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《血清胆汁酸谱变化对胆结石发病预测及证候研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号Ｒ２７５．９学校代号１０５７２ＵＤＣ６１０２０５２１０２０４９密级公开学号１ＧｕａｎｇｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ博士学位论文血清胆汁酸谱变化对胆结石发病预测及证候研究学位申请人陈则旭指导教师姓名吕爱平专业名称中西医结合基础申请学位类型科学学位论文提交日期２０１８年４月 分类号R275.9学校代号10572UDC610密级公开学号20152102049广州中医药大学GuangzhouUniversityofChineseMedicine博士学位论文血清胆汁酸谱变化对胆结石发病预测及证候研究学位申请人陈则旭指导教师姓名吕爱平专业名称中西医结合基础申请学位类型科学学位论文提交日期2018年4月 广蜊中薩藤大孿孿位论文簾劊性声稱＊本人癉１声＿，．所羅交翁參镱论变籩个人在辱师熟指麝下，截＆滋行谢究Ｘ．作街觀轉瓱龕果＊餘文申ａ饉．特鬅＿软注明１躍》内容料＊本嫌文不會任筒其黴个人鐵集摔ｓ鳋麓褰或鋼写过＿作蠢戚藥？対本窯鶬爾驚像ｍ纛蘩煲誠辑个入翱集＃＊地ｅ在文中ｍ嗔義方武标嚷弁致＿■＊本人攤金癱俱到本声明＿＿＿蘼由本人承捏？＿細繼磁ＳＭｔ＾ＳＢＪｆ９＞ｉ｜ｒ关于学位论变麵酿＿明本人宪金了鍵疒＿中羅厲大学有关傷鼸使用攀截婊文＿鏹歲＊薄囊学梭像霞纖ｆｔ釅家有褰部ｆｉｍ构迸交论文＿复萍傳靡电子飯，允许被査饞獬僭國＊本人饑絞广賴中ｍ霸大学胃ｍ将本攀位论文鯓金讎成■．内容親入有关数＿库邀１１＿氣可獄嚴羯，＆、鳙，＿其龜复镣手毅傷眷顧汇饞本学位谂文梦献作■名谂文寻麵名上ｆｓ難年丨月吆日 摘要目的：通过代谢组学技术检测胆结石患者血清胆汁酸代谢谱,经比对分析得出不同疾病状态、不同证型胆结石患者的胆汁酸代谢谱特征，并进行生物信息学分析，获得代谢标志物可能涉及的分子生物学网络通路,发掘可能预测胆结石发病的代谢物，为胆结石证候分类提供数据支持。方法：纳入胆结石患者30例归为GS组，按性别年龄配对健康人30例，归为H组，作为GS组的对照。纳入新发病胆结石患者未发病节点样本19例归为GS-0组，发病节点样本19例归为GS-1组，按性别年龄配对健康人19例归为H-O组，作为GS-0组的对照组；横向比较GS组与H组、GS-0组与H0组两组之间的胆汁酸代谢谱差异，对以上胆酸代谢谱差异结果进行生物信息学分析。纵向比较GS-1组与GS-0组胆汁酸代谢谱差异，对差异结果进行生物信息学分析。比较肝阴不足型胆结石患者和肝胆气郁型胆结石患者胆汁酸代谢谱差异，进行生物信息学分析。结果：1.GS组与健康人群相比，胆结石患者存在如下胆汁酸谱差异物10种。下调的差异性代谢物为熊脱氧胆酸（UDCA），上调趋势的差异性代谢物为甘氨胆酸（GCA）、猪脱氧胆酸（HDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）。GS-0与健康人群存在胆汁酸谱存在12种差异物，上调趋势的差异性代谢物为甘氨胆酸（GCA）、猪脱氧胆酸（HDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨鹅胆酸（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）、胆酸（CA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）。无论是胆结石患者还是胆结石疾病前状态人群，其血清胆汁酸代谢谱都与健康人群存在差别，两者共同的差异胆汁酸为GCA、HDCA、TCA、GDCA、GCDCA、HCA、TCDCA、7-KetoDCA，且波动趋向一致。GS-0与GS-1比较，存在9种差异性代谢物：上调趋势的差异性代谢物为猪脱氧胆酸（HDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）、猪胆酸（HCA）。下调趋势的差异性代谢物为鹅脱氧胆酸（CDCA）、石胆酸（LCA）、胆酸（CA）、甘氨猪脱氧胆酸（GHDCA）、脱氧胆酸（DCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）。通过横向对比可知，GCA、HDCA具有较大的VIP贡献值。纵向对比发现，HDCA是新发病胆结石患者未发病状态与疾病前状态的VIP贡献值较大的代谢差异物，从未发病状态到疾病状态，HDCA呈升高趋势。2.胆结石发病过程涉及生物学作用包括胆汁酸生物合成，中性途径，FXR/RXR通路激活、肝内胆汁淤积，生物分子网络涵盖：GATA3、GATA4、GATA6、GRB2、HNF4-α、KLF4、MYC、PAX1、POU5F1、SOX2、SOX7、TAF4、CEBPA、Sprr2，生物学改变包括胆汁酸合成障碍、I 体重异常、环磷腺苷合成异常、动脉粥样硬化。胆结石疾病前状态至疾病状态涉及上游调控因子，乳糖和降脂素。涉及生物学改变类型包括自身体重的变化、动脉粥样硬化、胆固醇代谢。3.胆结石肝阴不足证和肝胆气郁证相比较，肝胆气郁组CA、LCA水平上调，GHCA水平下调。胆汁酸谱差异物涉及生物学作用包括：FXR/RXR通路的激活、PXR/RXR通路的激活、胆汁酸生物合成，中性途径、肝内胆汁淤积，生物分子网络涵盖：GATA3、GATA4、GATA6、GRB2、HNF4-α、KLF4、MYC、PAX1、POU5F1、SOX2、SOX7、TAF4、CEBPA、Sprr2，及生物学改变包括：肝内胆汁淤积、胆汁酸合成障碍、环腺苷酸合成、结肠癌细胞激活、肌成纤维细胞激活、DNA损伤。肝胆气郁证与胆汁淤积相关性更大。结论：HDCA可能是贯穿胆结石发病过程中，能够预测胆结石发病机制的胆汁酸。胆结石肝阴不足证和肝胆气郁证相比较，肝胆气郁组CA、LCA水平上调，GHCA水平下调。代谢组学技术联合生物信息学技术是中西医结合探索疾病实质的有效研究方法。为早期预测胆结石发病提供依据。关键词：胆结石；证候；疾病预测；代谢组学；II ThestudyofPredictiononThepathogenesisofGallstonesbyChangesofSerumCholicAcidSpectrumandResearchofTCMSyndrome︒︒Specialty:ChineseandwesternbasicmedicineAuthor:ZexuChenTutor:AipingLuAbstractObjectiveBytheanalysisofserumbileacidmetabolismspectrumofgallstonespatients,inordertogetserumbileacidmetabolitesspectrumcharacteristicsandmetabolicmarkersmaybeinvolvedinthemolecularbiologyofnetworkfordifferentdiseasestates,differentTCMsyndroemofgallstonespatients，oexplorethepredictingendogenousmetabolitesofgallstones.MethodsClassifying30patientswithgallstoneswithmorethanoneyearcourseasGSgroup,accordingtoageandgendermatchedhealthy30caseswereclassifiedasgroupH.Classifying19sampleswithofnewonsetgallstonespatientsattheprediseasepoint，asGS-0group,accordingtoageandgendermatchedhealthy19caseswereclassifiedasgroupH-0.Classifying19sampleswithofnewonsetgallstonesatthediseasepoint，asGS-1group.GSgroupandgroupH,GS-0withH0setoftransversecomparisonofbileacidmetabolismspectraldifferences,andbioinformaticsanalysis.GS-1withGS-0groupownlongitudinalcomparisonofbileacidmetabolismspectraldifferences,andbioinformaticsanalysis.DivideallthegallstonepatientsintoliverYindeficiencysyndromeandliverqidepressionsymdromebydiagnosticcriteria,afterthematch,comparetwotypesofsyndromepatientswithgallstonesandanalysisthebileacidmetabolismspectraldifferencesbybioinformatics.Results1.Comparedwithhealthypeople,thereare10differencesinthebileacidspectrumoftheGSgroupgallstonespatients.UDCAhasdecreased,thelevelofGCA,HDCA,TCA,GDCA,GCDCA,TCDCA,7-KetoDCAhaveraised.ComparedwithhealthyIII people,thereare12differencesinthebileacidspectrumoftheGS-0groupgallstonespatients,thelevelofGCA,HDCA,TCA,GDCA,GCDCA,HCA,TCDCA,7-KetoDCA,CA,CDCA,DCA,LCAhaveraised.Whetherpatientswithgallstonesorpatientsinthegall-stoneprediseasestate,theserumbileacidmetabolismofthemaredifferenctwithhealthypeople,thesameconvergedandfluctuationsofbileacidareGCA,HDCA,TCA,GDCA,GCDCA,TCDCA,7-KetoDCA.ComparedwithG1-0group，thelevelofHDCA,7-KetoDCA,HCAintheGS-1grouphaveraised，thelevelofCDCA,LCA,CA,GHDCA,DCA,GDCAhavedecreased。Throughthehorizontalcomparison,theGCA,HDCAhavegreatcontributiontotheVIPvalue.LongitudinalcomparisonfoundthatHDCAisthelargermetabolicdifferenceswithhighVIPcontributionvalue,HDCAshowedatrendofriseinthediseasestates.2.theneutralbileacidmetabolismpathway,FXR/RXRactivationpathway,intrahepaticcholestasisinvolvetheprocess,Biologicalmolecularnetworksinclude:GATA3,GATA4,GATA6,GRB2,HNF4-alpha,KLF4,MYC,PAX1,POU5F1,SOX2,SOX7,TAF4,CEBPA,Sprr2,involvingrelateddiseasesinvolvingthebileacidsynthesisdysfunction,abnormalweightloss,adenosinecyclophosphatesyntheticanomaly,atherosclerosis.TheupstreamregulatoryfactorsinvolvedGallstonenewonsetdiseasestatetodiseasestatesincludelactoseandlipid.Thepathologyofbiologicalchangesandtypesincludeleanbodymass,atherosclerosis,cholesterolmetabolic.3.GallstonesliverYindeficiencysyndromeandliverqidepressionsyndrome,liverqidepressiongroupofCA,LCAlevelrise,GHCAleveldown.BileacidcontentinvolvestheclassicalpathwayofFXR/RXRspectraldifferences,PXR/RXRpathways,neutralbileacidmetabolismpathway,intrahepaticcholestasispathway,rBiologicalmolecularnetworksinclude:GATA3,GATA4,GATA6,GRB2,HNF4-alpha,KLF4,MYC,PAX1,POU5F1,SOX2,SOX7,TAF4,CEBPA,Sprr2,andtypesofthebiologicalchangesintrahepaticcholestasis,bileacidsynthesisdisorder,cyclicampsynthesis,coloncancercellactivation,musclefibroblastactivationandDNAdamage.Liverqidepressionsyndromewasmorestronglywithcholestasis.ConclusionHDCAmaybeabletopredictbileacidtothepathogenesisofgallstonediseasintheprocessoftheincidenceofgallstones.ComparingthepatientswithGallstonesliverYindeficiencysyndromeandpatientswithliverqidepressionsyndrome,thelevelofCA,LCAlevelofliverqidepressiongroupraise,GHCAleveldecrease.MetabonomicstechnologycombinationofIV bioinformaticstechnologyisaneffectiveresearchmethodofcombiningtraditionalChineseandwesternmedicinetoexplorecomplexpathogenesis.Providethebasisforearlypredictincidenceofgallstones.Keywords：gallstones;syndrome;diseaseprediction;Metabonomics;V 目录广州中医药大学学位论文原创性声明...................................II摘要................................................................IAbstract..........................................................III目录..............................................................VII引言................................................................1第一章文献研究......................................................31.1胆结石的现代医学研究........................................31.1.1胆结石病因............................................31.1.2胆结石的预测..........................................31.1.3胆结石的治疗..........................................41.2胆结石的中医研究............................................51.2.1胆结石相关证候研究....................................51.2.2胆结石及肝胆系疾病相关中医证候的胆汁酸代谢研究........51.2.3胆结石的中医药治疗、..................................61.3代谢组学研究................................................61.3.1胆结石的代谢组学研究..................................61.3.2中医相关证候的代谢组学研究............................71.4生物信息学研究..............................................71.4.1生物信息学与组学技术..................................81.4.2生物信息学技术与文本挖掘技术..........................81.4.3生物信息学技术与代谢网络技术..........................91.4.4生物信息学技术与基因芯片技术..........................91.5小结........................................................9第二章临床研究横向预测.............................................102.1研究概要...................................................102.2研究对象...................................................102.2.1样本来源.............................................102.2.2诊断标准...........................................102.3硏究方法...................................................112.3.1症状体征、实验室检査信息采集.........................112.3.2血液标本采集.........................................112.3.3血清代谢组学检测和分析...............................112.4数据整合、构建分子网络及网络映射研究.......................12VII 2.5数据处理及分析.............................................132.6研究人群的基线特征.........................................132.7UPLC-Q-TOF/MS稳定性和可重复性评价.....................142.8PCA与OPLS-DA分析结果.....................................152.9胆汁酸代谢谱差异物比较.....................................172.9.1GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物比较....................172.9.2GS-0组与H-0组胆汁酸代谢谱差异物比较................182.10胆结石胆汁酸谱差异代谢物分子网络生物学分析............192.10.1GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物生物学分析比较.........192.10.2GS-0组与H0组胆汁酸代谢谱差异物生物学分析比较......202.11小结......................................................21第三章临床研究纵向对比.............................................233.1研究概要..................................................233.2研究对象..................................................233.2.1样本来源.............................................233.3硏究方法...................................................233.3.1症状体征、实验室检査信息采集.........................233.3.2血液标本采集.........................................233.3.3血清代谢组学检测和分析...............................233.4数据整合、构建分子网络及网络映射研究.......................233.5数据处理及分析.............................................243.6研究人群的基线特征.........................................243.7UPLC-Q-TOF/MS稳定性和可重复性评价.....................243.8PCA和OPLS-DA分析结果.....................................253.9胆汁酸代谢谱差异物比较.....................................263.10胆结石胆汁酸谱差异代谢物分子网络生物学分析............263.11小结......................................................27第四章不同中医证型胆结石患者血清胆汁酸谱对比.......................284.1研究概要...................................................284.2研究对象...................................................284.2.1样本来源.............................................284.3硏究方法...................................................294.3.1症状体征、实验室检査信息采集.........................294.3.2血液标本采集.........................................294.3.3血清代谢组学检测和分析...............................29VIII 4.4数据整合、构建分子网络及网络映射研究.......................294.5数据处理及分析.............................................294.6研究人群的基线特征.........................................294.7UPLC-Q-TOF/MS稳定性和可重复性评价.....................304.8胆汁酸代谢谱差异物比较.....................................314.9不同证型胆结石胆汁酸谱差异代谢物生物信息学分析.........324.10小结......................................................34第五章讨论.........................................................355.1胆结石的危害及预测的必要性.................................355.2胆汁酸代谢对胆结石发病的影响和预测疾病的意义...............355.3代谢组学是研究胆汁酸代谢谱和中医证候的有效方法.............365.4代谢组学和生物信息学技术有助于探索疾病证候的发生发展因素...375.5胆结石疾病状态和胆结石疾病前状态的胆汁酸代谢谱与健康人群的相关对比...............................................................375.6新发病胆结石患者疾病状态和疾病前状态的胆汁酸代谢谱及相关比对...................................................................385.7肝阴不足证胆结石患者和肝胆气郁组胆结石患者的胆汁酸代谢谱及相关比对...............................................................395.8胆汁酸代谢谱研究是对传统中医理论的补充和创新...............40参考文献...........................................................42结语...............................................................50附录...............................................................51在校期间发表论文情况...............................................58致谢...............................................................59IX 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究引言疾病预测是预防医学的核心。疾病的发生、发展带来的后果不仅损害了个体的生理、心理健康与经济利益，也为社会带来沉重负担。适时、精准地预测疾病可以有目的地规避不利因素乃至致病因子，进而提高个体的生存质量，减轻个人和社会的负担。中医学自古以来就是重视预防医学及疾病预测的医学学科。“未病先防、已病防变、即病防复”，意味着掌握合理详尽的诊断学信息有助于认知疾病的演变规律，并提高疾病的诊疗水平，与现代医学的慢病防控理念具有一致性。《金匮要略》云：“见肝之病，知肝传脾，当先实脾”；《黄帝内经》的五运六气学说在中医基础理论的知见上，结合证候和脉诊，为运气预测传染病的发生、转归和致死进行了专篇论述，堪称疾病预测的医学圭臬。胆结石是临床常见病症，由于胆汁淤积，胆道感染或脂质代谢失调形成结石。胆结石致死率较低，但发病率较高。中国大陆胆结石发病率每10年增加约2倍，患病率约在10%左右。肥胖、年龄大于40岁和家族史都是胆结石发病的固定公共危险因素，女性、具有多次生育经历的妇女和某些特定的种族则是胆结石的高发病人群。胆结石与代谢异常疾病如肥胖、糖尿病等关系密切。虽然胆结石直接致死率不高，但极易影响患者的生存质量；同时，胆结石患者的胰腺炎、癌变等疾病的发病率较高，对个体健康具有极大的威胁。科学研究方面，依据目前的医学及生物学研究结果，可以规避已知的胆结石公共危险因素，但胆结石的预测和预防仍未实现标准化、数量化、具象化以及精确化。临床诊疗方面，对于胆结石的诊断技术已经相当成熟，但对于其预测指标的挖掘，治疗方案的合理化仍需要大量的基础与临床研究。能够精准预测及避免胆结石的发生与发展的意义更甚于诊断与治疗。随着科学技术的发展，代谢组学和生物信息学技术为筛选疾病转化标志物提供新思路和新方法，其利用高通量的检测和数据处理为手段，通过检测小分子代谢物的变化，以信息建模与系统整合为目标，能够如实地反映生物体系受外界刺激或遗传修饰的细胞或组织的代谢应答变化，将疾病预警实现可能。现代医学视角下的疾病预测，需要制定灵敏、真实、可靠的临床指标。代谢组学的诞生于发展无疑为筛选疾病病程潜在的生物标志物提供了可靠的方法。中医学的视角下疾病的再分类，以现代数据研究方法及代谢组学与中医学相结合，能够将抽象的中医学证候具象化，有助于了解疾病的发生、发展和变化规律，对疾病的预测、诊断与治疗大有裨益。胆汁酸是胆结石发病中的重要因子。人体血清各种胆汁酸比例的波动，含量与种属的变化，与胆结石的发病与转归关系密切，个别胆酸在临床上会作为胆结石的治疗药物。胆汁酸对肝胆疾病的诊断、鉴别诊断及病理研究价值重大。本研究拟以胆结石疾病自然发展规律为研究内容，以超高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱（Ultra-highPerformanceLiquidChromatography-QuadrupoleTime-of-Flight1 广州中医药大学2018届博士学位论文MassSpectrometry,UPLC-Q-TOF-MS）检测血清胆汁酸代谢谱为主要检测手段，将胆结石患者与健康人群行横向比较，将新发病胆结石患者未发病节点与健康人群行横向比较；将新发病胆结石患者未发病与发病节点行纵向比较。分析不同疾病状态、不同人群的胆汁酸谱特征，应用主成分分析法(PrincipalComponentsAnalysis,PCA)和正交偏最小二乘判别法(OrthogonalPartialLeastSquares-DiscriminationAnalysis,OPLS-DA)对检测获得的数据进行统计分析，基于以上分析结果，获得胆结石相关的潜在代谢标志物。同时将胆结石患者加以辨证分型分类，比较不同证候胆汁酸谱特征。以生物信息学技术分析胆汁酸谱特征代谢物的生物信息，筛选出可能利于胆结石早期诊断的标志性代谢物及分子标靶。将代谢组学结果、综合生物医学指标检测结果、中医证候信息进行分析，构建可视化胆结石中医证候代谢组学信息网络。2 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究第一章文献研究1.1胆结石的现代医学研究1.1.1胆结石病因胆结石（Gallstone,GS）由钙离子、胆红素、胆固醇和蛋白质沉积而来，是一[1]种常见病。中国大陆GS发病率每10年增加约2倍，患病率约在10%左右。胆结石是引起慢性胆囊炎的主要病因，GS及慢性胆囊炎患者除有胆绞痛发作外，也可表现有消化不良、对脂肪餐不耐受、腹胀等症状。国外流行病学研究表明其发病率占总人口[2][3]的9.03%，近75%的患者无明显症状。GS发病的危险因素涵盖：超重、高脂血症、[4][5][6]避孕药的使用、抑郁、饮用含铁质过高的饮用水。胆结石的发病与代谢病和非酒[7]精性脂肪肝密切相关。胆固醇结石约占胆石症的90%，由多因素综合作用形成，如[8]胆固醇过饱和、胆固醇加速成核。GS的形成与胆汁的主要成分胆酸(CholicAcid,CA)的代谢紊乱有关,胆汁约75%由肝细胞生成，25%由胆管细胞生成。CA是胆汁的主要成份，也是胆固醇在体内代谢的最终产物，占胆汁总固体量的50%~70%。GS患者几[9][10]乎都存在不同程度的胆汁酸代谢异常。人体血清中胆酸的种类和含量如果发生改变，胆固醇即不能维持微胶粒状态,逐渐形成结晶并析出，终致胆固醇结石。胆汁中脱氧胆酸(DCA，DeoxycholicAcid)比例升高时，肝脏倾向于分泌胆固醇饱和度较高的胆汁，使该类型胆汁的胆固醇较易从小管滤出；DCA比例升高时，抑制胆固醇合成限速酶的鹅脱氧胆酸(ChenodeoxycholicAcid,CDCA)比例下降，将加快胆固醇的[11]合成，增加胆汁成石性。有研究称，胆囊结石患者的甘氨鹅脱氧胆酸(GlycochenodeoxycholicAcid,GCDCA)下降，甘氨脱氧胆酸(GlycodeoxycholicAcid,[12]GDCA)的比例明显上升。发生胰岛素抵抗(InsulinResistance,IR)时，脂质代[13]谢紊乱，如胆盐、胆固醇、卵磷脂三者比例失调，使发病率升高。同时，胆固醇生[14]物合成酶还原酶被激活，胆汁酸肠肝循环的限速酶7α-羟化酶被抑制，促使胆汁胆固醇升高，趋向饱和。IR状态下的高水平胰岛素还可激活LDL受体，促使低密度脂蛋白胆固醇(LowDensityLipoproteinCholesterin,LDL-C)进入肝脏，增加肝脏分[15]泌胆固醇饱和度较高的胆汁，使胆固醇结石成石性升高。胆囊动力减弱也是胆结石形成的主要原因之一，直接促进胆囊内结石的形成，而结石形成后又进一步损害胆囊[16][16][17]收缩功能。胆色素结石因胆色素集聚而形成，胆汁成分中未结合胆红素和钙离子浓度积大于其条件浓度积常数时，过饱和的胆红素钙将从胆汁中沉淀出来；提高胆汁酸浓度，干扰未结合胆红素内氢键形成，可降低胆红素钙沉淀形成的机率。黑色素结石的形成与慢性溶血状态、肝硬化胆囊纤维化有关，棕色素结石的形成与慢性细菌或寄生虫感染有关。1.1.2胆结石的预测[18]超声诊断与CT是胆结石普适性的诊断方法。血清酶联合检测GS患者5′-核苷3 广州中医药大学2018届博士学位论文[19]酸酶（5-NucleotideEnzyme,5′-NT）较肝病患者增高。研究表明，肝外严重胆汁淤积导致胆结石患者的胆汁CA19-9水平较胆管癌患者增高，血清CA19-9（Chlangiocarcinoma19-9）水平常用于检测胆管癌。TG、高密度脂蛋白（High-Density[20]Lipoprotein,HDL)and直接胆红素(DirectBilirubin,DBIL)。癌胚抗原（CarcinoEmbryonieAntigen,CEA）、CA19.9联合检测可提高肝内胆管结石合并胆管癌的术前[21]检出率,对肝内胆管结石的鉴别诊断可能有一定帮助。通过对胆结石患者手术前胆石超声回声灰阶直方图分析，预测胆石的化学类型。术后对胆结石进行红外光谱分析，将不同化学类型的胆石与直方图的类型相比较。不同胆结石化学类型和直方图图形（高峰型、尖峰型、底圆峰型、底平峰型、多峰型和高圆峰型）可能存在一定关联。早期研究发现，胆固醇结石的典型特征可被超声检测所探测，超声检测对胆结石的敏[22]感性达72.90%，特异性100%。基于该项检测方法的成熟，诊断胆固醇结石不需要再使用口服胆囊造影术。通过数据可纳入胆结石患者症状和体征的频率为正确识别,[30]胆结石胰腺炎患者的82%。运用时间序列自回归移动平均模型能够较好地拟合及预[31]测胆结石病月发病率,预测精度较高。虽然关于胆结石预测的文献渐有报道，但至今仍无具体的观测指标以预测胆囊结石发病。1.1.3胆结石的治疗1.1.3.1药物治疗CDCA作为天然原生胆汁酸，是鸡，鸭，鹅等胆汁中的主要有机化合物之一。在临床实践中，鹅去氧胆酸是治疗胆固醇结石的药物。口服鹅去氧胆酸以扩大胆汁酸池，减少肝脏胆固醇的分泌。鹅去氧胆酸对脂质代谢具有广泛的影响，包括降低LDL的血[23]浆清除率。接触溶石是通过经皮经肝胆囊穿刺置管置入辛酸甘油单酯(GlycerolMonooctanoin,GMOC)、甲基叔丁醚(MethylTertiaryButylEther,MTBE)、二甲基亚砜(DimethylSulfoxide,DMSO)等药物进行治疗，些药物可以缓解胆结石的疼痛，[24][25]过其化学成分对人体起到镇定和麻醉的作用。肖震宇纳入90例手术治疗的肝胆管结石患者，评估其术后口服牛磺熊去氧胆酸(TauroursodeoxycholicAcid,TUDCA)预防结石复发的有效性及临床价值。发现术后2年TUDCA组胆管结石复发率为6.7%,对照组为26.7%；TUDCA组再手术率为2.2%,对照组为20.0%。1.1.3.2手术治疗临床上经常采用传统开腹手术来治疗胆结石，是一种较为成熟、安全的手术方式，可以解除梗阻、切除病灶、清除结石、保持胆汁排放流畅。开腹手术包括：例如胆总管探查、取石、引流术，胆囊造口术，胆囊切除术，胆叶切除术，肝胆管狭窄与重建[26]术。腹腔镜胆总管切开取石T管引流术是继腹腔镜胆囊切除术之后出现的一种治疗方法，是在腹腔镜监视下，将胆道镜插入并进行取石，手术结束后放置T管引流。该种手术不仅具有腹腔镜的良好视野，同时还能够对硬镜无法进行的腔内操作进行很好的完成，在取得与开腹手术相媲关的治疗效果的同时，使患者在不需要开腹就能够进4 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究[28]行治疗。经电子十二指肠镜于术的发展基础是内镜逆行胆胰管造影，主要是通过经口将电子十二指肠镜插入，找到十二指肠乳头后，患者胆管内进行造影，将乳头括约肌用特制切开刀切开并进行取石，如果患者的结石较大，则可以先进行碎石然后取出[29]。1.2胆结石的中医研究“凡十一脏，取决于胆也”是中医学对胆腑生理功能的高度概括。胆藏“精汁”，由“肝之余气”化生，借小肠以为出路，是胆汁肠肝循环的古代中医认识。中医根据其胆结石的临床表现归属于“胆胀”、“胁痛”、“腹痛”、“黄瘦”等证范畴。《诸病源候论》曰：“胸胁痛者,由胆与肝及肾之支脉虚为寒气所乘故也”。又言“气、水、饮停滞，结聚成癖，因热气相搏，则郁蒸不散，故胁下满痛而身发黄，名曰癖黄”。认为胁痛的发生脏腑除肝胆外，还与肾脏有关，气滞、瘀血、砂石等外邪阻滞胆道，胆汁失于常道而外溢，致肌肤身目发黄。现代中医认为，胆石症形成的病因主要有情志因素、瘀血阻滞、饮食不节、寒温不适、蛔虫上扰等，上述致病因素导致气血无法顺畅的运行，湿热蕴结中焦，肝失疏泄，胆汁郁积，湿热日久不去，煎熬成石。1.2.1胆结石相关证候研究[32]尤海玲对62例GS患者进行辨证，肝胆湿热型最高达33例，肝胆气滞型15例，[33]瘀血阻滞型14例。李辉的辩证分型方案为分为肝胆湿热型、肝郁气滞型、胆失疏[34]泄型、肝阴不足型。刘志新等纳入1133例胆总管结石患者，经腹部超声、CT、MRCP检查，ERCP乳头切开取石，分析发病年龄、结石部位、大小、数目与中医证型特点的相互关系。肝血亏虚证、肝郁气滞证、肝气虚证、肝阳不足证等年长患者常见证型与[35]胆总管结石发生关系密切。李立等采用文本挖掘方法，采用敏感关键词频数统计的数据分层算法，挖掘胆结石的证候及中药。发现胆结石肝胆湿热、肝郁气滞为最主要[36]证候，肝郁脾虚及气滞血瘀为常见证型。顾晔斌等通过回归性分析既往流行病学调查资料，发现胆结石合并急性胆囊炎以肝胆湿热证型多见；肝内胆管结石多以肝阴不足证型为主；日常作息对胆结石影响较大：肝胆湿热证较常见于饮食不规律，肝阴亏虚证型在饮食不规律者不多见；气阴不足证型常见于嗜烟患者易表现为。运动时间超过1h者胆结石发病率较低。1.2.2胆结石及肝胆系疾病相关中医证候的胆汁酸代谢研究[37]魏德全在研究气阴两虚证胆色素结石及胆固醇结石患者血清CA过程中发现：气阴两虚胆固醇结石患者TG/CA比值下调，气阴两虚胆红素结石组患者TBIL及游离胆红素(FreeBilirubin,FBIL)水平升高，血清钙离子及β-葡萄糖醛酸苷酶(β-Glucuronidase)上升。肝郁气滞型胆结石患者血清总胆汁酸水平下降，成纤维细胞生长因子19（FibroblastGrowthFactor，FGF19）及小异源二聚体伴侣受体表达升[38]高，氨基末端激酶（JunN-TerminalKinase，JNK）信号通路激活。同时，肝郁气[39]滞型GS患者磷脂浓度下降，胆汁胆固醇饱和度上升，导致胆结石生成趋势升高。5 广州中医药大学2018届博士学位论文[40]湿热证型下总胆汁酸(TotalBileAcid,TBA)水平上升，甘胆酸水平上升。湿热中[41]阻证患者总胆红素、间接胆红素较肝郁脾虚证、肝肾阴虚证高。湿热证与牛磺鹅脱氧胆酸（TaurochenodeoxycholicAcid,TCDCA）、猪脱氧胆酸（UrsodeoxycholicAcid,UDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸-3-葡萄糖醛酸、甘氨鹅脱氧胆盐-3-硫酸盐等胆汁酸[42]成分密切相关。脾肾阳虚证患者TBIL、结合胆红素(Conjugatedbilirubin,CBIL)[43]水平高于湿热蕴结证、脾虚痰湿证、瘀血内阻证、肝肾阴虚证及肝气郁结证；湿热蕴结证胆汁酸水平高于脾肾阳虚证、瘀血内阻证、脾虚痰湿证、肝肾阴虚证及肝气郁[44]结证。脾肾阳虚证、脾虚痰湿证患者肝脏合成CA功能较差，脾肾阳虚证与湿热蕴[45]结证患者存在明显的胆红素代谢障碍。阴虚证型的间接胆红素(Indirect[46]Bilirubin,IBIL)及TBA水平中最高，湿热证次之。1.2.3胆结石的中医药治疗、中医治疗胆结石以“急则治标、缓则治本、辨证施治”原则，对症治疗，疏缓症[47]状，调理脏腑、疏肝利胆、化石排石，调适疏泄通降。利胆排石汤能够疏通肝脏的气血瘀滞，通下利胆。金钱草、郁金、茵陈、白芍、海金砂、姜黄、大黄具有促进胆囊舒张的功能；陈皮、谷芽具有促进胆囊舒张的作用；麦芽、积实兼具胆囊收缩舒张功能；甘草能够调和各味药物。这些药物共同作用，能够加强胆囊收缩，促使胆汁分泌，降低胆道压力，利于排石过程的进行，还能增加胆汁酸在胆汁中的含量。在胆结[48]石未对胆囊功能产生影响时，不应草率地进行胆囊切除。利胆排石汤对胆结石的治疗效果高于常规药物治疗的效果，且对肝脏正常功能产生干扰的概率小，并且具有降[49][50]血脂作用。王蒨等采用熊去氧胆酸片干预胆总管控查+T管引流术或鼻胆导管引流术后的原发性胆管结石患者。发现清利湿热、活血化瘀的中药利胆灵联合应用熊去氧胆酸能增加胆色素结石患者引流术后胆汁中的总胆汁酸及结合型胆汁酸的含量,并且能有效扩大机体胆酸池，从而降低胆汁成石性。利胆灵组以及联合组可明显降低胆汁中内源性β-葡萄糖醛酸酶活性。其可能机制在于利胆灵联合应用熊脱氧胆酸能增加TBIL的排出，降低游离胆红素（UnconjugatedBilirubin，UCB）和Ca2+浓度，从而降低胆汁成石性。1.3代谢组学研究1.3.1胆结石的代谢组学研究代谢组学是借助于液相色谱质谱法（LiquidChromatography-MassSpectrometry,LC-MS）、气相色谱质谱法（GasChromatography-MassSpectrometry,GC-MS）、超高效液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱的方法(Ultra-highPerformanceLiquidChromatography-QuadrupoleTime-of-FlightMassSpectrometry,UPLC-Q-TOF-M)及核磁共振（NuclearMagneticResonance,NMR）等高通量、高分辨、高灵敏度的现代仪器分析手段，对生物体液如血浆、尿液、组织液等内源性代谢物进行定性、定量研究，并结合模式识别的信息学技术，分析得出生物体在不同状态下的终端代谢物6 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究差异和相应的代谢谱峰特点，最终能反映出生物体在特定阶段、特定状态下整体功能变化的学科。通过测定血清结合胆汁酸浓度了解胆结石时胆汁酸代谢的变化。测定血[51]清结合胆汁酸对于胆结石的治疗及早期预防有临床应用价值。徐雷鸣等应用高效液相色谱法，定量测定20例胆结石病人和15例正常对照者血清中7种结合胆汁酸含量。胆结石的形成与胆汁酸代谢紊乱密切相关，CA/CDCA比值及DCA含量升高，可作为胆结石形成的危险信号。利用核磁共振氢谱（1HNuclearMagneticResonancehydrogen[52]spectrum，1HNMR）技术可以更好地研究探讨实验兔胆囊结石血浆代谢组学特征。其优势在于可实现无偏向、无创性的检测，擅长研究代谢产物中的复杂成分，适合每个个体代谢成分。胆结石模型豚鼠血清柠檬酸、丙酮、谷氨酸、甘氨酸、赖氨酸、蛋[53]氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸水平明显升高，乳酸、丙酮酸和谷氨酰胺降低。1.3.2中医相关证候的代谢组学研究[54]赵慧辉等对冠心病心绞痛血瘀证进行了蛋白质组学研究，结果初步发现结合珠蛋白β链、邻苯二甲酸二丁酯（DibutylPhthalate,DBP）、血红蛋白β链（HemoglobinBeta-chain,HBB）、甲状腺素运载蛋白、载脂蛋白I（Apolipoprotein-Ⅰ,ApoA-Ⅰ）、载脂蛋白Ⅳ(Apolipoprotein-Ⅳ,ApoA-Ⅳ)在心绞痛血瘀证患者和正常人血浆中存在差异表达，代谢组学结果提示冠心病不稳定性心绞痛血瘀证特征表现为炎症反应、血脂、血氧代谢紊乱。代谢组学可能是研究中医学证本质的有效方法对心力衰竭肾阳虚证患者GC/MS代谢组学研究方法研究，能将肾阳虚证组、非肾阳虚证组和正常组3者区分，同时还发现慢性心力衰竭患者与正常人存在柠檬酸、丙氨酸、[55]3-甲基戊烯二酸、丙胺、组胺5种差异性代谢物质。通过通过高效液相色谱-飞行时间质谱技术(HighPerformanceLiquidChromatography-QuadrupoleTime-of-FlightMassSpectrometry,HPLC-TOF/MS)技术发现，高血压病肝阳上亢患[56]者组机体相关代谢发生显著变化。主要包括氨基酸、游离脂肪酸、神经鞘氨醇等。[57]陈威妮采用GC/MS进行代谢组学检测，应用PCA和PLS-DA进行分析,寻找糖尿病前期、2型糖尿病与健康对照组之间，气阴两虚证与无症状组之间差异性代谢产物,得到特定疾病和中医证候状态下内源性代谢标记物。糖尿病前期组与健康对照组比较，上调的代谢产物有6个：2-羟基丁酸、尿素、葡萄糖、棕榈酸、半乳糖、硬脂酸；下调的代谢产物1个：甘氨酸。2型糖尿病组与健康对照组比较，上调的代谢产物有14个：2-羟基丁酸、3-羟基丁酸、尿素、丙三醇、苯丙氨酸、鸟氨酸、葡萄糖、酪氨酸、棕榈酸、半乳糖、unknown(rt39.7)、亚油酸、油酸、硬脂酸；下调的代谢产物有2个：甘氨酸、赤藓糖。1.4生物信息学研究证候具有多变性、模糊性、复杂性、隐匿性的特点，很难通过单因素分析解释清楚，因此可以借助生物信息技术对其进行分析，分析病证相关机制，建立反映中医药整体特色的新策略和新方法。7 广州中医药大学2018届博士学位论文1.4.1生物信息学与组学技术[58]沈姗姗通过对神经性耳鸣肾虚证患者的血清终端代谢物进行UPLC-Q-TOF-MS检测和分子网络生物学分析，获得耳鸣肾虚证相关的终端代谢物谱特征和代谢标志物可能涉及的分子生物学网络通路。发现神经性耳鸣肾虚证患者与健康人群之间存在的内源性差异代谢物：谷氨酸、5-羟色胺、牛磺酸、8-羟基鸟嘌呤、乳清酸，且上下调方向变化一致，表明5个差异代谢物有可能是肾虚证耳鸣发病中具有更高预测指示价值的潜在代谢标志物。分子网络生物学共同涉及的经典生物学通路：钙信号通路，嘧啶核苷酸的从头合成,尿苷-5’-磷酸生物合成和背侧核神经元神经疼痛信号通路，可能[59]是耳鸣发病过程中具有重要作用的潜在生物学通路。牛旭艳以热证类风湿性关节炎(RheumatoidAthritis,RA)为切入点，综合运用定向文本挖掘、PubChem.小分子化合物数据库检索、临床典热证RA患者外周血CD4+T细胞基因组学检测以及IngenuityPathwayAnalysis(IPA)网络构建等研究方法。通过基因芯片技术，得到RA热证与正常人比较的差异基因21个。通过IPA软件分别构建RA热证和对证中药靶蛋白的分子相互作用网络。发现RA热证的分子网络和对证中药靶点的分子网络所涉及的共同的生物学通路：GM-CSF信号通路，CTLA4信号通路，T细胞受体信号通路及辅助T细胞中的CD28信号通路可能就是对证治疗RA热证“药-证对应”的分子生物学机制[60]之。李梢将病与证的关系置于生物分子网络的背景下进行比较分析，并为此提出了融合文献挖掘与基因表达谱分析、构建特定病证生物分子网络的LMMA方法。该方法也是用于分析同病异证、异病同证分子基础的前提条件。寒热证生物分子网络与血管新生生物分子网络之间存在共同的信号通路，即病与证在网络层面存在结合点。同时寒热证候的网络标志还可有效区分血管新生的不同分子机制。1.4.2生物信息学技术与文本挖掘技术[61]生物信息学技术常与文本挖掘技协同使用。张慧芹应用课题组自行研发的文本提取工具，依照文本数据采集、数据格式转化及建库、数据挖掘及分析、数据可视化呈现4个步骤对非酒精性脂肪性肝病相关文本信息进行分析处理。结果得出：非酒精性脂肪性肝病的核心证型为肝气郁结、痰瘀互结、湿热内蕴、肝郁脾虚和肝肾阴虚。干预非酒精性脂肪性肝病的核心药物有丹参、山楂、泽泻、柴胡、白术、何首乌和郁金，核心方剂包括膈下逐瘀汤、四逆散、柴胡疏肝散和二陈汤。采用文本挖掘和生物[62]信息分子网络分析是探索疾病异病同治基础的有效方法。周珂分析高尿酸血症和非酒精性脂肪肝中医证候分类及用药规律并进行可视化，提取两病共同的证候分类及其相应的中药配伍组合。检索中药配伍组合活性成分对应的人类靶蛋白和两病的相关基因;在分子网络分析平台分别构建靶蛋白和基因分子网络，通过网络映射分析，找到中药配伍组合治疗两病相关的通路和高连接分子。痰瘀互结证是两病最常见的共同证型，方证对应，中药配伍组合(丹参、大黄、茯苓、泽泻、当归、白术)是治疗两病共用使用最多的药物；这些药物可能通过调控5个分子(26S蛋白酶体，细胞外信8 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究号调节激酶1/2，核转录因子-κB，泛素C和蛋白激酶B和1个生物学通路(肝X受体/维甲酸X受体激活通路)对两病发挥协同治疗效应。1.4.3生物信息学技术与代谢网络技术[63]苏式兵认为从基因组/元基因组信息构建可能的代谢网络技术，用网络简化分解，网络自动延展收缩，以及网络比对，相似性打分等系统生物学方法分析证候不同时期网络特性与异同，以代谢组学代谢特征为探针，反推映射到代谢网络上的逻辑关系，寻找证候生物学代谢特征谱，并在基因组学或蛋白组学上获得支持验证。1.4.4生物信息学技术与基因芯片技术[64]杨泽民利用BRBArrayTools和IPA软件对慢性浅表性胃炎脾虚证和健康人胃黏膜DNA芯片数据分析发现75%DE1差异表达基因与物质能量代谢直接相关，除PARP1外，所有差异表达基因全部下调。“脾虚证基因表达总体以下调为主”该特征与利用“Ratio值＋NCB网络注释”的方法分析的结果一致，但是在基因数量和种类上存在明显的差异，由筛选差异表达基因的方法以及样品数量不同导致的。1.5小结代谢组学通过检测血液、尿液和唾液等代谢产物，进行与正常人群的差异分析来了解体内的异常代谢状态，从而分析细胞、组织和器官的变化，与中医整体辨证，见微知著的理念契合。现已知，血清胆汁酸代谢谱的变化特征不仅可以作为胆结石发病诊断的佐证，也是作为先天性胆管扩张、肝炎的发病的客观证明。全面分析胆结石患者血清胆汁酸代谢谱可为胆结石的及早诊断与防治提供理论依据与数据支持，而完成这一研究依托于以超高效液相色谱分析方法为首的代谢组学技术与生物信息学技术。同步依托于代谢组学技术证候内在代谢探究与疾病再分类为胆结石疾病动态提供科学可靠的数据基础，同时也是对胆结石的病证机制理论体系的完善。实现胆结石的预测，不仅会为社会及个人减少负担，随着医疗事业的发展，胆汁酸代谢谱必将运用于更多疾病的预防、诊断与治疗。9 广州中医药大学2018届博士学位论文第二章临床研究横向预测2.1研究概要本次研究采用非盲、对照的设计实验原则。比较胆结石患者与健康人群的胆汁酸代谢谱差异；比较新发病胆结石患者未发病节点与健康人群的胆汁酸代谢谱差异，获得可参考预测胆结石发病的胆汁酸代谢谱特征及相关的分子通路网络。2.2研究对象2.2.1样本来源胆结石患者和健康人群来自北京某社区医院体检人群。纳入2016年已发病患者30人，留取2016年时样本30例作为GS组；另一部分纳入2015年未发病，2016年新发病的胆结石患者19人，留取其未发病节点血清样本19例作为GS-0组，留取其发病节点血清样本19例作为GS-1组。正常对照组人群样本纳入50例，即50人。所有纳入患者均符合相应的西医诊断标准、病例纳入标准。2.2.2诊断标准2.2.2.1胆结石诊断标准[65]主要参考中华医学会外科学分会胆道外科学组.肝胆管结石病诊断治疗指南。（1）持续的右上腹或中上腹疼痛，伴有右肩背部放射性酸痛，饱餐或进食油腻食物后诱发伴疼痛加重。（2）伴有恶心、返酸、暧气、腹胀等消化不良症状,体格检查提示墨菲氏征阳性或伴有肝区叩击痛。（3）经B超或CT影像学检查提示胆囊结石或合并胆总管结石，临床有症状或无症状。2.2.2.2中医证型诊断标准主要参照中华中医药学会提出并发布、中国中医药出版社出版《中医外科常见病[66][67]。诊疗指南》，2002年中国医药科技出版社《中药新药临床研究指导原则》肝胆气郁证右胁胀痛或心下痞满，疼痛、闷胀因情志变化而增减，胸闷不舒，纳食减少，嗳气频作，大便干结或艰难，脉弦。肝阴不足证头晕目眩，五心烦热，口干咽燥，胸胁疼痛，悠悠不休，遇劳加重，舌红尖刺，中有裂纹或见光剥或脉弦细带数。2.2.2.3正常对照组选择标准经详细询问病史、体格检查及胸片、B超、心电图、血尿常规、肝肾功能、血糖等理化检查，评定无重大系统疾病。2.2.2.4纳入标准10 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究（1）年龄在30—75岁之间；（2）符合胆结石诊断标准；（3）签署同意参加本实验的书面知情同意书。2.2.2.5排除标准（1）诊断为胆囊穿孔并发急性腹膜炎、急性梗阻性化脓性胆管炎、胆源性胰腺炎者急性单纯性胆囊炎、急性化脓性胆囊炎、急性坏疽性胆囊炎、胆囊穿孔并发弥漫性腹膜炎者。（2）合并心、肝、肾、脑、肺等器官严重的原发性疾病（如哮喘、癌症、艾滋99病）或影响其生存的严重疾病者；血白细胞<4×10；血小板计数0.05。（如表1、表2）所示。故皆具有可比性。13 广州中医药大学2018届博士学位论文表1GS组与H组人群基线指标GSHPGender（M/F）14/1616/140.4Age50.32±6.1648.73±5.250.68BMI25.34±3.5924.08±2.060.11FGLU6.02±1.255.4±0.540.6TC5±0.954.73±0.660.19TG1.82±1.941.03±0.310.1HDL1.29±0.381.38±0.30.18LDL2.97±0.72.91±0.510.57Creatinine65.4±14.7163.07±10.250.61BUA302.63±75.33288.47±65.440.44ALT19.47±10.7418.63±7.870.81AST22.5±8.7521.8±4.210.64AFP7.66±1.137.62±1.240.84CEA7.32±1.126.65±0.720.31表2GS-0组与H0组人群基线指标GS-0H0PGender（M/F）11/811/80.63Age54.1±10.8946.89±9.160.15BMI24.27±3.5422.89±1.40.6FGLU5.71±0.665.38±0.50.11TC4.9±0.834.77±0.70.67TG1.76±1.070.98±0.360.1HDL1.41±0.631.42±0.330.39LDL2.89±0.652.98±0.530.58Creatinine63.26±9.5763.95±10.760.69BUA319±71.41299.53±70.270.17ALT19±7.3717.68±8.820.54AST20.95±6.2321.11±4.310.93AFP7.91±0.877.66±1.430.86CEA7.15±1.026.51±0.70.32.7UPLC-Q-TOF/MS稳定性和可重复性评价对每个血清样本测定6次重复性评估，抽取5个色谱图检测并结合多种化合物的各自具备的极性和质核比特征，结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD范围是化0.06-1.03%，相对峰面积的RSD范围是5.15-13.62%。对于液质联用系统的稳定性评估主要通过QC样本测试完成。所抽取QC样本峰面积、保留时间和质量精度稳定，各共有峰的相对保留时间的RSD范围0.05-1.13%，相对峰面积的RSD范围是4.90-14.31%，质量精度范围在0.14E-04%-0.76E-04%。。14 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究2.8PCA与OPLS-DA分析结果GSVSH(OPLS-DA)12H268H1664H11GS20GS11GS9H24GS142GS21GS15GS2GS1H9H7GS8GS18GS22GS26H2GS25H29H25H10H8H40GS6GS12GS3H28GS10H5GS19GS23GS16GS24GS5GS29H30H27H21H6H1H15GS17GS27GS4GS28H3H14H12GS7H17H18H13-2H22H20H19GS13H23GS30-4-6-5-4-3-2-101231.08425*t[1]R2X[1]=0.0683R2Xo[1]=0.159Ellipse:Hotelling'sT2(95%)图一GS组与H组比较：OPLS-DAGSVSH(OPLS-DA)0.80.60.4UDCACDCDCAA12-KetoLCACA0.2TLCAMCATUDCATHDCAGLCAapoCA12-KetoCDC0THCATBAIso-LCA6-KetoLCAGUDCATDCALCA-0.27-KetoDCAHCAGHCA7-KetoLCANorDCAGHDCAHDCA-0.4TCDCATCAGCDCAGDCA-0.6GCA-0.8-1-0.4-0.3-0.2-0.100.10.20.3p[1]R2X[1]=0.0683图二GS组与H组比较：S-plot图15 广州中医药大学2018届博士学位论文GS-0VSH0(OPLS-DA)12GS010108GS01564H072GS018GS08H06H014H011GS02GS04GS017H018GS019H09H04H016H03H020GS011H013H01GS07H015GS016GS03GS05H017-2H010H05H08H019GS09GS01GS012GS06H012-4GS013GS014-6-8-5-4-3-2-1012341.04284*t[1]R2X[1]=0.0874R2Xo[1]=0.209Ellipse:Hotelling'sT2(95%)图三GS-0组与H0组比较：OPLS-DA图GS-0VSH0(OPLS-DA)0.80.60.40.212-KetoLCAGLCATHCA0MCAGHDCAGHCAapoCATHDCAIso-LCAUDCA-0.26-KetoLCAGDCADCATDCA7-KetoLCA12-KetoCDCGCDCATCDCATUDCATLCA-0.4CDCANorDCA7-KetoDCAGUDCALCACAHCATCATBA-0.6HDCAGCA-0.8-1-0.4-0.3-0.2-0.100.10.20.3p[1]R2X[1]=0.0874图四GS-0组与H0组比较：S-plot图应用主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘判别式（OPLS-DA）各对GS组与H组，GS-0组与H0组的血清样本数据进行模式识别和判别分析。结果提示模式图能够明显区别出两组的分组趋势,表明GS组与H组、GS-0组与H0组的胆汁酸代谢物谱不同，由此可印证胆结石人群与健康人群胆汁酸谱存在不同。胆结石未发病节点人群与健康16 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究人群胆汁酸谱亦存在不同。2.9胆汁酸代谢谱差异物比较2.9.1GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物比较进一步通过高分辨率质谱扫描得到的质核比(m/z)，并在自建标品库、NIST化rary2005、LECO/FiehMetabolomicsLibrary、HMDB(http://www.hmdb.ca/)进行检索验证，并利用SIMCA-P14.1的VIPprediciton功能计算各代谢物的VIP值，即表示代谢物在各组里的重要程度，最终取VIP＞1者，罗列差异代谢物如图及表所示。结果表明：和健康人群比较，胆结石患者存在胆汁酸谱差异物9种。下调的差异性代谢物为熊脱氧胆酸（UDCA），上调趋势的差异性代谢物为甘氨胆酸（GCA）、猪脱氧胆酸（HDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）。GSVSH(OPLS-DA)21.510.50VarID(Primary)图五GS组与H组比较：VIPprediction分值表3GS组与H胆汁酸代谢谱差异物分子结构分子量名称缩写名称ID（NCBI）变化趋势C26H43NO6465.631GCAGlycocholicacid10140升高C24H40O4392.58HDCAhyodeoxycholicacid5283820升高C26H43NO7S515.706TCAtaurocholicacid6675升高C26H42NNaO5471.614GDCAglycodeoxycholicacid16760472升高glycochenodeoxycholicC26H43NO5449.632GCDCA12544升高acidC24H40O5408.579HCAhyocholicacid92805升高taurochenodeoxycholicC26H45NO6S499.707TCDCA387316升高acidC24H38O5406.5637-KetoDCA7-Ketodeoxycholicacid188292升高C24H40O4392.58UDCAursodeoxycholicacid31401降低17 广州中医药大学2018届博士学位论文2.9.2GS-0组与H-0组胆汁酸代谢谱差异物比较进一步通过高分辨率质谱扫描得到的质核比(m/z),并在自建标品库、NIST化rary2005、LECO/FiehMetabolomicsLibraryW及HMDB(http://www.hmdlxca/)进行检索,并利用SIMCA-P的VIPprediciton功能计算各代谢物的VIP值，最终取VIP＞1者，罗列差异代谢物如图及表所示。结果表明：新发胆结石患者未发病节点和健康人群比较胆汁酸谱存在12种差异物，上调趋势的差异性代谢物为甘氨胆酸（GCA）、猪脱氧胆酸（HDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨鹅胆酸（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）、胆酸（CA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）、石胆酸脱氧胆酸（LCA）。GS0VSH0(OPLS-DA)1.81.61.41.210.80.60.40.20VarID(Primary)图六GS-0组与H0组比较：VIPprediction分值表4GS-0组与H0胆汁酸代谢谱差异物分子结构分子量名称缩写名称ID（NCBI）变化C24H40O4392.58HDCAhyodeoxycholicacid5283820升高C26H43NO6465.631GCAGlycocholicacid10140升高C26H43NO7S515.706TCAtaurocholicacid6675升高C26H43NO5449.632GCDCAglycochenodeoxycholicacid12544升高C26H45NO6S499.707TCDCAtaurochenodeoxycholicacid387316升高C26H42NNaO5471.614GDCAglycodeoxycholicacid16760472升高C24H40O5408.579HCAhyocholicacid92805升高C24H38O5406.5637-KetoDCA7-Ketodeoxycholicacid188292升高C24H40O4392.58CDCAChenodeoxycholicacid10133升高C24H40O5408.579CAcholicacid221493升高C24H40O3376.581LCAlithocholicacid9903升高C24H40O4392.58DCAdeoxycholicacid222528升高18 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究2.10胆结石胆汁酸谱差异代谢物分子网络生物学分析2.10.1GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物生物学分析比较以各差异性代谢物名称作为关键词，在NCBI(http://www.pubmed.com/)HMDB(http://www.hmdb.ca/)、KEGG(http://www.kegg.jp/)搜索代谢物ID号，并登记制表。将胆汁酸谱差异物ID号Excel表格格式导入IPA生物软件进行分析，构建其内在关联生物分子网络和主要涉及的生物学功能。胆结石患者和健康人群胆汁酸谱差异物涉及生物学作用为胆汁酸生物合成，中性途径（BileAcidBiosynthesis,NeutralPathways），法尼醇X受体/维甲酸受体通路的激活（FXR/RXRActivation）、肝内胆汁淤积（HepaticCholestasis），涉及生物学分子网络如图四所示，涵盖GATA转录因子家族的GATA3、GATA4、GATA6，生长受体因子（GrowthFactorReceptorBoundprotein2,GRB2）、肝脏核因子4α(HepatocyteNuclearFactor4-alpha,HNF4-α)、Kruppel样因子4（Kruppel-LikeFactor4，KLF4)、骨髓细胞瘤致癌基因(MyelocytomatosisOncogene，MYC)、配对盒基因-1（PairedBox1,PAX1）、POU5F1(POUdomain,class5,transcriptionFactor1,POU5F1)、性决定基因SOX(SRY(SexdeterminingRegionY)-box)家族的SOX2、SOX7、TAF4、增强子结合蛋白-α(Enhancerbingdingprotein，CEBPA)、富脯胺酸小蛋白（Smallprolinrichprotein2，Sprr2），上游调控子为牛磺石胆酸（taurolithocholicacid,TLCA）、SLC10A2、乳糖、降脂素、核受体亚家族5A2(NuclearReceptorSubfamily5,groupA,member2，NR5A2)。涉及生物学改变为肝内胆汁淤积、环腺苷酸合成、磷脂水解、DNA损伤。图七GS组与H组代谢谱差异物相关生物分子网络图19 广州中医药大学2018届博士学位论文表5GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物涉及生物学作用生物学作用PBileAcidBiosynthesis，NeutralPathways5.46E-06FXR/RXRActivation4.69E-02HepaticCholestasis6.35E-02图八GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物涉及生物学作用表6GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物涉及调控子上游调控子Ptaurolithocholicacid1.05E-02SLC10A21.40E-02lactose1.40E-02nafenopin2.09E-02NR5A22.78E-02表7GS组与H组胆汁酸代谢谱差异物涉及疾病损伤类型疾病分类生物学改变类型Pgastrointestinaldiseaseintrahepaticcholestasis1.49E-09cellsignalingnucleticacidmetabolismsynthesisofcyclicAMP1.68E-06cellmorphologyPHofintracelluarspace5.42E-06lipidmetabolismhydrolysisofsphingomyellin1.57E-04DNAreplicationDNAdamage4.24E-042.10.2GS-0组与H0组胆汁酸代谢谱差异物生物学分析比较新发胆结石未发病节点患者血清胆汁酸代谢谱和健康人群胆汁酸代谢谱差异物导入IPA分析系统。结果如表7、表8所示，和健康人群比较，差异涉及调控因子涵20 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究盖降脂素、乳糖、NR5A2、对氧磷酶3(paraoxonase3,PON3).生物学改变涉及胆汁酸合成障碍、体重异常、环磷腺苷合成异常、动脉粥样硬化。表8GS-0组与H0组胆汁酸代谢谱差异物涉及上游调控子上游调控子Pnafenopin4.10E-05lactose9.33E-03NR5A21.86E-02PON33.02E-02表9GS-0组与H0组胆汁酸代谢谱差异物涉及生物学改变疾病分类生物学改变Pgastrointestinaldiseasebileacidsynthesisdefect4.34E-03organnismalinjuryandabnormalitiesleanbodymass6.51E-03cellsignalingnucleticacidmetabolismsynthesisofcyclicAMP7.35E-03cardiovasulardiseaseatherogenesis1.30E-022.11小结综合研究结果，代谢组学的运用能够将胆结石患者与健康人群、胆结石未发病节点与健康人群的血清差异代谢物明显区别开，与健康人群相比，胆结石患者存在如下胆汁酸谱差异物9种。下调的差异性代谢物为熊脱氧胆酸（UDCA），上调趋势的差异性代谢物为甘氨胆酸（GCA）、猪脱氧胆酸（HDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）。所以可以得出胆结石患者血清胆汁酸代谢谱与健康人群胆汁酸代谢谱已然存在差异，胆结石患者和健康人群胆汁酸谱差异物涉及生物学学作用为胆汁酸生物合成，中性途径，法尼醇X受体/维甲酸受体通路的激活、肝内胆汁淤积，相关连接因子包括GATA3、GATA4、GATA6、GRB2、HNF4-α、KLF4、MYC、PAX1、POU5F1、SOX2、SOX7、TAF4、CEBPA、Sprr2，上游调控子为TLCA、SLC10A2、乳糖、降脂素、NR5A2。涉及病理改变为肝内胆汁淤积、环腺苷酸合成、磷脂水解、DNA损伤。新发病胆结石患者在未发病节点的胆汁酸谱与健康人群存在12种差异物，上调趋势的差异性代谢物为甘氨胆酸（GCA）、猪脱氧胆酸（HDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨鹅胆酸（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）、胆酸（CA）、鹅脱氧胆酸（CDCA）、脱氧胆酸（DCA）、石胆酸（LCA）。由健康人群发展到胆结石前状态人群，涉及调控因子包括降脂素、乳糖、NR5A2、PON3.相关疾病损失涉及胆汁酸合成障碍、体重异常、环磷腺苷合成异常、动脉粥样硬化。与健康人群比较，GS组与GS-0组的胆汁酸代谢谱具有共同的变化，体现在甘氨胆酸（GCA）、猪脱氧胆酸（HDCA）、牛磺胆酸（TCA）、甘氨鹅胆酸（GDCA）、甘氨鹅脱氧胆酸（GCDCA）、猪胆酸（HCA）、牛磺鹅脱氧胆酸（TCDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）的上调趋势。非参数检验得出，GS组GCA、HDCA、7-KetoDCA水平高于H组（P＜0.05），具有统计学意义。21 广州中医药大学2018届博士学位论文22 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究第三章临床研究纵向对比3.1研究概要本次研究采用非盲、对照的设计实验原则。以UPLC-Q-TOF/MS技术检测新发病胆结石人群不同疾病状态下（未发病节点与新发病节点）样本的血清胆汁酸代谢谱，比较组间胆汁酸代谢谱差异，获得可参考预测胆结石发病的胆汁酸代谢谱特征及相关的分子通路网络。3.2研究对象3.2.1样本来源新发病胆结石患者来自北京某社区医院体检人群。纳入2015年未发病，2016年新发病胆结石患者19人，留取其未发病节点血清样本19例作为GS-0组，留取其发病节点血清样本19例作为GS-1组。所有纳入患者均符合相应的西医诊断标准、病例纳入标准。3.2.2诊断标准同第二章3.2.2.1胆结石诊断标准同第二章3.2.2.2中医证型诊断标准同第二章3.2.2.3正常对照组选择标准同第二章3.2.2.4纳入标准同第二章3.2.2.5排除标准同第二章3.3硏究方法3.3.1症状体征、实验室检査信息采集同第二章3.3.2血液标本采集同第二章3.3.3血清代谢组学检测和分析同第二章3.4数据整合、构建分子网络及网络映射研究同第二章23 广州中医药大学2018届博士学位论文3.5数据处理及分析同第二章3.6研究人群的基线特征本研究在2015-2016年间人群体检的血样中，一共筛选研究对象19例。其中胆结新发病人群19例，该人群采纳其胆结石新发病节点样本19例，归为GS-1组；该人群采纳其胆结石未发病节点19例，归为GS-0组。以两组数据做配对分析，两组在性别、年龄、身高、腰围、血糖、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、肌酐、尿酸、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白上无统计学差异，P值均>0.05（如表9）所示。表10GS-0组与GS-1组人群基线指标GS-0GS-1PAge*********BMI24.27±3.5424.82±3.930.63FGLU5.71±0.665.68±0.510.89TC4.9±0.835.01±0.950.64TG1.76±1.071.66±1.260.49HDL1.41±0.631.4±0.410.4LDL2.89±0.652.94±0.650.92Creatinine63.26±9.5768.63±16.590.44BUA319±71.41316.42±95.340.75ALT19±7.3720.63±14.290.71AST20.95±6.2320.74±5.370.69AFP7.91±0.878.12±1.310.42CEA7.15±1.027.28±1.10.543.7UPLC-Q-TOF/MS稳定性和可重复性评价对每个血清样本测定6次重复性评估,抽取5个色谱图检测并结合多种化合物各自具备的极性和质核比特征，结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD范和相对峰面积的RSD范围稳定。所抽取QC样本峰面积、保留时间和质量精度稳定。24 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究3.8PCA和OPLS-DA分析结果GS-0VSGS-1(OPLS-DA)12GS0-158GS0-106GS1-134GS1-192GS1-7GS1-10GS1-18GS0-8GS0-18GS0-16GS0-19GS1-9GS1-15GS1-20GS0-4GS1-3GS0-17GS1-6GS1-17GS1-4GS1-8GS0-11GS1-1GS1-14GS0-2GS0-7GS0-14GS1-5-2GS0-1GS0-3GS0-9GS0-5GS1-11GS0-12GS0-13GS0-6GS1-16GS1-12-4-6-8-4-3-2-101231.255*t[1]R2X[1]=0.06R2Xo[1]=0.217Ellipse:Hotelling'sT2(95%)图九GS-0组与GS-1组比较：OPLS-DA图GS-0VSGS-1(OPLS-DA)0.80.6THCA0.4TLCAHCAHDCATCA0.26-KetoLCATUDCA7-KetoDCAGHCAapoCA0GCATHDCAGLCAMCATCDCA-0.2CDCAUDCAGHDCA7-KetoLCAGUDCAIso-LCALCATBA12-KetoCDCGCDCANorDCAGDCA-0.412-KetoLCATDCACADCA-0.6-0.8-1-0.5-0.4-0.3-0.2-0.100.10.20.30.4p[1]R2X[1]=0.06图十GS-0组与GS-1组比较：S-plot图应用主成分分析(PCA)对GS-0组与GS-1组的血清样本数据进行模式识别和判别分析。胆结石未发病节点人群与胆结石发病节点人群胆汁酸谱存在不同。25 广州中医药大学2018届博士学位论文3.9胆汁酸代谢谱差异物比较与GS-0组比较，GS-1组胆结石患者存在如下胆汁酸谱差异物9种。上调趋势的差异性代谢物为猪脱氧胆酸（HDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）、猪胆酸（HCA）。下调趋势的差异性代谢物为鹅脱氧胆酸（CDCA）、石胆酸（LCA）、胆酸（CA）、甘氨猪脱氧胆酸（GHDCA）、脱氧胆酸（DCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）。GS-0VSGS-1(OPLS-DA)21.510.50VarID(Primary)图十一GS组与H组比较：VIPprediction分值表11GS-0组与GS-1组人群胆汁酸代谢谱差异物分子结构分子量名称缩写名称ID（NCBI）变化C24H40O4392.58HDCAhyodeoxycholicacid5283820升高C26H42NNaO5471.614GDCAglycodeoxycholicacid16760472降低7-KetodeoxycholicC24H38O5406.5637-KetoDCA188292升高acidC24H40O4392.58DCAdeoxycholicacid222528降低C24H40O5408.579HCAhyocholicacid92805升高C24H40O3376.581LCAlithocholicacid9903降低C24H40O5408.579CAcholicacid221493降低C24H40O4392.58CDCAChenodeoxycholicacid10133降低glycochenodeoxycholicC26H43NO5449.632GHDCA12544降低acid3.10胆结石胆汁酸谱差异代谢物分子网络生物学分析GS-0组和GS-1组血清胆汁酸谱差异物所关联的相比较。乳糖和降脂素是其上游调控因子。涉及的疾病损伤类型包括自身体重的变化、动脉粥样硬化、胆固醇代谢。26 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究表12GS-0组与GS-1组胆汁酸代谢谱差异物涉及上游调控子上游调控子PLactose4.67E-03nafenopin7.01E-02表13GS-0组与GS-1组胆汁酸代谢谱差异物涉及生物学改变类型疾病分类生物学改变类型Porgannismalinjuryandabnormalitiesleanbodymass2.17E-03cardiovasulardiseaseatherogenesis4.34E-03cardiovasulardiseasesizeofatheroscleroticlesion5.79E-03lipidmetabolismabsorptionofcholesterol7.24E-033.11小结新发病胆结石患者在发病节点和未发病节点的血清胆汁酸谱存在9种差异性代谢物：上调趋势的差异性代谢物为猪脱氧胆酸（HDCA）、7-酮基脱氧胆酸（7-KetoDCA）、猪胆酸（HCA）。下调趋势的差异性代谢物为鹅脱氧胆酸（CDCA）、石胆酸（LCA）、胆酸（CA）、甘氨猪脱氧胆酸（GHDCA）、脱氧胆酸（DCA）、甘氨脱氧胆酸（GDCA）。乳糖和降脂素是其上游调控因子。涉及的病理及生物学改变类型包括自身体重的变化、动脉粥样硬化、胆固醇代谢。通过横向对比可知，GCA、HDCA是胆结石患者与健康人群胆汁酸代谢谱代谢差异物中VIP贡献值较大的两个胆汁酸，新发病胆结石患者疾病前状态与健康人群胆汁酸代谢谱存在同样的波动，即GCA、HDCA具有较大的VIP贡献值。纵向对比发现，HDCA是新发病胆结石患者未发病状态与疾病前状态的VIP贡献值较大的代谢差异物，从未发病状态到疾病状态，HDCA呈升高趋势。27 广州中医药大学2018届博士学位论文第四章不同中医证型胆结石患者血清胆汁酸谱对比4.1研究概要本次研究采用非盲、对照的设计实验原则。以UPLC-Q-TOF/MS检测不同证候胆结石患者血清胆汁酸代谢谱，比较判别不同证候胆结石患者的胆汁酸代谢谱特征及相关的分子通路网络。4.2研究对象4.2.1样本来源胆结石患者来自北京某社区医院体检人群。所有纳入患者均符合相应的西医诊断标准、病例纳入标准。4.2.2.1胆结石诊断标准主要参考中华医学会外科学分会胆道外科学组.肝胆管结石病诊断治疗指南。（1）持续的右上腹或中上腹疼痛，伴有右肩背部放射性酸痛，饱餐或进食油腻食物后诱发伴疼痛加重。（2）伴有恶心、返酸、暧气、腹胀等消化不良症状,体格检查提示墨菲氏征阳性或伴有肝区叩击痛。（3）经B超或CT影像学检查提示胆囊结石或合并胆总管结石，临床有症状或无症状。4.2.2.2中医证型诊断标准主要参考中华中医药学会提出并发布、中国中医药出版社出版《中医外科常见病诊疗指南》，参考2002年中国医药科技出版社《中药新药临床研究指导原则》。肝胆气郁证右胁胀痛或心下痞满，疼痛、闷胀因情志变化而增减，胸闷不舒，纳食减少，嗳气频作，大便干结或艰难，脉弦。肝阴不足证头晕目眩，五心烦热，口干咽燥，胸胁疼痛，悠悠不休，遇劳加重，舌红尖刺，中有裂纹或见光剥或脉弦细带数。4.2.2.3正常对照组选择标准经详细询问病史、体格检查及胸片、B超、心电图、血尿常规、肝肾功能、血糖等理化检查，评定无重大系统疾病。4.2.2.4纳入标准（1）年龄在30~75岁之间；（2）符合胆结石诊断标准；（3）签署同意参加本实验的书面知情同意书。4.2.2.5排除标准28 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究（1）诊断为胆囊穿孔并发急性腹膜炎、急性梗阻性化脓性胆管炎、胆源性胰腺炎者急性单纯性胆囊炎、急性化脓性胆囊炎、急性坏疽性胆囊炎、胆囊穿孔并发弥漫性腹膜炎者。（2）合并心、肝、肾、脑、肺等器官严重的原发性疾病（如哮喘、癌症、艾滋99病）或影响其生存的严重疾病者；血白细胞<4×10；血小板计数0.05（如表12）所示。故皆具有可比性29 广州中医药大学2018届博士学位论文表14肝阴不足组与肝胆气郁组人群基线指标肝阴不足证肝胆气郁证PGende（M/F）8/88/60.49Age50.81±1.8854.11±10.890.2BMI25.44±4.0824.98±3.450.71FGLU6.04±1.555.93±0.850.14TC5.21±0.864.96±0.980.63TG2.07±2.581.4±0.730.68HDL1.28±0.321.47±0.510.34LDL3.06±0.682.96±0.690.6Creatinine66.56±13.8368.73±15.360.77BUA325.38±68.46296.6±85.490.16ALT21.13±12.1217.07±8.140.47AST23.19±11.1121.27±4.40.71AFP7.66±1.297.59±0.920.86CEA7.18±1.197.36±1.140.554.7UPLC-Q-TOF/MS稳定性和可重复性评价对每个血清样本测定6次重复性评估,结果表明各共有峰的相对保留时间的RSD范和相对峰面积的RSD范围稳定。所抽取QC样本峰面积、保留时间和质量精度稳定。肝阴不足VS肝胆气郁(OPLS-DA)1264Y5Q1Y9Q52Y4Q11Q7Y14Q14Q2Y10Q8Y2Y11Q4Q150Y6Y7Y15Q10Y8Q3Q6Y13Y16Y3-2Q9Y1Y12-4Q13-6Q12-8-5-4-3-2-1012341.01931*t[1]R2X[1]=0.0947R2Xo[1]=0.168Ellipse:Hotelling'sT2(95%)图十二肝阴不足组与肝胆气郁组比较：OPLS-DA图30 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究肝阴不足VS肝胆气郁(OPLS-DA)0.80.612-KetoCDCGHCATHCA0.4TLCATHDCAapoCA0.27-KetoDCAMCA6-KetoLCA7-KetoLCAGCDCAHCAGHDCACDCAHDCAGUDCA0UDCATUDCAGDCA-0.2TDCA12-KetoLCATCDCATCATBAGCA-0.4GLCACAIso-LCADCALCA-0.6NorDCA-0.8-1-0.4-0.3-0.2-0.100.10.20.3p[1]R2X[1]=0.0947图十三肝阴不足组与肝胆气郁组比较：S-plot图4.8胆汁酸代谢谱差异物比较肝阴不足组和肝胆气郁组比较存在胆汁酸差异物3种。与肝阴不足组比较，肝胆气郁组胆酸（CA）、石胆酸（LCA）水平上调，甘氨猪胆酸（GHCA）水平下调。肝阴不足组VS肝胆气郁组(OPLS-DA)1.81.61.41.210.80.60.40.20VarID(Primary)图十四肝阴不足组与肝胆气郁组比较：VIPprediction分值31 广州中医药大学2018届博士学位论文表15肝阴不足组与肝胆气郁组人群胆汁酸代谢谱差异物分子结构分子量名称缩写名称ID变化C24H40O5408.579CAcholicacid221493升高C24H40O3376.581LCAlithocholicacid9903升高glycohyocholic7136146C26H43NO6465.631GHCA降低acid24.9不同证型胆结石胆汁酸谱差异代谢物生物信息学分析将肝阴不足组和肝胆气郁组血清胆汁酸谱差异物进行生物信息学分析。肝阴不足组胆结石患者和肝胆气郁组胆结石患者胆汁酸谱差异物涉及生物学作用为法尼醇X受体/维甲酸受体通路激活（FXR/RXRActivation）、孕烷受体/维甲酸受体通路激活(PXR/RXRActivation)、胆汁酸生物合成，中性途径（BileAcidBiosynthesis,NeutralPathways），肝内胆汁淤积（HepaticCholestasis），涉及相关分子网络如图四所示，相关连接因子涵盖GATA转录因子家族的GATA3、GATA4、GATA6，生长受体因子（GrowthFactorReceptorBoundProtein2,GRB2）、肝脏核因子4α(Hepatocytenuclearfactor4-alpha,HNF4-α)、Kruppel样因子4（Kruppel-likefactor4，KLF4)、骨髓细胞瘤致癌基因(MyelocytomatosisOncogene，MYC)、配对盒基因-1（PairedBox1,PAX1）、POU5F1(POUdomain,Class5,TranscriptionFactor1,POU5F1)、性决定基因SOX(SRY(SexdeterminingRegionY)-box)家族的SOX2、SOX7、TAF4、增强子结合蛋白-α(enhancerbingdingprotein，CEBPA)、富脯胺酸小蛋白（Smallprolinrichprotein2，Sprr2），上游调控子为三磷酸腺苷881（AdenosineTriphosphate,ATP881）、牛磺石胆酸（TaurolithocholicAcid,TLCA）、核受体亚家族(nuclearreceptorsubfamily5,groupA,member2，NR5A2)、Paraoxonase3PON3、NR1H4、HNF4A。涉及生物学改变类型有肝内胆汁淤积、胆汁酸合成障碍、环腺苷酸合成、结肠癌细胞激活、肌成纤维细胞激活、DNA损伤。表16肝阴不足组与肝胆气郁组胆汁酸代谢谱差异物涉及生物学作用生物学作用PFXR/RXRActivation1.72E-04PXR/RXRActivation1.08E-02HepaticCholestasis3.23E-02BileAcidBiosynthesis，NeutralPathways7.62E-0232 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究图十五肝阴不足组与肝胆气郁组差异性代谢物相关生物分子网络图图十六肝阴不足组与肝胆气郁组差异性代谢物涉及生物学作用33 广州中医药大学2018届博士学位论文表17肝阴不足组与肝胆气郁组胆汁酸代谢谱差异物涉及上游调控子上游调控子PATP8819.33E-03NR5A21.86E-02PON33.02E-02NR1H43.25E-02HNF4A3.71E-02表18肝阴不足组与肝胆气郁组胆汁酸代谢谱差异物涉及生物学改变疾病分类生物学改变类型Pgastrointestinaldiseaseintrahepaticcholestasis2.77E-07gastrointestinaldiseasebileacidsynthesisdefect3.15E-06celltocellsignalingandinteractionactivationofmyofibroblasts1.89E-05celluarmovementinvasionofcolorectalcancercelllines6.60E-05cellsignalingnucleticacidmetabolismsynthesisofcyclicAMP1.25E-044.10小结肝阴不足组和肝胆气郁组比较存在胆汁酸差异物3种。与肝阴不足组比较，肝胆气郁组CA、LCA水平上调，GHCA水平下调。将肝阴不足组和肝胆气郁组血清胆汁酸谱差异物进行生物信息学分析。肝阴不足组胆结石患者和肝胆气郁组胆结石患者胆汁酸谱差异物涉及生物学作用为FXR/RXRActivation、PXR/RXRActivation、BileAcidBiosynthesis,NeutralPathways、HepaticCholestasis，相关连接因子包括：GATA3、GATA4、GATA6、GRB2、HNF4-α、KLF4、MYC、PAX1、POU5F1、SOX2、SOX7、TAF4、CEBPA、Sprr2，上游调控子为三磷酸腺苷881（AdenosineTriphosphate,ATP881）、牛磺石胆酸（taurolithocholicacid,TLCA）、核受体亚家族(nuclearreceptorsubfamily5,groupA,member2，NR5A2)等。涉及生物学改变类型有肝内胆汁淤积、胆汁酸合成障碍、环腺苷酸合成、结肠癌细胞激活、肌成纤维细胞激活、DNA损伤。34 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究第五章讨论5.1胆结石的危害及预测的必要性疾病预测是预防医学的核心。疾病的发生、发展带来的后果不仅损害了个体的生理、心理健康与经济利益，也为社会带来沉重负担。适时、精准地预测疾病可以有目的地规避危险因子及致病因素，进而提高个体的生存质量，为社会减轻负担。2006年的流行病学调查研究提示，自20世纪末期以来我国胆囊胆固醇结石比例明显上升[68]至79.9%。研究者于2002年回溯至1981年，分析8000多例胆结石患者，发现肝[68]内胆管结石发病率上升，由1981的23.4%升至2000年以前的55.8%。胆结石发病过程中存在多因素的共同及相互作用。性别、遗传、高脂高糖饮食和胆结石相关。某些特定种族的胆结石发病率较高，如维吾尔族溃疡性结肠炎患者胆结石患病率可能较[70]高。急性胆囊炎、胰腺炎、胆管炎、肠梗阻是胆结石的常见并发症。肝硬化合并胆[71]囊结石具较高的发病率。经历多年研究，目前对预防胆结石的大致危险因素已有所[72]认识，但目前仍缺乏有效的策略预防胆结石的形成。胆结石为个人及社会带来的危害不容忽视。虽然胆结石的诊断和治疗法已经相对成熟，但并不意味胆结石患者经现行治疗法后不伴任何并发症，而引发其他的病理过程和生物学改变。当今胆结石的治疗法多选用微创的腹腔镜切除术。但因胆结石手术的切口多位于腹部，故容易引起肠[73][74][75]道病原菌的内源性感染。此外肝胆结石的再次手术的可能性较高，院内感染风险大，再次手术存在相当的难度，且具有较多的并发症。患有遗传性疾病Caroli病的胆结石患者胆结石复发时，则较易出现肝内胆汁淤积、肝纤维化、门静脉高压及乃[76][77]至肝胆系统的癌变。经胆囊切除术后患者容易出现胃肠紊乱。有研究称，治疗胆结石患者行胆囊切除术后胃癌发病率增高。其原因可能由于胆囊切除后，患者的胆汁[78]排泄过多排入胃腔，刺激胃黏膜并导致病变，导致胃癌发生。因此，虽然关于胆结石预测的文献有所报道，但至今仍无具体的观测指标以预测胆囊结石发病。5.2胆汁酸代谢对胆结石发病的影响和预测疾病的意义胆汁酸由肝细胞生成，由胆囊排泄，进入消化系统参与食物消化。胆汁酸分为两类：一类为游离型胆汁酸（FreeBileAcid,FBA），包括CA、DCA、CDCA和少量的UDCA、LCA，另一类是上述FBA经过牛磺化和甘氨化的胆汁酸，如TCDCA、GCDCA、THDCA等。人类胆结石的主要成分包括：胆固醇、胆红素、不同类型的胆酸、脂类（磷脂、游离[79]脂肪酸）、蛋白质、钙、镁。各类胆汁酸比例的改变是胆石病形成的重要机制,部分胆酸在临床上已经作为胆结石的治疗药物，如UDCA和UDCA经牛磺酸化生成的TUDCA具有较好的溶石作用，二者水平上升能够促进胆汁分泌，减少胆固醇的饱和度，从而[80][81]降低结石发生率。胆汁酸代谢谱的研究对胆结石的预测、治疗意义重大，除其与胆结石密切相关外，个体胆汁酸谱在不同的生理及病理状态下存在较明显的差异，并具有一定的时序关联性。肝胆胰疾病及代谢性疾病患者的血清胆汁酸谱具备各自的特35 广州中医药大学2018届博士学位论文[82]征。单纯性肥胖者血清胆汁酸谱中以GCDCA和TCDCA增高为主。小儿先天性胆管扩张症患儿术前血清TBA、TCA和CDCA水平升高明显，而CA、CDCA和UDCA水平降低；[83]术前血清TCA和DCA的百分含量升高，TCA和GCA比值升高，而UDCA百分含量下降。以反相高效液相色谱（RPHPLC）检测妊娠肝内胆汁淤积症(IntrahepaticCholestasisofPregnancy,ICP)患者血清胆汁酸谱，结果发现该类患者胆汁酸谱GCA和GCDCA增高为主，比值可达3.5:1水平约为正常孕妇的20倍；ICP患者血清游离CA的浓度与正常孕妇比较不具备统计学差异；ICP患者的胆汁酸代谢谱不同于乙型肝炎伴转氨酶[84]轻中度增高患者的胆汁酸谱,故检测胆汁酸谱对ICP有重要的预测意义。以气相色谱法检测肝毒性物质黑索金接触者血清胆汁酸谱，其CDCA、DCA、LCA水平升高。氯乙烯接触者发现其DCA及LCA升高。急性黄疸型肝炎、慢性活动型肝炎、肝硬化、肝[85]癌的血清CA、CDCA和LCA均存在不同程度升高，以CA、CDCA变化较明显。综上可知，胆结石等肝胆疾病及代谢疾病在发生、发展过程中，个体的血清胆汁酸谱的各类胆汁酸的存在质与量的波动。机体微观世界的波动可以发生在疾病未发生以前，疾病还未实现，变化已经发生。疾病的内在实质可以认为是基因、蛋白、代谢物的扰动和变化的外在表现。实现胆结石的预测，必须结合动态时空才能完整地还原疾病发展状态。也必须选择精准、全面的检测手段才能如实观测疾病前后的代谢物的确切含量。故本课题选用代谢组学技术检测患者血清样本的胆汁酸全谱。5.3代谢组学是研究胆汁酸代谢谱和中医证候的有效方法代谢组学的综合分析对象是小分子代谢物或特定的生物样品，通过对生物分子水平状态的观测，描述机体的实际的健康或疾病状况。许多领域的发展都受益于代谢组学的研究。在临床研究方面，代谢组学通过建立标准化的性能及数据的分析，并开发、验证及定制生物标记物，从代谢物角度阐述一个复杂的生物系统的信息。其优势在于[86]非侵入性、灵敏度高，能推动特定的诊断技术和新疗法的完善与发展。UPLC-Q-TOF-MS是代谢组学的常用测定手段。其测定方法简单,具备灵敏、精确、高通量等优点。在药物有效成分鉴定方面，其能可靠、快速地识别中药方剂的复杂多样的[87][88]化学成分,有助于揭示中药方剂化学成分和药效的物质。在中医证候研究方面，UPLC-Q-TOF-MS配合主成分分析(PCA)、正交偏小最二乘判别式分析(OPLS-DA)能明显[89]区分证候疾病人群与健康人群的代谢谱差异。对于中药干预不同证候个体后的血清[90]代谢谱差异，UPLC-Q-TOF-MS也同样适用。可以认为，UPLC-Q-TOF-MS能如实精确地反映中药有效成分、疾病（证候）代谢谱组成，以及中药干预后疾病个体的代谢谱差异。其准确性依赖于仪器的性能,可以提高诊治的科学化、定量化,避免了人为因素的误诊，因此适用于血清胆汁酸全谱的检测。代谢组学是系统生物学的工具之一,其独到的研究思路在于由上至下。辨证论治是中医的特色核心诊疗思想，这一思想类同于“黑箱理论”。“有诸内必形诸于外”，“藏居于内，形见于外”，象在外反映了藏。相当于显现在外的生理、病理状态，藏在内36 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究映射着象，相当于机体内的小分子代谢物如胆汁酸的波动能够预示疾病的转归。代谢组学的研究可以通过对病证相关特定组分的共性加以分析、判断，能够帮助人们更好的理解病变过程及机体内物质的代谢途径和代谢状况。同时，代谢组学还有助于疾病[91]的生物标记物的发现而达到辅助临床诊断的目的。所以代谢组学适用于证候研究。5.4代谢组学和生物信息学技术有助于探索疾病证候的发生发展因素既往的证候研究历经了三大时期，包括70年代后期的证候动物模型研究、80年代中期的证候微观指标客观化研究以及21世纪初的病证方物质基础研究。纵览历项研究成果，肾虚证、血瘀证以及类风湿性关节炎病证的相关研究堪称圭臬。证候诊断及疗效评价的客观化与标准化研究对实现中医药现代化至关重要。以现代科学研究方法施用于中医证候生物学临床研究，是中医药现代化发展阶段的自我要求以及必经之路。以统计学为基础的证候研究赖于重复性好、易于操作的中医辨证分型系统，建立证素为证候的诊断和规范化研究提供更多的客观资料和依据，扩大样本量并对基础疾病细化是其发展趋势。结合组学技术，试图通过对中医病证引起的生物标记物的发现，建立证候的识别模式，寻找中医证的生物学本质，也是提升辨证准确性和诊疗水平。中医证候研究具备相当的难度与复杂性。相较于单一片面的现代医学生理病理数据引入阐述中医证候，系统生物学研究所具有的多层次、多靶点的不共的研究特点及其整体性、动态性、时空性和复杂性与中医证候有较多相似之处，为中医证的本质及中药复方研究创造了较为有利的条件，有可能借此而揭示中医证候及中药复方的科学内涵。因此微观、辨证、深入的证候研究得力于代谢组学、基因组学和蛋白质组学的应用。[92][93][94][95][96]依于组学技术，将代谢物、基因、蛋白作为研究对象，结合临床辨证分型，寻找与证候相关的特征性物质，使得疾病的辨证分型具有客观性、准确性及可重复性，整体地由物质基础评价证候的实质，合理阐释中医理论中的同病异治、异病同治，为疾病的再分类提供依据。证候具有多变性、模糊性、复杂性、隐匿性的特点，很难通过单因素分析解释清楚，因此可以借助生物信息技术对其进行分析，分析病证相关机制，建立反映中医药整体特色的新策略和新方法。生物信息学已经广泛运用于生物及疾病研究中。5.5胆结石疾病状态和胆结石疾病前状态的胆汁酸代谢谱与健康人群的相关对比本次研究选取人群分类两类，胆结石人群和健康人群。所采纳的胆结石人群分为胆结石1年病程以上患者和新发胆结石患者。新发胆结石患者选取了发病节点和未发病节点的样本。按照疾病发展时间规律来看，健康状态、胆结石疾病前状态、胆结石新发疾病状态、胆结石1年病程以上状态依次是以时间为轴的疾病发展的过程。故所检测的血清胆汁酸代谢谱的相互比对得到的差异性代谢物可以视作动态变化。GS组与健康人群相比，胆结石患者存在如下胆汁酸谱差异物9种。下调的胆汁酸代谢谱差异物为UDCA，上调趋势的胆汁酸代谢谱差异物为GCA、HDCA、TCA、GDCA、GCDCA、HCA、TCDCA、7-KetoDCA。GS-0与健康人群存在12种差异物，上调趋势的胆37 广州中医药大学2018届博士学位论文汁酸谱差异物为GCA、HDCA、TCA、GDCA、GCDCA、HCA、TCDCA、7-KetoDCA、CA、CDCA、DCA、LCA。无论是胆结石患者还是胆结石疾病前状态人群，其血清胆汁酸代谢谱都与健康人群的存在差别，两者共同的差异胆汁酸为GCA、HDCA、TCA、GDCA、GCDCA、HCA、TCDCA、7-KetoDCA，且波动趋向一致。按VIPpre值结合统计学分析可得，HDCA与GCA可能为诊断胆结石人群与健康人群的胆汁酸代谢谱差异物。胆结石疾病前状态时，其胆汁酸代谢谱已经发生改变，其与健康人群代谢谱的差异，和胆结石患者与健康人群的差异存在一致的波动。可见胆结石尚未发生，内源性的改变已经形成。本次研究比较胆结石疾病前状态与健康人群胆汁酸代谢谱，胆结石疾病前状态人群具备同胆结石人群相近的物质波动GCA、HDCA、TCA、GDCA、GCDCA、HCA、TCDCA、7-KetoDCA。胆结石疾病前状态人群特有的的物质波动体现在CA、CDCA、DCA、LCA，胆结石人群特有的波动体现在UDCA。与既往研究一致之处在于，胆结石组血清和胆结石发病前状态的[97]GCA、TCA、GDCA、TCDCA相对于正常人群存在升高趋势。与既往研究不同之处在于，[98]CA、DCA可能为胆石病患者的特征性标志物，而本次胆结石发病前状态的胆汁酸代谢谱的CA、DCA较健康人升高。未结合的胆酸如CA、CDCA、DCA具有疏水性及细胞毒性。CA、CDCA、DCA等物质的累积将致线粒体凋亡、细胞膜破裂、以及活性氧簇的释[99][100][101]放增加，最终造成细胞凋亡和坏死。UDCA是口服治疗胆固醇胆结石的重要药物。UDCA能够通过调节血脂，改善非酒精性脂肪肝，对胆固醇胆结石有溶解作用。胆结石人群UDCA水平趋于降低，提示胆汁酸谱的该类改变对于胆结石的成石的抑制作[102][103]用被减弱。HCA清开灵注射液的有效成分之一。研究证实，HCA对于血脑屏障中[104]具有较高的透过能力。HCA可以降低细胞间黏附分子-1（IntercellularAdhesion[105]molecule,ICAM-1）蛋白和基因表达，避免白细胞黏附，微血栓形成和脑梗死的扩大，[106]HCA钠对卵巢癌细胞有一定的抑制作用。胆结石在发病过程中涉及的生物学作用有胆汁酸代谢、FXR/RXR通路的激活、和肝内胆汁淤积。FXR的激活，能促进胆囊内胆盐、磷脂的浓度的增加，因而降低胆汁胆固醇饱和度，减少胆固醇结石的发生。FXR激活对肥胖、非酒精性脂肪肝、动脉粥样硬化的发展同样有抑制作用。FXR通过抑制过氧化物酶增殖受体γ（PeroxisomeProliferation-ActivatedReceptorγ，PPARγ）[107]表达改善脂质代谢。故FXR/RXR通路与胆结石发病密切相关。5.6新发病胆结石患者疾病状态和疾病前状态的胆汁酸代谢谱及相关比对本研究将新发病胆结石患者，发病节点归为GS-1组，未发病节点为GS-0组。二者对比即自身对比。经OPLS-DA及VIPpre分析，胆结前后疾病状态血清胆汁酸代谢谱存在9种差异性代谢物：上调趋势的差异性代谢物为HDCA、7-KetoDCA、HCA；下调趋势的差异性代谢物为CDCA、LCA、CA、GHDCA、DCA、GDCA。通过横向对比可知，GCA、HDCA是胆结石患者与健康人群胆汁酸代谢谱代谢差异物中VIP贡献值较大的两个胆汁酸，新发病胆结石患者疾病前状态与健康人群胆汁酸代谢谱存在同样的波动，即GCA、HDCA具有较大的VIP贡献值，并呈升高趋势。纵向对比发现，HDCA是新发病胆结石38 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究患者未发病状态与疾病前状态的VIP贡献值较大的代谢差异物，从未发病状态到疾病状态，HDCA呈升高趋势。通过横向比较组已经得出，胆结石患者血清HDCA水平高于健康人群，现通过自身比较，新发病胆结石患者发病节点血清HDCA水平高于未发病节点，即疾病状态血清HDCA水平高于疾病前状态，新发病胆结石患者未发病节点血清HDCA水平高于同样高于健康人群。因此，HDCA可能是甄别胆结石发病内环境与健康内环境的标志性代谢物。猪脱氧胆酸（hyodeoxycholicacid,HDCA）是胆汁中的甾类成分，也是中药牛黄及多种含牛黄的中成药中的活性成分，具有广泛的药理活性。能够抑制胆酸的形成及溶解脂肪，降低血中胆固醇和三酰甘油，适用于高血脂症、动[108][109][110]脉粥样硬化症，具有抗菌、抗缺氧损伤等作用。现代药理学分析认为，HDCA[111]具有清热解毒、镇心止惊、利痰开窍的功效。以6种不同的胆汁酸干预高脂饮食饲[112]养的雄性仓鼠，HDCA干预的仓鼠的胆固醇结石发病率最低。HDCA在预防胆石的详细机制还有待阐明。胆结石疾病状态HDCA水平相对于健康人群的升高，疾病状态HDCA水平相对于疾病前状态的升高，疾病前状态HDCA水平相对于健康人群的升高，可能是机体因抑制疾病发生、发展的代偿性升高。5.7肝阴不足证胆结石患者和肝胆气郁组胆结石患者的胆汁酸代谢谱及相关比对肝胆气郁证以右胁胀痛或心下痞满为主要证候，其症状较易受情志波及。此外伴随，纳食减少，嗳气频作，大便干结或艰难等消化系统症状。肝胆气郁时，胆腑疏泄[113]失司，可致胆汁郁积而成石。研究表明，肝胆气郁胆结石患者的胆汁粘度指数升高[114][115]，肝胆气郁胆结石患者更容易合并抑郁症。肝阴不足证胆结石患者的典型症状为肋痛，然痛势隐隐悠悠不休，遇劳加重，口干咽燥，心中烦热，头晕目眩，舌红少苔，脉细弦而数。和肝阴不足证胆结石患者相比，肝胆气郁证患者血清CA和LCA升高，GHCA下降。CA是初级胆汁酸，是主要胆汁酸之一,作为信号转导分子，常参与肝脏胆汁淤积、脂质代谢等病变。研究表明，CA与肠道菌群的相互作用对肠癌发生发展存在一定作用，肠癌病程中存在CA水平的升高，与信号转导与转录激活因子（SignalTransducerandActivatorofTranscription3，STAT3）等肿瘤相关信号通路的激[116]活相关。CA可能会通过氧化应激信号激活巨噬细胞、促使内脏脂肪、动脉硬化和[117]非酒精性脂肪肝的发展。CA还可促进肝脏胆汁酸水平的细胞色素P4502D6[118]（CytochromeP4502D6,CYP2D6）表达的转录调控。LCA由CDCA在肠内通过细菌代谢而产生，是维生素D和孕烷受体(PregnaneXReceptor,PXR)的配体，参与介导肝[119]毒性和胆汁淤积。LCA在ICP孕妇血清水平升高，可以作为ICP鉴别诊断的敏感和[120][121]特定的生物标志物,对ICP的诊断及病情监测有一定意义。有研究表明,激活toll样受体4(tolllikereceptor，TLR4)将导致坏死性小肠结肠炎(NecrotizingEnterocolitis，NEC)。PXR的激活则表现出TLR4信号的抑制,LCA激活肠道PXR受体[122]和减少NEC-related肠道炎症。LCA升高与肝内胆汁淤积相关。胆汁合成运输如果失调，就可能导致肝内胆汁淤积，长期慢性的胆汁淤积具有一定的肝毒性作用，甚至39 广州中医药大学2018届博士学位论文会导致肝细胞或者胆管细胞癌变。结合生物信息学分析，肝阴不足组胆结石患者和肝胆气郁组胆结石患者胆汁酸谱差异物涉及生物学作用为FXR/RXR通路激活、PXR/RXR通路激活、胆汁酸生物合成，中性途径、肝内胆汁淤积，生物分子网络涵盖：GATA3、GATA4、GATA6、GRB2、HNF4-α、KLF4、MYC、PAX1、POU5F1、SOX2、SOX7、TAF4、CEBPA、Sprr2，上游调控子为三磷酸腺苷881（AdenosineTriphosphate,ATP881）。涉及生物学改变类型有肝内胆汁淤积、胆汁酸合成障碍、环腺苷酸合成、结肠癌细胞激活、肌成纤维细胞激活、DNA损伤。研究结果表明，胆结石病的肝胆气郁证病程中肝内胆汁淤积关联更紧密。5.8胆汁酸代谢谱研究是对传统中医理论的补充和创新胆汁酸是涉及病理及生理重要的调控因子。研究表明，胆汁酸与肠道上皮细胞损伤与修复相关。DCA可显著抑制肠道上皮细胞增殖，抑制损伤修复。而UDCA则拮抗[123]DCA，促进肠道上损伤的疗愈。此外，胆汁酸还具有较强的抗菌性。在高胆酸及高[124]胆固醇饮食的干预下，使壁厚菌门与拟杆菌门比例下降，引发肠道菌群的改变。肠道菌群在物质与能量代谢中作用重要，肠道菌群代谢了机体内部分胆固醇，使胆固醇[125]转化为胆汁酸。肠道菌群的改变会影响肠道对胆固醇的吸收、胆汁酸的成分和胆汁[126]池的大小，从整体上改变肝肠循环。促进胆固醇7α羟化酶将促进胆固醇生成胆汁[127]酸。当胆汁中的DCA处于高水平及具有较高的胆固醇饱和度时，肠道菌群将促进胆固醇7α-羟化酶表达，相反，胆汁中DCA水平降低、胆固醇饱和度下降时，7α-羟化[127]酶表达受到抑制。“凡十一脏取决于胆”的内涵不仅在胆腑的生理作用，而是指出胆在人体生命调节中的微观过程。胆汁酸的代谢在疾病发病、发展和转归的重要作用，可以认为是胆腑生理及病理的具象化体现，更是对“凡十一脏取决于胆”的直接阐明，也是对传统中医理论的补充与创新。胆为中清之腑，内藏精汁；胆主决断，蕴藏生发之机，与肝相协调，主气机的生发和调畅，“凡十一脏取决于胆”就是对胆腑生理功能的高度概括。十一脏，有学者认为是“十一脏”即指该句之上原文所指心、肝、脾、肺、肾、胃、大肠、小肠、三焦、膀胱，如王冰云“然胆者中正刚断无私偏，故十一脏取决于胆也”，也就是说胆因为其中正刚断无私的特质，对周身的脏腑有一个统领[129]和摄导作用。也有学者提出，十一脏是土脏的谬误。土脏即脾土至阴之类的脾胃、大肠、小肠等负责转化水谷的脏腑，这一系列的生理活动需要厥阴肝木和少阳胆木的[130]“疏土”功能方能实现。无论学说何种，都能说明胆的生理功能都与周身脏腑正常运作密不可分。现代医学的胆汁酸谱研究恰恰能佐证胆的中医学内涵。胆的排泄功能是否正常，胆汁酸的种属质量是否变更，胆汁是否容易成石，代谢物受到扰动而改变的内涵，以及与能量代谢的关联。造成了种种显示在外的征象。目前有关胆结石的代谢组学研究较少。本次研究选取人体血清29种胆汁酸作为观测指标，构建观测人群的血清胆汁酸代谢谱。从整体与微观、静止与变化相结合的角度，横向比较与纵向比较分析不同疾病状态人群及健康人群之间的差异性代谢物，40 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究再以中医辨证论治为切入点，从角度分析不同证型之间的差异性代谢物，是对疾病内涵合理阐述。运用代谢组学和生物信息学技术阐明胆结石发病机制，除对胆结石预测有意义之外，对其他疾病的预测和诊断同样具有意义重大。胆汁酸代谢谱的检测立足于对肝胆疾病及其他疾病、不同证候的胆汁酸变化全面分析，能够较好地挖掘不同疾病状态的内在环境微观实质。对于胆结石疾病研究来说，结合胆结石证候研究的病证[131]关联研究有助于对胆结石疾病的再分类，也有助于阐释胆结石发生、发展和转归。相信在未来，胆汁酸代谢谱的检测必将有更为广泛的运用。41 广州中医药大学2018届博士学位论文参考文献[1]KollerT,KollerovaJ,HlavatyT,etal.Cholelithiasisandmarkersofnonalcoholicfattyliverdiseaseinpatientswithmetabolicriskfactors［J］.ScandJGastroenterol,2012,47(2):197-203．[2]GuptaS.K.,ShuklaV.K.Silentgallstones:atherapeuticdilemma［J］.Trop.Gastroenterol.2004;25(2):65–68.[3]GrodsteinF,ColditzGA,HunterDJ,etal.Aprospectivestudyofsymptomaticgallstonesinwomen;relationwithoralcontraceptivesandotherriskfactors[J].ObstetGynecol.1994;84(2):207–214.[4]AmigoL.,ZanlungoS.,MendozaH.,etal.Riskfactorsandpathogenesisofcholesterolgallstones:stateoftheart.Eur.Rev.Med.Pharmacol.Sci［J］.1999;3(6):241-6..[5]VölzkeaHenry,BaumeisteraSebastianE.,AlteaDietrich,etal.Independentriskfactorsforgallstoneformationinaregionwithhighcholelithiasisprevalence.Digestion［J］.2005;71:97–105.[6]ImanoM,SatouT,ItohT,etal.Animmunohistochemicalstudyofosteopontininpigmentgallstoneformation［J］.AmSurg.2010Jan;76(1):91-5.[7]AhmedF,BalochQ,MemonZA,etal.Anobservationalstudyontheassociationofnonalcoholicfattyliverdiseaseandmetabolicsyndromewithgallstonediseaserequiringcholecystectomy.[J]AnnMedSurg(Lond).2017,17:7-13.[8]PasternakA,BugajskaJ,SzuraM,etal.BiliaryPolyunsaturatedFattyAcidsandTelocytesinGallstoneDisease[J].CellTransplant.2017Jan24;26(1):125-133.[9]BerrF,PratschkeE,FischerS,PaumgartnerG.DisordersofBileAcidMetabolisminCholesterolGallstoneDisease［J］.JClinInvest.1992,90(3):859～868.[10]PomareEW,Low-BeerTS.Selectivesuppressionofchenodeoxycholatesynthesisbycholatemetabolitesinman［J］.ClinSciMolMed1975;48(4):315-21.[11]苗彬,崔乃强,李忠廉.胆囊结石患者肝细胞胆汁酸分泌的变化[J].肝胆胰外科杂志,2005,17(1):5-7.[12]HussainSH,PexeiraSP,MurphyGM,eta1.DeoxycholicacidinfluencescholesterolsolubilizationandmicrocrystalnucleationtimeinGallbladderbile[J].Hepatology,1995,22(6):1735-1744.[13]FanZP,QiuDK,ZengMD.Theexpressionofmetabolismrelatedgenesinpatientsofnon-alcoholicfattyliverdiseaseswithcholelithiasis［J］.ChinJDigest,2008,28(7):488-491．[14]OramJF,BrintonEA,BiermanEL.etal.Regulationofhighdensitylipoproteinreceptoractivityinculturedhumanskinfibroblastsandhumanarterialsmoothmusclecells[J].JClinInvest.1983;72(5):1611-21.[15]孙百军,崔乃强.胆色素结石患者肝细胞分泌状态与炎性细胞因子的关系[J].肝胆胰外科杂志,2001,13(3):118-120.42 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究[16]郝瑞瑞，王惠吉，贾继东，等.肝硬化患者胆囊运动功能与胆结石形成的关系探讨[J].中华肝脏病杂志,2006,14(2):137-138.[17]朱雷明,蔡端,张延龄.模拟胆汁体系中游离胆红素的热力学研究[J].外科理论与实践,1999(01):13-17.[18]高锋.5种血清酶联合检测在肝胆疾病诊断和鉴别诊断中的价值[J].吉林医学,2015,36(02):269-270.[19]TaheriH，GhemianN，TaghaviY，etal.Biochemicalprofileofbilefluidinpatientswithmalignantcholestasisincomparisonwithcholestasisduetogallstone.[J]CaspianJInternMed.2015;6(3):165-9.[20]聂凯,薛小军,张文华,等.血清CEA、CA19-9联合检测在肝内胆管结石合并肝内胆管细胞癌诊断中的价值[J].中华肝脏外科手术学电子杂志,2015,4(4):215-217.[21]杨玉龙,郝志强,宋文渊,等.超声回声灰阶直方图分析预测胆结石成分的研究[J].肝胆胰外科杂志,2002，14(1):15-17.[22]GrahamDF,WyllieFJ.Predictionofgall-stonepancreatitisbycomputerBrMedJ.1979,1(61):515-7.[23]XiangzhengH,JianminW.PreparationandApplicationofChenodeoxycholicAcidandItsDerivatives[J].PROGRESSINCHEMISTRY,2016,28(6):814-828.[24]GhoshLaskarM,ErikssonM,RudlingM,etal.TreatmentwiththenaturalFXRagonistchenodeoxycholicacidreducesclearanceofplasmaLDLwhilstdecreasingcirculatingPCSK9,lipoprotein(a)andapolipoproteinC‐III[J].Journalofinternalmedicine,2017,281(6):575-585.[25]肖震宇,杨藩,童兵,黄志勇.牛磺熊去氧胆酸预防肝胆管结石术后复发的随机对照研究[J].中国微创外科杂志,2015,15(10):891-893.[26]BittnerR.Thestandardoflaparoscopiccholecystectomy[J].Langenbeck'sarchivesofsurgery,2004,389(3):157-163.[27]石运振,胡安国.胆结石内镜治疗进展[J].腹腔镜外科杂志,2012.32(2):156-157.[28]邱华斌，李怀磐，李生永.用腹腔镜胆囊切除术和小切口胆囊切除术治疗胆结石的疗效研究[J].当代医药论丛.2014.15(19):203-204.[29]陈小宇.腹腔镜联合胆道镜与传统开腹于术治疗胆结石94例的临床效果对比观察[J].大家健康(学术版).2015.11(3):64-65.[30]马亮亮,田富鹏.ARMA模型在胆结石病发病率预测中的应用[J].军事医学科学院院刊,2010,34(5):469-472.[31]岳志华,孙会敏,田颂九,郭玉宁.HPLC-ELSD-UV法同时测定人体胆结石中胆固醇、胆红素及各种胆酸的含量[J].药物分析杂志,2004,24(3):310-314.[32]尤海玲,陈源.四逆五金汤"治疗胆石症62例临床研究[J].江苏中医药,2010,43(10):23-24.[33]李辉.中西医结合治疗胆囊胆石症56例疗效观察[J].中国实用医药.2011,6(29):174-175.[34]刘志新,林一帆,朱虹,等.1133例胆总管结石发生年龄与生物学特征及中医证型关系探讨[J].中华中医药学刊,2012,30(07):1660-1662.[35]李立,蔡峰,梁非,等.基于文本挖掘技术探索中医治疗胆结石药证对应规律研究[J].辽宁中43 广州中医药大学2018届博士学位论文医杂志,2013,40(4):664-666.[36]顾晔斌,余奎,张静喆.胆石病证候分布特点及其相关因素分析[J].中国中医基础医学杂志,2012,18(2):137-138.[37]魏德全,张建纲,方敦学,等.益气养阴汤对胆石症患者胆汁成分的影响[J].中西医结合杂志,1990,10(08):470-472+452.[38]马俊,郭吕,夏小英.小柴胡汤加减方对胆石症术后患者血清总胆汁酸和成纤维细胞生长因子19的影响研究[J].现代中西医结合杂志,2015,24(09):942-944.[39]王恒杰,刘长明,郭吕,等.小柴胡汤加减方对胆道术后患者胆汁成分及成石趋势的影响[J].辽宁中医药大学学报，2012，14(11):174-176.[40]高瑛,石坤和,顾渊,等.胆石症术后联合中药制剂对患者血清总胆汁酸及预后情况的影响[J].世界中医药,2017,12(02):355-358.[41]陶承静,赵灏.清淤利胆汤联合西药治疗湿热型妊娠期肝内胆汁淤积症疗效观察[J].新中医,2016,48(5):172-174.[42]李菲菲,王蕾,张玮.慢性乙型肝炎中医证候与实验室指标的相关性研究[J].国际检验医学杂志,2014,35(5):545-546.[43]余靖,张炳厚,刘红旭,等.清胆利湿汤(丸)治疗慢性胆石症性胆囊炎181例临床观察[J].北京中医,2000,11(4):11-14.[44]刘友,李洪,张光,等.慢性乙型肝炎湿热中阻证的血浆代谢组学[J].世界华人消化杂志,2014,(01):107-113.[45]刘倩,王晓素.肝硬化证型与生物学指标相关性研究[J].辽宁中医药大学学报,2012,14(2):113-116.[46]赵志超,卢秉久.肝硬化腹水中医证型与检测指标相关性分析[J].世界中西医结合杂志,2012,7(8):680-682[47]刘明凤,周世双.胆结石的中医临床治疗[J].中外医疗,2012,31(17):95-95.[48]张璞.中药利胆排石汤治疗胆结石56例临床研究[J].中医临床研究,2015,7(23):69-70.[49]王蒨,孙百军,李东华,崔乃强.中药利胆灵对胆色素结石患者引流胆汁中胆汁酸的影响[J].天津中医药,2007(02):110-113.[50]孙百军,崔乃强,李东华,王倩.利胆药物对胆色素结石患者引流胆汁成分的影响[J].中国中西医结合杂志,2006(09):841.[51]徐雷鸣,宗春华,张敏红,等.胆结石患者血清结合胆汁酸测定的临床研究[J].临床内科杂志,2000,17(1):35-36.[52]俞渊,唐乾利,黄欣,等.大黄灵仙胶囊防治兔胆石病的代谢组学及超微病理研究[J].中华中医药志.2013,28(11):3359-3362.[53]杨忠良,杨秀云,李剑，等.金威消石颗粒抑制豚鼠胆固醇胆石形成的代谢组学研究[J].河南中医.2016,36(3):420-423.[54]赵慧辉,陈建新,史琦,等.基于差异凝胶双向电泳技术的冠心病不稳定性心绞痛血瘀证患者血浆差异蛋白特征研究[J].中国中西医结合杂志,2010,30(5):488-492．[55]郑海生,蒋健,贾伟,等.慢性心力衰竭肾阳虚证患者代谢组学研究[J].中华中医药杂志,2010,25(2):198-201.44 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究[56]蒋海强,李运伦,解君.基于高效液相色谱-飞行时间质谱技术的高血压病肝阳上亢证尿液代谢组学研究[J].中国中西医结合杂志,2012,32(3):333-337.[57]陈威妮.基于代谢组学技术的2型糖尿病中医证的动态研究[D].广州中医药大学,2012.[58]沈姗姗.神经性耳鸣肾虚证血清代谢组学研究[D].中国中医科学院,2015.[59]牛旭艳,李健,吕诚,等.类风湿性关节炎热证“药-证对应”机制的网络药理学研究[J].中国实验方剂学杂志,2012,18(08):299-303.[60]KangGL,LiS,ZhangJF.Entropy-basedmodelforinterpretinglifesystemsintraditionalChinesemedicine[J].EvidBasedComplementAlternatMed,2008,5(3):273-279[61]张慧芹,郝钰,李健,等.文本挖掘非酒精性脂肪性肝病中医证候及用药规律[J].中国中医基础医学杂志,2014,20(08):1120-1122.[62]周珂,刘忠第,谭勇,等.高尿酸血症和非酒精性脂肪肝异病同治规律及分子机制预测[J].中国实验方剂学杂志,2017,23(01):206-212.[63]苏式兵,胡义扬,赵立平,等.慢性乙型病毒性肝炎中医证候生物学基础的研究思路[J].中国中西医结合杂志,2011,31(02):252-255.[64]杨泽民,陈蔚文,王颖芳.慢性浅表性胃炎脾虚证患者与健康人物质能量代谢基因差异表达研究[J].中国中西医结合杂志,2013,33(02):159-163.[65]中华医学会外科学分会胆道外科学组.肝胆管结石病诊断治疗指南.中华消化外科杂志,2007,6(2):156-160.[66]中医外科常见病诊疗指南编写组.中医外科常见病诊疗指南［M］.1版北京：中国中医药出版社，2012：49-51[67]SFDA.中药新药临床研究指导原则(试行).北京:中国医药科技出版社,2002:281-285.[68]王智峰，祝学光，刘玉兰．胆石症的诊断与治疗进展．临床消化病杂志，2006，18（6）：325-327．[69]陈希纲,刘家奇,彭民浩,等.胆石病临床流行病学调查——附8585例分析.中华普通外科杂志,2002(02):34-36.[70]卢加杰,高峰,阿依努尔·阿合曼,等.溃疡性结肠炎与无症状胆结石的关系及危险因素分析[J].胃肠病学和肝病学杂志,2016,25(10):1136-1140.[71]丁佐龙,黄勇.肝硬化患者合并胆囊结石临床特征分析[J].实用肝脏病杂志,2012,15(03):265-266.[72]ShabanzadehDM1.Incidenceofgallstonediseaseandcomplications［J］.CurrOpinGastroenterol.2018,34(2):81-89.[73]郭建华,王春城,唐宇菲.胆结石患者术后医院感染的危险因素分析[J].河北医科大学学报,2015,36(2):152-155.[74]曾鹏.145例肝胆结石术后再次手术的原因分析及预防对策[J].中国医药指南,2013,11(18):434-435.[75]杨永,杨连招,莫新少,等.胆结石并胆道感染不同菌群术后切口愈合情况的临床研究[J].护理研究,2011,25(36):3337-3338.[76]W.DeJesus-Rojas,K.McBeth,A.Yadav,etal.SevereHepatopulmonarySyndromeinaChildwithCaroliSyndromeCaseReport［J］.hindawi.2017(2017):1-4.[77]寇晓茹,孙立明,郭娜,等.针刺治疗胆结石术后胃肠功能紊乱疗效观察[J].上海针灸杂45 广州中医药大学2018届博士学位论文志,2010,29(2):103-104.[78]刘洪.胆结石及胆囊切除与胃癌发生的关系[J].实用癌症杂志,2014,29(11):1433-1435.[79]KapoorBS1,AgarwalAK,KhannaNN.Predictionofgallstonecompositionbyultrasound:implicationsfornon-surgicaltherapy［J］.BrJRadiol.1995,68(80):459-62.[80]IshibashiH1,KomoriA,ShimodaS,etal.Riskfactorsandpredictionoflong-termoutcomeinprimarybiliarycirrhosis［J］.InternMed.2011;50(1):1-10.[81]朱晨宇,高曰文,朱华,朱耀明,王广胜.熊去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸治疗胆固醇性胆结石的疗效比较[J].中国药房,2012,23(04):321-322.[82]韩建华,苏薇,文艳,等.单纯性肥胖者血清胆汁酸谱研究[J].检验医学,2012,27(10):795-798.[83]印其友,肖现民,李昊,等.小儿先天性胆管扩张症血清胆汁酸谱的初步分析[J].中华小儿外科杂志,2007,28(09):469-472.[84]东云华,李金样,向双林,等.血清胆汁酸谱在肝病鉴别诊断中的应用研究.华西医科大学学报,1997,(1):73-76.[85]刘春芳,丁敏,何俊,等.应用高效液相色谱法建立妊娠肝内胆汁淤积症的胆汁酸谱中华检验医学杂志,2005,7(7):713-715.[86]KlupczyńskaA,DerezińskiP,KokotZJ.METABOLOMICSINMEDICALSCIENCES--TRENDS,CHALLENGESANDPERSPECTIVES[J].ActaPolPharm.2015Jul-Aug;72(4):629-41.[87]LiuMJ,WangY2,LiLYetal.[UPLC-Q-TOF/MSforrapidanalysisofchemicalconstituentsinSanhuangtablets][J].ZhongguoZhongYaoZaZhi.2017;42(9):1685-1692.[88]LinHM,LinLF,XiaZZ,etal.NeuroprotectiveeffectsandUPLC-Q-TOF/MS-basedactivecomponentsidentificationofexternalappliedanovelWen-Luo-Tongmicroemulsion[J].ArtifCellsNanomedBiotechnol.2017Nov13:1-11.[89]LiuWP,LiCY1,HuangJ1,etal.[IdentificationofbiomarkersinurineofratswithspleenQideficiencyandbiologicalsignificance][J].ZhongguoZhongYaoZaZhi.2017Dec;42(24):4855-4863[90]陈银芳,傅应军,刘超,等.基于UPLC-Q-TOF-MS/MS技术的代谢组学法探索补气药干预气虚大鼠的生物学基础[J].中药新药与临床药理,2017,28(02):191-195.[91]AntonioRosato,LeonardoTenori,MartaCascante,etal.Fromcorrelationtocausation:analysisofmetabolomicsdatausingsystemsbiologyapproaches[J].Metabolomics.2018;14(4):37.[92]PanX,KentR,WonKJ,CholicAcidFeedingLeadstoIncreasedCYP2D6ExpressioninCYP2D6-HumanizedMice[J].DrugMetabDispos.2017;45(4):346-352.[93]冯利民,杜武勋,朱明丹,等.脂质组学在中医证的生物学基础研究中的优势探讨[J].中华中医药杂志(原中国医药学报),2012,27(11):2883-2886.[94]GaoS,ChenLY,WangP,etal.MicroRNAexpressioninsalivarysupernatantofpatientswithpancreaticcanceranditsrelationshipwithZHENG.BiomedResInt,2014:756347.[95]ZhangAH,SunH,QiuS.RecenthighlightsofmetabolomicsinChinesemedicinesyndrome46 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究research.EvidBasedComplementAlternatMed,2013:402159.[96]刘姬艳,江婷婷,李继承.中医证侯研究中蛋白质组学技术的应用进展[J].中华中医药杂志,2016,31(1):196-199[97]LinaLuo,JiriAubrecht,DingzhouLi,etal.Assessmentofserumbileacidprofilesasbiomarkersofliverinjuryandliverdiseaseinhumans[J].PLoSOne.2018;13(3):e0193824.[98]JadhavK,XuY,XuY,etal.ReversalofmetabolicdisordersbypharmacologicalactivationofbileacidreceptorsTGR5andFXR[J].MolMetab.2018Jan11.pii:S2212-8778(17)30919-5.[99]JangJ-H,RickenbacherA,HumarB,WeberA,RaptisDA,LehmannK,etal.Serotoninprotectsmouseliverfromcholestaticinjurybydecreasingbilesaltpoolafterbileductligation.Hepatology.2012;56(1):209–18.[100]BechmannLP,KocabayogluP,SowaJ-P,etal.Freefattyacidsrepresssmallheterodimerpartner(SHP)activationandadiponectincounteractsbileacid-inducedliverinjuryinsuperobesepatientswithnonalcoholicsteatohepatitis.Hepatology.2013;57(4):1394–406.[101]PéanN,DoignonI,GarcinI,BesnardA,JulienB,LiuB,etal.ThereceptorTGR5protectstheliverfrombileacidoverloadduringliverregenerationinmice.Hepatology.2013;58(4):1451–60.[102]孙晓风,周莹丽,陈君,等.熊去氧胆酸治疗非酒精性脂肪肝的临床疗效[J].肝脏,2014,19(03):198-199.[103]朱晨宇,高曰文,朱华,等.熊去氧胆酸与牛磺熊去氧胆酸治疗胆固醇性胆结石的疗效比较[J].中国药房,2012,23(04):321-322.[104]杨立伟,刘潇潇,巩珺,乔莉.清开灵系列品种中胆酸和猪去氧胆酸的通用检测定方法研究[J].中国药房,2012,23(35):3340-3342.[105]高永红,袁拯忠,牛福玲,等.猪胆酸对体外缺血再灌注大鼠脑微血管内皮细胞ICAM-1的影响[J].北京中医药大学学报,2007(10):670-673.[106]刘琦,刘春敏,任蕴芳,等.全反式维甲酸联合猪胆酸钠对人卵巢癌细胞生长抑制作用的影响[J].江苏医药,2002(11):822-824.[107]徐侠.胆石病患者的胆汁酸成份分析[D].大连医科大学,2011.[108]SehayekE,OnoJG,DuncanEM,etal.Hyodeoxycholicacidefficientlysuppressesatherosclerosisformationandplasmacholesterollevelsinmice[J].JLipidRes,2001,42(8):1250-1256.[109]赵妍,屈会化,张越,等.猪去氧胆酸人工抗原的合成及鉴定[J].中草药,2014,45(23):3387-3391.[110]赵艳红,王丹,王素军,张振清,阮金秀.清开灵注射液中非胆酸成分对胆酸和异去氧胆酸药代动力学影响[J].解放军药学学报,2007(03):178-181.[111]CohenBI,MatobaN,MosbachEH,etal.Bileacidssubstitutedinthe6positionpreventcholesterolgallstoneformationinthehamster[J].Gastroenterology.1990Feb;98(2):397-405.47 广州中医药大学2018届博士学位论文[112]DenkGU,MaitzS,WimmerR,etal.onjugationisessentialfortheanticholestaticeffectofNorUrsodeoxycholicacidintaurolithocholicacid-inducedcholestasisinratliver[J].Hepatology.2010;52(5):1758-68.[113]高文艳,林一帆,杨国玉,等.胆石片治疗伴胆囊结石的慢性胆囊炎肝胆气郁证:随机、双盲、对照临床试验[J].中国中西医结合消化杂志,2014,22(12):717-720+724.[114]侯淑英,朱宏安,宁丽.肝郁气滞型胆结石患者胆汁粘度的观察[J].中国中西医结合杂志,1996(07):401.[115]王梽.胆石病合并焦虑抑郁状态与胆石病中医证型相关性的研究[A].国际数字医学会.2017国际数字医学会数字中医药分会论文集[C].国际数字医学会:,2017:2.[116]王斯南.胆酸与宿主肠道菌群互作在肠腺瘤恶变中的机制研究[D].天津医科大学,2017.[117]YamadaS,KawaguchiH,YamadaT,etal.CholicAcidEnhancesVisceralAdiposity,AtherosclerosisandNonalcoholicFattyLiverDiseaseinMicrominipigs[J].JAtherosclerThromb.2017Nov1;24(11):1150-1166.[118]CarazoA,HyrsovaL,DusekJ,etal.Acetylateddeoxycholic(DCA)andcholic(CA)acidsarepotentligandsofpregnaneX(PXR)receptor［J］.ToxicolLett.2017;265:86-96.[119]Kong1,GaoX,WangC,etal.ProtectiveeffectsofyangoninfromanediblebotanicalKavaagainstlithocholicacid-inducedcholestasisandhepatotoxicity［J］.EurJPharmacol.2018;824:64-71.[120]LucangioliSE1,CastañoG,ContinMD,etal.Lithocholicacidasabiomarkerofintrahepaticcholestasisofpregnancyduringursodeoxycholicacidtreatment［J］.AnnClinBiochem.2009;46(Pt1):44-9.[121]CastañoG,LucangioliS,SookoianS,etal.Bileacidprofilesbycapillaryelectrophoresisinintrahepaticcholestasisofpregnancy［J］.ClinSci(Lond).2006;110(4):459-65.[122]HuangK,MukherjeeS,DesMaraisV,etal.TargetingthePXR-TLR4signalingpathwaytoreduceintestinalinflammationinanexperimentalmodelofnecrotizingenterocolitis［J］.PediatrRes.2018Jan23.[123]MrozMS1,LajczakNK1,GogginsBJ2,etal.Thebileacids,deoxycholicacidandursodeoxycholicacid,regulatecolonicepithelialwoundhealing.AmJPhysiolGastrointestLiverPhysiol.2018，314(3):G378-G387.[124]QihanWang,LongJiao,ChuanqiHe,etal.Alterationofgutmicrobiotainassociationwithcholesterolgallstoneformationinmice[J].BMCGastroenterol.2017;17(1):74.[125]SayinSI,WahlströmA,FelinJ,etal.Gutmicrobiotaregulatesbileacidmetabolismbyreducingthelevelsoftauro-beta-muricholicacid,anaturallyoccurringFXRantagonist[J].CellMetab.2013;17:225–35.[126]MidtvedtT.Microbialbileacidtransformation.AmJClinNutr.1974;27:1341–7.[127]CHENWen，GUOJunxia，CHANGPing.Theeffectoftaurineoncholesterolmetabolism［J］.MolNutrFoodRes，2012，56（5）:681－690.48 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究[128]HussainiSH,PereiraSP,MurphyGM,DowlingRH.Deoxycholicacidinfluencescholesterolsolubilizationandmicrocrystalnucleationtimeingallbladderbile.Hepatology.1995;22:1735–44.[129]丛培玮,许南阳,易杰.浅析“凡十一脏取决于胆”[J].辽宁中医药大学学报,2008(05):66-67.[130]陈明“.凡十一脏取决于胆”纵横谈[J].北京中医药大学学报，1994，17(1)：14-16.[131]查青林,何羿婷,吕爱平.类风湿关节炎寒热属性分类及其对中西药疗效的影响[J].江西中医学院学报,2007(06):21-23.49 广州中医药大学2018届博士学位论文结语1.分析胆结石患者和胆结石新发患者未发病节点和未发病人群血清胆汁酸代谢谱比较，和胆结石新发患者未发病节点和发病节点的分析，HDCA可能是贯穿胆结石发病过程中，能够预测胆结石发病机制的标志性代谢物。2.胆结石发病过程涉及生物学作用包括，胆汁酸生物合成，中性途径、FXR/RXR通路的激活、肝内胆汁淤积，生物分子网络涵盖：GATA3、GATA4、GATA6、GRB2、HNF4-α、KLF4、MYC、PAX1、POU5F1、SOX2、SOX7、TAF4、CEBPA、Sprr2，涉及生物学改变包括：胆汁酸合成障碍、体重异常、环磷腺苷合成异常。3.胆结石肝阴不足证和肝胆气郁证相比较，肝胆气郁组CA、LCA水平上调，GHCA水平下调。胆汁酸谱差异物涉及生物学作用为FXR/RXR通路的激活、PXR/RXR通路的激活、胆汁酸生物合成，中性途径、肝内胆汁淤积，相关连接因子包括：GATA3、GATA4、GATA6、GRB2、HNF4-α、KLF4、MYC、PAX1、POU5F1、SOX2、SOX7、TAF4、CEBPA、Sprr2，生物学改变类型有肝内胆汁淤积、胆汁酸合成障碍、环腺苷酸合成、结肠癌细胞激活、肌成纤维细胞激活、DNA损伤。肝胆气郁证与胆汁淤积相关性更大。4.代谢组学技术联合生物信息学技术是中西医结合探索疾病实质的的有效研究方法。为早期预测胆结石发病提供依据。50 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究附录51 广州中医药大学2018届博士学位论文附录2：评分量表中医症状信息及日常饮食情况问卷姓名：体检编号：填表时间：以下内容，请在所选择的项目的“︒”内划“√”。面色淡白︒有︒无面色萎黄︒有︒无面红︒有︒无口唇紫暗︒有︒无面部浮肿︒有︒无精神不振︒有︒无倦怠懒言︒有︒无消瘦︒有︒无形体肥胖︒有︒无心烦易怒︒有︒无畏寒︒有︒无畏热︒有︒无潮热︒有︒无自汗︒有︒无盗汗︒有︒无头晕︒有︒无头痛︒有︒无头胀︒有︒无头重脚轻︒有︒无头痛如裹︒有︒无视物模糊︒有︒无眼睛干涩︒有︒无目赤︒有︒无耳鸣︒有︒无听力下降︒有︒无失眠︒有︒无多梦︒有︒无易醒︒有︒无多寐︒有︒无健忘︒有︒无胸闷︒有︒无气短︒有︒无心悸︒有︒无胸胁胀痛︒有︒无局部刺痛︒有︒无食少︒有︒无饭后易胀︒有︒无多食易饥︒有︒无恶心︒有︒无烧心︒有︒无呕吐痰涎︒有︒无痰多︒有︒无白痰︒有︒无黄痰︒有︒无口黏腻︒有︒无口干多饮︒有︒无渴不欲饮︒有︒无喜喝温水︒有︒无喜喝凉水︒有︒无口苦︒有︒无腰膝酸软︒有︒无身体困重︒有︒无腰痛︒有︒无腰腿怕冷︒有︒无肢体浮肿︒有︒无肢体麻木︒有︒无皮肤干燥︒有︒无皮肤瘙痒︒有︒无关节疼痛︒有︒无外阴潮湿︒有︒无尿频︒有︒无小便短赤︒有︒无小便清长︒有︒无小便浑浊︒有︒无夜尿次/晚大便黏腻︒有︒无大便臭秽︒有︒无便秘︒有︒无便稀︒有︒无时干时稀︒有︒无舌象（医生填写）：脉象（医生填写）：中医证型（医生填写）3.日常饮食（1、2、4项可多选）饮食口味：︒嗜甜︒嗜咸︒嗜油炸食︒嗜热食︒嗜生冷︒素食︒辛辣︒其它是否经常吃：︒高脂肪食物︒油炸食物︒熏制食物︒腌制食物︒动物内脏︒海鲜︒啤酒︒豆制品︒高蛋白食品每天的主食量：︒半斤以下︒半斤-1斤︒1斤以上4）是否长期饮用：︒茶类︒咖啡︒软饮料︒白开水︒其它豆腐和豆制品:︒每天吃︒经常吃︒偶尔吃︒不吃6）奶和奶制品摄入量:︒每天吃︒经常吃︒偶尔吃︒不吃每月植物油/油脂消费量:︒>6斤︒2-5斤︒<2斤8）每月食盐消费量:︒>1斤︒0.5-1斤︒<0.5斤4.吸烟习惯︒不吸︒吸烟开始吸烟年龄:岁︒不详吸烟量:（支/日）︒偶尔吸（<1支/日）︒不详5.饮酒习惯︒不饮酒︒饮酒︒偶尔饮开始饮酒年龄:岁︒不详饮酒量:（两/天）︒偶尔饮︒不详饮酒类型（可多选）:︒白酒︒葡萄酒︒黄酒︒啤酒︒果酒︒红酒︒其他︒不详52 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究姓名：体检编号：填表时间：请在体检前填写完成，体检时请携带此表，谢谢！体检前一日进食食谱（以下内容，请在所选择的项目的“︒”内划“√”）主食肉、蛋鱼或其他海鲜蔬菜未吃种类量种类量种类量名称量︒馒头/面包类︒粥︒鸡蛋︒鱼类︒少量︒少量︒少量︒少量︒油条/油饼类︒牛奶︒瘦肉︒螃蟹早饭︒未吃︒适量︒适量︒适量︒适量︒包子/馅饼类︒麦片︒肥肉︒贝类︒大量︒大量︒大量︒大量︒豆浆/豆腐脑︒其他︒其他︒其他︒鸡蛋︒鱼类︒米饭︒少量︒少量︒少量︒少量︒瘦肉︒螃蟹中饭︒未吃︒面食︒适量︒适量︒适量︒适量︒肥肉︒贝类︒其他︒大量︒大量︒大量︒大量︒其他︒其他︒鸡蛋︒鱼类︒米饭︒少量︒少量︒少量︒少量︒瘦肉︒螃蟹晚饭︒未吃︒面食︒适量︒适量︒适量︒适量︒肥肉︒贝类︒其他︒大量︒大量︒大量︒大量︒其他︒其他︒西瓜︒哈密瓜︒桃子︒荔枝︒香蕉︒苹果︒樱桃︒葡萄水果/零食︒未吃︒少量︒适量︒大量︒梨︒其他：酒︒未饮︒白酒︒啤酒︒红酒︒其他酒酒精度：%︒少量︒适量︒大量茶︒未饮︒绿茶︒红茶︒普洱茶︒其他︒少量︒适量︒大量饮料咖︒未饮︒咖啡︒饮料︒其他︒少量︒适量︒大量啡吸烟︒未吸︒<10支︒11-20支︒21-30支︒>31支53 广州中医药大学2018届博士学位论文附录3：英文缩略语缩略语英文全称中文全称ATP881AdenosineTriphosphate881三磷酸腺苷881ACAApocholicAcid原胆酸CACholicAcid胆酸CCAChenocholicAcid鹅胆酸CA19-9Chlangiocarcinoma19-9糖蛋白抗原CBILConjugatedBilirubin结合胆红素CDCAChenodeoxycholicAcid鹅脱氧胆酸DCADeoxycholicAcid脱氧胆酸FBILFreeBilirubin游离胆红素成纤维细胞生长FGF19FibroblastGrowthFactor19因子19FXRFarnesoidXReceptor法尼醇X受体GSGallstone胆结石Gaschromatography-Mass气相色谱质谱联GC-MSSpectrometry用仪GCAGlycocholicAcid甘氨胆酸GCDCAGlycochenodeoxycholicAcid甘氨鹅脱氧胆酸GDCAGlycodeoxycholicAcid甘氨脱氧胆酸GHDCAGlycohyodeoxycholicAcid甘氨猪脱氧胆酸GLCAGlycolithocholicAcid甘氨石胆酸GUDCAGlycoursodeoxycholicAcid甘氨熊脱氧胆酸GGlycoλ-MuricholicAcid甘氨λ-鼠胆酸lambda-MCAGrowthFactorReceptorBound生长因子受体蛋GRBProtein白HCAHyocholicAcid猪胆酸HDLHighDensityLipoprotein高密度脂蛋白HDCAHyodeoxycholicAcid猪脱氧胆酸HNF4-αHepatocyteNuclearFactor4-alpha肝脏核因子HighPerformanceLiquid高效液相色谱飞HPLC-TOFChromatography-timeofFlight行时间IBILIndirectBilirubin间接胆红素54 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究IRInsulinResistance胰岛素抵抗Iso-LCAIsolithocholicAcid异石胆酸IPAIngenuityPathwayAnalysis生物信息分析JNKJunN-TerminalKinase氨基末端激酶KLF4Kruppel-likefactor4Kruppel样因子4LiquidChromatography-MassLC-MS液相色谱质谱联用仪SpectrometryLCALithocholicAcid石胆酸LDLLowDensityLipoprotein低密度脂蛋白lambda-MCAλ-MuricholicAcidλ-鼠胆酸MCAMurocholicAcid鼠胆酸MYCMyelocytomatosisOncogene骨髓细胞瘤致癌基因NMRNuclearMagneticResonance核磁共振NuclearReceptorsubfamily5,groupNR5A2核受体亚家族A,member2OptimizedPotentialsForLiquidOPLS正交偏最小二乘SimulationsPCAPrincipalComponentAnalysis主成分分析PAX1Pairedbox1配对盒基因-1POUdomain,class5,transcriptionPOU5F1POU5F1Factor1PON3Paraoxonase3对氧磷酶3PXRPregnaneXReceptor孕烷受体Sprr2Smallprolinrichprotein2富脯胺酸小蛋白TCTotalCholestrol总胆固醇TBILTotalBilirubin结合胆红素TBATotalBileAcid总胆汁酸TCATaurocholicAcid牛磺胆酸TCDCATaurochenodeoxycholicAcid牛磺鹅脱氧胆酸TCHOTotalCholesterol总胆固醇TDCATaurodeoxycholicAcid牛磺脱氧胆酸TGTriglyceride甘油三酯TLCATaurolithocholicAcid牛磺石胆酸TUDCATauroursodeoxycholicAcid牛磺熊脱氧胆酸55 广州中医药大学2018届博士学位论文THDCATaurohyodeoxycholicAcid牛磺猪脱氧胆酸Tlambda-MCATauroλ-MuricholicAcid牛磺λ-鼠胆酸UCAUrsodeoxycholicAcid熊胆酸UDCAUrsodeoxycholicAcid熊脱氧胆酸Ultra-highPerformanceLiquid超高效液相色谱UPLC-Q-TOF-Chromatography-Quadrupole-四极杆-飞行时间串MTime-of-FlightMassSpectrometry联质谱23-脱甲脱氧胆23-NDCA23-NordeoxycholicAcid酸6-KLCA6-KetolithocholicAcid6-酮基石胆酸7-KLCA7-KetolithocholicAcid7-酮基石胆酸12-KLCA12-KetolithocholicAcid12-酮基石胆酸7,12-二酮石胆7,12-DKLCA7,12-DiketolithocholicAcid酸7-KDCA7-KetodeoxycholicAcid7-酮基脱氧胆酸12-酮基鹅脱氧12-KCDCA12-KetochenodeoxycholicAcid胆酸56 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究附录4：代谢组学常见仪器耗材表促凝采血管（5ml）、抗凝采血管（2ml）、采血针（应根据样本采样耗材种类、样本量、检测目的）和检测条件进行合理选择一次性塑料滴管（3ml，据人数确定数量）常规实验室两种容积的EP管（3ml，据人数确定数量）耗材离心机2台（多管架自动平衡离心机，32孔）、移液器5-6把实验仪器（规格1ml）、天平1台（架盘天平，目前使用的为最大称量100g规格）一次性无菌手套、口罩、白大褂、胶布、EP管架、酒精喷壶、其他耗材剪刀、marker笔，据人数而定干冰（贮存于-80℃冰箱）、保温箱样品采集时间表、样品信息记录表、中医证候信息及日常饮食记录本问卷、体检前饮食记录一份附录5：EP管盖文字模板：血样：5G44冻存盒侧面文字模板北京社区血样年-月-日10002687457 广州中医药大学2018届博士学位论文在校期间发表论文情况发表论文：[1]陈依楚,李亮,衡先培,等.丹瓜方对ApoE~(-/-)糖尿病模型小鼠脑组织Caspase-3蛋白及Bcl-2、BaxmRNA表达水平的影响[J].中国中西医结合杂志,2017,37(12):1476-1481.[2]陈则旭,郑光,王耀献.基于文本挖掘方法对比2005年前后脑梗塞“证-法-药”差异[J].中国中医基础医学杂志,2018(5):[3]KangZheng，ZexuChen，WenSun.Hei-Gu-TengZhuifenghuoluogranuleModulatesIL-12SignalPathwaytoInhibittheInflammatoryResponseinRheumatoidArthritis[J].JournalOfImmunologyResearch,2018(5):58 血清胆汁酸谱动态变化对胆结石发病预测意义及证候研究致谢三年博士求学时光即将结束。在论文完成之际，回首往昔，几多耕耘，几多收获，几多汗水，可能留有遗憾，但也有不少精彩。自此由衷地感激一切。首先诚挚地感谢我的导师吕爱平教授。今天此番优秀的平台，都是吕爱平老师筚路蓝缕创建而来。上至等身课题著作，下至微细纸笔耗材,中则若干交流研发，无不凝聚着由吕老师及诸位同门的心血和智慧。以他为始的治学修身的严谨态度，孜孜不倦的科研精神，宽宏大度的博爱胸怀，对我们后学来说都是取之不尽的财富。感谢姜淼老师，感谢我在读期间课题建立的巨大帮助，对我的技能培养以及个人成长的关心与促进，她总是耐心地帮我修改论文、探讨课题。亦庄亦谐的她，以乐观积极的态度感染着课题组的大家。感谢吕诚老师，他始终秉持着睿智沉稳的风范为我的课题提出宝贵意见。感谢何小鹃老师、辛淑敏老师、李立博士、赵宁博士、张弛博士和白菁安师姐、程仕萍师姐、赵雨坤师兄对我工作中所有的关心和帮助。也感谢郑康、樊丹平、樊丹采、郭晴晴、陶黎、刘斌、舒海洋、刘学、邱雪梅、沈佳雯、罗会、孙文、张印、赵贺如、崔华、邓永琦、胡晗对我的关爱与温暖，以及陪我走过的青春岁月。感谢广州中医药大学以及教育过我的所有老师，谢谢你们对学生孜孜不倦的栽培。感谢符宇、王宇、钟子邵、黄晶一、刘文琛、黎金华、王吉菊、许玉珉、周明涛、郑转芳、黎智彬等同学，因为长期不在学校，特别感谢他们替我处理学校的大部分事务，以及对我专业及公共课程的学术指导和答疑解惑。感谢我的家人，总是在我身后默默地支持我，他们的包容和爱是我前进的动力。感谢我的朋友，为我的成功付出许许多多。自此，祝愿意大家吉祥如意，圆满成就！59 统计学审核证明学号：２０１５２１０２０４９兹有博士研究生陈则旭原：陈依楚（导师吕爱平）的｜学位论文《血清胆賺谱动态变化对繼石舖预臟义及证｜候研究》中有关统计学方面的内容，经我部门审定合格＃特此｜ｍ．ＩＩ广州中医药大学统雅教研室｜负责人：ｆＩ二０—八年５月于曰｜Ｉ
