角蛋白17对小鼠银屑病样模型的影响及其机制研究

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分类号R758.63UDC616.5密级公开角蛋白17对小鼠银屑病样模型的影响及其机制研究庄玉晨培养类别全日制学位类型学术学位一级学科(专业类)临床医学二级学科(专业)皮肤病与性病学研究方向银屑病发病机制研究指导教师王刚教授（主任医师）培养单位第一附属医院二O一八年五月 空军军医大学硕士学位论文目录缩略语表....................................................................................................................1中文摘要....................................................................................................................3ABSTRACT...............................................................................................................6前言....................................................................................................................9文献回顾...................................................................................................................11正文........................................................................................................................22角蛋白17对小鼠银屑病样模型的影响及其机制研究........................................221材料......................................................................................................................221.1主要仪器设备..............................................................................................221.2主要实验试剂..............................................................................................231.3实验溶液配方.............................................................................................231.4其他材料......................................................................................................242方法......................................................................................................................262.1咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的构建..................................................262.2干涉K17对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的影响.............................282.3敲除K17对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的影响.............................312.4统计处理......................................................................................................323结果......................................................................................................................333.1小鼠模型构建..............................................................................................333.2敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样表型的影响..........................343.3敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样皮损细胞因子表达的影响..363.4敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样皮损炎细胞浸润的影响......393.5敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样皮损血管的影响..................414讨论......................................................................................................................44小结......................................................................................................................49 空军军医大学硕士学位论文附录......................................................................................................................57个人简历和研究成果..............................................................................................57致谢......................................................................................................................58 空军军医大学硕士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称β-Actinbetaactinβ-肌动蛋白CCLC-CmotifchemokineligandC-C模体趋化因子配体CCRC-CmotifchemokinereceptorC-C模体趋化因子受体cDNAComplementaryDNA互补DNAcmCentimeter厘米CXCLC-X-CmotifchemokineligandC-X-C模体趋化因子配体CXCRC-X-CmotifchemokinereceptorC-X-C模体趋化因子受体dday天DEPC水diethylpyrocarbonatewater焦碳酸二乙酯处理后的纯水DNAdeoxyribonucleicAcid脱氧核糖核酸ggram克GWASgenome-wideassociationstudy全基因组关联分析hhour小时HLAhumanleukocyteantigen人体白细胞抗原H&EHematoxylinandEosin苏木素-伊红染色IFN-γinterferongammaγ干扰素ILinterleukin白细胞介素IMQImiquimod咪喹莫特K17Keratin17角蛋白17minminute分钟mlmilliliter毫升mRNAmessengerRNA信使RNAMHCmajorhistocompatibilitycomplex主要组织相容性复合物-1- 空军军医大学硕士学位论文NSnormalSaline生理盐水PBSphosphate-bufferedsaline磷酸盐缓冲液PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应PLGFplacentalgrowthfactor胎盘生长因子RNAribonucleicacid核糖核酸ssecond秒siRNAsmallinterferingRNA小干扰RNATLRTolllikereceptorToll样受体TNF-αtumornecrosisfactoralpha肿瘤坏死因子αTregregulatoryTcell调节性T细胞vvolt伏特VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子VEGFRvascularendothelialgrowthfactorrecptor血管内皮生长因子受体WTWidetype野生型μmmicrometer微米-2- 空军军医大学硕士学位论文角蛋白17对小鼠银屑病样模型的影响及其机制研究硕士研究生：庄玉晨导师：王刚教授辅导教师：党二乐副研究员空军军医大学西京医院皮肤科，西安710032资助基金项目：国家自然科学基金（No.81430073）中文摘要银屑病作为一种临床常见的慢性炎症性皮肤病，因其病情反复并且十分顽固，不仅对患者的身心健康和生活质量产生严重影响，同时也给患者亲属带来了深深的压力。近些年国内外对银屑病的发病机制研究成果众多，这也说明其具体发病机制十分复杂，也让临床治疗缺乏有效的靶点。当前研究认为，遗传、环境以及自身免疫等因素共同介导的皮肤局部免疫微环境紊乱是银屑病发病的重要环节。以角质形成细胞、T细胞为代表的多种固有免疫细胞与适应性免疫细胞相互作用，在银屑病皮损处形成复杂的免疫应答网络，共同参与疾病的发病。因此针对银屑病皮损多种细胞间的相互作用机制进行研究，对于进一步揭示银屑病的发病机制具有重要意义。角蛋白17（K17）是一种细胞骨架蛋白，对于维持角质形成细胞的形态稳定具有重要作用。K17在正常角质形成细胞不表达，而在银屑病患者表皮特异性高表达，并且其表达水平与银屑病的严重程度呈正相关，因此又被称为“银屑病相关角蛋白”。我们课题组基于前期的研究成果首次提出银屑病发病的“K17/T细胞/细胞因子”环路机制：外界刺激导致的应激、感染、创伤等因素能够激活角质形成细胞，使其高表-3- 空军军医大学硕士学位论文达K17，后者通过对角质形成细胞分泌的CXCL1进行调控，促使皮损周围募集大量的中性粒细胞发挥免疫学作用，这些中性粒细胞不仅能够进一步暴露K17的抗原表位，还能活化皮损局部的T细胞，而后活化的T细胞则通过释放大量细胞因子如：IL-17A、IL-22及IFN-γ等，继续作用于角质形成细胞，使得K17的表达进一步升高，再促使角质形成细胞分泌大量的CXCL1，募集更多的中性粒细胞加重局部免疫反应，成恶性循环。针对K17通过调节角质形成细胞免疫学活性参与银屑病发病的重要作用，本课题将利用K17基因敲除小鼠对上述K17功能进行验证，明确K17参与银屑病发病的重要作用。目的：利用K17基因敲除小鼠结合咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型，研究K17在银屑病中的作用及其免疫分子机制，明确K17siRNA用于治疗银屑病的可行性。方法：1、基于课题组引进的K17基因敲除小鼠，构建咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型，通过表型观察及H&E染色明确敲除K17对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型疾病表型的影响；利用流式细胞术、实时定量PCR等技术观察敲除K17对小鼠表皮中细胞因子和趋化因子的表达以及真皮中中性粒细胞浸润的调节作用，从而明确K17参与银屑病发病的免疫分子机制。2、设计合成针对K17的siRNA，外用于咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型，通过表型观察、H&E染色、实时定量PCR及流式细胞术观察抑制K17对银屑病皮损严重程度、表皮中细胞因子和趋化因子的表达以及中性粒细胞浸润的抑制作用，在动物水平明确K17siRNA用于治疗银屑病的可行性。结果：1、表型观察及H&E染色显示：与对照小鼠相比，K17基因敲除小鼠的银屑病样皮损有明显缓解，表皮厚度明显变薄，并且皮损中的毛细血管数量明显减少；2、实时定量PCR结果显示：与对照小鼠相比，K17基因敲除小鼠皮损组织中细胞因子IL-6、IL-8、IL-22、VEGF以及趋化因子CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、CCL-20、CCL-22、CCR-10的表达均明显降低；-4- 空军军医大学硕士学位论文3、流式细胞术结果显示：与对照小鼠相比，K17基因敲除小鼠皮损中浸润的中性粒细胞数量明显减少；4、外用涂抹K17siRNA后，咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的研究结果与上述K17基因敲除小鼠结果一致，即抑制K17表达后，银屑病样皮损有明显缓解，表皮厚度明显变薄，并且皮损中的毛细血管数量明显减少；皮损组织中细胞因子IL-6、IL-8、IL-22、VEGF以及趋化因子CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、CCL-20、CCL-22、CCR-10的表达均明显降低；流式细胞术结果显示：抑制K17表达后皮损中浸润的中性粒细胞数量明显减少。结论：我们利用K17基因敲除小鼠研究并证实：银屑病局部皮损表达异常升高的K17可通过调节由角质形成细胞分泌的多种促银屑病的细胞因子和趋化因子的表达、局部血管增生以及中性粒细胞浸润，促进皮损局部的免疫应答，参与银屑病发病。同时针对K17进行靶向干预能够明显缓解银屑病表型，首次明确K17作为靶点治疗银屑病的重要作用。关键词：银屑病；角质形成细胞；角蛋白17；细胞因子；血管内皮生长因子。-5- 空军军医大学硕士学位论文Theroleofkeratin17inimiquimod-inducedpsoriasis-likemousemodelCandidateformaster:ZhuangYuchenSμpervisor:WangGangTutor:DangErleDepartmentofdermatology,Xijinghospital,AirForceMedicalΜniversity,Xi’an710032,ChinaSponsoredPrograms:NationalNaturalScienceFoundationofChina(GrantNo.81430073)AbstractPsoriasisisacommonchronicskindiseasetypicallycharacterizedbysharplyerythematousplaquesindifferentsizesandshapeswithsilveryscales.Therecurrenceofthediseasebringsgreattroubletopatientsphysicallyandmentally.Yearsofsubstantialadvanceshavebeenmadetoelucidatingitsmolecularpathogenesis.However,themajorpartsremainunsolved.Recentstudiesbelievethatdisorderoflocalmicroenvironment,settingbygeneticandenvironmentalfactorsalongwithinnateandadaptiveimmunesystem,playsanimportantroleinthepathogenesisofpsoriasis.Thiscomplexinterplayinitiatesacascadeofthediseaseeventandinducesintricatecross-talkbetweenkeratinocytesandimmunecells,theprocessofwhichfinallymaintainstheinflammatorymilieuandaggravatesthediseasecondition.Hence,greatsignificancewillbemadetoexploretheintercellularinteractionsinpsoriaticlesionsforrevealingthemechanismsofpsoriasis.Keratin17(K17)isacytoskeletalprotein,maintainingtheframeworkofkeratinocytes.K17ishighlyexpressedinpsoriaticepidermisanditshigh-expressinglevel-6- 空军军医大学硕士学位论文ispositivelyrelatedtotheseverityofpsoriasis.Basedonourpreviouswork,ourgroupfirstlybroughtforwardK17/T-cell/cytokinesautoimmunepositivefeedbackloop,indicatingthatkeratinocytescanbeactivatedandhighlyexpressK17underthecircumstancesofstress,infectionorinjury.Inturn,K17regulateskeratinocytesinsecretingofCXCL1whichrecruitsneutrophilstomigratetothelesions,thenthemigratedneutrophilshelptoexposeepitopesofK17thatactivateTcellstoreleasecytokinessuchasIFN-γ,IL-17AandIL-22.ThesecytokinescouldtheninducehighexpressionofK17inkeratinocytesandthecascadegoesontobecomeaviciousloop.AsK17playingsuchavitalroleinthepathogenesisofpsoriasis,ourgroupdecidedtoemployK17-knockoutmicetotestifytheeffectofK17andfinallyclarifyitssignificance.ObjectiveToexploretheroleofK17inthepathogenesisofpsoriasisanditsimmune-molecularmechanismbyemployingtheimiquimod-inducedpsoriasis-likeK17-knockoutmicemodelandtotestifytheeffectofK17-siRNAasatreatmentindealingwithpsoriasis.Method1.Theimiquimod-inducedpsoriasis-likemicemodelwasestablishedwithK17-knockoutmice.AppearancewasobservedandH&Estainingwasperformedtoevaluatetheseverityofthediseaseinducedbyimiquimod;Real-timePCRandflowcytometrywereappliedtotesttheexpressionofcytokinesandchemokinesinkeratinocytesandtheinfiltrationofneutrophilsrespectively.2.K17siRNAweredesignedtodown-regulatetheexpressionofK17intheepidermisofmicebeforeapplyingtheimiquimodfortheestablishmentofimiquimod-inducedpsoriasis-likemicemodel.AppearancewasobservedandH&Estainingwasperformedtoevaluatetheseverityofthedisease;Real-timePCRandflowcytometrywereappliedtotesttheexpressionofcytokinesandchemokinesinkeratinocytesandtheinfiltrationofneutrophilsrespectively.Resμlts-7- 空军军医大学硕士学位论文1.AppearanceandH&Estainingshowedanobviousreliefofpsoriaticlesions,decreasedthicknessofepidermisandbloodcapillariesshrinkinginnumbersinK17-knockoutmicegroup.2.Real-timePCRrevealedthattheexpressionofcytokines(IL-6,IL-8,IL-22,VEGF)andchemokines(CXCL-1,CXCR-3,CCR-4CCL-20,CCL-22,CCR-10)weresignificantlydown-regulatedinK17-knockoutmicegroup.3.FlowcytometryshowedlessneutrophilinfiltrationinK17-knockoutmicegroup.4.AftertopicalapplicationofK17siRNA,theresultsfromtheimiquimod-inducedpsoriasis-likemicemodelgroupcoincidedwiththatfromtheK17-knockoutmicegroup,allofwhichweretheobviousreliefofpsoriaticlesions,decreasedthicknessofepidermis,lessbloodcapillaries,down-regulatedcytokines(IL-6,IL-8,IL-22,VEGF)andchemokines(CXCL-1,CXCR-3,CCR-4CCL-20,CCL-22,CCR-10)andlessneutrophilinfiltrationaftertheinhibitionofK17expression.ConclμsionWiththehelpofK17-knockoutmice,wetestifiedthataberrantlyhighlyexpressedK17inthepsoriaticlesionsmaymanipulatethepathogenesisofpsoriasisbyregulatingthekeratinocytesinexpressingvariouscytokinesandchemokines,andalsobypromotingthelocalangiogenesisandneutrophilinfiltration.Meanwhile,theresultsfirstlydemonstratedthesignificantimportanceofK17asatherapeutictargetindealingwithpsoriasis.Keywords:Psoriasis;keratinocytes;kertin17;cytokines;vascularendothelialgrowthfactor.-8- 空军军医大学硕士学位论文前言银屑病作为一种临床常见的慢性炎症性皮肤病，其病情反复且十分顽固的特点给患者及亲属造成了沉重的生活负担和精神困扰，而其以红斑、鳞屑为主要表现的外观严重影响患者的生活质量和身心健康。但是，目前针对银屑病的诱因以及具体发病机制尚不十分明确。研究表明，遗传因素、环境因素以及自身免疫因素共同导致了银屑病的发生和发展。以往研究认为，T细胞作为机体的主要免疫细胞，在银屑病的发病过程中起着主要的作用。近些年，随着研究的深入，除T细胞之外，广大学者还对角质形成细胞在银屑病中发挥的作用有了更新的认识，同时也对如树突状细胞、中性粒细胞等多种参与免疫调节、杀伤作用的细胞有了深入的了解。然而这些细胞具体在疾病的不同阶段中以何种方式发挥何种作用还需更进一步的研究。角蛋白17（K17）作为一种细胞骨架蛋白，常与角蛋白6（K6）结合形成异物二聚体来维持细胞形态结构的稳定。在正常情况下，K17分布于毛囊、指甲、皮脂腺及汗腺等部位，在正常的表皮角质形成细胞中不表达。然而，K17特异性高表达于银屑病患者表皮角质形成细胞，并且其表达水平与银屑病的严重程度相关，这提示了K17在银屑病的发生发展过程中发挥着重要的生物学功能。我们课题组一直致力于K17在银屑病中的作用研究，并于2006年首次提出银屑病发病的“K17/T细胞/细胞因子”环路机制：外界刺激导致的应激、感染、创伤等因素能够激活角质形成细胞，使其高表达K17，后者通过对角质形成细胞分泌的CXCL1进行调控，促使皮损周围募集大量的中性粒细胞发挥免疫学作用，这些中性粒细胞不仅能够进一步暴露K17的抗原表位，还能活化皮损局部的T细胞，而后活化的T细胞则通过释放大量细胞因子如：IL-17A、IL-22及IFN-γ等，继续作用于角质形成细胞，使得K17的表达进一步升高，再促使角质形成细胞分泌大量的CXCL1，募集更多的中性粒细胞加重局部免疫反应，成恶性循环。在课题组前期工作的基础上，本课题将利用K17基因敲除小鼠结合咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型，进一步探讨K17通过调节角质形成细胞免疫学活性参与银屑病发病的重要作用。同时初步研究靶向K17治疗银屑病的作用，为今后研究和发展-9- 空军军医大学硕士学位论文银屑病的靶向治疗药物打下基础。-10- 空军军医大学硕士学位论文文献回顾1.银屑病概况银屑病是一种临床常见的免疫相关的慢性炎症性皮肤病，其全球发病率约为[1][2]2-8%，我国患病人数也已超过600万。银屑病患者常因皮肤外观的病态改变以及相关治疗药物伴随的副作用而倍感焦虑，加之病情顽固且易反复，严重影响患者身心健康导致生活质量下降。临床上主要将银屑病分为4类：寻常型银屑病、红皮病型银屑病、脓疱型银屑病及关节病型银屑病。除此之外，特殊部位的银屑病如甲银屑病亦有一定的比例。在上述分类中以寻常型银屑病最为多见。其典型的临床表现为：好发于头皮、四肢及躯干的境界清楚的红色斑块，上覆白色鳞屑。鳞屑主要由过度增生且伴有角化不全的表皮所致。组织学特征为角化不全、棘层肥厚及毛细血[3,4]管扩张，同时伴有真皮浅层的炎细胞浸润。2.银屑病的发病机制银屑病的发病机制非常复杂，目前尚不十分清楚。当下公认的发病因素包括遗传因素和环境因素，二者共同作用诱发和促进银屑病的发生发展。研究表明，银屑病的发病具有家族遗传倾向，遗传与环境因素（如药物、创伤、吸烟、压力等）共[4-7]同作用，激活相应的自身免疫应答诱发银屑病发病（图1）。[4]图1银屑病的发病机制-11- 空军军医大学硕士学位论文2.1遗传因素[8]Lomholt等学者早在1963年就发现银屑病具有家族遗传倾向。随后的家系研究发现，同卵双生的双胞胎同时患病的几率为20-73%，而异卵双生的双胞胎同时患病[9-12]的几率远低于前者，仅为9-20%，这为银屑病与遗传的关联性提供了直接证据。近年来，通过连锁相关性分析发现了决定银屑病的主要遗传因素，并称之为银屑病[13,14]遗传易感位点1（PSORS1）。该位点为一段位于MHC内1~250kb的基因片段，定位于6p21.3染色体。而后通过序列和单体型分析、GWAS以及高密度单核苷酸多态性分析（SNPs），进一步将PSORS1的区间精确到包含HLA-C的长179kb的区[15]域，提示HLA-C高度近似于PSORS1基因。而HLA-C中包含的最小启动子区域[16]SNPs导致了等位基因的差异性表达，其中就包括HLA-Cw*0602。MHC-I类分子在所有有核细胞中均有表达，使得HLA-C能够调节固有免疫反应和适应性免疫反应[7]。然而，尽管HLA-C有如此强有力遗传证据以及明显的免疫功能，仍然缺少对银屑病易感性Cw*0602等位基因精确机制的功能学研究，并且尚未发现有Cw*0602特异性抗原或结合蛋白。随着高通量基因分型技术的发展和常见基因序列变异的基因组数据库的建成，为利用GWAS和随后的Meta分析鉴定一系列银屑病易感基因[17,18][19]奠定了基础。近些年的研究共发现了21个银屑病的遗传易感位点，它们的发现为研究银屑病的发病机制提供了新的线索。安徽医科大学张学军教授通过对汉族人MHC分子的深度测序，除外确定了HLA-Cw*0602等位基因为银屑病的易感基因外，还发现了两个新的易感基因（HLA-DPB1和BTNL2）及五个新的易感基因位点（HLA-C*0704、rs118179173、HLA-B中的氨基酸116、HLA-DPB1*0501及BTNL2[20,21]中的氨基酸281）。这些发现为银屑病遗传易感性的深入研究，提供了更加坚实的基础。2.2环境因素在对银屑病的发病机制研究中，相对于易感基因的研究发现，环境因素在银屑病发病机制中的作用研究相对滞后。已知的环境因素包括药物、感染、创伤、吸烟、饮酒以及应激反应。其中，某些药物如抗病毒药、抗增生药物（咪喹莫特）、抗抑郁-12- 空军军医大学硕士学位论文药、降压药（β-受体阻滞剂）、IFNs、甚至治疗银屑病所需的抗细胞因子制剂（抗-TNF[22]抗体）已被临床证明为银屑病的诱发因素并可加重恶化病情。目前主要用于治疗外生殖器和肛周尖锐湿疣的咪喹莫特乳膏（toll样受体7/8激动剂），已成为研究最为清楚的银屑病诱发因素之一，其可能的致病机制是激活了I[23,24]型IFN通路。该通路的产生途径及重要性已经被临床模型和转录组学所证实。[25]最初有临床观察发现，局部涂抹咪喹莫特可加重银屑病。在随后针对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的临床相关研究中发现，小鼠可以产生与人类银屑病相似的皮[26,27]肤改变，这也是为何咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型能够成为当前研究银屑病最常用的模型之一。对于咽喉部的链球菌感染与银屑病发病之间的相关性早有报[28][29]道，且主要为点滴型银屑病。而在斑块型银屑病患者的皮损和扁桃体中，也均[30]发现了同源T细胞克隆。在斑块型银屑病中，纹身和手术切口可导致创伤部位出[31]现银屑病的同形反应。另外，吸烟、饮酒等行为因素以及焦虑等精神性疾病与银屑病间的关系则很难研究清楚。尽管大量研究提供了压力应激、吸烟与银屑病之间联系的证据，但对于这些因素到底是诱发了银屑病还是加重了银屑病病情，目前仍[32]旧尚无统一定论。2.3自身免疫因素免疫因素在银屑病发病中的重要性及复杂程度不亚于以上任何一种发病机制。固有免疫和适应性免疫以及各类促炎介质都参与到银屑病的每一发病环节中。此外，随着研究者对银屑病皮肤组织学改变的研究以及对免疫调节机制的认识逐渐加深，关于银屑病应当属于上皮组织疾病还是免疫介导疾病的问题成为学者多年来争论的焦点。免疫系统以何种机制参与并导致角质形成细胞偏离正常分化轨道，以及角质形成细胞以何种方式反作用于免疫系统使其发生异常，已成为近些年银屑病研究的关键所在。从银屑病患者皮肤的外观改变出发，关注点自然集中于角质形成细胞及其异常分化过程。在正常的皮肤中，基底部角质形成细胞分化始于表皮的棘层和颗粒层，[33]最终死亡后形成了无核的角质层，也因此形成了一层保护屏障。在角质形成细胞的整个生长分化过程中，其在棘层由生长周期进入分化周期，后者包含了多种功能-13- 空军军医大学硕士学位论文性蛋白的合成、特定的角蛋白合成以及细胞外脂质的合成和释放，最终形成了角质层外壳。正常情况下，这一过程需要28天。然而，在银屑病的皮损中，过度增生的角质形成细胞将此过程缩短到了5至8天，因而出现角化不全、脂质分泌的减少、颗粒层变薄以及角化过度所造成的皮肤鳞屑这一典型银屑病表现。随着免疫抑制剂的应用所带来的意想不到的疗效，对于银屑病的发病机制研究重点逐渐转移到固有免疫和适应性免疫方面。目前研究发现，固有免疫在银屑病的初期发挥着重要作用。当机体受到外界刺激，比如创伤、感染等，作为人体最外层的屏障，角质形成细胞会被激活并分泌大量的免疫活性物质如：抗菌肽LL-37等，后者能够激活已表达TLR7/9的角质形成细[34,35]胞以及浆细胞样树突状细胞，二者释放大量I型IFN，而I型IFN在银屑病的起始阶段发挥重要的作用。除此之外，被激活的角质形成细胞还可释放大量细胞因子如：IL-6、TNF及IL-1β等，促进髓样树突状细胞的成熟并使之活化。有研究报道，银屑病真皮组织中成熟并活化的髓样树突状细胞较正常的皮肤组织可以升高30倍之[36]多。这些活化的髓样树突状细胞亦可产生多种细胞因子如：TNF、IL-20及IL-23[37]等，从而进一步加重局部炎症反应。另一方面，作为抗原提呈细胞，成熟的树突[38]状细胞可以通过引流淋巴结将抗原提呈给幼稚T细胞。因此，在链球菌与银屑病相关性研究中发现，多种链球菌抗原如：M蛋白（其结构与人源角蛋白高度相似）[39]及CpGDNA与人体的一些大分子极具相似性，故其可以活化特定的T细胞，后[40,41]者识别自身抗原，造成炎症反应。γδT细胞作为一种自身的固有免疫细胞，正常情况下在表皮中发挥免疫监视的作[42]用。近年来研究发现，γδT细胞可通过分泌IL-17参与银屑病的发生发展。因此当清除了银屑病皮肤中的γδT细胞后，其病情也会得到相应的缓解。此现象在小鼠银[43]屑病样模型中亦得到验证，这也将γδT细胞在银屑病发生发展中的认识提升到了新的水平。++自然杀伤细胞是一群重要的固有免疫细胞，表面表达CD56CD16，能够杀伤多[44]种被感染的细胞及癌细胞。研究表明，自然杀伤细胞能够产生大量的IFN-γ，从而激活角质形成细胞，使其分泌多种细胞因子。与此同时，被激活的角质形成细胞亦-14- 空军军医大学硕士学位论文能够通过分泌趋化因子如CCL-20、CCL-5及CXCL-10等，趋化自然杀伤细胞至皮损[45]出，进一步加重局部炎症反应。在银屑病发病的早期阶段，以中性粒细胞在表皮的浸润最常见，常表现为微脓疡，成为银屑病的重要组织病理学特征。作为机体重要的固有免疫细胞，中性粒细胞的主要作用即为抵抗外界病原入侵。早期研究发现，中性粒细胞具有多种免疫功能，包括吞噬作用和分泌细胞因子，以前者最为经典。而其分泌的细胞因子则具有[46,47]调节局部免疫反应的作用。近些年来的研究表明，中性粒细胞能够通过分泌趋[48]化因子CXCL-1及CXCL-2等，募集活化的效应T细胞，参与局部炎症反应。另外，中性粒细胞也能分泌IL-6、IL-8、IL-17及抗菌肽等，发挥调节局部免疫反应的[49,50]作用。有研究表明，银屑病局部皮损CXCL-1和CXCL-8（IL-8）的表达增高，前者主要由巨噬细胞、上皮细胞和中性粒细胞分泌，同时具有趋化中性粒细胞的功[51,52]能，而CXCL-8（IL-8）也具有相同的功能。然而，趋化中性粒细胞的具体机制还有待深入研究。由此可见，在整个固有免疫过程中，角质形成细胞、树突状细胞、γδT细胞、自然杀伤细胞、中性粒细胞及巨噬细胞等共同参与其中，发挥各自免疫作用，促进银[48]屑病的发生发展，见图2。-15- 空军军医大学硕士学位论文[48]图2.银屑病中细胞因子与免疫细胞的相互作用在固有免疫反应进行的过程中，树突状细胞等一系列抗原提呈细胞逐渐激活机体的T细胞，此时适应性免疫反应开始参与到银屑病的发展过程中。曾有学者研究发现，清除银屑病患者局部皮损中活化的T细胞后，患者的临床症状有所改善，因[53]++此提出银屑病与T细胞之间存在关联。而后通过进一步研究CD4和CD8T淋巴[54,55]+细胞在银屑病中的作用，证明了前者为银屑病致病的主要因素。CD4T淋巴细胞有多种不同细胞亚群组成，主要包括Th1、Th2、Th17以及调节性T细胞（Treg）等。[56,57]最初，Th1细胞被认为是斑块型银屑病免疫反应的主要介质。其可大量分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，加重局部炎症反应。而Th2细胞分泌的IL-4则可进一步促进其自身的极化，同时上调银屑病皮损表皮GATA3mRNA和蛋白表达，[58]通过转录和转录后机制抑制IL-1β和IL-6等炎性因子的表达。由于IL-1β在上调IL-6，IL-8及TNF-α的表达、Th17和Th22的分化以及刺激IL-17和IL-22的分泌过[59,60]程中均扮演着重要的角色，因此，通过抑制此通路，Th2分泌的IL-4可将银屑病皮损恢复至正常。在检测银屑病皮损中的细胞因子和Th1/Th2细胞比例时发现，-16- 空军军医大学硕士学位论文Th1/Th2的平衡间似乎存在一个双向反应模式，在不同类型的银屑病中有着不同的偏移。例如，在红皮病型银屑病中（一种重型银屑病），其Th2细胞来源的细胞因子（IL-4，IL-10）表达量明显高于寻常型银屑病，且Th1/Th2比例也较寻常型银屑病显著降低[61]，这反映了一种失衡的Th1和Th2模式。由此来看，Th1和Th2细胞均参与了银屑病发病的免疫反应，然而，尚不清楚Th1/Th2间平衡的偏移是如何导致银屑病发病。目前认为，银屑病的皮损中Th1细胞和IFN-γ水平均有所升高，银屑病发病早期IFN-γ激活抗原提呈细胞，并刺激后者产生CCL-20，与IL-17协同促进银屑病角质形成细胞β-防御素2的产生以及抗菌肽和趋化相关蛋白的表达，介导局部免疫微[62]环境的紊乱。与此同时，在Th1细胞的作用下，异常的角质形成细胞释放大量的抗菌肽以及IL-1家族的细胞因子包括IL-1β和IL-18，进一步参与Th1和Th17的细[63][64]胞分化过程。这表明，Th1细胞和Th17细胞共同参与银屑病的发生发展。在人类和小鼠模型中越来越多的证据表明，Th17细胞亚群在促进银屑病发病中[65]起到重要的作用。在银屑病皮损中，Th17细胞数量明显高于正常皮肤，其分化依[66]赖于转录因子RORγT、IL-1β、IL-6及IL-23。同时，Th17细胞对于IL-9、IL-12、IL-17、IL-22的分泌有着至关重要的作用。因此，银屑病中Th17细胞的激活能够进一步加强角质形成细胞的炎症反应，产生IL-23/Th17轴之间的正反馈循环，这一结[27]果在咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型上得到验证。进一步说明Th17细胞与银屑病发病有着非常重要的关系。成熟的Treg细胞表达Foxp3、TGF-β、IL-10、穿孔蛋白和颗粒酶A，其作用为[67,68]维持外周免疫耐受，从而限制慢性炎症疾病和预防自身免疫性疾病。由此可见，Treg细胞在维持机体免疫平衡中发挥着重要的作用，同时也可抑制局部包括Th17细[69]胞在内的其他免疫细胞的生物活性。Treg细胞的极化主要通过TGF-β、IL-4、IFN-γ、[70]IL-2、IL-6以及其他T细胞亚群介导。而IL-6作为其分化过程中必不可少的细胞[69]因子，也能够阻碍Th17细胞的活化和增殖，发挥多重免疫学作用，促进Treg细胞和Th17细胞之间的平衡。研究表明，银屑病患者皮损中的Treg细胞数较正常皮[71]肤有所增多。另有研究发现，经过氨基葡萄糖和小剂量环孢素联合治疗后，咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的银屑病样皮损有所好转，Th17相关细胞因子有所减少，-17- 空军军医大学硕士学位论文[72]同时Treg细胞数量增多，从而说明Treg细胞能够通过抑制银屑病中其他致病性T细胞如Th1和Th17细胞的生物学功能，维持机体免疫微环境的平衡。产生IL-22的Th22细胞和产生IL-9的Th9细胞组成了另外两种特定的效应T细胞。IL-22能够诱导产生细胞因子特异性的趋化因子，并且通过IL-23/Th17轴调节[38]并放大特定效应T细胞的免疫反应。IL-9则作为Th17信号通路的潜在调节因子发挥自身的免疫调节作用。然而，对于Th22细胞和Th9细胞在银屑病中的作用，仍处在初步的研究阶段。+此外，CD8T细胞在银屑病发病过程中也发挥着一定的免疫学作用。银屑病患+[73][74]者血液中的CD8T细胞常常携带其致病最重要的易感位点PSORS1。Johnston等+发现在浸润性银屑病皮损中，CD8T细胞可识别与链球菌M蛋白具有相同的表位的+角蛋白自身抗原，发挥其细胞毒性作用。此外有研究表明，穿孔素介导的CD8T细[75]+胞能够造成角质形成细胞的损伤。这一现象进一步加深了对CD8T细胞在银屑病发生发展中的认识。3.角蛋白173.1K17概述角蛋白是上皮细胞表达的一类纤维结构蛋白簇，按照氨基酸序列、分子大小、所带电荷等可分为I型角蛋白（酸性角蛋白）和II型角蛋白（中性和碱性角蛋白）[76]两大家族，两类角蛋白以配对的形式存在，每对角蛋白在上皮不同分化程度中差异性表达。在正常表皮中，基底层主要表达角蛋白5（K5）及角蛋白14（K14），而基底层以上细胞中则主要表达角蛋白1（K1）和角蛋白10（K10）。角蛋白是一种多[77]功能的蛋白质，其错义突变可能导致多种组织特异性疾病。此外，更多证据表明，除了给细胞提供机械性支撑，角蛋白还参与细胞的增殖分化与凋亡、上皮损伤的愈[78]合与重塑等生物学功能。角蛋白17（K17）作为角蛋白家族中的一员，属于I型角蛋白，由头、体、尾三[79]个结构域构成，其中体区为其主要的功能区，整个蛋白具有高度保守性，其在不[80]同种属间，如鼠和牛，体和尾两个结构域均可保持90%以上的保守性。正常情况[81]下，K17主要分布于甲板、汗腺、毛囊下部等处的肌上皮细胞中，其基因突变可-18- 空军军医大学硕士学位论文[77]以引起多发性脂囊瘤等疾病。这提示K17能够参与皮肤附属器的分化发育。当皮肤损伤后，K17的表达亦会有所升高。相反，如果干涉原代角质形成细胞K17的表达，会引起原代角质形成细胞的体积缩小，同时降低细胞内部蛋白质的合成效率。[82]另外，在K17敲除的小鼠实验中还发现其胚胎外胚层创口的愈合时间有所延长。另有研究证实，K17能够通过激酶信号转导通路，对细胞的增殖与凋亡以及胞内蛋[83]白质的合成进行调节，发挥一定的生物学功能。3.2K17与银屑病[84]早在上世纪90年代即有学者发现K17在银屑病患者头皮中高表达。而后亦有[85]研究发现K17表达水平与疾病的严重程度呈正相关。由于在正常的表皮角质形成细胞中不表达，因此K17的异常高表达提示其与银屑病之间存在着密切的联系。同时，银屑病的典型表现，即角化过度伴角化不全，实质上是角质形成细胞的过度增殖和异常分化的表现，伴随这样的现象，角质形成细胞内部的角蛋白谱也发生了相应的改变。比如角蛋白1（K1）和角蛋白10（K10），二者表达于正常角质形成细胞，而在银屑病皮损中低表达，取而代之的则是代表着角质形成细胞高增殖状态的角蛋[86]白，包括角蛋白6（K6）、角蛋白16（K16）和K17（见图3）。那么，K17如此[87]异常高表达的机制是什么呢？Komine等对此进行了深入的研究发现，凡是能够激活STAT1信号通路、使之磷酸化的细胞因子，也能够上调K17的表达，比如IL-6。相反，由于诸如IL-3、IL-4、IL-10、IFN-α等细胞因子不能激活STAT1通路，因此角质形成细胞内的K17也就不会在上述细胞因子的刺激下高表达。由此可知STAT1是K17表达上调的重要转录因子。-19- 空军军医大学硕士学位论文[86]图3.正常表皮与银屑病表皮角蛋白表达对比我们课题组于长期致力于K17在银屑病发病中的作用研究，在细胞及动物模型中发现银屑病相关细胞因子IL-17A能够通过STAT1和STAT3两个信号通路上调角[88]质形成细胞中K17的表达，同时，IL-22能够通过STAT3和ERK1/2通路来上调[89]角质形成细胞中K17的表达。可见，银屑病角质形成细胞中K17的表达受到多种细胞因子的调控，这些由辅助性T细胞所分泌的细胞因子包括IL-17、IL-22和IFN-γ等，在银屑病发病过程中扮演着十分重要的角色。另有研究发现，由于K17含有与链球菌M蛋白相类似的氨基酸序列“ALEEANxxL”，且含有这一序列的K17肽段能够被抗原提呈细胞提呈并刺激来源于银屑病患者的T细胞，使其活化并分泌IFN-γ，[90]因此提示K17可能是银屑病自身反应性T细胞的靶抗原。随后，K17与链球菌M[74]蛋白相类似的另一抗原表位“GLRRxLD”也被发现。我们课题组通过利用银屑病患者的外周血T细胞，与人工合成的K17肽段和抗原提呈细胞进行体外共孵育，证实了自身反应性T细胞确实能够被含有“ALEEANxxL”表位的K17肽段所激活，与此同[91]时，还发现了三个新的K17抗原表位也能够活化T细胞。由此可见，K17可能作为一个重要的自身抗原，参与银屑病的免疫反应过程。在此基础上，我们课题组首次提出了银屑病发病过程中的一个由K17参与的“K17/T细胞/细胞因子”环路：外界刺激导致的应激、感染、创伤等因素能够激活角质形成细胞，使其高表达K17，后者通过对角质形成细胞分泌的CXCL1进行调控，-20- 空军军医大学硕士学位论文促使皮损周围募集大量的中性粒细胞发挥免疫学作用，这些中性粒细胞不仅能够进一步暴露K17的抗原表位，还能活化皮损局部的T细胞，而后活化的T细胞则通过释放大量细胞因子如：IL-17A、IL-22及IFN-γ等，继续作用于角质形成细胞，使得K17的表达进一步升高，再促使角质形成细胞分泌大量的CXCL1，募集更多的中性粒细胞加重局部免疫反应，成恶性循环。针对K17通过调节角质形成细胞免疫学活性参与银屑病发病的重要作用，本课题将利用K17基因敲除小鼠对上述K17功能进行验证，明确K17参与银屑病发病的重要作用。-21- 空军军医大学硕士学位论文正文角蛋白17对小鼠银屑病样模型的影响及其机制研究1材料1.1主要仪器设备电子天平瑞士美特勒（Mettler）公司紫外分光光度计美国贝克曼库尔特公司制冰机美国Grant公司冰箱青岛海尔电冰箱有限公司旋转混合仪日本奥林巴斯公司小型高速离心机美国贝克曼库尔特公司台式离心机美国贝克曼库尔特公司-80℃超低温冰箱日本三洋公司微量移液器德国Eppendorf公司紫外凝胶成像仪美国伯乐公司移液器枪头/Eppendorf管德国Thermo公司荧光定量PCR仪美国伯乐公司琼脂糖凝胶电泳仪美国伯乐公司PH计美国Thermo公司流式细胞仪美国贝克曼库尔特公司组织石蜡切片机德国徕卡公司全自动病理组织染色机德国徕卡公司-22- 空军军医大学硕士学位论文1.2主要实验试剂PrimeScriptRTMasterMix日本TaKaRa生物公司RNA提取试剂盒上海普洛麦格生物产品有限公司琼脂糖美国SOLARBIO公司溴化乙锭美国Sigma公司Cwbio2×TaqMasterMix北京康为世纪公司TMSYBRPremixEXTaqII日本TaKaRa生物公司DL2000DNAMarker日本TaKaRa生物公司7-AAD美国Biolegend公司4型胶原酶美国Worthingto公司11型胶原酶美国Sigma公司透明质酸酶美国Sigma公司DNasel美国Sigma公司HEPES美国Invitrogen公司计数珠美国Invitrogen公司大鼠抗小鼠CD16/CD32美国Biolegend公司蛋白酶K德国Merck公司咪喹莫特乳膏英国3M医药用品有限公司1.3实验溶液配方1)1×PBS缓冲液配制NaCl4.0gKH2PO40.13gNa2HPO40.71gKCl0.1g去离子水500ml-23- 空军军医大学硕士学位论文按上述比例称量各成分,调pH值至7.35，高温高压灭菌，4℃保存。2)10×TBE电泳缓冲液Tris-HCl108g硼酸55gNa2EDTA·2H2O7.44g去离子水1000ml按上述比例配置，使用时稀释为1×TBE电泳缓冲液3)DEPC水DEPC1ml去离子水1000ml高温高压灭菌后室温保存4)组织裂解液KCl0.056gTris-HCl0.044gTriten-10015μl蛋白酶K6mg去离子水15ml1.4其他材料1)RNA提取试剂盒组分RNA裂解液40mlRNA稀释液30mlRNA洗液40ml10×DNA酶I缓冲液0.3mlDNA酶I(冻干粉)1瓶1-硫代甘油1ml无核酸酶水13ml-24- 空军军医大学硕士学位论文2)实时定量PCR引物由大连Takara公司设计并合成，序列如下：表1PCR引物序列基因名称引物序列（5’-3’方向）退火温度(℃)K17F:GAGAGGATGCCCACCTGACT57R:GAGCTGAGTCCTTAACGGGT57CCR-4F:TGAAGCCTGGTTACAAGCGT60R:CTGCACGGACATTTCAACCG60CCR-10F:AGCGCACTTGGTTTCAGTCT60R:GGAAAAATGAGCCGACAGCG60CXCR-3F:CAACTACGATCAGCGCCTCA60R:GTAGGCCATGACCAGAAGGG60CCL-20F:AGCAGCAAGCAACTACGACT60R:TGGATCAGCGCACACAGATT60CCL-22F:GTGAGGCTCTGGTCCCTCTA60R:GGTAAGGCTGGCCTGAATGT60CXCL-1F:ACCCAAACCGAAGTCATAGC57R:ACAGGTGCCATCAGAGCAGT57IL-6F:CCCCAATTTCCAATGCTCTCC60R:CGCACTAGGTTTGCCGAGTA60IL-8F:GAAGGTGCAGTTTTGCCAAGG57R:AACCCTCTGCACCCAGTTTTC57IL-22F:CAACTGTTGACACTTGTGCGA57R:TGACGATGTATGGCTGCTGG57β-ActinF:AGCCTTCCTTCTTGGGTATG57R:GCTCAGTAACAGTCCGCCTA57RPLP0F:AACTCTGCATTCTCGCTTCC60R:TCGTTTGTACCCGTTGATGA60-25- 空军军医大学硕士学位论文VEGFF：CAGGCTGCTGTAACGATGAA60R：CTATGTGCTGGCTTTGGTGA602方法2.1咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的构建2.1.1实验动物来源野生型C57BL/6小鼠均购于第四军医大学实验动物中心，K17基因敲除鼠购于美国杰弗逊实验室，所有小鼠均为FPS级，于第四军医大学实验动物中心进行FPS级环境饲养，自由进食水，湿度50%，室温20～25℃。2.1.2角蛋白17敲除鼠基因型鉴定K17敲除鼠基因型鉴定方法：取小鼠尾部约1cm，置于1.5ml的EP管中，加入100μl组织裂解液，55℃孵育24h，待组织溶解后，将EP管以94℃煮沸15min，离心13000rmp/min，5min，收集上清液于另一干净的EP管中，即为小鼠DNA，扩增PCR后利用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。小鼠鉴定的PCR引物序列及结果判定方法，如表2所示：表2K17敲除小鼠基因鉴定PCR引物序列小鼠引物序列退火温度结果判读-/-K17a）CGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCT60℃WT：600bp-/-b）AGCCTGGACCCTTCCCGAAGTCAG60℃K17：400bp+/-c）GGCCAGGTGGGCGGCGAAATCAAC60℃K17：400+600bp1)建立PCR反应体系20μl：表3K17小鼠基因型鉴定20μlPCR扩增体系试剂加入量（共20μl）引物(a+b+c)0.5μl+0.5μl+0.5μlTaqMasterMix10μlcDNA1μl-26- 空军军医大学硕士学位论文去离子水7.5μl2)PCR扩增条件：95℃4min，1个循环；变性95℃40s，退火60℃40s，延伸72℃40s，共34个循环；4℃永久。3)配制琼脂糖凝胶：用天平称取琼脂糖2g，加入100ml的TBE液中（配制2%）置于三角烧瓶混匀，微波炉加热琼脂糖至其完全溶解，加入溴化乙锭，均匀混合；后将琼脂糖溶液小心倒入电泳槽，避免产生气泡，插入梳子，室温静置30min，待凝固。4)电泳：胶凝后，以垂直方向小心拔出梳子，将凝胶块置于电泳槽内，加入足量TBE至完全淹没胶面；将10μlPCR产物加入上样孔内，电压120V，45min，取出凝胶，利用紫外凝胶成像系统进行分析。2.1.3K17-siRNA制备K17-siRNA：从上海吉玛制药技术有限公司订购的K17-siRNA，序列如表4所示，按照试剂说明，将一定量的DEPC水与siRNA混合，配成20μM浓度的siRNA液体。配制K17-siRNA乳膏：三种siRNA各10μl，1xPBS30μl，凡士林100μl。充分混匀。表4K17-siRNA序列基因名称正义链5’-3’反义链3’-5’Krt17-Mus-219GGGAGCAACAGUUAUUCCATTUGGAAUAACUGUUGCUCCCTTKrt17-Mus-452CUACAGCGCUUAUUACCAUTTAUGGUAAUAAGCGCUGUAGTTKrt17-Mus-1472GAGACCAUUAAAGCUUGCUTTAGCAAGCUUUAAUGGUCUCTT2.1.4咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型1)实验分组：将9只野生型小鼠从随机数表中任意行/列开始，依次读取2位数作为一个随机数录于编号下；将全部随机数从小到大编排序并按1-9编号，按此序号1~3为凡士林阴性对照组（记为：Ctrl-V组）；序号4～6为凡士林+咪喹莫特组（记为：IMQ-V组）；序号7~9为siRNA+咪喹莫特组（记为：IMQ-siRNA-27- 空军军医大学硕士学位论文组）。另将6只野生型小鼠编号，从1至6；随机数表编号方法同上，序号1～3，为阴性对照组（记为：Ctrl组）；序号4～6为咪喹莫特组（记为：IMQ-WT组）；-/-同时随机取K17敲除鼠3只，作为K17敲除组小鼠（记为：IMQ-K17组）。2)剃毛：将200μl5%戊巴比妥钠溶液（5g戊巴比妥钠+100ml生理盐水）腹腔注射于小鼠体内，待其麻醉后，分别用剃刀和刮胡刀剃除背部毛发。3)咪喹莫特诱导银屑病病模型：所有涂抹于剃毛后第二天开始进行，每天涂抹时间固定。IMQ-siRNA组小鼠于每天上午涂抹K17-siRNA乳膏干涉其K17表达，连续2天，第3天起于上午继续涂抹K17-siRNA乳膏，下午涂抹咪喹莫特，连续6天，共计8天；IMQ-V组于每天上午涂抹凡士林，连续2天，第3天起于上午继续涂抹凡士林，下午涂抹咪喹莫特，连续6天，共计8天；Ctrl-V组于每-/-天上午涂抹凡士林，连续8天。IMQ-WT组和IMQ-K17组小鼠于每天下午连续涂抹咪喹莫特，共计6天。Ctrl组小鼠不做任何处理。2.2干涉K17对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的影响2.2.1实时定量PCR检测siRNA干涉小鼠银屑病样模型中K17的表达情况提取siRNA干涉小鼠的RNA：1)脱颈处死小鼠后，取背部皮肤，刮除脂肪，将组织平铺于托盘，并置入60℃水浴锅中1分钟，取出后用手术刀将组织表皮刮出，放于EP管，存放于冰中。2)冰浴条件向放有小鼠表皮组织的EP管中加入无核酸酶水1.5ml，分别加入300μl的裂解液、稀释液，用移液器混匀，室温静置3～5min，之后于70℃加热3min。以最大速度离心样本5min，小心吸取上清液。3)加入上清体积0.5倍的无水乙醇，用移液器进行吹打混匀3～4次。随后将离心柱/收集管取出，将混合物转移至离心柱中，12000～14000×g离心1min，弃滤液。4)加600μlRNA洗液，12000～14000×g离心45s，弃去滤液。5)准备好DNA酶I孵育液，加入50μl至吸附膜中央，室温静置15min。6)加600μlRNA洗液，12000～14000×g离心45s，弃滤液。将离心柱重新安置-28- 空军军医大学硕士学位论文于收集管上，12000～14000×g离心2min。7)将离心柱转移至洗脱管上，向离心柱膜中央加入50-200ml无核酸酶水，室温静置2min，12000～14000×g离心1min。8)将洗脱管内离心出的液体再次加入离心柱膜中央，温静置2min，12000～14000×g离心1min，此时洗脱管中的液体为提取的RNA，抽取10μl样品定量，剩余RNA保存于-80℃，定量后立即进行反转录。9)RNA定量：取小鼠皮肤组织RNA样品10μl用去离子水稀释至100μl，紫外分光光度计检测260nm波长处A260的吸光度值和A260/A280比值，计算出RNA的浓度并判断其纯度。反转录RNA：1)建立20μl反转录体系：反转录酶及引物混合溶液PrimeScriptRTMasterMix4μl，RNA溶液1μg，DEPC水补齐至总体积至20μl。2)将反应体系放入PCR仪，设定反应条件为：37℃反应15min，85℃反应5s，4℃永久，反应结束后产物即为反转录cDNA溶液，DEPC水稀释3倍后冻存于-20℃。实时定量PCR：1)建立10μlPCR反应体系表510μlPCR反应体系试剂加入量（共10μl）引物(F+R)0.5μl+0.5μlTMSYBRPremixExTaq5μlcDNA1μl无核酸酶水3μl2)反应条件：95℃预变性30s，95℃反应5s，60℃或57℃反应30s，72℃反应45s，总循环40次，73℃延伸5min。3)扩增完成后，进行溶解曲线分析，95℃1min，55℃1min，以0.01℃/s的速度升温至95℃，连续监测荧光。4)每个样本设3复孔，取平均值，管家基因β-Actin和RPLP0的表达量作为内参。-29- 空军军医大学硕士学位论文2.2.2H&E染色观察siRNA干涉小鼠银屑病样模型皮损的变化情况将建模成功的IMQ-siRNA组、Ctrl-V组、IMQ-V组小鼠处死后按以下步骤进行H&E染色，测量各组表皮厚度并对各组皮损中血管进行计数。1)取小鼠背部皮损约1.0×0.5cm，放入足量的10%福尔马林固定液中固定24小时。2)配置浓度分别为80%、90%、95%的酒精及无水酒精，按此顺序依次浸泡，每次15min，再浸泡于二甲苯中透明15min。3)将已熔化的石蜡放入平皿中，后将组织迅速夹起并放入石蜡中，稍后将其取出待其凝固成块。4)将蜡块固定于切片机上，按照5~10μm厚的标准切片，45℃恒温箱中烘干。5)将烘干的切片浸泡于二甲苯中，脱去石蜡，再从高浓度至低浓度酒精浸泡，每次10min，而后浸泡于去离子水中等待染色。6)将切片置于苏木精溶液中染色10min；酸水和氨水涮洗2~3次；流水冲洗后放入去离子水中浸泡15min，再用80%、90%、95%的酒精脱水各15min，伊红染色液染色4min。7)酒精脱水，二甲苯透明。8)滴少许树胶于切片上，盖玻片封片并标记。9)测量组织表皮厚度：将各组织H&E切片扫描至电脑，用NDP（NanoZoomerDigitalPathologyImage）软件分析。将每个组织均分10等份，每一份测一次表皮厚度，10等份取平均值，而后进行统计学分析。10)皮损中血管计数：在将各组织H&E染色切片扫描至电脑，应用NDP软件，将每个组织均分为10等份，每一份在20×视野下计数血管个数，10等份取平均值，而后进行统计学分析。2.2.3实时定量PCR检测siRNA干涉小鼠银屑病样模型中细胞因子的表达情况提取建模成功的IMQ-siRNA组、Ctrl-V组、IMQ-V组小鼠表皮RNA并进行反转录后对细胞因子IL-6，IL-8，IL-22及趋化因子CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、CCR-10、CCL-20、CCL-22表达量进行实时定量PCR测定。引物序列见表1，RNA提取、定-30- 空军军医大学硕士学位论文量、反转录及实时定量PCR步骤见2.2.1。2.2.4流式细胞术检siRNA干涉小鼠银屑病样模型中的炎细胞浸润情况1)将建模成功的IMQ-siRNA组、Ctrl-V组、IMQ-V组建模成功的小鼠脱颈处死，剪取背部皮损约1.0x1.0cm，刮除脂肪，置于消化液（1mg/ml4型胶原酶，1mg/ml11型胶原酶，0.5mg/ml透明质酸酶，100μg/mlDNaseI，10μMHEPES，用1640培养基配置）中剪碎。2)将剪碎组织收集至10mlEP管中，做好标记，置于37℃水浴摇床，300转/min，消化35min，取出消化完成后的组织，加入配制好的流式液4ml（2%灭活胎牛血清，0.02%(w/v)叠氮化钠，用1×PBS配置），充分震荡混匀30s，过200目细胞筛，收集滤液于流式管中。3)1200rpm/min，离心5min，同时配置抗小鼠CD16CD32抗体封闭液。4)弃上清，加入100μl抗小鼠CD16CD32抗体封闭液避光冰上孵育20min。5)1200rpm/min，离心5min，同时配制抗小鼠Gr1-FITC抗体（每100μl加入0.5μl抗体）。6)弃上清，加入配置好的抗小鼠Gr1-FITC抗体，冰上避光孵育30min。7)1200rpm/min，离心5min，弃上清，加入300μl流式液（内含0.5μl7-AAD及一定量计数珠），立即上流式细胞仪检测。2.2.5实时定量PCR检测siRNA干涉小鼠银屑病样模型中VEGF表达情况提取建模成功的IMQ-siRNA组、Ctrl-V组、IMQ-V组小鼠表皮RNA并进行反转录后对VEGF表达量进行实时定量PCR测定。引物序列见表1，RNA提取、定量、反转录及实时定量PCR步骤见2.2.1。2.3敲除K17对咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型的影响2.3.1实时定量PCR检测角蛋白17敲除小鼠银屑病样模型中K17的表达情况-/-提取建模成功的IMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠、Ctrl组小鼠RNA并进行反转录后对K17的表达量进行实时定量PCR测定。引物序列见表1，RNA提取、定量、-31- 空军军医大学硕士学位论文反转录及实时定量PCR步骤见2.2.1。2.3.2H&E染色观察角蛋白17敲除小鼠银屑病样模型皮损的变化情况-/-将建模成功的IMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠、Ctrl组小鼠处死后进行H&E染色，并对各组小鼠皮损的表皮厚度逐一进行测量，同时对三组皮损中的血管数进行统计学分析，方法步骤同2.2.2。2.3.3实时定量PCR检测角蛋白17敲除小鼠银屑病样模型中细胞因子的表达情况-/-提取建模成功的IMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠、Ctrl组小鼠RNA并进行反转录后对细胞因子IL-6，IL-8，IL-22及趋化因子CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、CCR-10、CCL-20、CCL-22表达量进行实时定量PCR测定。引物序列见表1，RNA提取、定量、反转录及实时定量PCR步骤见2.2.1。2.3.4流式细胞术检测角蛋白17敲除小鼠银屑病样模型中的炎细胞浸润情况-/-将建模成功的IMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠、Ctrl组小鼠脱颈处死，剪取背部皮肤，处理后按2.2.4步骤进行流式细胞检测。2.3.5实时定量PCR检测角蛋白17敲除小鼠银屑病样模型中VEGF的表达情况-/-提取建模成功的IMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠、Ctrl组小鼠表皮RNA并进行反转录后对VEGF表达量进行实时定量PCR测定。引物序列见表1，RNA提取、定量、反转录及实时定量PCR步骤见2.2.1。2.4统计处理数据表现形式为均数±标准差（x±s），采用软件SPSS17.0对结果进行统计学分析，多组间比较用One-wayANOVA法进行差异分析，p<0.05认为具有统计学差异。-32- 空军军医大学硕士学位论文3结果3.1小鼠模型的构建3.1.1K17基因敲除小鼠鉴定及K17的表达分析利用扩增PCR和琼脂糖凝胶电泳的方法，鉴定K17敲除鼠（方法见2.1.2）。结果如图5所示，“-/-”代表完全敲除（纯合子），“WT”代表未敲除（即野生型小鼠），“+/-”代表不完全敲除（杂合子）。选取“-/-”完全敲除的小鼠，育种鉴定依旧为“-/-”，表明-/-K17敲除鼠育种成功（图4A）。分别在野生型小鼠（WT）和K17敲除鼠（K17）-/-背部连续6天涂抹IMQ（方法见2.1.4），实时定量PCR检测K17表达情况，IMQ-K17组K17的表达量（0.65±0.07）明显低于IMQ-WT组（10.03±2.15），差异有统计学意义（p<0.001）（图4B）。图4.K17敲除鼠电泳图谱（A）及K17的表达（B）M为DNAmarker，-/-为完全敲除（纯合子），WT为未敲除（即野生型小鼠），+/-为不完全敲除（杂合子）；(***p<0.001)3.1.2外用K17siRNA干涉小鼠表皮角质形成细胞K17表达将配制好的K17-siRNA乳膏涂抹于剃毛后的野生型C57BL/6小鼠背部，连续涂抹2天后，再继续涂抹K17-siRNA乳膏的同时加用IMQ（方法见2.1.4），检测对IMQ诱导小鼠银屑病样模型进行siRNA干涉后其K17表达情况。脱颈处死小鼠后，取小鼠背部皮肤组织行实时定量PCR，检测K17表达。结果显示，IMQ-siRNA组K17的表达量（0.65±0.07）明显低于IMQ-V组（3.98±1.09），差异有统计学意义（p<0.001），-33- 空军军医大学硕士学位论文而与Ctrl-V组（1.00±0.59）相比差异无统计学意义（p>0.05）（图5），提示外用K17siRNA可明显抑制IMQ诱导的小鼠表皮角质形成细胞K17表达。图5.K17在siRNA干涉IMQ诱导小鼠银屑病样模型中的表达(***p<0.001,ns为无统计学差异)3.2敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样表型的影响3.2.1敲除K17可明显减轻IMQ诱导小鼠银屑病样表型-/-分别在野生型小鼠（WT）和K17敲除鼠（K17）背部连续涂抹IMQ6天，而后观察两组小鼠和阴性对照组（Ctrl）的皮损差异（方法见2.1.4）。外观上，IMQ-WT-/-组小鼠背部皮肤发红且粗糙，上覆大量白色鳞屑；IMQ-K17组小鼠背部皮肤则相对光滑，白色鳞屑也较少（图6A）。H&E切片染色可见，IMQ-WT组表皮较Ctrl组明-/-显增厚，且真皮浅层可见较多的炎细胞浸润；而IMQ-K17组的表皮增生较IMQ-WT组轻，同时真皮浅层的炎细胞浸润更少（图6B）。表皮厚度测量结果显示，IMQ-WT-/-组（75.0±5.6）表皮较Ctrl组（13.9±2.0）增厚明显（p<0.001），IMQ-K17组（46.7±2.8）的表皮虽然也有所增厚，但是与IMQ-WT组相比程度有所减轻（p<0.001）（图6C），提示敲除K17可明显减轻IMQ诱导小鼠银屑病样表型。-34- 空军军医大学硕士学位论文-/-图6.Ctrl组、IMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠的外观（A）；小鼠低倍和高倍镜下的H&E染色结果（B）；小鼠表皮厚度的统计结果（C）（***p<0.001）3.2.2干涉K17可明显减轻IMQ诱导小鼠银屑病样表型在IMQ-V组交替涂抹凡士林和IMQ、IMQ-siRNA组交替涂抹K17-siRNA和IMQ（方法见2.1.4）后，可以观察到IMQ-siRNA组和IMQ-V组在外观上差异不明显（图7A）。但是在H&E染色切片上可以看出，IMQ-siRNA组的表皮较IMQ-V组薄，更接近Ctrl-V组（图7B），同时可以观察到，在IMQ-V组中，真皮浅层有较多的炎细胞浸润，表皮内也可见少量的炎细胞，而在另外两组小鼠皮肤组织切片中此现象并不明显。测量表皮厚度，进行统计学分析发现（图7C），相较于Ctrl-V组（14.6±1.8），IMQ-V组（59.8±4.9）和IMQ-siRNA组（45.4±4.8）的表皮均有增厚（p<0.001），但前者增厚的程度较明显，且具有统计学意义（p<0.01），提示抑制K17可明显减轻IMQ诱导小鼠银屑病样表型。-35- 空军军医大学硕士学位论文图7.Ctrl-V组、IMQ-V组、IMQ-siRNA组小鼠的外观（A）；小鼠低倍和高倍镜下的H&E染色结果（B）；小鼠表皮厚度的统计结果（C）（**p<0.01；***p<0.001）3.3敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样皮损的细胞因子表达的影响3.3.1敲除K17可抑制IMQ诱导小鼠银屑病样皮损皮损中细胞因子的表达-/-通过上述H&E染色切片观察到IMQ-K17组表皮增生较IMQ-WT组有所减弱，那么K17表达降低造成表皮增生的减弱、角质形成细胞增殖水平的降低，是否会影响表皮内的相关细胞因子及趋化因子的表达？因此我们通过实时定量PCR来观察三组小鼠中相关细胞因子及趋化因子的表达变化情况（方法见2.2.3）。结果显示：IMQ-WT组的IL-6、IL-8及IL-22等细胞因子的表达量和CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、-/-CCR-10、CCL-20、CCL-22等趋化因子的表达量均高于Ctrl组，而在IMQ-K17组中，上述因子的表达量相较于IMQ-WT组均有不同程度的下降（图8），提示K17表达量的减少可能导致细胞因子及趋化因子表达量的下降。-36- 空军军医大学硕士学位论文-/-图8.Ctrl组、IMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠表皮组织细胞因子（A）和趋化因子（B）的表达（*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001）3.3.2干涉K17可抑制IMQ诱导小鼠银屑病样皮损皮损中细胞因子的表达-/-在上述实验中，我们观察到在IMQ诱导银屑病样皮损后，IMQ-K17的IL-6、IL-8及IL-22等细胞因子的表达量和CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、CCR-10、CCL-20、CCL-22等趋化因子的表达量相较于IMQ-WT组均有不同程度的下降。那么在外用K7siRNA小鼠中，这些细胞因子和趋化因子表达量的变化是否也有同样的趋势？我们再次用实时定量PCR检测上述细胞因子和趋化因子（方法见2.3.3）。结果显示，IMQ-V组中IL-6、IL-8及IL-22的表达量明显高于Ctrl-V组（p<0.01，p<0.001，p<0.01），而在IMQ-siRNA组中，三种细胞因子的表达量较IMQ-V组有明显降低（p<0.001，-37- 空军军医大学硕士学位论文p<0.001，p<0.01）（图9A）。趋化因子CXCL-1、CXCR-3、CCR-4、CCR-10、CCL-20、CCL-22的表达结果显示，IMQ-V组的表达量均显著高于Ctrl-V组，但各趋化因子在IMQ-siRNA组中的表达却较IMQ-V组有明显的降低（图9B）。以上结果表明，K17能够通过影响细胞因子和趋化因子的表达，进而减轻银屑病的表型。图9.Ctrl-V组、IMQ-V组、IMQ-siRNA组小鼠表皮组织细胞因子（A）和趋化因子（B）的表达（*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001）-38- 空军军医大学硕士学位论文3.4敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样皮损炎细胞浸润的影响3.4.1敲除K17可明显抑制IMQ诱导小鼠银屑病样皮损中性粒细胞的浸润-/-通过对H&E切片染色的观察，我们发现IMQ-K17组中的真皮浅层有较多的炎细胞浸润，表皮内也可见一定量的炎细胞，而在另外两组中此现象并不明显。结合实时定量PCR的实验结果，我们推测在IMQ诱导的小鼠银屑病样模型中K17可能还发挥着对炎症细胞的趋化作用。因此，我们用流式细胞术检测此模型中的中性粒细胞浸润情况（方法见2.2.4）。结果表明：IMQ-WT组的中性粒细胞百分比明显高于-/-Ctrl组（41.65±6.51vs0.20±0.11，p<0.001），而IMQ-K17组的中性粒细胞数量则远低于IMQ-WT组（0.55±0.28vs41.65±6.51，p<0.001）（图10）。由此证明K17的缺失，可以明显减轻IMQ诱导的小鼠银屑病样模型中的中性粒细胞的浸润的程度。-/-图10.流式细胞术检测Ctrl组、IIMQ-WT组、IMQ-K17组小鼠皮损中浸润的中性粒细胞数量（***p<0.001）-39- 空军军医大学硕士学位论文3.4.2干涉K17可明显抑制IMQ诱导小鼠银屑病样皮损中性粒细胞的浸润在上述K17基因敲除小鼠实验中，我们观察到在IMQ诱导银屑病样皮损后，-/-IMQ-K17组小鼠皮损中的中性粒细胞数量远较IMQ-WT组少，因此我们利用K17siRNA小鼠进一步验证K17对IMQ诱导小鼠银屑病样模型中的中性粒细胞趋化作用的影响（方法见2.3.4）。结果表明：IMQ-V组的中性粒细胞百分比明显高于Ctrl-V组（9.39±2.22vs0.38±0.24，p<0.001），而K17表达降低的IMQ-siRNA组中性粒细胞数量则远低于IMQ-V组（1.53±0.89vs9.39±2.22，p<0.001）（见图11）。由此可见K17表达量的降低，可以减轻IMQ诱导的小鼠银屑病样模型中的中性粒细胞浸润的程度。图11.流式细胞术检测Ctrl-V组、IMQ-V组、IMQ-siRNA组小鼠皮损中浸润的中性粒细胞数量。（***p<0.001）-40- 空军军医大学硕士学位论文3.5敲除/干涉K17对IMQ诱导小鼠银屑病样皮损血管的影响3.5.1敲除/干涉K17可减弱IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮损中的血管扩张在IMQ涂抹IMQ-V和IMQ-siRNA组小鼠皮肤6天后（方法见2.1.4），将三组小鼠脱颈处死，取背部皮肤可见，IMQ-V组小鼠皮肤较Ctrl-V组和IMQ-siRNA组小鼠红，血管稍扩张，细小分支亦较后二组多，而IMQ-siRNA组小鼠皮肤与Ctrl-V组相比，差异不明显（图12A）。-/--/-在IMQ-K17组小鼠的实验中，用IMQ涂抹IMQ-WT和IMQ-K17组小鼠背部-/-连续6天后（方法见2.1.4），取背部皮肤可见，Ctrl组和IMQ-K17组小鼠背部皮肤血管数量较少，分支亦较少，且管径细小；而IMQ-WT组血管管径较Ctrl组和-/-IMQ-K17组明显增粗，且分支更多（图12B）。图12.IMQ诱导小鼠银屑病样模型背部皮肤血管-41- 空军军医大学硕士学位论文3.5.2敲除/干涉K17可抑制IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮损中的血管数量通过H&E染色切片观察小鼠皮肤血管增生情况，并统计血管数，结果显示，IMQ-siRNA组小鼠皮损真皮浅层血管数量及扩张程度与Ctrl-V组相比差异不明显，而IMQ-V组小鼠皮损真皮浅层血管较Ctrl-V组及IMQ-siRNA组小鼠多，且血管扩张明显（图13A）。血管数统计结果显示：IMQ-siRNA组的血管数（5.0±1.2）与Ctrl-V组（3.7±1.2）无统计学差异（p>0.05），而IMQ-V组的真皮浅层血管数（7.6±1.5）明显多于IMQ-siRNA组及Ctrl-V组，且有统计学意义（p<0.05，p<0.01）（图13B）。-/-另一组结果显示，IMQ-K17组小鼠皮损真皮浅层可见少量的毛细血管，其管径较细，而IMQ-WT组小鼠的真皮浅层则可见管径较粗大的毛细血管，数量较Ctrl组和IMQ--/--/-K17组多（图13C）。血管数统计结果显示：IMQ-K17组小鼠的真皮浅层毛细血管数（5.01±0.48）与Ctrl组（3.58±0.63）相比无明显差异（p>0.05），但明显少于IMQ-WT组（9.07±1.17），且有统计学差异（p<0.01）（图13D）。此结果说明：K17表达量下降，可以减少IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮损中血管数量。图13.H&E染色切片下IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮肤组织中毛细血管数量A、C为H&E染色，黑色箭头示毛细血管；B、D为毛细血管数量统计结果（*p<0.05，**p<0.01，***p<00.01）-42- 空军军医大学硕士学位论文3.5.3敲除/干涉K17可抑制IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮损中的VEGF表达通过观察小鼠皮肤组织我们发现，在IMQ诱导的银屑病模型中，IMQ-V组小鼠的皮肤较Ctrl-V组及IMQ-siRNA组小鼠皮肤红，对皮肤组织血管数量进行统计的结果显示，IMQ-V组小鼠表皮鳞屑更多、表皮增生程度明显，在毛细血管增生程度方-/-面也较明显。同样，IMQ-WT组小鼠的皮肤与Ctrl组和IMQ-K17组小鼠相比，其鳞屑更加明显，表皮增生更显著，血管数量也较多。由于VEGF是血管增生的主要促进因子，因此我们通过实时定量PCR的方法，检测VEGF在小鼠表皮组织中的表达情况。结果显示：IMQ-siRNA组小鼠的皮肤组织的VEGF表达量（0.55±0.28）与Ctrl-V组（1.0±0.05）相比无统计学差异（p>0.05），但明显低于IMQ-V组小鼠（4.45±1.0）-/--/-且有统计学差异（p<0.001）（图14A）。在IMQ-K17组小鼠的实验中，IMQ-K17组小鼠皮肤组织的VEGF表达量（1.09±0.55）同Ctrl组（1.00±0.22）相比无统计学差异（p>0.05），但明显低于IMQ-WT组（4.62±0.90），且有统计学差异（p<0.001）（图14B）。结果说明：K17表达量的降低，可以通过下调VEGF的表达，抑制IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮损中的血管生成，进而减轻银屑病样皮损的表型。图14.IMQ诱导小鼠银屑病样模型表皮组织中VEGF的表达情况（***p<0.001）-43- 空军军医大学硕士学位论文4讨论本研究利用K17基因敲除小鼠结合咪喹莫特诱导小鼠银屑病样模型进行研究，发现敲除小鼠K17可明显缓解小鼠银屑病表型，并抑制多种细胞因子和趋化因子的表达，影响中性粒细胞向炎症部位的趋化。同时，我们进一步利用siRNA干涉小鼠K17表达对上述实验结果进行验证，证明了K17在IMQ诱导小鼠银屑病样模型中发挥了重要作用，为研究K17在银屑病发病机制及病程发展过程中的作用提供基础，也为以K17作为银屑病治疗靶点的研发提供实验依据。寻常型银屑病是一种临床常见的慢性炎症性皮肤疾病，组织病理表现为角化过度伴角化不全的角质形成细胞、扩张的真皮乳头血管及真皮浅层的炎细胞浸润。其复杂的免疫学机制造成了皮肤、指甲及关节的损害。而本病病情的顽固且易复发，严重影响患者及亲属的身心健康。时至今日，银屑病的发病机制尚未阐明。既往研究认为皮肤局部的免疫微环境异常导致表皮中角质形成细胞增生的异常，而角质形成[92,93]细胞异常的增生进一步造成局部免疫微环境的紊乱，共同导致银屑病的发生。这一过程中，有许多免疫细胞及细胞因子共同参与。目前公认的银屑病发病机制是：在外界刺激如创伤或感染的情况下，激活的角质形成细胞释放阳离子抗菌肽LL-37，[34,35,94]后者与自身DNA或RNA片段结合，形成LL-37/DNA/RNA复合体，从而激活载[24]有TLR7/9受体的浆细胞样树突状细胞。这些激活的树突状细胞随体液循环至淋巴结，促进辅助性T细胞成熟，在角质形成细胞所分泌的大量趋化因子的作用下，这些辅助性T细胞迁移至表皮，继而分泌大量细胞因子如IL-23、IFN-γ等，这些细胞因子能够进一步刺激角质形成细胞，使其增殖的同时分泌更多的细胞因子和趋化因子，如此形成正反馈调节机制，持续参与银屑病的发展。故在银屑病发病的过程中，固有免疫和适应性免疫均发挥了至关重要的作用，而角质形成细胞细胞在一定程度上将二者联系起来，然而固有免疫和适应性免疫相互间具体的作用机制依然不是十分清楚。角质形成细胞是皮肤的重要组成部分，也是银屑病发病过程中的主要参与者。以往认为角质形成细胞的异常增殖、分化仅仅是银屑病的一系列免疫问题所带来的结果。随着研究的日渐深入，皮肤组织在机体免疫系统及免疫反应中的作用逐渐被挖-44- 空军军医大学硕士学位论文掘，角质形成细胞也在银屑病的发生发展过程中扮演着越来越重要的角色。K17作为角质形成细胞的骨架蛋白，在正常皮肤的表皮中不表达，却高表达于银屑病患者的角质形成细胞中。本课题组一直以来致力于研究K17在银屑病中的作用。我们发现：K17与链球菌M蛋白具有同源的表位序列，二者均可激活来自银屑病患者[91]的T细胞，使其产生IL-17A、IL-22及IFN-γ等细胞因子，这些细胞因子反过来又能够促进角质形成细胞进一步增殖，上调其内部K17的表达，形成一个正反馈的环路[95]。为了进一步研究这一环路，使其更加丰满，我们针对K17进行了一系列深入研究。作为研究银屑病的动物模型，外用咪喹莫特（IMQ）乳膏（Toll样受体激动剂）诱导小鼠产生银屑病样模型是一种常用的方法。此模型能够在临床和病理上很好地模拟银屑病的表现，而且操作简便，耗时短。我们首先在K17基因敲除小鼠背部构建咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型，发现-/-IMQ-K17组的小鼠背部皮损无论在表皮厚度还是炎细胞浸润程度上，均较IMQ-WT组小鼠程度均明显减轻。这一结果提示在IMQ诱导的银屑病样模型的小鼠中，K17的表达能够正向促进角质形成细胞的增殖，而下调K17的表达，则减弱了角质形成细胞的增殖效应。同时，利用实时定量PCR对银屑病相关的细胞因子如IL-6、IL-8和IL-22以及CXCL-1、CXCR-3、CCL-20等趋化因子进行相关检测发现，敲除K17使得上述细胞因子和趋化因子的表达也出现不同程度地下调，这与其对应组的表型是相互吻合的。而后我们应用K17-siRNA抑制小鼠K17表达来进一步证实上述实验结果。可见IMQ-siRNA组的表皮鳞屑远少于IMQ-V组小鼠，同时表皮厚度也远小于IMQ-V组。在细胞因子和趋化因子的检测中亦出现相似的结果。然而，IMQ-siRNA组和-/-IMQ-V组小鼠的鳞屑要少于IMQ-K17组和IMQ-WT组，表皮厚度前两组也薄于后两组，究其原因可能于前两组外用IMQ的同时，也交替涂抹了凡士林。凡士林具有保湿、滋润皮肤的作用，在一定程度上影响了IMQ对皮肤的作用，同时也缓解了IMQ造成的皮肤干燥、脱屑的症状。中性粒细胞作为固有免疫的重要组成部分，在银屑病早期即出现于皮损当中，形[96]成Munro微脓疡。而其分泌的IL-6、IL-8等细胞因子可能均直接或间接地造成银屑[97,98][99]病免疫微环境的紊乱。另外有研究发现，清除银屑病表皮内的中性粒细胞有-45- 空军军医大学硕士学位论文助于缓解病情。因此，我们通过实验进一步研究K17与中性粒细胞在银屑病发生发展过程中的相互联系和作用。通过流式细胞术我们发现，无论是在IMQ-siRNA组还是-/-IMQ-K17组，其表皮中的中性粒细胞百分比远低于IMQ-V组和IMQ-WT组。结合实时定量PCR检测IL-6、IL-8及CXCL-1的结果，我们推测下调K17的表达能够减弱角质形成细胞的增殖、分化，进而减少能够刺激并趋化中性粒细胞的细胞因子及趋化因子IL-6、IL-8及CXCL-1的分泌，从而减少中性粒细胞趋化至表皮，减轻炎症反应。综上所述，敲除K17能够减弱角质形成细胞对中性粒细胞的趋化作用是本实验的主要发现。通过下调K17的表达，减少了角质形成细胞分泌的细胞因子及趋化因子，从而减弱了对炎细胞如中性粒细胞的趋化作用，使得炎症部位的炎细胞数量减少，局部免疫微环境中的细胞因子减少，进而使得角质形成细胞的增殖和分化有所减轻，缓解了银屑病的病情。这不仅验证了本课题组前期提出的“K17/T细胞/细胞因子环路”，而且为将K17作为靶向治疗、干预银屑病发生发展提供了实验基础。本实验利用siRNA在IMQ诱导C57BL/6小鼠银屑病样模型过程中干涉K17的表达，以及通过IMQ涂抹K17敲除鼠，探究了K17在IMQ诱导小鼠银屑病样模型中对血管生成的影响。实验结果初步证明通过下调K17的表达，降低了皮损处VEGF的表达量，从而减弱了患处的血管增生，进而减轻了银屑病样的表型。这一结果不仅巩固了K17在银屑病发病机制中的重要地位，同时也为银屑病的机制研究开辟了一条新的途径。VEGF最初因发现其可增强血管通透性而被称为血管通透因子，是目前已知作用最强的促血管生成因子之一，是分子量34-42kd的同源二聚体糖蛋白，对内皮细胞的[100-102]生长及分化必不可少。VEGF基因家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、[103]VEGF-D、VEGF-E以及胎盘生长因子（placentalgrowthfactor，PLGF）。其中[104]VEGF-A作为机体最主要的参与血管生成的细胞因子而存在，VEGF-C和VEGF-D[105]则主要与淋巴管生成有关。VEGF-A基因由8个外显子组成，外显子选择性拼接[106]导致其至少有5种亚型，最常见的有氨基酸121，145，165，189，206。VEGF-B是肝素结合生长因子基本元素，其结构与VEGF-A及PLGF相似，主要存在于心脏、[107]骨骼肌和胰腺组织中，以旁分泌方式调节内皮细胞功能。VEGF-B及VEGF-C的-46- 空军军医大学硕士学位论文[108]高表达与淋巴结转移性肿瘤密切相关，但其在肿瘤发展中发挥的作用尚不清楚。VEGF的受体最初发现于内皮细胞，包括3种高亲和力的酪氨酸激酶受体，即FLT1/VEGFR-1、FLK1/KDR/VEGFR-2和FLT4/VEGFR-3，与相应配体相互作用参与[104]血管的形成。VEGFR-1主要分布于单核细胞和血管内皮细胞，主要与VEGF-A，[109]VEGF-B，PLGF相结合。VEGFR2则多分布于血管内皮细胞，与VEGF-A，VEGF-C[109]有较强亲和力。主要分布于淋巴内皮细胞的VEGFR-3则与VEGF-C和VEGF-D结合。这三种VEGF受体在介导其发挥生理功能方面也不尽相同。其中VEGFR-1介导单核细胞的趋化作用，而VEGFR-2则主要参与内皮细胞的增殖。VEGF通过与酪氨酸激酶受体相互作用将信号传递至下游而发挥促进细胞增殖、刺激细胞迁移、增[104]加血管通透性以及促进血管生成等功能。在正常健康成人中，VEGF信号在很大程度上受限于创伤愈合和女性生殖周期。在伤口愈合过程中，激活的血小板释放多种细胞因子，包括VEGF在内。另外，VEGF亦可由单核细胞、角质形成细胞及内皮细胞分泌而来，作用于毛细血管上皮相应的[110]受体，受体激活后促进内皮细胞增殖和迁移，形成新血管。有研究证实，在银屑[111]病的早期即有微血管的重构，而这种重构包括了血管的扩张、高渗透性、延长和迂曲，同时伴有血管内皮细胞的增生。这与VEGF-A的基因具有很高的基因多态性有关，其基因与银屑病易感位点PSORS1有很高的相似度，但二者间并未发现有遗[112]传的连锁不平衡，这说明二者具有相互独立的遗传特性。上述血管的变化更加有利于银屑病皮损处白细胞等炎细胞的浸润、各种炎症因子及趋化因子功能的发挥，从而加剧局部炎症反应。与此同时，作为VEGF-A的主要来源，角质形成细胞在银屑病中的过度增生，必然使得VEGF-A的分泌量大大增高，而其增高的程度取决于[113]疾病的严重程度。增高的VEGF-A不仅影响皮损部位的皮肤，亦可对正常部位的[113]皮肤产生影响。另外，银屑病患者血浆中的VEGF-A水平也有所升高，并且与疾[114][115]病的严重程度相关，而血浆中高水平的VEGF-A也与关节病型银屑病密切相关。有研究表明，大量的VEGF-A可以在诱导血管生成的同时，促进局部组织炎症发展，使银屑病病情恶化。相反，使用强有力的血管内皮生长因子拮抗剂则可逆转这一现[116]象。由此可见，VEGF在银屑病发病的初始阶段以及疾病的后续发展过程中皆扮-47- 空军军医大学硕士学位论文演重要角色。那么，在银屑病发生发展过程中异常高表达的K17，是否会对银屑病皮损处的血管生成有所影响呢？与VEGF的关系又如何？目前鲜有研究报道。因此，我们利用K17-siRNA，配制成乳膏后外用于野生型小鼠背部2天，再进行外用IMQ交替涂抹6天，观察IMQ-siRNA组与仅用凡士林和IMQ交替涂抹6天的IMQ-V组小鼠皮损的对比状况，发现前者皮损与对照组（Ctrl-V，仅涂抹凡士林）差别不明显，却远没有IMQ-V组小鼠皮损红，此现象反映出IMQ-V组小鼠皮损很可能存在肉眼无法察觉的毛细血管增多，但在外观上，IMQ-V组小鼠皮损的血管数仅比IMQ-siRNA组和Ctrl-V组小鼠稍有增多。在H&E染色切片下的观察可发现，IMQ-siRNA组小鼠皮损无论是真皮浅层的血管数还是血管管径的大小，均与Ctrl-V组无明显差异，但与IMQ-V组相比，血管数明显减少，并且后者的血管管径普遍较大（仅肉眼观察，未统计）。此种现象在IMQ诱导K17基因敲除鼠银屑病样模型实验中表现的尤为明显，两组实验数据相互印证。因此说明，在IMQ诱导的小鼠银屑病样模型中，K17的异常高表达同皮损中的血管异常增多存在正相关。随后，通过对两种小鼠皮损的VEGF表达量的检测发现，随着K17表达量的下调，表皮中VEGF-/-表达的量亦有所降低。这与IMQ-siRNA组及IMQ-K17组小鼠皮损中的血管数减少相吻合。说明K17表达量的下调，有助于减少VEGF的表达和分泌，进而减少了IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮损中血管的增生，从而减轻银屑病的表型。综上所述，通过下调或者敲除表皮中的K17，可以减少IMQ诱导小鼠银屑病样模型皮损中VEGF的表达，使得皮损中的血管生成作用有所减弱，从而减轻或缓解了银屑病样皮损的症状。此实验首次将K17与银屑病皮损中的VEGF及血管生成相联系，初步探究了K17与VEGF的相互作用，不仅扩充了K17在银屑病发病机制中的作用，为今后的研究打下了基础，同时也为日后的治疗提供了新的方向。-48- 空军军医大学硕士学位论文小结在银屑病发病机制的研究过程中，固有免疫和适应性免疫自然是大家研究的重点，随着研究的深入，人们逐渐意识到二者的异常紊乱是银屑病发病的核心问题所在，然而两种免疫反应之间是否具有直接的联系、相互之间的作用如何等一系列问题一直萦绕在广大学者脑中。本课题组前期的研究发现，自身反应性T细胞能够被银屑病角质形成细胞中异常高表达的K17活化，进而产生诸多银屑病相关的细胞因子，这些由自身反应性T细胞产生的细胞因子在发挥其自身相关功能的同时，还能反作用于角质形成细胞，进一步上调K17的表达，形成正反馈环路。另外，在银屑病发病初期，大量的中性粒细胞在皮损处募集，产生炎症反应，可见作为固有免疫重要组成部分的中性粒细胞很可能参与了银屑病初期的发生发展。本研究利用K17基因敲除小鼠结果咪喹莫特诱导的小鼠银屑病样模型进行研究，主要得到以下结论：1.明确K17通过调节银屑病相关的细胞因子和趋化因子的表达，促进中性粒细胞在皮损局部募集，继而导致银屑病发病的重要机制；2.首次发现K17通过调控角质形成细胞中VEGF的表达，进而影响血管的生成，参与银屑病发病；3.证实通过抑制K17可明显降低银屑病相关细胞因子和趋化因子的表达，减少中性粒细胞的浸润，从而改善局部免疫微环境，缓解银屑病症状。本研究在动物水平证实K17通过调节角质形成细胞免疫学活性参与银屑病发生发展的作用，并对其关键的分子机制进行验证，明确K17通过调节银屑病相关的细胞因子和趋化因子的表达，调控局部免疫微环境紊乱参与银屑病发病的作用，进一步丰富了本课题组提出的“K17/T细胞/细胞因子”环路假说。与此同时，初步明确了将K17作为银屑病靶向治疗的作用，为今后的银屑病临床治疗开辟了新的途径。-49- 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空军军医大学硕士学位论文附录个人简历和研究成果基本情况姓名：庄玉晨性别：男政治面貌：中共党员民族：汉族出生年月：1987.10籍贯：沈阳学习经历2006.09~2011.07第四军医大学临床医学2014.09~2017.07第四军医大学皮肤病与性病学发表论文ZhuangY,HanC,LiB,JinL,DangE,FangH,QiaoH,WangG*.NB-UVBirradiationdownregulateskeratin-17expressioninkeratinocytesbyinhibitingtheERK1/2andSTAT3signalingpathways.ArchDermatolRes.2018,(2):147-156.在校获奖情况2014-2015年度校优秀学员2015-2016年度校优秀学员-57- 空军军医大学硕士学位论文致谢尺璧非宝，寸阴是竞，羁旅三年，恍惚间竟已至尽头，旋踵间感慨良多，非文字能尽之。古语云：学者必求师，然经师易遇，人师难求。鄙人才疏学浅，幸蒙恩师王刚教授垂盼，且不烦吾愚钝不堪，每有疑惑，未尝不悉心指导，知无不言，言无不尽。学界泰斗刘玉峰教授，学识浩瀚，灿若繁星。真可谓一纪树桃李，神州蹊芳菲。有道是黑发积霜映日月，十丈龙孙绕凤池。师者，传道、授业、解惑也。高天文教授、李春英教授、廖文俊教授、王雷老师，业精品正，授业解惑之余，医者仁心，身教言传，师垂典则，范示群伦，其如幽兰香远益清，似竹临风怀虚净直。沐浴其间，终有所得。是故师道既尊，学风自善。幸得恩师，亦得贵友。辅导教师党二乐，栉风沐雨不以为苦，事必躬亲皆无巨细，鸿儒硕学，每每求教，亦能旁征博引，受益匪浅；博士李冰、晋亮，引身入门，不吝赐教，博闻强记，满腹经纶；硕士郝军峰，不意间点拨一二，便使吾茅塞顿开；博士邵帅，花信年华，负笈游学，结交惟心，不胜受恩感激；硕士朱振来，志合道乖，同声相应，得遇之我所幸。同门共业者，研究员杨璐婷、方卉、雷洁、乔佩、姜曼、张洁瑜、张园、王华、郭伟，知遇知契，结交莫逆，幸甚幸甚。而立已过，恰逢娇妻，日多问候，夜伴红袖，着衣添食，未有怨言；父母已近花甲，仍日夜为儿劳心伤神，然己未取寸功，内心有愧。离别之际，感叹天波易谢，寸暑难留，惟愿恩师贵体康健，兄长同道珍重，西京皮肤再登高。-58-