五倍子中β-PGG抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的研究

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单位代码：10680分类号：R28学号：20151051密级：硕士学位论文五倍子中β-PGG抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的研究β-PGGofGallaChinensisinhibitisapoptosisofisletβcellofdiabeticrats教学单位云南中医学院研究生姓名马定乾学科、专业中药学研究方向中药药理与应用学位类型学术型指导教师范源教授二○一八年四月 硕士学位论文五倍子中β-PGG抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的研究β-PGGofGallaChinensisinhibitisapoptosisofisletβcellofdiabeticrats申请人姓名马定乾学科、专业中药学研究方向中药药理与应用申请学位类型学术型指导教师范源教授完成日期二O一七年四月 云南中医学院论文独创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是个人在导师的指导下，独立进行研宄工作所取得的成果，无抄袭及编造行为。除文中已经特别加以注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或集体己经发表或撰写过的作品成果。对本文做出重要贡献的个人和集体，均己在文中以明确方式标注并致谢。本人完全意识到本声明的法律结果并由本人所承担的法律责任。学位论文作者签名■：日期：年〈月Ｚ日／云南中医学院学位论文使用授权声明云南中医学院有权保留使用本人学位论文，同意学院按规定向国家有关部门机构送交论文的复印件和电子版，允许被查阅和借阅。本人授权云南中医学院可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复印手段保存或汇编本学位论文。可以公布（包括刊登）论文的全部或部分内容。（保密论文在解密后应遵守此规定）学位论文作者签名：日期：人／年／月人入曰專，学位论文导师签名：日期：年么月ｈ曰／“”本人及导师同意将论文提交至清华大学中国学术期刊（光盘版）电子社进行电子和网络出版，并编入ＣＮＫＩ系列数据库，传播本学位论文的全部或部分内容，同意按《中国优秀博硕士学位论文全文数据库出版章程》规定享受相关权益。学位论文作者签名：日期：彳年｛月々日学位论文导师签名：日期：年《月＞日／ 目录中文摘要........................................................................................................................1ABSTRACT...................................................................................................................3英文缩略词表................................................................................................................6引言................................................................................................................................7第一部分响应面法优化提取五倍子中β-PGG工艺研究..........................................91.1实验材料.........................................................................................................91.2方法...............................................................................................................101.3结果...............................................................................................................121.4结论...............................................................................................................16第二部分β-PGG抑制糖尿病模型大鼠胰岛β细胞凋亡的研究...........................172.1实验材料.......................................................................................................172.2方法...............................................................................................................212.3结果...............................................................................................................252.4结论...............................................................................................................32讨论..............................................................................................................................33结论..............................................................................................................................35参考文献......................................................................................................................36文献综述......................................................................................................................38参考文献......................................................................................................................41硕士期间主要研究成果..............................................................................................44致谢..............................................................................................................................45 五倍子中β-PGG抑制糖尿病大鼠胰岛β细胞凋亡的研究中文摘要目的：糖尿病（diabetesmellitus，DM）是当今威胁全人类健康最重要的慢性非传染性疾病之一。糖尿病是一种多基因遗传性疾病，胰岛β细胞凋亡是糖尿病患者胰腺中主要的病理变化，胰岛β细胞凋亡的主要原因为氧化应激、线粒体损伤、内质网应激等。五没食子酰基葡萄糖（1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose，β-PGG）是中药五倍子（GallaChinensis）中含量较为丰富的一种水溶性多酚类化合物，其具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤等多重生物学及药理学活性，近年来发现β-PGG在治疗糖尿病方面具有一定作用，如改善胰岛素抵抗，增加胰岛素分泌等。β-PGG的抗炎、抗氧化作用能够抑制炎症因子及氧化应激导致的胰岛β细胞凋亡，但β-PGG是否能抑制内质网应激导致的胰岛β细胞凋亡来改善糖尿病的报道较少。本课题设计实验探究β-PGG是否可以通过抑制内质网应激途径抑制糖尿病模型大鼠胰岛β细胞凋亡。方法：1.响应面法优化提取五倍子中β-PGG工艺研究以超声时间、料液比和甲醇体积分数为影响β-PGG提取的条件，用Design-Expert软件Box-Behnken中心组合设计法设计响应面分析超声时间、料液比、甲醇体积分数对β-PGG提取量的影响，并通过方差分析回归建立数学模型。2.β-PGG抑制糖尿病模型大鼠胰岛β细胞凋亡的研究雄性wistar大鼠70只，适应性喂养一周后，分为正常组（n=10）和造模组（n=60）。造模组大鼠禁食12h，给予一次性腹腔注射链脲佐菌素（Streptozocin,STZ）50mg/kg，72h后以空腹血糖（Fastingbloodglucose,FBG）≥11.1mmol/L的确定为糖尿病大鼠。将造模成功的糖尿病大鼠随机分为模型组（n=10），阳性组（n=10，西格列汀10.5mg/kg*d），β-PGG低剂量组（n=10，20mg/kg*d），β-PGG中剂量组（n=10，40mg/kg*d）和β-PGG高剂量组（n=10，80mg/kg*d），正常组和模型组灌胃等量的溶剂液体，连续灌胃6周。每周末测FBG和体重。干预终止后取材，HE染色观察胰腺组织中胰岛细胞的损伤情况及1 组织形态学改变，胰岛β细胞特殊染色观察胰岛β细胞的凋亡情况；WesternBlot法检测胰腺组织中Caspase-12、Caspase-3、JNK和TXNIP蛋白的表达量。结果：1.响应面法优化提取五倍子中β-PGG工艺研究在提取条件为超声时间22min，料液比1：42（g/mL），甲醇体积分数为49%时，β-PGG提取量达到24.742mg/g。2.β-PGG抑制糖尿病模型大鼠胰岛β细胞凋亡的研究体重与血糖：给药干预6周后，正常组大鼠体重持续增加，模型组大鼠平均体重较轻，阳性组，β-PGG低、中、高剂量组大鼠平均体重与模型组相比有不同程度的改善，其中阳性组和β-PGG高剂量组与模型组比有显著性差异（P<0.05）。胰腺组织细胞染色显示：β-PGG高剂量组可明显改善胰岛的萎缩，维持胰岛β细胞的数量。WesternBlot检测结果显示：模型组大鼠胰腺组织Caspase-12蛋白表达量明显增加。阳性组、β-PGG高剂量组与模型组相比，蛋白表达量明显下降，差异具有显著性（P＜0.05）；模型组大鼠胰腺组织Caspase-3蛋白表达量增加，各给药组蛋白的表达量均不同程度的降低，其中阳性组与模型组比较，差异具有显著性（P＜0.01），β-PGG高剂量组与模型组比较，差异具有显著性（P＜0.05）；模型组大鼠JNK蛋白表达量明显上升，阳性组、β-PGG低、中、高剂量组的蛋白表达水平下降，其中阳性组、β-PGG高剂量组与模型组相比有显著性差异（P＜0.05）；TXNIP蛋白表达水平在阳性组、β-PGG高剂量组在给药6周后胰腺组织明显下调，与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.05）结论：1.响应面法优化提取五倍子中β-PGG工艺研究Box-Behnken设计响应面分析法可以很好地对五倍子中β-PGG提取进行工艺优化。2.β-PGG抑制糖尿病模型大鼠胰岛β细胞凋亡的研究β-PGG可维持糖尿病大鼠的体重，改善体重减轻症状；降低糖尿病大鼠的空腹血糖，减轻高血糖症；抑制胰岛萎缩，增加胰岛β细胞数量；抑制内质网应激引起的胰岛β细胞凋亡。关键词：糖尿病；β-PGG；抑制凋亡；内质网应激2 ABSTRACTβ-PGGofGallaChinensisinhibitisapoptosisofisletβcellofdiabeticratsObjective:Diabetesmellitusisoneofthemostimportantchronicnoncommunicablediseasesthreateninghumanhealthtoday.Diabetesisamultigenehereditarydisease.Theapoptosisofisletbetaβisthemainpathologicalchangeinthepancreasofdiabeticpatients.Themaincausesofisletβcellapoptosisareoxidativestressandmitochondrialdamage,endoplasmicreticulumstressandsoon.β-PGG(1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose)isoneofwater-solublepolyphenolsinGallaChinensis.Ithasmultiplebiologicalandpharmacologicalactivities,suchasantioxidation,anti-inflammatoryandanti-tumor.Inrecentyears,ithasbeenfoundthatβ-PGGhasacertainroleinthetreatmentofdiabetes,suchasimprovinginsulinresistanceandincreasinginsulinsecretion.Theanti-inflammatoryandantioxidanteffectsofβ-PGGcaninhibittheapoptosisofisletβcellsinducedbyinflammatoryfactorsandoxidativestress,buttherearefewreportsonwhetherβ-PGGcaninhibittheapoptosisofisletβcellsinducedbyendoplasmicreticulumstresstoimprovediabetes.Wedesignedexperimentstoexplorewhetherβ-PGGcaninhibittheapoptosisofpancreaticβcellsindiabeticratsbyinhibitingtheendoplasmicreticulumstresspathway.Methods:1.OptimizationofExtractionProcessofβ-PGGfromGallaChinensisbyResponseSurfaceMethod.Theultrasonictime,solid-liquidratioandvolumefractionofmethanolfortheeffectsofβ-PGGextractionconditions,designresponsesurfaceanalysistheinfluenceofultrasonictime,solid-liquidratio,volumefractionofmethanolonβ-PGGwasextractedwiththecombinationdesignmethodDesign-ExpertBox-Behnkensoftwarecenter,andestablishthemathematicalmodelthroughtheregressionanalysisofvariance.2.Theroleofβ-PGGinimprovingdiabeticratsandthemechanismofinhibitingapoptosis.3 Afteraweekofadaptivefeeding,70maleWistarratsweredividedintocontrolgroup(n=10)andmodelgroup(n=60).Theratsinthemodelgroupwerefasted12h,andStreptozocin(STZ)50mg/kgwereinjectedintraperitoneally.After72h,thediabeticratsweredeterminedbyfastingbloodglucose(FBG)morethan11.1mmol/L.Thediabeticratswererandomlydividedintomodelgroup(n=10),positivegroup(n=10,Sitagliptin10.5mg/kg*d),lowdosegroupofβ-PGG(n=10,20mg/kg*d),dosegroupofβ-PGG(n=10,40mg/kg*d)andβ-PGGhighdosegroup(n=10,80mg/kg*d).Controlgroupandmodelgroupgavagesolventliquid.Allratswerecovered6weeksofcontinuousadministration.FBGandweightweremeasuredattheendoftheweek.Aftertheintervention,thedamageandhistomorphologyofpancreaticisletcellswereobservedbyHematoxylin-Eosinstaining.TheapoptosisofisletβcellswasobservedbyFuchsin-OrangeGstainingofisletβcells,andtheamountofCaspase-12,Caspase-3,JNKandTXNIPproteininpancreatictissuewasdetectedbyWesternBlotmethod.Results:1.OptimizationofExtractionProcessofβ-PGGfromGallaChinensisbyResponseSurfaceMethod.Theextractionofβ-PGGreached24.742mg/gwhentheextractionconditionswereultrasonictime22min,theratioofmaterialto1:42(g/mL),andthevolumefractionofmethanolwas49%.2.Theroleofβ-PGGinimprovingdiabeticratsandthemechanismofinhibitingapoptosis.After6weeksofdrugintervention,theweightofthecontrolgroupratsincreasedcontinuously.Theaverageweightofthemodelgroupwaslighter.Theaverageweightoftheratsinthelow,middleandhighdosegroupoftheβ-PGGgrouphaddifferentdegreesofimprovementcomparedwiththemodelgroup.Thepositivegroupandthehighdosegroupofβ-PGGweresignificantlydifferentfromthoseinthemodelgroup(P<0.05).Thecellstainingofpancreatictissueshowedthatthehighdoseofβ-PGGcouldsignificantlyimprovetheatrophyofisletsanddecreasethedamageofpancreaticβcells.4 WesternBlotdetectionshowedthattheexpressionofCaspase-12proteininpancreastissueofmodelgroupincreasedsignificantly.Theexpressionofproteininthepositivegroupandthehighdosegroupoftheβ-PGGgroupwassignificantlylowerthanthatinthemodelgroup(P<0.05).TheexpressionofCaspase-3proteininthepancreastissueofthemodelratsincreasedandtheexpressionoftheproteinineachgroupdecreasedinvaryingdegrees,andthedifferencewassignificantcomparedwiththemodelgroup(P<0.01),thedifferencebetweenthehighdosegroupofβ-PGGandthemodelgroupwassignificant(P<0.05).TheexpressionofJNKproteininthemodelgroupwasobviouslyincreased.Theproteinexpressionlevelofthepositivegroupandthelow,middleandhighdosegroupdecreased,andthepositivegroupandthehighdosegroupofβ-PGGweresignificantlydifferentfromthoseinthemodelgroup(P<0.05).TheexpressionlevelofTXNIPproteininthepositivegroupandthehighdosegroupofβ-PGGdecreasedsignificantlyafter6weeksofadministration,andthedifferencewasstatisticallysignificantcomparedwiththemodelgroup(P<0.05).Conclusion:1.OptimizationofExtractionProcessofβ-PGGfromGallaChinensisbyResponseSurfaceMethod.Box-Behnkendesignresponsesurfaceanalysiscanoptimizetheprocessofextractionofβ-PGGinGallaChinensis.2.Theroleofβ-PGGinimprovingdiabeticratsandthemechanismofinhibitingapoptosis.β-PGGcanmaintaintheweightofdiabeticrats,improvethesymptomsofweightloss,reducethefastingbloodglucoseofdiabeticrats,reducehyperglycemia,inhibitisletatrophy,increasethenumberofisletβcellsandinhibittheapoptosisofisletβcellsinducedbyendoplasmicreticulumstress.Keywords:Diabetes;β-PGG;inhibitionofapoptosis;ERS5 英文缩略词表英文缩写英文全称中文全称STZStreptozocin链脲佐菌素T2DMType2diabetesmellitus2型糖尿病β-PGG1,2,3,4,6-penta-O-galloyl-β-D-glucose五没食子酰基葡萄糖FBGFastingbloodglucose空腹血糖HPLCHighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱法HEHematoxylin-Eosinstaining苏木精—伊红染色法SDSStatisticalprogramforsocialsciences十二烷基磺酸钠SPSSStatisticalprogramforsocialsciences社会科学统计程序TBETrisboricacidbufferTris-硼酸缓冲液TBSTris-bufferedsalineTris缓冲液TEMEDN,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine四甲基乙二胺CMC-NaCarboxymethylcellulosesodium羧甲基纤维素钠WBWesternblot蛋白免疫印迹法Caspase-3cysteinylaspartatespecificproteinase-3半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3Caspase-12cysteinylaspartatespecificproteinase-12半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-12JNKc-JunN-terminalkinase应激活化蛋白激酶TXNIPthioredoxin-interactingprotein硫氧还蛋白互作蛋白6 引言糖尿病是一种以胰岛素分泌不足和胰岛素抵抗为主要的病理特征的多基因遗传性疾病。糖尿病分为1型糖尿病、2型糖尿病、妊娠糖尿病等。1型糖尿病[1]主要由于自身抗体对β细胞进行攻击造成β细胞凋亡，自身胰岛素分泌不足。2型糖尿病的高血糖状态是以胰岛素抵抗及胰岛β细胞分泌功能障碍为主要原因，糖尿病中2型糖尿病占90%以上。2型糖尿病病程发展的一定阶段也可出现胰岛β细胞凋亡，其机制如下：①胰岛素受体或受体后缺陷致使肌肉、脂肪等组织摄取葡萄糖减少，致使血糖增高；②胰岛素相对不足或拮抗胰岛素增多使肝糖原分解及糖原异生增多，致使肝糖输出增多；③胰岛β细胞缺陷导致胰岛素分泌不足致高血糖；④长期的高血糖状态刺激胰岛β细胞分泌，导致β细胞功能衰竭和凋[2]亡。胰岛β细胞是人体内分泌胰岛素的唯一的细胞，胰岛β细胞含有大量的内质网。内质网（endoplasmicreticulum，ER）是真核细胞中蛋白质合成、折叠与分泌的重要细胞器，具有蛋白质翻译后修饰、折叠和装配，类固醇合成，脂质合成，2＋糖原合成与分解的作用，同时在细胞内钙的贮存和维持细胞内Ca稳态中起重[3]要作用。内质网中不能正确折叠的畸形肽链或未组装成寡聚体的蛋白质亚单位，无论是在内质网腔内还是在内质网膜上，一般不能进入高尔基体，主要通过泛素依赖性降解途径被蛋白酶体所降解。当未折叠蛋白或错误折叠蛋白在内质网内堆积时使内质网功能紊乱，就会导致ERS，引起未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）。在应激早期，内质网合成蛋白的能力短暂地减弱，这有助于减少蛋白进入内质网腔内而防止内质网过度负荷；随后，编码内质网蛋白翻译、折叠、输出、降解的基因被激活，从而促进内质网对蓄积在内质网腔内的错误折叠或未折叠蛋白质的处理，而有利于维持细胞正常功能。但是，若ERS过度或过强则激活Caspase信号通路和JNK信号同路引起细胞凋亡或死亡等变化，因此，[4]ERS既是细胞抵抗应激的生理反应，又是应激造成细胞损伤或凋亡的重要机制。且研究证实，ERS是细胞内发生的最早反应，是线粒体氧化应激等细胞应激反应[5]的共同初始通路，ERS可独立于其他途径直接诱导细胞凋亡。所以，在高糖状态刺激下，胰岛β细胞易容易发生ERS，导致胰岛β细胞凋亡。糖尿病属于中医理论“消渴症”范畴，而五倍子是中医治疗“消渴症”的传7 统中药，古代许多医家单用五倍子治疗“消渴”。五倍子中含量较丰富的β-PGG近年来被发现具有改善糖尿病的作用。β-PGG抑制炎症因子及氧化应激导致的胰[6-8]岛β细胞凋亡，但β-PGG是否能抑制内质网应激导致的胰岛β细胞凋亡来改善糖尿病的报道较少。故设计本实验来观察β-PGG对糖尿病大鼠的改善作用以及探究是否其能够抑制内质网应激导致的胰岛β细胞凋亡。8 第一部分响应面法优化提取五倍子中β-PGG工艺研究五倍子（GallaChinensis）为漆树科植物盐肤木RhuschinensisMill.、青麸杨RhuspotaniniiMaxim.或红麸杨RhuspunjabensisStew.var.sinica(Diels)Rehd.et[9]Wils.叶上的干燥虫瘿。《本草纲目》中记载其敛肺降火，止消渴。五倍子中单宁酸类成分含量丰富。其中PGG（包括α-PGG和β-PGG）在五倍子中含量约为[10]6%。但是目前还少有对五倍子中β-PGG提取工艺研究的报道，故设计本实验对提取五倍子中β-PGG的条件进行优化。图1β-PGG分子结构式1实验材料1.1仪器高效液相色谱仪（Agilent1200）：美国Agilent公司四元梯度泵真空在线脱气机自动进样器柱温箱VWD检测器Agilent色谱工作站超声清洗机（YL-080ST型）深圳仁义行商贸有限公司旋转蒸发仪（EYEL4型）上海爱朗仪器有限公司1/1万之一电子分析天平（FA1004N型）上海菁海仪器有限公司9 循环水式真空泵（SHZ-D-Ⅲ）巩义英峪予华仪器厂电子天平（JY2001）上海浦春计量仪器有限公司1.2材料β-PGG对照品（纯度＞98%，批号PRF8021403）成都普瑞法科技有限公司乙腈德国Merck公司纯净水杭州娃哈哈集团有限公司其余试剂均为分析纯。五倍子（角倍）药材购于安国药材市场（产地云南批号20170506）。图2五倍子药材2实验方法2.1β-PGG对照品溶液的配制及供试品的制备精密称取β-PGG标准品2.2mg，置于10ml容量瓶中，加入甲醇溶解定溶。将干燥五倍子虫瘿打碎，清理干净虫卵，粉碎后过筛备用。2.2色谱条件色谱柱为AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（4.6×250mm,5um），流动相A为0.1%-磷酸水溶液，C为乙腈，梯度洗脱：表1β-PGG梯度洗脱色谱条件时间(min)有机相C(乙腈)的比例0～1510%～25%15～2025%设置流速为1.0ml/min，检测波长为281nm，柱温为25℃，进样量为10ul。10 2.3β-PGG标准曲线的制作及供试品β-PGG含量的测定β-PGG对照品按上述色谱条件分别按进样量1μL，3μL，5μL，7μL，9μL，11μL进样，得到β-PGG的峰面积(Y)及进样量所对应β-PGG的质量浓度(X)的线性回归，2得到方程Y=2248X+68.16,R=0.9997，β-PGG在0.22mg/mL-2.42mg/mL范围内线性关系良好。2.4β-PGG含量的测定用2.2中的色谱条件测得样品β-PGG的峰面积，根据回归方程计算质量浓度，再根据质量浓度计算出五倍子中β-PGG的提取量。五倍子β-PGG提取量（mg/g）=样品中β-PGG浓度（mg/mL）×样液体积（mL）/称取药粉质量（g）2.5响应面法实验图3不同超声时间对五倍子中β-PGG提取量的影响图4不同料液比对五倍子中β-PGG提取量的影响11 图5不同甲醇体积分数对五倍子中β-PGG提取量的影响根据Box-Behnken实验设计原理，进行单因素实验来确定响应面实验各因素的范围（如图3-5）。本实验选取超声提取时间、料液比、甲醇体积分数3个对β-PGG提取量影响显著的因素进行响应面实验设计，实验因素及水平见表2。表2响应面实验设计因素水平表超声时间料液比甲醇体积分数水平（A）/min（B）（C）/%-1101:15400201:20501301:25603结果3.1响应值分析中心组合实验方案及结果见表3，以β-PGG提取量为响应值（Y）进行实验，本实验设定17个实验点，5个中心点，各实验点随机顺序进行，每组实验重复三次取平均值。采用响应面分析法分析实验结果，得到回归方程-4-3-3Y=-14.534+1.527A+0.472B+0.553C-9.500×10AB-2.925×10AC-4.450×10BC-0.2-32-32031A-2.748×10B-3.052×10C。12 表3响应面实验方案及结果超声时间料液比甲醇体积分数提取量/序号（A）/min（B）（C）/%（mg/g）100026.9521-1021.98300025.68410-122.665-11021.6860-1124.64700025.56801-125.16901025.451001023.381111121.4212-1-1020.2513-10120.68140-1-122.341501122.121611022.8417-10-119.583.2方差分析通过Design-Expert8.0.6软件回归拟合后,进行方差分析如表4所示。13 表4响应面实验结果方差分析方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型66.7697.427.170.0083**A5.6315.635.440.0524B0.8410.840.810.3977C0.09710.0970.0940.7685AB0.08110.0810.0790.7874AC1.3711.371.320.2877BC7.1317.136.90.0341*2A40.42140.4239.090.0004**2B1.6111.611.560.25232C6.2716.276.070.0432*残差7.2471.03失拟项0.6530.220.130.9366纯误差6.5941.65总差7416注：**表示P<0.001；*表示P<0.05。从表4方差分析结果可知，模型的回归效果显著（P<0.05）,线性系数较好2（R=0.9022），说明建立的模型能较好地描述实验结果，可用于分析及预测响应值。由表4的P值大小可以判断，超声时间（A）、料液比（B）、甲醇体积分数（C）对β-PGG提取影响的大小顺序为：超声时间>料液比>甲醇体积分数。3.3响应面分析利用Design-Expert软件对实验方案和结果进行二次多元回归拟合，得到二次回归方程的响应曲面图如图6-8。14 图6超声时间与料液比对β-PGG提取量的响应曲面与等高线图7超声时间与甲醇体积分数对β-PGG提取量的响应曲面与等高线图8料液比与甲醇体积分数对β-PGG提取量的响应曲面与等高线15 3.4验证性实验通过对各个因素的响应面实验设计分析，得到最优提取条件即五倍子粉末在超声时间21.67min，料液比1：42.23（g/mL），甲醇体积分数为49.38%。验证性实验按提取时间22min，料液比1：42（g/mL），甲醇体积分数49%的条件进行，平行重复3次，得到β-PGG提取量为24.742mg/g，RSD为3.58%，模型对β-PGG提取量的预测值为25.635mg/g，真实值与预测值误差为-3.48%。4结论β-PGG在五倍子中含量较为丰富，目前少见优化提取五倍子中β-PGG条件的报道。本实验以超声时间、料液比、甲醇体积分数为提取条件，运用响应面法设计实验对五倍子中β-PGG的提取条件进行了优化，结果表明，实验建立的模型能够较好地描述实验结果，且得到了理论上最优的提取条件，通过实验验证得到了最佳的提取工艺条件。16 第二部分β-PGG抑制糖尿病模型大鼠胰岛β细胞凋亡的研究胰岛β细胞具有高度发达的内质网，研究发现IAPP、软脂酸能使胰岛β细胞[11-12]出现内质网应激，导致胰岛β细胞凋亡。内质网应激诱导细胞凋亡涉及两条信号同路。第一条凋亡通路涉及JNK通路的活化。在内质网应激期间，活化的肌醇酶-1(inositol-requiringenzyme1，IRE-1)募集肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumornecrosisfactorreceptor-associatedfactor2，TRAF2)和凋亡信号调节激酶(ASK-1)来形成IRE-1-TRAF2-ASK1复合体从而导致JNK的活化和下游依赖线粒体/凋亡蛋白酶活化因子的半胱天冬酶(Caspase)活化。活化的ASK1导致JNK的[13]磷酸化，进一步活化促凋亡蛋白与微管的连接。第二条凋亡通路为Caspase-12介导的凋亡。它是内质网中一个特殊的凋亡途径，它独立于线粒体与死亡受体的[14]活化，通过直接活化下游Caspase-3来发挥作用。本实验采用一次性注射STZ建立大鼠糖尿病模型，观察β-PGG对糖尿病大鼠血糖和体重的改善作用，探究其抑制内质网应激导致的胰岛β细胞凋亡的作用。1实验材料1.1实验动物雄性Wistar大鼠，SPF级，4周龄，110～120g，购于成都达硕生物科技有限公司，生产许可证号：SCXK（川）-2015-030。所有大鼠均饲养于SPF级动物实验室，温度20℃~25℃；湿度40%~70%；照明为12h∶12h明暗交替。所有大鼠给予普通饲料及纯净水饲养。1.2实验药物、耗材1.2.1实验药物链脲佐菌素Streptozocin，STZ，Sigma，S0130β-PGG标准品（纯度＞98%，批号PRF8021403）成都普瑞法科技有限公司盐酸西格列汀捷诺维1.2.2实验耗材RIPA裂解液碧云天BCA蛋白浓度测定试剂盒碧云天ECL显色液碧云天17 SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（6X）Fermentas丽春红染色液北京索莱宝CASPASE-12抗体（abs120719a）absinCASPASE-3抗体（05/2017）CSTTXNIP抗体（14715）CSTJNK抗体（9258s）CSTβ-actin抗体（20536-1-AP）proteintech二抗：通用型二抗（7074s）CST丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、异丙醇、SDSsigma甘氨酸、tris、temedamresco乙醇、二甲苯、石蜡、苏木素染色液、伊红染色液、高锰酸钾、醛品红染色液、橙黄G液中性树胶、载玻片、盖玻片、脱水盒各种规格的离心管（0.65ml，1.5ml，15ml等）kirgen各种规格的吸头（白色，黄色，蓝色）kirgenPVDF膜（0.45um、0.22um）MilliporeWhatman滤纸（3MM）GE纤维垫(BIO-RAD)：GE镊子、离心管架、玻璃匀浆器等，海门脱脂奶粉异丙醇：国产分析纯无水乙醇：国产分析纯DEPC：北京索莱宝48孔PCR板（Lifetech）96孔PCR板（Axygene）封板膜（Axygene）1.3主要溶液的配置1.STZ注射液的配置取适量STZ粉末，用pH4.3-4.5的柠檬酸钠缓冲液溶解成1%的注射液，冰18 浴避光，且在30min内使用完，现配现用。2.盐酸西格列汀阳性药取盐酸西格列汀片，用研钵研成细粉，加0.5%羧甲基纤维素钠溶液，再研磨，超声5min，配成浓度为1mg/ml的溶液，临用前配制。3.β-PGG灌胃液的配置取一定质量β-PGG粉末溶于0.5%羧甲基纤维素钠溶液中，不断搅拌至均匀，配制成所需浓度和体积的β-PGG悬浮液。4.磷酸盐缓冲液(PBS)在天平上称取Na2HPO4▪12H2O3.61g，KH2PO40.2g，NaCl8.0g，KCl0.2g，加去离子水800ml，搅拌至完全溶解，然后定容至1000ml，高温、高压灭菌，冷却至室温，调PH值至7.2～7.4，于4℃储存，备用。5.蛋白裂解缓冲液每片蛋白酶抑制剂溶于1.5ml超纯水中，于4℃储存备用。6.SDS-PAGE凝胶的制作①10%SDS的配制取SDS10.0g加超纯水至100ml，放置于磁力搅拌器溶解，室温保存。②30%聚丙烯酰胺溶液取丙烯酰胺（Acr）29.0g，甲叉双丙烯酰胺（Bic）1g，加超纯水80ml，完全溶解后定容至100ml，使用时需室温静置30min，且无沉淀发生。③1.5mol/LTris-HCl（PH=8.8）取Tris45.43g，加超纯水200ml溶解，浓盐酸调PH至8.8，用超纯水定容至250ml，室温保存。④10%过硫酸铵（AP）取过硫酸铵0.10g，加超纯水溶解，定容至1.0ml，分装后于4℃储存。⑤10%分离胶和4%浓缩胶19 表5电泳胶的配比液体类别剂量（mL）超纯水3.6ml30%Acr/Bic4.0ml1.5MTris-HCl(PH=8.8)2.2ml10%SDS0.1ml10%AP0.1mlTEMED0.008ml总体积10.0ml7电泳液缓冲液取Tris3.03g，甘氨酸18.77g，SDS1.0g，溶于800ml超纯水中，完全溶解后定容至1.0L，室温保存。8.TBS缓冲液吸取1mol/LTris·HCl（pH7.5）10mL，NaCl8.8g，加超纯水溶解并定容至1.0L。9.TBST缓冲液取100%吐温-201.0ml，加TBS溶解并定容至1.0L，即得。10.湿转移缓冲液取Tris5.8g，SDS0.37g，甘氨酸2.9g，加甲醇200ml，加超纯水溶解并定容至1.0L，4℃保存。11.封闭液脱脂奶粉0.5g，加TBST缓冲液10ml溶解。1.4仪器电子天平（JY2001）上海浦春计量仪器有限公司血糖仪及配套试纸美国雅培制药有限公司酶标分析仪（RaytoRT-6100型）上海酶联生物科技有限公司全自动脱水机（ThermoEXCELSIORAS）杭州柏奥谷科技有限公司生物组织包埋机（BM-Ⅷ）广州葆科键医疗器械有限公司半自动切片机（ThermoFINESSE+）杭州柏奥谷科技有限公司20 摊片烤片机（CS-Ⅵ型）郑州恒路科贸有限公司显微镜成贯仪器有限公司恒温干燥箱日本SANYO公司自动消毒锅日本SANYO公司普通冰箱（4℃，-20℃）青岛海尔公司超低温冰箱（-80℃）美国Thermo公司掌上离心机其林贝尔仪器制造有限公司高速冷冻离心机（CF-16RX）HITACH公司水浴锅日本SANYO公司全波长分光光度计上海UNICO公司凝胶成像仪美国BIO-RAD公司垂直电泳槽美国BIO-RAD公司湿式转膜槽美国BIO-RAD公司封口机上海麦尔多公司静音混合仪其林贝尔仪器制造有限公司移液器（1000ul，200ul）大龙公司移液器（2.5ul，10ul）德国Eppendorf公司超声破碎仪美国sonics2实验方法2.1大鼠糖尿病造模及分组给药2.1.1造模方法雄性4周龄wistar大鼠70只，随机分为正常组（n=10），造模组（n=60）。适应性喂养1周，所有大鼠禁食不禁水12h后，造模组给予一次性腹腔注射STZ50mg/kg，正常组腹腔注射等量的溶剂液体。72h后检测FBG，期间自由饮水，若FBG≥11.1mmol/L，且出现毛色枯黄无光，饮水量增加，垫料潮湿等症状即认为造模成功。2.1.2分组给药给药方式：每天9:00-10:00灌胃给药，模型组和正常组给予等量的溶剂灌胃，每天1次，共灌胃6周。21 给药计量：β-PGG低剂量组、中剂量组、高剂量组分别为20mg/kg、40mg/kg、80mg/kg，阳性药（西格列汀）的给药剂量为人鼠等效剂量10.5mg/kg。给药体积：1mL/100g体重。将成模的50只大鼠随机分为5组，每组10只，分别为模型组、阳性组（西格列汀10.5mg/kg）、β-PGG低剂量组（20mg/kg）、β-PGG中剂量组（40mg/kg）、β-PGG低剂量组（80mg/kg）。给药期间所有大鼠给予普通饲料及纯净水喂养，每周测量并记录大鼠FBG和体重。测FBG前，禁食不禁水10h，之后用葡萄糖氧化酶法，针刺尾静脉测定大鼠FBG。2.2胰腺组织的采集灌胃给药结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，迅速剪开腹部，摘取胰腺，用0.9%生理盐水漂洗干净，滤纸吸干，一部分置于盛有胰腺组织固定液的溶液中固定保存，用于制作病理切片；一部分组织，迅速置于液氮中，后放于-80℃冰箱冷冻保存，用于Westernblot实验。2.3胰腺组织HE染色1.洗涤将用组织固定液保存的胰腺组织放入脱水盒流水冲洗2h，冲去固定液和沉淀物。2.脱水透明将洗涤完的胰腺组织放入全自动脱水机内，用不同浓度的乙醇，从低到高(70%、80%、95%、无水乙醇)逐渐脱去组织块的水分。再将组织块溶于无水乙醇中，取出再置于二甲苯中透明，重复3次，用二甲苯替换组织中的乙醇，这时组织呈半透明状。3.浸蜡包埋将已透明的组织置于熔化的石蜡中，放入熔蜡箱中保温，使组织中的透明剂二甲苯完全置换出来。将浸蜡完全的组织块进行包埋：倒入熔化的石蜡，迅速取出已浸透的石蜡组织块，冷却凝固使其具有一定的硬度和韧度。4.切片展片用切片机将石蜡组织切成4μm的薄片，将切下的组织薄片放于45℃水中展平。22 5.贴片烤片将展平的切片贴于玻片上，并将贴好的玻片放于60-70℃烤箱烘烤20min，使组织紧贴于玻片上。6.脱蜡染色：（1）用二甲苯将切片中的石蜡脱去，然后用浓度从高到低的乙醇将二甲苯置换出来，以水冲洗1min后放入超纯水待染色。（2）苏木素染液染色：Harris苏木素染液染色8-10分钟，用水稍冲洗。（3）分化、蓝化：1%盐酸乙醇液分化数秒，以脱去细胞核中结合过多的染料和细胞质吸附的染料；用水冲洗蓝化3-5min，使苏木素染上的细胞核变成蓝色。（4）伊红染色液染色数秒，稍水冲洗。（5）脱水、透明：从低浓度到高浓度的乙醇脱水，再用二甲苯透明切片。（6）用中性树胶封片，贴上标签。2.4胰岛细胞醛品红-橙黄G染色⑴新鲜胰腺组织固定于Bouin氏液，流水冲洗一晚，常规脱水、包埋。⑵将包埋好的组织用切片机切成4-5um薄片。⑶切片、脱蜡。用现配的酸性高锰酸钾溶液(0.5%高锰酸钾：0.5%硫酸)氧化5min，稍用水冲洗。⑷用2%草酸漂白2-3min，流水冲洗5min。⑸70%乙醇稍洗，再入醛品红染液染色30min。⑹70%乙醇浸洗两次，每次半分钟，直到无多余的染料洗出，稍水冲洗。⑺橙黄G复染1秒钟。⑻无水乙醇冲洗，吹干、透明、中性树胶封固。2.5胰腺组织Westernblot实验（1）蛋白样品制备将胰腺组织从-80℃冰箱取出，迅速将组织剪碎，每100mg组织中加入500μL的RIPA裂解液(含30ul蛋白酶抑制剂)，反复充分剪碎组织，冰浴环境下，用细胞研磨器研磨均匀，冰浴上静置裂解10min。重复4次。充分裂解后，于高速冷冻离心机上，4℃，转速12000rpm，离心15min，收集上清液，弃去沉淀。23 （2）蛋白定量采用比色法进行蛋白定量，操作按BCA蛋白定量试剂盒说明书进行。a．配制A、B混合液，根据样品数和标准蛋白浓度梯度数之和乘以200ulA:B=50:1。b．96孔培养板中配制梯度蛋白标准品。c．另起一排，每孔加入19ul的RIPA裂解液和1ul蛋白样品（稀释20倍）。表6BCA蛋白定量浓度孔号01234567蛋白标准溶液（μL）01248121620RIPA裂解液（μL）2019181612840对应蛋白浓度（μg/μL）00.0250.050.100.200.300.400.50注：孔号0～7所加蛋白标准液的浓度为0.5μg／μld．各孔加入200μLBCA工作液，37℃温箱孵育25min，在分光光度计562nm测定OD值。（3）制胶及上样a.将各个样品的蛋白上样量调整为160μg（总蛋白上样量均一化），上样体积不齐的，用RIPA裂解液补齐至15μL。每管加入3μL6×loadingbuffer，吹打混匀，于沸水中变性10min。瞬时离心5秒，4℃短暂保存，-20℃长期保存。b.自来水洗净制胶玻璃板，去离子水冲洗后放烘箱中烘干，要求玻璃板边缘无残余胶粒，玻璃板面无水渍。将玻璃板放入制胶装置中，保持基线平齐，密封良好。c.按试剂配制方法配制10%SDS-PAGE分离胶溶液，混匀后立即注入垂直的胶架上，用异丙醇封闭，静置30min。当异丙醇与凝胶层出现清晰折线时，胶完全凝固。倒去上层异丙醇并用滤纸吸干，缓缓加入4%浓缩胶，插入加样梳，避免产生气泡。d.待凝胶完全凝结后，将凝胶玻璃板垂直固定于凝胶电泳仪上。将电泳仪上下两槽分别加入电泳缓冲液，小心拔去加样梳，并用电泳缓冲液冲洗加样孔。e.用10ul移液枪吸取样品，垂直向下缓慢注入胶孔，每张胶加入蛋白分子量Marker。24 （4）电泳接通凝胶电泳仪电源，设置电压为180V，电流为100mA，根据实际情况确定电泳时间，停止电泳后取下玻板，切取浓缩胶。（5）湿法转膜a．根据胶的大小，剪相应大小的PVDF膜和滤纸，用甲醇浸泡PVDF膜少许时间。将PVDF膜、滤纸和海绵垫一同浸泡于湿转缓冲液中。按如下顺序叠放电转“三明治”：负极(黑面)→海绵垫→3层滤纸→胶→PVDF膜→3层滤纸→海绵垫→正极(白色)。b．将三明治夹子放入转移槽中，黑面对槽的黑面，白面对槽的红面。转移槽置于盆中，周围加冰块。200mA转膜1h后关闭电源，取出PVDF膜。c．置于丽春红染色液中染色3～5分钟，观察转膜后蛋白条带情况，用超纯水漂洗去除染液。（6）免疫反应a.将PVDF膜置于5％的牛血清白蛋白中，室温（20℃～30℃）封闭1h。b．取出PVDF膜，在摇床上用TBST洗涤3次，每次5min。将膜放入预先稀释好的一抗杂交袋中（Caspase-12，Caspase-3，JNK，TXNIP，β-actin，抗体稀释倍数为1:1000），4℃孵育过夜。c．取出杂交袋，室温复温10min，用TBST在摇床上洗涤PVDF膜3次，每次10min。加入预先稀释好的二抗，摇床上孵育2h。（7）化学发光、显影、分析二抗孵育完毕后，用TBST在摇床上洗涤PVDF膜3次，每次10min。用吸水纸尽量吸干PVDF膜上的水分后，将其平放在采集化学发光信号凝胶成像仪里，避免出现气泡。按照ECL显影液说明书，将A、B液按1:1配制，并滴加到PVDF膜上，直至影像出现，采用imageJ软件分析条带灰度。以β-actin蛋白作为内参，进行OD值的比较。3实验结果3.2模型评价造模组60只大鼠注射STZ后共有50大鼠FBG达标，成模率为83%，造模组大鼠FBG与正常组相比，有显著性差异（P<0.01）。25 3.3大鼠的一般状况正常组大鼠状况良好，精神状态较佳，活动自如，毛发光泽，饮水量正常，体重持续稳定增长，无死亡情况；模型组大鼠状况较差，精神状态欠佳，毛发枯黄无光，饮水量较大，垫料潮湿，出现死亡等情况。β-PGG高剂量组大鼠治疗后平均体重与模型组相比有显著性差异（P<0.05）。治疗前后各组体重变化见表7。给药期间各组大鼠体重变化见图9。表7各组大鼠治疗前后体重情况（g）治疗前治疗后正常组183.7±3.30305±12.24***模型组180.4±7.83168.3±24.03#阳性组185±4.64201.5±32.60β-PGG低剂量组179.8±4.10175±23.19β-PGG中剂量组182.1±11.14180.9±29.59#β-PGG高剂量组178.7±8.52215.2±64.97#注：正常组相比***P<0.001；与模型组相比P<0.05。350300250正常组模型组(g)200阳性组150体重β-PGG高剂量组100β-PGG中剂量组50β-PGG低剂量组00246图9各组大鼠体重变化趋势3.4治疗前后大鼠血糖水平的变化正常大鼠经过6周的饲养，FBG保持稳定，模型组FBG与正常组相比有显著性差异（P<0.01），灌胃β-PGG6周后，β-PGG低、中、高剂量组大鼠FBG有明显改善，见表8。给药期间各组大鼠FBG变化情况见图10。26 表8各组大鼠治疗前后空腹血糖情况（mmol/L）治疗前治疗后正常组4.0±0.363.4±0.47***模型组26.0±2.6019.3±3.95#阳性组26.7±2.2310.5±7.42β-PGG低剂量组27.4±0.4116±7.07β-PGG中剂量组27.1±1.0518.5±7.00#β-PGG高剂量组27±0.7210.7±7.76#注：与正常组相比：***P<0.001；与模型组相比P<0.05。3025正常组20模型组15阳性组β-PGG高剂量组FBG(mmol/L)10β-PGG中剂量组5β-PGG低剂量组01234图10各组大鼠空腹血糖变化趋势3.5胰腺组织HE染色观察胰腺组织HE染色显示了各组大鼠胰腺组织形态学的改变（图11，×200）。正常组大鼠胰腺组织显微镜下观察胰岛大，胰岛与周围细胞界限明显，胰岛细胞形态完整，细胞之间界限清晰（图11A）。模型组大鼠胰岛萎缩，胰岛与周围细胞界限不明显，胰岛细胞形态不完整，细胞之间界限不清晰（图11B）。阳性组、β-PGG低、中、高剂量组与模型组比较，胰岛较大，胰岛与周围细胞界限较明显，胰岛细胞形态较完整，细胞之间界限较清晰，组织形态学有明显改善（图11C-F）。27 正常组（A）模型组（B）阳性组（C）β-PGG高剂量组（D）β-PGG中剂量组（E）β-PGG低剂量组（F）图11各组大鼠胰腺组织HE染色结果3.6胰岛β细胞特殊染色大鼠胰岛β细胞醛品红-橙黄G染色结果（图12，×200），胰岛β细胞胞质颗粒呈紫红色至深紫色，其他细胞呈淡黄色。正常组胰岛中胰岛β细胞较多（图12A）。模型组胰岛β细胞数量减少（图12B）。阳性组和β-PGG高剂量组胰岛β细胞数相对较多（图12C-D）。正常组（A）模型组（B）阳性组（C）β-PGG高剂量组（D）β-PGG中剂量组（E）β-PGG低剂量组（F）图12各组大鼠胰岛β细胞特殊染色结果28 3.7Westernblot实验采用WB蛋白检测技术检测大鼠药物干预6周后胰腺组织细胞中Caspase-3、Caspase-12、JNK、和TXNIP的表达量，得到电泳图谱（图13）和蛋白灰度分析结果（表9-12，图14-17）。Caspase-1255kdaCaspase-335kdaJNK46kdaTXNIP55kdaβ-actin43kda123456图13大鼠胰腺组织WB检测蛋白表达结果注：1正常组；2模型组；3阳性组；4β-PGG低剂量组；5β-PGG中剂量组；6β-PGG高剂量组表11和图11结果显示，模型组大鼠胰腺组织Caspase-12蛋白表达量明显增加。药物干预6周后，阳性组、β-PGG高剂量组与模型组相比，蛋白表达量明显下降，差异具有显著性（P＜0.05），β-PGG低、中剂量组与模型组相比，表达量有所下降。说明β-PGG可明显降低大鼠胰腺组织Caspase-12蛋白表达水平。表9各组大鼠胰腺组织细胞Caspase-12蛋白相对表达量组别相对表达倍数正常组1.00±0.33模型组2.72±0.69**#阳性组1.29±0.27β-PGG低剂量组2.10±0.92β-PGG中剂量组1.59±0.83β-PGG高剂量组1.05±0.16##注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：P<0.05。29 图14大鼠胰腺组织蛋白Caspase-12相对表达量柱状图表12和图12显示为Caspase-3蛋白的相对表达量，各给药组蛋白的表达量与模型组相比均不同程度的降低，其中阳性组与模型组比较，差异具有显著性（P＜0.01）；β-PGG高剂量组与模型组比较，差异具有显著性（P＜0.05）。说明西格列汀和β-PGG可降低糖尿病大鼠胰腺组织Caspase-3蛋白的表达。表10各组大鼠胰腺组织细胞Caspase-3蛋白相对表达量组别相对表达倍数正常组1.00±0.20模型组4.06±0.84**##阳性组1.59±0.35β-PGG低剂量组3.76±1.07β-PGG中剂量组3.39±1.32β-PGG高剂量组2.31±0.75####注：与正常组比较：**P<0.01；与模型组比较：P<0.05，P<0.01。图15大鼠胰腺组织蛋白Caspase-3相对表达量柱状图表13和图13结果为大鼠胰腺组织JNK蛋白的表达情况，模型组大鼠与正30 常组相比蛋白表达量明显上升。与模型组相比，阳性组、β-PGG低、中、高剂量组的蛋白表达水平下降，其中阳性组、β-PGG高剂量组与模型组相比有显著性差异（P＜0.05）。说明β-PGG可下调糖尿病大鼠胰腺组织JNK蛋白的表达。表11各组大鼠胰腺组织细胞JNK蛋白相对表达量组别相对表达倍数正常组1.00±0.31模型组2.66±1.00*#阳性组1.28±0.51β-PGG低剂量组2.22±0.87β-PGG中剂量组1.83±0.67β-PGG高剂量组1.20±0.41##注：与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：P<0.05。图16大鼠胰腺组织蛋白JNK相对表达量柱状图表14和图14为各组大鼠胰腺组织TXNIP蛋白的表达水平。阳性组、β-PGG高剂量组在药物干预6周后胰腺组织蛋白表达水平明显下调，差异具有统计学意义（P＜0.05）。31 表12各组大鼠胰腺组织细胞TXNIP蛋白相对表达量组别相对表达倍数正常组1.00±0.23模型组1.67±0.50*#阳性组0.99±0.11β-PGG低剂量组1.48±0.33β-PGG中剂量组1.23±0.35β-PGG高剂量组1.03±0.32##注：与正常组比较：*P<0.05；与模型组比较：P<0.05。图17大鼠胰腺组织蛋白TXNIP相对表达量柱状图4结论1.β-PGG对糖尿病大鼠的体重和血糖的改善作用β-PGG可维持糖尿病大鼠的体重，改善体重减轻症状；降低糖尿病大鼠的空腹血糖，减轻高血糖症；改善糖尿病大鼠尿糖、饮水量多等状况，减轻尿糖症状；改善毛色及活动量和反应力。由此可知，β-PGG可以从不同程度改善糖尿病的症状。2.β-PGG从内质网应激途径抑制胰岛β细胞凋亡β-PGG可改善糖尿病大鼠的胰岛细胞状态，增加β细胞数量；增加Caspase-12、Caspase-3和JNK蛋白的表达量，故而认为，β-PGG可能通过抑制内质网应激途径抑制β细胞凋亡，从而达到改善糖尿病的作用。32 讨论糖尿病是一种由于胰岛素分泌不足以及胰岛功能缺失导致的长期的以高血糖为症状的疾病。胰岛β细胞主要功能是分泌胰岛素，调节血糖，而胰岛素是人体唯一一种能够降血糖的激素，胰岛β细胞出现功能障碍或凋亡，就会出现糖尿病患者血糖升高，体重减轻的情况。为探究β-PGG对糖尿病大鼠的干预作用，本实验从糖尿病大鼠体重、血糖、胰腺组织病理切片3个方面对大鼠进行观察，同时讨论β-PGG对胰岛细胞内质网应激的抑制作用。1构建大鼠糖尿病模型一次性较大剂量注射STZ可以导致大鼠胰岛β细胞凋亡。DNA烷化剂STZ[15-16]对胰岛β细胞有选择性破坏的特点，其通过改变β细胞结构与功能引起胰岛β细胞功能障碍或数量的缺失。而且注射STZ后，残存的胰岛β细胞不得不增加活性来增加胰岛素分泌以维持血糖在正常范围，这将引起胰岛β细胞内质网负担及细胞内代谢压力的增加，导致β细胞自身损害加重，最终引起细胞凋亡或坏[4]死。因此，注射STZ建立大鼠糖尿病模型比较符合实验要求。本实验模型基于以上理论，对wistar雄性大鼠一次性腹腔注射STZ（50mg/kg）破坏胰岛β细胞，建立大鼠糖尿病模型。注射72h后FBG≥11.1mmol/L，同时，观察到大鼠的神态萎靡，毛色干枯无光泽，且不同程度出现尿糖，饮水量增加等症状的即认为达到模型要求。2β-PGG对糖尿病大鼠体重和血糖的影响以及抑制内质网应激导致的胰岛β细胞凋亡糖尿病患者机体同时存在着胰岛素抵抗和胰岛β细胞凋亡两种病理变化，机体的胰岛素抵抗使胰岛素不能与靶细胞有效的结合，血液中的葡萄糖转化为脂肪、糖原等过程受阻；同时高糖状态使胰岛β细胞凋亡加速，分泌胰岛素的胰岛β细胞减少，进一步加重糖尿病。胰岛素抵抗或胰岛素分泌减少的同时，胰高血糖素的作用不受影响，机体脂肪、糖原持续转化为葡萄糖进入血液，之后尿糖排出，营养的流失导致体重减轻。本实验对糖尿病模型大鼠进行给药干预6周后，β-PGG低、中、高剂量组大鼠平均体重和FBG与模型组相比均有改善，且β-PGG高剂量组大鼠平均体重和FBG与模型组相比均有显著性差异（P<0.05）；HE染色及胰岛β细胞凋亡特殊染色结果显示，β-PGG能够改善胰岛形态，维持胰岛β细胞的数33 量，同时WB实验检测结果显示β-PGG可降低糖尿病大鼠胰腺组织细胞TXNIP的[17-18]水平，TXNIP是胰岛细胞炎症途径凋亡的核心分子，与胰岛β细胞功能异常[19]及凋亡密切相关。综上结果，可推测β-PGG从缓解胰岛素抵抗及抑制胰岛β细胞凋亡两方面对糖尿病大鼠的血糖和体重进行改善。β-PGG改善胰岛素抵抗作用[20-21][22]以及通过抑制氧化应激等途径抑制胰岛β细胞凋亡已经有报道，但其是否可通过抑制胰岛β细胞内质网应激导致的胰岛β细胞凋亡的报道较少，故而本实验又进行了β-PGG抑制内质网应激导致的β细胞凋亡的探索。实验发现，STZ造模后的大鼠，内质网应激的相关蛋白如Caspase-3、Caspase-12、JNK表达量将明显增加，说明胰岛细胞发生了内质网应激。本实验对糖尿病大鼠进行β-PGG干预6周后，WB结果显示β-PGG低、中、高剂量组大鼠胰岛组织细胞Caspase-3、Caspase-12、JNK蛋白表达量不同程度的降低，且β-PGG高剂量组与模型组相比均有显著性差异（P<0.05）。由此可以初步推断，β-PGG可以通过抑制内质网应激的途径抑制β细胞凋亡而达到改善糖尿病的目的。但是β-PGG抑制内质网应激的信号调节的具体机制以及其他抑制β细胞凋亡的作用机制仍未明确，还需要更多的研究。总之，β-PGG可以抑制糖尿病大鼠内质网应激导致的β细胞凋亡。34 结论1.最佳提取条件为超声时间22min，料液比1：42（g/mL），甲醇体积分数为49%时，β-PGG提取量达到24.742mg/g。2.五倍子中β-PGG可以改善STZ诱导的大鼠糖尿病的血糖、体重，可能通过抑制内质网应激而抑制胰岛β细胞凋亡。35 参考文献[1]佚名.中国2型糖尿病及其并发症的流行病学[J].中国糖尿病杂志,2011,22(8):4-42.[2]BadawiA,SayeghS,SadounE,etal.RelationshipbetweeninsulinresistanceandplasmavitaminDinadults[J].DiabetesMetabSyndrObes,2014,7:297-303．[3]KaufmanRJ．Orchestratingtheunfoldedproteinresponseinhealthanddisease[J].ClinInvest，2002,110(10):1389-1398.[4]俞雅萍,晏春根.糖尿病发病与内质网应激[J].中国临床康复,2005,9(27):139－141．[5]TabasI,RonD.Integratingthemechanismsofapoptosisinducedbyendoplasmicreticulumstress[J].NatureCellBiology,2011,13(3):184.[6]OhGS,PaeHO,ChoiBM,etal.Penta-O-galloyl-beta-D-glucoseinhibitsphorbolmyristateacetate-inducedintereukin-8geneexpressioninhumanmonocyticU937cellsthroughitsinactivationofnuclearfactor-κB[J].IntImmunopharmacol,2004,4(3):377-386.[7]GenfaL,JiangZ,HongZ,etal.Thescreeningandisolationofaneffectiveanti-endotoxinmonomerfromRadixPaeoniaeRubrausingaffinitybiosensortechnology[J].IntImmunopharmacol,2005,5(6):1007-1017．[8]YangMH,VasquezY,AliZ,etal.ConstituentsfromTerminaliaspeciesincreasePPARαandPPARγlevelsandstimulateglucoseuptakewithoutenhancingadipocytedifferentiation[J].JEthnopharmacol,2013,149(2):490-498．[9]国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京:中国医药科技出版社,2010:62.[10]王维聪,王潮,宋学英,等.44种中药中1,2,3,4,6-五-O-倍酰-D-葡萄糖含量的测定[J].中国中药杂志,2008,33(6):656-659.[11]HuangCJ,LinCY,HaatajaL,etal.Highexpressionratesofhumanisletamyloidpolypeptideinduceendoplasmicreticulumstressmediatedbeta-cellapoptosis,acharacteristicofhumanswithtype2butnottype1diabetes[J].Diabetes,2007,56(8):2016-2027.[12]KaraskovE,ScottC,ZhangL,etal.ChronicPalmitateButNotOleateExposureInducesEndoplasmic-ReticulumStress,WhichMayContributetoINS-1Pancreaticβ-CellApoptosis[J].Endocrinology,2006,147(7):3398-3407.[13]ZhengQY,LiPP,JinFS,etal.UrsolicacidinducesERstressresponsetoactivateASK1-JNKsignalingandinduceapoptosisinhumanbladdercancerT24cells[J].Cellular36 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文献综述糖尿病与胰岛β细胞凋亡摘要：胰岛β细胞凋亡是1，2型糖尿病的显著特征。1型糖尿病为胰岛细胞的自身免疫性疾病。2型糖尿病发生发展的特点为胰岛素抵抗和胰岛β细胞功能缺陷。近年来，胰岛β细胞凋亡的分子机制报道较多，如高血糖，高血脂，氧化应激，内质网应激和线粒体途径等。在对改善胰岛β细胞凋亡及功能方面也有较多报道。关键词：糖尿病；胰岛β细胞；凋亡糖尿病已经成为全球威胁人类健康的三大慢性非传染性疾病之一，我国糖尿病患者总数位居世界首位，其中2型糖尿病患者占90%以上，预计到2025年全[1]球糖尿病患者将突破3亿。众多的患者无疑对社会带来沉重的负担，但与此同时，大量的研究工作者也在科研一线对糖尿病的病因机制及治疗方案进行着研究。细胞凋亡指细胞在生理或病理条件下，遵循自身的规律按部就班地死亡过程。胰岛β细胞凋亡与糖尿病的发生有密切关系。1胰岛β细胞凋亡的因素1.1糖毒性诱导的胰岛β细胞凋亡众所周知，糖尿病患者以高血糖为特征。在2型糖尿病发生发展中，胰岛功能是逐步丧失的，一方面胰岛素分泌障碍导致血糖维持较高的水平，高血糖对胰岛β细胞产生糖毒性；另一方面，胰岛细胞代偿性增生以及超负荷运转导致细胞[2]衰竭凋亡。李琳等利用不同浓度葡萄糖对小鼠胰岛β细胞株MIN-6进行培养，结果发现高浓度及低浓度葡萄糖作用72h均可抑制MIN-6细胞生长，认为低于或高于25mmol/L葡萄糖浓度可抑制胰岛β细胞的增殖及增加胰岛β细胞的凋亡。[3]龚蕾以小鼠胰岛微血管内皮细胞（MS-1细胞）为研究对象，研究高糖引起胰岛微血管MS-1细胞凋亡的机制。结果表明高糖通过活性氧自由基（RNS）启动内源性凋亡途径引起MS-1细胞凋亡，且高糖通过激活c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路调节活性氧自由基（ROS）及O2-的产生，上调诱导型一氧化氮合酶（iNOS）的表达，调节Bax、Bal-2、Cleavedcaspase-3和CleavedPARP的蛋白表达。张[4]洁针对CDC2L2编码的蛋白p58与胰岛β细胞凋亡的关系及其作用的分子机制进行了研究，结果表明高糖条件下诱导INS-1细胞凋亡的分子机制可能是通过上38 调Bax的表达、下调Bcl-2的表达，从而增加线粒体外膜的通透性，使CytoC由线粒体向胞浆释放，最终活化Caspase-3引起细胞凋亡。1.2脂毒性诱导胰岛β细胞凋亡[5]胰岛β细胞长期处于高脂环境中，可导致凋亡。对于脂毒性诱导胰岛β细[6]胞凋亡的机制，秦君研究发现Tribbles同源蛋白家族（TRBs）的一种应激相关蛋白TRB3与脂毒性关系密切。游离脂肪酸（FFA）诱导小鼠胰岛TRB3及内质网应激标志物CHOP和ATF4的表达上调，并且TRB3通过PKCδ通路参与调控[7]FFA诱导的胰岛β细胞凋亡。高雅楠首次提出Humanin（HN）多肽可以保护棕榈酸诱导的胰岛细胞的凋亡同时加快脂代谢。1.3氧化应激导致的胰岛β细胞凋亡氧化应激是指集体在收到体内外有害因素的刺激时，机体的活性氧簇（ROS）和活性氮簇（RNS）等的过量产生，并且超出了集机体对氧化物清除的能力，因[8]而对集体的组织器官造成损伤的过程，其与2型糖尿病密切相关。ROS包括超2-氧阴离子（O）、羟自由基（·OH）、过氧化氢（H2O2）等：RNS包括一氧化氮-[9]（NO）、二氧化氮（NO2）、过氧化亚硝酸盐（ONOO）等。具体机制为氧化应激过程中产生的大量ROS和RNS可通过细胞脂质过氧化、损伤DNA分子、[10]调节细胞凋亡相关基因等途径诱导细胞凋亡。1.4内质网应激诱导胰岛β细胞凋亡当新合成的蛋白质N末端糖基化、二硫键形成以及蛋白质由内质网向高尔基体转运等过程受阻时，非折叠或错误折叠的新合成的蛋白质在内质网中大量堆2+积，或是Ca平衡状态的打破，都会损伤内质网的正常生理功能，成为内质网应[11]激（endoplasmicreticulumstress，ERS）。ERS通过启动适应性未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）介导高糖、高脂、炎症因子、缺氧等因素[12]诱导胰岛β细胞凋亡。方妮通过研究Tribble同源蛋白3（tribblehomolog3，TRIB3）与内质网应激之间的关系得出TRIB3通过活化NF-kB通路促进内质网以及其下游的氧化应激诱导胰岛β细胞凋亡的结论。1.5线粒体途径的胰岛β细胞凋亡[13]线粒体途径是细胞程序化死亡的重要途径之一。在特定刺激下，线粒体中Bax蛋白表达增加，激活线粒体凋亡途径。细胞色素c、凋亡诱导因子（AIF）39 表达增加，释放到细胞质中的细胞色素c使caspase-3、caspase-9剪切活化，从[14]而激活了caspase依赖性凋亡途径。2胰岛β细胞凋亡的改善[15]近年来，在对胰岛β细胞保护和抗凋亡的报道较多。西医药方面，脂联素是由脂肪细胞分泌的唯一与体脂含量呈负相关的脂肪因子。其干预减轻胰岛β细胞凋亡除了直接作用于胰岛β细胞外，还能通过减少其他凋亡诱导因素来拮抗[16]凋亡。胰高血糖素样肽-1（glucagon-likepeptide-1，GLP-1）是胰高血糖素样肽成员之一。它能促进胰岛素分泌，抑制胰岛β细胞凋亡，促进胰岛β细胞增殖。由于GLP-1毒副作用较传统2型糖尿病小，基于GLP-1的新药开发也有了一定进展，主要包括DDP-4抑制剂、GLP-1类似物和GLP-1受体激动剂。当然，除了使用药物治疗和改善胰岛β细胞凋亡，也有应用胰岛移植来弥补糖尿病患者胰[17]岛素的绝对缺失。中医药方面，中医药治疗糖尿病在我国有着悠久的历史。我国传统医学所谓消渴症与如今的糖尿病相类似。近年来，一方面人们在探索着出传统复方以外的[18]中医疗法，另一方面，来自中药的天然活性产物成为了研究的热点。王栩等利用“调理脾胃针法”对2型糖尿病大鼠进行干预，实现了减轻胰岛素抵抗及修复[19][20]胰岛β细胞双重干预。庞晓英与赵亲伟都利用针刺的方法分别从线粒体途径与内质网途径对胰岛β细胞的凋亡做了研究，结果表明，针刺可以抑制胰岛β细胞凋亡。来自中药的对胰岛β细胞凋亡有抑制作用的天然活性产物有白藜芦醇[21][22][23][24][25]，红景天苷，黄芪多糖，黄参多糖，人参皂苷CompoundK，小檗[26]碱等。综上所述，胰岛β细胞凋亡的机制多种多样，相互联系，若要将其凋亡机制做透彻仍需要大量工作。了解胰岛β细胞凋亡机制能对糖尿病的预防治疗有重要意义。40 参考文献[1]廖涌.中国糖尿病的流行病学现状及展望[J].重庆医科大学学报,2015,40(7):1042-1045.[2]李琳,刘瑜,李春霖等.不同葡萄糖浓度对小鼠胰岛β细胞增殖和凋亡的影响[J].军医进修学院学报，2011，32（6）：629-631.[3]龚蕾.高糖致胰岛微血管内皮细胞凋亡的机制及年龄相关胰岛β细胞再生的研究[D].济南：山东大学医学院，2013:6-76.[4]张洁.p58促胰岛β细胞凋亡机制的研究[D].北京：中国协和医科大学[5]黄刚娅.长期接触高浓度游离脂肪酸对大鼠胰岛β细胞凋亡的影响[J].临床和实验医学杂志,2011,10(18):1409-1410.[6]秦君.TRB3在游离脂肪酸诱导胰岛β细胞凋亡中的作用及机制研究[D].济南：山东大学医学院，2014：6-75.[7]高雅楠.[Gly14]-Humanin对β细胞凋亡的保护作用及对糖代谢和脂代谢的相关调控作用[D].长春:吉林大学生命科学学院,2015:4-40.[8]王莉萍.α-硫辛酸对2型糖尿病大鼠氧化应激致胰岛β细胞凋亡的影响[D].上海：上海交通大学农业与生物学院,2013:14-15.[9]陈超,刘玫梅,沈云峰,等.早期胰岛素治疗减轻氧化应激改善db/db糖尿病小鼠胰岛功能的试验研究[J],江西医药,2015,50(12):1359-1362.[10]王燕萍,潘晓东,姜苏原,等.氧化应激可通过NF-κB-iNOS-NO信号通路诱导小鼠胰岛β细胞凋亡[J].中国应用生理学杂志,2009:25(2):255-259.[11]夏元平,王立花,樊燕蓉.细胞凋亡与内质网应激机制[J].药学与临床研究,2010,18(3):291-293.[12]方妮.TRIB3参与内质网应激诱导的胰岛细胞凋亡机制的研究[D].北京:北京协和医学院研究生院中日友好临床医学研究所,2014:1-99.[13]高方远,陆贤军,任光俊.细胞凋亡的线粒体途径调控[J].应用与环境生物学报,2004,10(2):251-255.[14]曹军军,杨茂伟,郭宝磊,等.高糖通过线粒体途径诱导成骨细胞凋亡[J].中国生物化学与分子生物学报,2012,28(12):1109-1114.[15]龙健.脂联素抑制胰岛β细胞脂性凋亡及其机制研究[D].重庆:重庆医科大学附属第一医院,2015:7-69.41 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