVP3S85（J）和pcDNA-2CAVVP2R101（K）转染组凋亡细胞相对较少，阳性组（L）已经出现大量27 晚期凋亡或坏死。图12重组质粒转染细胞后凋亡检测A：普通白光细胞凋亡观察；B：AnnexinV-EGFP染色；C：PI染色；G:阴性对照；H:pcDNA-2CAVVP1Q394;I:pcDNA-CAV△VP3;J:pcDNA-CAVVP3S85;K:pcDNA-CAVVP2R101;L：阳性对照Fig.12.ApoptosisdetectionofdifferentmutationsA：Normalobservation;B:AnnexinV-EGFP;C:PI;G:negativecontrol;H:pcDNA-2CAVVP1Q394;I:pcDNA-CAV△VP3;J:pcDNA-CAVVP3S85;K:pcDNA-CAVVP2R101;L:positivecontrol28 2.6.3重组质粒转染细胞后病毒致病因子VP3蛋白在细胞内的表达首先对纯化的多克隆抗体进行检测：利用原核表达的VP3融合蛋白为抗原，以纯化的抗VP3蛋白兔血清为一抗，二抗为羊抗兔HRP-IgG酶标二抗，进行Westernblotting分析，如图13在预期位置出现条带。图13抗VP3兔血清抗体纯化检测.M：蛋白MarkerVP3-His融合蛋白；Fig.13PurificationofVP3rabbitserumantibodyM:proteinmarker;fusionproteinofVP3-His利用上述纯化的CAV蛋白抗体进行细胞内病毒蛋白检测。首先对培养到3-6代的细胞中病毒的VP3蛋白表达情况进行检测，由图14中A图可知在细胞培养到第3-5代时VP3表达量较高。选择提取第4代细胞蛋白分别检测病毒VP3蛋白在细胞内表达情况。由图14中的B可知除VP3缺失突变组检测不到病毒VP3蛋白表达，其他侵染细胞组均能检测到病毒相关蛋白表达。图14细胞内CAV的VP3蛋白表达检测A.M:蛋白Marker;1-4:pcDNA-2CAVVP1Q394侵染组第3-6代细胞VP3蛋白B.pcDNA-2CAVVP3S85侵染组VP3蛋白;pcDNA-2CAVVP2R101侵染组VP3蛋白;pcDNA-2CAVVP1394侵染组VP3蛋白;pcDNA-2CAV△VP3侵染组VP3蛋白;阳性病毒侵染组VP3蛋白;VP3-His融合蛋白Fig.14VP3proteinexpressiondetectionofCAVincellsA.M:proteinmarker;1-4:VP3proteinofpcDNA-2CAVVP1Q394infect3-6generationcellsB.VP3proteinofpcDNA-2CAVVP3S85infection;VP3proteinofpcDNA-2CAVVP2R101infection;VP3proteinofpcDNA-2CAVVP1Q394infection;VP3proteinofpcDNA-2CAV△VP3infection;positivecontrol;VP3-Hisprotein29 2.6.4拯救的病毒侵染MSB1细胞后诱导凋亡情况将上述实验中所拯救的病毒侵染正常细胞，同时设置对照。通过PCR和酶切方法检测分子标签确定CAV基因组是否存在于细胞内，经过病毒特异性基因检测实验发现只拯救得到了pcDNA-2CAVVP1Q394质粒转染组突变毒。由此进一步利用流式细胞仪分析该拯救毒株与临床分离株对于细胞的病变情况，结果如图15突变病毒侵染和阳性对照与阴性对照相比存在显著差异（p﹤0.05），与阴性对照相比VP1Q394突变病毒能引起MSB1细胞发生凋亡，与CAV病毒分离株对照相比，突变病毒对细胞凋亡作用发生较慢，其存在更多的早期凋亡，晚期凋亡或死亡的细胞较少。图15CAVVP1Q394突变体对细胞凋亡的流式分析A:阴性对照；B:阳性对照；C:CAVVP1Q394Fig.15FlowcytometeranalyzesapoptosisoftheCAVVP1Q394mutantA:negativecontrol;B:positivecontrol;C:CAVVP1Q39430 3讨论CAV呈世界分布，近年来大多数中国商业化农场中均能检测到CAV抗体[4-5]。不同地区CAV基因型存在差异，宿主对于不同基因型病毒所产生的免疫效应可能不同。CAV可使宿主免疫抑制，从而导致多种病毒的混合和并发感染，为病毒检测和防制带来困难[9-10]。虽然对于CAV的致病机理有很多研究并取得很多有用的成果，国内外学者已研究出各种药物和疫苗等来预防此病，但并没有获得实用的商业化疫苗来针对此病[81-83]。这些年基因型疫苗研究发展迅速，其中圆环病毒DNA分子较小，操作简单，一般可直接PCR获得病毒全长基因，再进一步进行构建感染性DNA克隆[25]。由于基因突变和重组等可被用来致弱毒株，所以新型的CAV基因型疫苗被人们不断地研究探索[88]。本论文在分离的CAV临床毒株构建感染性克隆基础上[90]，为了进一步探讨这株CAV毒株是否能成为新型基因疫苗候选株，对其蛋白关键氨基酸进行定点突变，通过进一步实验得到含点突变的病毒。VP1是病毒衣壳蛋白，是引起机体产生免疫反应的主要抗原性蛋白[31]。最近国内张新珩等发现从人体内分离得到的CAV新毒株GD-G-12其VP1蛋白的394位氨基酸是谷氨酰胺是病毒具有较强致病性的一个重要因素[40]；可当394位是组氨酸时，病毒致病性会相对降低。由此本试验通过突变一株CAV毒株394位氨基酸来分析研究其是否能致弱原毒株。研究中发现含有VP1氨基酸突变的感染性克隆能够侵染鸡胚并在鸡胚内复制增殖得到带突变的病毒，但突变体对鸡胚的致病性仅表现在腿肌明显出血。进一步通过细胞实验检测发现该突变体在侵染MSB1细胞后可以正确表达蛋白，显微镜观察发现待细胞传到6-8代后与阳性对照相比出现肿大的细胞但量偏少。对细胞的凋亡效应较CAV临床分离株诱导的效应明显减弱，且代次明显加长。由此证实VP1突变体感染性克隆能够正常侵染机体和细胞，并能够表达相关蛋白。VP3蛋白具有诱导细胞凋亡能力，是病毒关键致病性蛋白，其诱导凋亡的机制一直是人们研究的热点，近些年对于其基因以及不同功能区氨基酸研究发展迅速，国外一些学者对其核定位以及选择性凋亡细胞机理进行了研究和探讨[59-63]。此试验不仅构建了VP3缺失的突变体克隆同时构建了VP3核定位信号截断的突变体克隆。用这两种质粒侵染SPF鸡胚和细胞时，发现鸡胚无明显病变，对MSB1细胞的病变影响也很小，病毒DNA和蛋白检测发现VP3缺失突变体没有检测到病毒相关蛋白。VP2是辅助VP1促使机体产生中和抗体的一个关键因素，近几年研究者通过突变以及重组VP1和VP2并探讨其对于机体的免疫效应，其中CAV的VP2蛋白磷酸酶基序中氨基酸的突变会减弱病毒的复制，减少感染细胞的病变，这些成果对于研究CAV致弱毒株有重要参考价值[47-50]。本试验突变VP2磷酸酶基序内氨基酸没有获得明显致病效31 应，与VP3突变体效应相类似，对于是否已经通过构建的突变体减弱病毒复制能力，从而导致其对细胞和鸡胚影响较小，可能需要进一步验证，并明确病毒拯救效果。综上结果可以看出构建的带点突变CAV基因感染性克隆能感染鸡胚和细胞，在感染细胞后通过病毒拯救能够得到突变病毒并具有感染性。侵染细胞观察和凋亡检测结果表明VP1的394位氨基酸突变和VP2磷酸酶基序中氨基酸突变可影响病毒复制，从而在一定程度上影响病毒致病性。VP3缺失病毒对于细胞几乎没有凋亡作用（可能抑制病毒复制），同样VP3核定位信号截断突变也会很大程度降低病毒对于细胞的凋亡作用。本研究突变感染性克隆为进一步研究CAV的致病机制及筛选疫苗候选株提供参考。32 4结论1、本研究构建了四种重组质粒：pcD-2CAV-VP1Q394、pcD-2CAV-VP2R101、pcD-2CAV△VP3和pcD-2CAV-VP3S85，并引入KpnI酶切位点。2、CAV分离株感染引起鸡胚明显矮小，而pcDNA-2CAVVP1Q394则仅对SPF鸡胚引起腿肌明显出血，其他突变体克隆对鸡胚致病性不明显。3、病毒拯救结果已明确得到了pcDNA-2CAVVP1Q394突变毒株，与临床分离株CAV感染细胞相比较，突变的病毒对于细胞凋亡作用相对减弱。33 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