酒精诱导肝L02细胞凋亡与自噬关系研究

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1、单位代码１０４７５学号１０４７５３１４１２３４分类号Ｒ４７硕士学位论文酒精诱导肝Ｌ０２细胞凋亡和自噬关系研究学科、专业：护理学研究方向：临床护理申请学位类别：医学硕士申请人：唐乃夫指导教师：刘彬教授二〇—ｂ年五月关于学位论文独创声明和学术诚信承诺本人向河南大学提出碩士学位申请．本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导＇师的指导下独立完成的，时所研究的课题有新的见解，据我所知，除文中特射加以说明Ｖ标注和致嫩的地方外，论文中不匕括其他人已轻发表或撰写过的研究成果，也不包括其他人为获得

2、任何教育一、科研机构的学位或证书而使用过的材料？与我同工作的同事对本研究所做的任柯贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢意ｅ在此本人却重承诺：所呈交的学位论文不存在舞弊作德抒为，文责自负？一一一＇２０１年Ｓ月７曰７关于学位论文著作权使用授权书本人经河南大学审核批准授予碩士学位。作为学位谇文的作者，本人完全了解并同意河南大学有关保留、使用学位论文的要求，即河南大学有权向国家图书馆、科研信息机构、數据收集机构和本較图书馆等提供＃位论文〈纸肩文本和电子文本）以供公众检索、查阅■■本人授权河南大学出于玄扬、展

3、览学較学米发展和进行学米交流等目的，可以束取影印、缩印、扫描和拷？筹复制手段保存、汇编学位论文（紙廇文本和电子文本）《（渉及保密内容的学位论文在解密后适用本授权书）学位获得者（学位论文作者）签名：＾％Ａ２〇１年ＪＴ月７：学位论文指导教名师签■２０１年曰月ｉ７STUDYOFAPOPTOSISANDAUTOPHAGYOFL02CELLSINDUCEDBYETHANOLADissertationSubmittedtotheGraduateSchoolofHenanUniversityinPartialFu

4、lfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofMedicineByNaiFuTangSupervisor:Prof.BinLiu.DateMay,2017摘要目的：用不同浓度的酒精作用人肝L02细胞，观察细胞的凋亡情况及细胞凋亡过程中细胞的自噬活动，构建并检测具有RNA干扰功能的siRNA，探究酒精诱导肝L02细胞凋亡过程中自噬所起到的作用。方法：MTT法检测酒精对肝L02细胞生存率的影响；流式细胞术PI单染及AnnexinⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率；DAPI染色观察细胞核形态改

5、变；吖啶橙染色观察酒精作用后细胞内自噬溶酶体变化；流式细胞术（吖啶橙染色）检测自噬溶酶体显色比例；间接免疫荧光法观察细胞内自噬标志蛋白LC3表达量的变化；蛋白免疫印迹法（Western-Blot）检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3及p62蛋白表达量；Beclin1-siRNA载体的构建与表达检测；检测RNA干扰后对酒精诱导肝L02细胞凋亡与自噬水平变化。结果：用酒精浓度分别为0mmol/L、50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L的去血清培养基分别处理肝L02细胞12h和24h，对

6、照组含血清不加酒精，与酒精浓度为0mmolL组相比，细胞生存率在12h分别是92.36%、87.91%、73.27%（P<0.05）、67.72%（P<0.05）、51.33%（P<0.01），24h分别是74.85%（P<0.05）、67.40%（P<0.01）、47.42%（P<0.01）、42.35%（P<0.01）、38.59%（P<0.01），提示酒精对肝L02细胞具有显著的增殖抑制，且细胞生存率呈现时间和浓度的依赖性；DAPI染色观察细胞核形态，可见随酒精浓度增加细胞数量明显减少并且出现细胞凋亡的特征性改变；流式细胞术Annex

7、inⅤ-FITC/PI双染法检测细胞凋亡率，与酒精浓度为0mmolL组相比，在酒精浓度为100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L时，细胞凋亡率分别是13.46%（P<0.05）、23.28%（P<0.01）、24.95%（P<0.01）和17.31%（P<0.05）；PI单染检测细胞凋亡率，与酒精浓度为0mmolL组相比，在酒精浓度50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、400mmol/L和800mmol/L细胞凋亡率分别为11.19%（P<0.05）、16.32%（P<0.05）、3

8、7.95%（P<0.01）、42.37%（P<0.01）和22.59%（P<0.01），提示酒精可显著诱导肝L02细胞凋亡；吖啶橙染色结果显示随酒精浓度增加，自噬溶酶体的数量显著