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Ｈ＾ＨＨＭＭ——— 未经本论文作者的书面授权，依法收存和保管本论文书面版本、电子版本的任何单位和个人，均不得对本论义、修改、出的全部或部分内容进行任何形式的复制、发行租（但纯学术性使用、改编等有碍作者著作权的商业性使用。不在此限）。否则，应承担侵极的法律责任吉林大学博ｉ学位论文原创性声明位论文，是本人在指导教师的指导本人郑重声明：所呈交学引用的内立进行研究工作所取得的成果。除文中己经注明下，独已经发表或撰写过的作容外，本论文不包含任何其他个人或集体和集体，均已化文中品成果。对本文的硏究做巾亟要贡献的个人由本人承明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果担。学位论文作者签名：州《年（月＆Ｈ刖月； —————————————————————————————蛹虫草子实体对氧化应激介导疾病的药效学研究—————————————————————PharmacodynamicStudiesofCordycepsMilitarisFruitBodyonOxidativeStress-MediatedDiseases————————————————————————作者姓名：宋静静专业名称：微生物与生化药学研究方向：生物技术制药指导教师：王英武教授学位类别：理学博士培养单位：生命科学学院论文答辩日期：年月日授予学位日期：年月日论文评阅人：答辩委员会组成：姓名职称工作单位姓名职称工作单位盲审专家正高级南京大学主席张大方教授长春中医药大学盲审专家正高级北京协和医学院委员魏民教授东北师范大学盲审专家正高级中国药科大学睢大员教授吉林大学滕利荣教授吉林大学李又欣教授吉林大学I 中文摘要蛹虫草子实体对氧化应激介导疾病的药效学研究蛹虫草（Cordycepsmilitaris）又名北冬虫夏草、北虫草、蚕蛹虫草、蛹草等，是虫草属的模式种。蛹虫草子实体是蛹虫草的生殖细胞“孢子”进入某些昆虫的蛹后，萌发菌丝继而从昆虫蛹的身体上长出金黄色、或橘黄色、或橘红色的棍棒状物体，即蛹虫草子实体（CM）。CM是蛹虫草主要食用和药用的部分。根据中华人民共和国卫生部公告2009年第3号文件的相关通知，并且根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，蛹虫草已经被批准为新资源食品。冬虫夏草是我国传统的名贵中药材，是滋补身体和治疗疾病的佳品。随着人们保健意识逐渐增强，导致冬虫夏草需求量急剧增加，加之盲目的采挖，冬虫夏草资源已濒临灭绝。蛹虫草，与冬虫夏草同属的真菌，现代研究表明蛹虫草与冬虫夏草有着相同的活性成分和药效活性，是冬虫夏草最好的替代品。氧化应激是指机体内氧化-还原系统失衡，产生的过多氧自由基不能被消除，造成细胞或组织损伤，进而引发相关疾病的发生。随着生活节奏的加快、生活方式的改变和环境的污染，氧化应激介导的疾病，如疲劳、糖尿病、肾炎和肿瘤的发病率逐渐增加，严重影响了人们的身体健康、生活质量和生存寿命。因此，开展抑制氧化应激的相关产品，治疗或辅助治疗氧化应激介导的疾病是非常重要和必要的。目前，虽然对于CM的药效活性有研究报道，但其研究的深度和广度尚不够，作用机制尚不明确，有待于进一步深入系统的研究。本研究从氧化应激方面着手，开展CM多种药效活性的研究，拓宽CM药效学领域，阐明CM药效相关的作用机制，为CM进一步开发利用提供理论依据。首先，本文同时以多糖、腺苷、虫草素和虫草酸为提取成分，对CM进行水提工艺优化。得到的CM最优的简化水提工艺为：首先是CM第一次低温提取，提取温度为45℃，提取时间为3.0h，料液比为1:30，提取之后，4000rpm离心10min，保留上清液Ⅰ，继续对沉淀进行第二次高温提取，提取温度为80℃，提I 取时间为3.5h，料液比为1:30，提取之后，4000rpm离心10min，保留上清液Ⅱ，合并两次上清液，所得上清液即为最优条件下提取的CM水提物。此时得到的CM水提物多糖含量为29.01%、腺苷含量为0.21%、虫草素含量为0.42%，虫草酸含量为6.13%。在此提取工艺下，对CM进行抗疲劳、糖尿病、膜性肾小球肾炎（MGN）和肿瘤的活性研究。在CM抗疲劳活性研究中，以小鼠为研究对象，对小鼠口服给予2周CM后，通过滚轴实验、跑步实验和负重游泳实验发现CM可以显著延长小鼠的运动时间。与空白组相比，CM还可以提高ATP的含量和抗氧化酶的活性，降低LD、LDH、MDA和ROS的含量。westernblot实验结果表明CM可能是通过增强小鼠肝脏中AMPK、AKT、mTOR和ERK蛋白的活性表达抑制氧化应激，增强抗氧化酶的表达，减少氧自由基的积累，从而提高小鼠体内能量供给能力，进而表现出抗疲劳活性。在CM抗糖尿病活性研究中，采用高糖高脂喂养联合STZ注射的方法建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，对建模成功的糖尿病大鼠灌胃给予4周CM或二甲双胍（Met）治疗，给药期间监测大鼠的体重和空腹血糖。与模型组相比，CM可以显著降低糖尿病大鼠空腹血糖、水食摄入量和排尿量，改善糖尿病导致的体重下降，同时改善糖尿病造成的血脂代谢异常，降低TC、TG和LDL-C的含量，提高HDL-C的含量，并且CM可以降低尿蛋白、Scr、BUN、IL-2、IL-6和TNF-α的含量，对肾脏损伤有明显的改善作用。与模型组相比，CM可以提高糖尿病大鼠抗氧化酶SOD和GSH-Px活性和降低ROS和MDA含量，进一步实验数据表明，CM可能是通过抑制糖尿病大鼠肾脏中的AKT和GSK-3β磷酸化活性表达，进而抑制糖尿病大鼠氧化应激的发生，减少炎症因子的释放，从而对Ⅱ型糖尿病及其并发症肾病表现出治疗作用。在CM抗膜性肾小球肾炎（MGN）活性研究中，大鼠尾静脉注射阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）建立MGN大鼠模型，对MGN大鼠灌胃给予4周CM和雷公藤多苷（TWG）治疗，与模型组相比，CM可以显著降低24-h尿蛋白、TC、TG、Scr和BUN的含量，提高血清总蛋白和白蛋白的含量，进而改善肾脏损伤；同时，CM可以提高MGN大鼠的抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性，降低ROS、MDA和相关炎症因子，如IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1II 的含量，并且可以抑制肾脏中AKT和NF-κB的活性表达，进而抑制氧化应激和炎症因子的表达从而对MGN大鼠表现出肾脏保护作用。在CM抗肿瘤活性研究中，以MCF-7和HepG2为肿瘤细胞模型进行体内和体外实验研究。实验结果表明，CM能够抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，并且通过促进肿瘤细胞内ROS的产生，降低线粒体膜电位，激活线粒体凋亡途径，促进线粒体凋亡相关蛋白caspase-3、Bax、caspase-8和PARP的表达，进而介导肿瘤细胞的凋亡；体内实验HepG2和MCF-7细胞的异位肿瘤裸鼠模型进一步证实CM可以通过线粒体凋亡途径介导肿瘤细胞的凋亡。关键词：蛹虫草子实体，氧化应激，疲劳，糖尿病，膜性肾小球肾炎，肿瘤III ABSTRACTPharmacodynamicstudiesofCordycepsMilitarisFruitBodyonOxidativeStress-MediatedDiseasesCordycepsmilitaris,alsocalledNorthCordycepssinensis,silkwormpupaCordyceps,pupaegrass,etc.,belongstoCordycepsFungus.CordycepsmilitarisfruitbodyisthemainedibleandmedicinalpartofCordycepsmilitaris.AccordingtotheannouncementofMinistryofHealthofthePeople'sRepublicofChina,Cordycepsmilitarishasbeenapprovedasanewresourceoffood.CordycepssinensisisatraditionalChinesemedicineinthehistory,whichisusedfornourishingbodiesandtreatingdiseases.Withtheincreasingofpeople'shealthconsciousness,thedemandofCordycepssinensishasbeenincreasingdramatically.TheresourceofCordycepssinensisisonthevergeofextinctionforover-exploitation.Cordycepsmilitaris,anentomopathogenicfungusbelongingtotheclassascomycetes,containsvariouspharmacologicalcomponentsandpossessesvariouspharmacologicalactivities,thesameasCordycepssinensis,soCordycepsmilitarisisthebestalternativeofCordycepssinensis.Oxidativestressreferstotheimbalanceofoxidation-reductionsysteminthebody,andtheoverproductionoffreeoxygenradicalscouldcausecellandtissuedamage,furtherleadtodiseases.Withtheacceleratedpaceoflife,thechangesinlifestyleandthepollutionofenvironment,thediseasesmediatedbyoxidativestress,suchasfatigue,diabetes,nephropathyandcancer,havebeengraduallywidespread,andseriouslyaffectedtheperson’shealth,lifequalityandlifetime.Therefore,it’sveryimportanttocarryouttheproductstoinhibitoxidativestress.AlthoughthebiologicalactivitiesofCMhavebeenreported,thebreadthanddepthofthesestudiesarestillnotenough,andtheactionmechanismisstillunclear,soit’simportantforthefurtherresearch.Inthisstudy,variouspharmacologicalactivitiescenteronoxidativestressofCMwerecarriedout,andtriedtoclarifytheIV actionmechanismwhichcouldprovidetheoreticalbasisforfurtherdevelopmentofCM.First,thisexperimentstudiedtheprocessoptimizationoftheaqueousextractofCordycepsmilitarisfruitbodywiththeexpectedvalueasmeasureindex,whichwasbuiltwiththecontentofpolysaccharide,adenosine,cordycepinandcordycepsacid.Basedonsingle-factoroptimizationstrategyandBox-Behnkendesign,theoptimalextractionprocessofCordycepsmilitarisfruitbodywasgot,andthatcouldbedescribedasCordycepsmilitarisfruitbodywasfirstlyextractedwith30volumesofdoubledistilled(D.D.)waterat45℃for3.0h,then4000rpmcentrifugefor10min,thesupernatantnamedⅠ;aftercentrifugation,theresiduewassecondlyextractedwith30volumesofD.D.waterat80℃foranother3.5h,4000rpmcentrifugefor10min,thesupernatantnamedⅡ;themergedsupernatantwastheaqueousextractofCordycepsmilitarisfruitbody.Cordycepsmilitarisfruitbodyaqueousextractcontains29.01%polysaccharides,0.21%adenosine,0.42%cordycepinand6.13%cordycepicacid.Inthestudyofanti-fatigueactivityofCM,2-weekCMadministrationsignificantlydelayedfatiguephenomenonwhichwasconfirmedviarotatingrodtest,forcedswimmingtestandforcedrunningtestinmousemodel.Comparedtonon-treatedmouse,CMadministrationincreasedATPlevelsandanti-oxidativeenzymesactivities,andreducedthelevelsofLD,LDH,MDAandROS,FurtherdatasuggestedthatCM-inducedfatiguerecoverywasmainlythroughactivatingAMPKandAKT/mTORpathways,andthephosphorylationofAMPKwithCM-enhancedcontributedtoitsanti-oxidanteffect.Altogether,CMcouldattenuateoxidativestressforincreasingATPandreducingtheaccumulationofmetabolitesthendelayfatigueappearance.InthestudyofantidiabeticandantinephriticeffectsofCMindiet-streptozotocin(STZ)-induceddiabeticrats,thefastingbloodglucoseandbodyweightofeachratweremonitoredduringfourweeksofcontinuousoraladministrationofCMatdosesof0.5,1.0,and2.0g/kgandmetforminat100mg/kg.Comparedtonon-treateddiabeticrats,hypoglycemiceffectsofCMondiabeticratswereindicatedbydecreasesV inplasmaglucose,foodandwatertake,andurineoutput.ThehypolipidemicactivityofCMwasconfirmedbythenormalizationofTC,TG,andLDL-CandHDL-Cindiabeticrats.Inhibitoryeffectsonalbuminuria,creatinine,ureanitrogen,andinflammatoryfactorsverifieditsrenalprotectiveactivityindiabeticrats.Furthermore,CMcouldenhancetheactivitiesofSODandGSH-Px，andreducethelevelsofMDAandROS,comparedtonon-treateddiabeticrats,CMdecreasedtheexpressionsofphosphor-AKTandphosphor-GSK-3βinthekidneys.Altogether,viaattenuatingoxidativestress,CMdisplayedantidiabeticandantinephriticactivitiesindiet-STZ-induceddiabeticrats.Inthestudyofanti-membranousglomerulonephritis(MGN)activityofCM,thecationicbovineserumalbumin(C-BSA)-inducedratmodelwereused.SignificantrenaldysfunctionwasobservedinMGNrats,comparatively,4-weekCMadministrationstronglydecreasedthelevelsof24-hurineprotein,totalcholesterol,triglyceride,bloodureanitrogenandserumcreatinine,andincreasedthelevelsofserumalbuminandtotalserumprotein.StrikinglyrecoveringkidneyhistologicalarchitecturewasnotedinCM-treatedMGNrats.Meanwhile,CMcouldsignificantlyimprovetheactivitiesofSODandGSH-Px,reducethelevelsofMDAandROScomparedtonon-treatedMGNrats.AlteredlevelsofinflammatorycytokinesincludingIL-2,IL-6,MCP-1,ICAM-1,VCAM-1,TNF-α,andNF-κBp65revertedtothenormallevelupontreatmentwithCM.ThepresentdatasuggestthatCMprotectstheratsagainstmembranousglomerulonephritisviathenormalizationofNF-κBactivity,therebyinhibitstheoxidativedamageandreducesinflammatorycytokineslevels.IntheexperimentofCMonanti-tumoractivity,CMreducedcellviability,inhibitedcellproliferationandcellmigrationability,causedtheover-productionofROS,inducedmitochondrialdysfunction,thenenhancedapoptoticrateinMCF-7andHepG2cells.TheexpressionsofcleavedPARPandcaspase-3,thehall-biomarkersofapoptosis,wereincreasedafter24-hCMtreatment.Furthermore,inbothMCF-7andHepG2cells,theenhancedlevelsofBaxandcleavedcaspase-8wereobservedinCM-treatedcells.Finally,theanti-tumoractivitiesofCMonhepatocellularcarcinomaVI andbreastcancerwereconfirmedinMCF-7andHepG2-xengraftednudemicemodel.Collectively,CMcouldenhancetheproductionofROS,causeoxidativestress,thenactivatethemitochondriaapoptoticsignalingpathwaystoinducetheapoptosisofMCF-7andHepG2cellsKeywords:Cordycepsmilitarisfruitbody,oxidativestress,fatigue,diabetes,membranousglomerulonephritis,tumorVII 英文缩略词缩写中文名称英文全称ACE血管紧张素转换酶AngiotensinconvertingenzymeADA美国糖尿病协会AmericandiabetesassociationAdvancedglycosylatedendAGEs终末端糖基化产物productsAdenosinemonophosphateAMPK腺苷酸活化蛋白激酶activatedproteinkinaseATP三磷酸腺苷AdenosinetriphosphateAUC曲线面积AreaunderthecurveBSA牛血清白蛋白BovineserumalbuminBUN尿素氮BloodureanitrogenC−BSA阳离子化牛血清白蛋白CationicbovineserumalbuminCM蛹虫草子实体CordycepsmilitarisfruitbodyDMSO二甲基亚砜DimethylsulfoxideEDA无水乙二胺EthylenediamineanhydrousEDC碳化二亚胺CarbodiimideEnzyme-linkedimmunosorbentELISA酶联免疫吸附测定assayeNOS内皮一氧化氮合成酶EndothelialnitricoxidesynthaseFBG空腹血糖Fastingblood-glucoseFBS胎牛血清FetalbovineserumGBM肾小球基膜GlomerularbasementmembraneGLP-1胰高血糖素样肽1Glucagon-likepeptide-1GSH-Px谷胱甘肽过氧化物酶GlutathioneperoxidaseHCC肝细胞癌HepatocellularcarcinomaHDL-C高密度脂蛋白胆固醇HighdensitylipoproteincholesterolHFHSD高脂高糖饲料HighfatandhighglucosefoodVIII 缩写中文名称英文全称HighperformanceliquidHPLC高效液相色谱法chromatographyICAM-1细胞间黏附分子-1Intercellularadhesionmolecule-1iCCA肝内胆管癌IntrahepaticcholangiocarcinomaIDF国际糖尿病联盟Internationaldiabetesfederation,INS胰岛素Insulin四氯-四乙基苯并咪唑基羰5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraetJC-1花青碘化物hyl-imidacarbocyanineiodideLD乳酸LacticacidLDH乳酸脱氢酶LactatedehydrogenaseLDL-C低密度脂蛋白胆固醇LowdensitylipoproteincholesterolMCP-1单核细胞趋化蛋白-1Monocytechemoattractantprotein-1MDA丙二醛MethanedicarboxylicaldehydeMet二甲双胍MetforminMGN膜性肾小球肾炎MembranousglomerulonephritisMN膜性肾病MembranousnephropathyMitochondrialoutermembraneMOMP线粒体外膜通透性permeabilizationmTOR雷帕霉素靶蛋白Mammaliantargetofrapamycin3-(4,5-dimethylthiazole-2)-2,3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，MTT5-diphenyl4azolenitrogen5-二苯基四氮唑溴盐brominesaltNAGN-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶N-acetyl-β-d-glucosaminidaseNF-κB核转录因子NucleartranscriptionfactorNMDAN-甲基-D天冬氨酸N-methyl-D-aspartateNrf2核因子相关因子NF-E2-relatedfactor2PBS磷酸盐缓冲液PhosphatebuffersolutionIX 缩写中文名称英文全称PK丙酮酸激酶PyruvatekinasePKC蛋白激酶CProteinkinaseCROS活性氧Reactiveoxygenspeciesrpm转/分钟RevolutionsperminuteRSA响应面分析ResponsesurfaceanalysisScr血尿肌酐SerumurinecreatinineSOD超氧化物歧化酶SuperoxidedismutaseSTZ链脲佐菌素StreptozocinT睾酮TestosteroneT2DMⅡ型糖尿病Type2diabctesmellitusTC总胆固醇TotalcholesterolTG甘油三酯TriglycerideTNF-α肿瘤坏死因子TumornecrosisfactorTWG雷公藤多苷TripterygiumwilfordiiglycosidesVascularendothelialcelladhesionVCAM-1血管内皮细胞粘附分子-1molecule-1WHO世界卫生组织WorldhealthorganizationX 目录中文摘要................................................IABSTRACT...............................................IV英文缩略词...........................................VIII目录................................................XI第一章绪论.............................................11.1蛹虫草子实体概述...................................11.1.1蛹虫草子实体简介...............................11.1.2蛹虫草子实体的人工培养.........................11.1.3蛹虫草的主要活性成分及药效.....................21.1.4蛹虫草产品.....................................31.2氧化应激..........................................41.2.1氧化应激概述...................................41.2.2氧化应激机制...................................41.2.3氧化应激介导的疾病.............................51.3蛹虫草子实体对氧化应激介导疾病的研究..............111.4立题背景与意义....................................111.4.1立题背景......................................111.4.2研究意义......................................12第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化.................132.1仪器与材料.......................................132.1.1主要仪器......................................132.1.2主要试剂......................................132.2实验方法.........................................142.2.1有效成分含量的检测方法........................14XI 2.2.2满意度函数的建立..............................152.2.3单因素实验优化CM水提工艺.....................162.2.4响应面法优化CM水提工艺.......................172.2.5验证实验......................................182.3实验结果.........................................182.3.1单因素实验优化结果............................182.3.2响应面法优化结果..............................222.3.3验证实验......................................272.4实验讨论.........................................282.5本章小结.........................................29第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究.....................313.1仪器与材料.......................................313.1.1主要仪器......................................313.1.2主要试剂......................................323.1.3主要检测试剂盒................................323.1.4实验动物......................................333.2实验方法.........................................333.2.1CM水提物制备.................................333.2.2CM对小鼠抗疲劳能力的测试.....................333.2.3样品收集......................................343.2.4ATP、乳酸和LDH含量测定.......................343.2.5CM对小鼠抗氧化能力的影响.....................343.2.6CM对小鼠体内激素水平的影响....................353.2.7Westernblot实验.............................353.2.8统计方法学分析................................35XII 3.3实验结果.........................................353.3.1抗疲劳能力测定................................353.3.2CM对游泳前后小鼠体内ATP含量的影响............383.3.3CM对游泳前后小鼠LD含量的影响.................393.3.4CM对游泳前后小鼠LDH活性的影响...............423.3.5CM对小鼠抗氧化能力的影响.....................453.3.6Westernblot实验.............................463.3.7CM对游泳前后小鼠激素水平的影响................503.4实验讨论.........................................523.5本章小结.........................................54第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究.......................................554.1仪器与材料.......................................554.1.1主要仪器......................................564.1.2主要试剂......................................564.1.3主要检测试剂盒................................564.1.4实验动物......................................574.2实验方法.........................................574.2.1HFHSD喂养联合STZ注射建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型...574.2.2给药与分组....................................584.2.3大鼠饮食、饮水、尿量测定......................584.2.4糖耐量实验....................................584.2.5样品收集......................................584.2.6生化指标检测..................................584.2.7ELISA检测....................................59XIII 4.2.8病理形态学观察................................594.2.9Westernblot实验.............................594.2.10统计方法学分析...............................594.3实验结果.........................................594.3.1CM对糖尿病大鼠体重的影响.....................604.3.2蛹虫草子实体对大鼠饮食、饮水和尿量的影响......604.3.3CM对糖尿病大鼠空腹血糖的影响..................624.3.4CM对糖尿病大鼠糖耐量的影响....................624.3.5CM对糖尿病大鼠胰岛素含量的影响................644.3.6CM对糖尿病大鼠PK活力的影响...................654.3.7CM对糖尿病大鼠血脂代谢的影响..................664.3.8CM对血清中Scr、BUN和NAG以及尿蛋白含量的影响.684.3.9CM对大鼠抗氧化能力的影响.....................694.3.10CM对大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α含量的影响.714.3.11H&E染色对肾脏病理学变化的观察................734.3.12Westernblot实验............................744.4实验讨论.........................................754.5本章小结.........................................77第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究.......................................................795.1仪器与材料.......................................795.1.1主要仪器......................................795.1.2主要试剂......................................805.1.3主要检测试剂盒................................805.1.4实验动物......................................81XIV 5.2实验方法.........................................815.2.1阳离子化牛血清白蛋白（C−BSA）的制备...........815.2.2MGN大鼠模型的建立和分组给药...................825.2.3样品收集......................................825.2.4生化指标检测..................................825.2.5ELISA检测....................................835.2.6病理形态学观察................................835.2.7Westernblot实验.............................835.2.8统计方法学分析................................835.3实验结果.........................................835.3.1CM对MGN大鼠体重的影响.......................835.3.2CM对MGN大鼠24-h尿蛋白的影响.................845.3.3CM对MGN大鼠血清中蛋白含量的影响..............855.3.4CM对MGN大鼠Scr和BUN含量的影响..............865.3.5CM对MGN大鼠血脂代谢的影响....................875.3.6CM对MGN大鼠抗氧化能力的影响..................885.3.7CM对MGN大鼠血清ELISA检测....................905.3.8H&E染色对肾脏病理形态学观察...................955.3.9Westernblot实验.............................965.4实验讨论.........................................975.5本章小结.........................................99第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究......1016.1仪器与材料......................................1016.1.1主要仪器.....................................1016.1.2主要试剂.....................................102XV 6.1.3主要检测试剂盒...............................1026.1.4细胞株......................................1036.1.5实验动物.....................................1036.2实验方法........................................1036.2.1MTT实验.....................................1036.2.2结晶紫实验...................................1036.2.3细胞迁移实验.................................1046.2.4LDH活性测定.................................1046.2.5Hoechst染色.................................1046.2.6ROS实验.....................................1046.2.7线粒体膜电位实验.............................1046.2.8Westernblot实验............................1056.2.9体内裸鼠实验.................................1056.2.10统计方法学分析..............................1056.3实验结果........................................1056.3.1MTT实验.....................................1066.3.2结晶紫实验...................................1076.3.3细胞迁移实验.................................1086.3.4LDH活性测定.................................1096.3.5Hoechst实验.................................1106.3.6ROS实验.....................................1116.3.7线粒体膜电位实验.............................1126.3.8Westernblot实验............................1136.3.9裸鼠体内实验.................................1156.4实验讨论........................................118XVI 6.5本章小结........................................119第七章结论与展望.....................................1217.1结论............................................1217.2展望............................................121参考文献..............................................123作者简介及在学期间所取得的科研成果.....................141致谢..................................................145XVII 第一章绪论第一章绪论1.1蛹虫草子实体概述1.1.1蛹虫草子实体简介蛹虫草（Cordycepsmilitaris）又名北冬虫夏草、北虫草、蚕蛹虫草、蛹草等，是虫草属的模式种，在生物分类学上属于真菌门、子囊菌亚门、核菌纲、球壳菌目、麦角菌科、虫草属[1]。蛹虫草子实体是蛹虫草的生殖细胞“孢子”进入某些昆虫的蛹后，萌发菌丝继而从昆虫蛹的身体上长出金黄色、或橘黄色、或橘红色的棍棒状物体，即蛹虫草子实体。蛹虫草子实体是蛹虫草主要食用和药用的部分。根据中华人民共和国卫生部公告2009年第3号文件的相关通知，并且根据《中华人民共和国食品安全法》和《新资源食品管理办法》的规定，蛹虫草已经被批准为新资源食品。1.1.2蛹虫草子实体的人工培养野生蛹虫草在世界各地均有分布，是一种世界性分布的广布种。在中国，野生蛹虫草主要分布在吉林、辽宁、河北、云南等地，分布范围比较广[2]。但是由于野生的蛹虫草数量非常稀少，并且人们对蛹虫草的需求量逐渐增大，野生蛹虫草资源已经不能满足市场的需求，因而需要人工培育蛹虫草来弥补天然蛹虫草资源的不足。19世纪60年代，DeBary首次在昆虫上进行了蛹虫草子实体的培养，之后人们在不同的昆虫身上进行蛹虫草培植实验，最后发现Daeseungjam品种的蚕蛹是最适合做蛹虫草子实体的基质[3]。但是由于昆虫的价格、微生物易感染和不易操作等原因，人们开始选择有机物作为蛹虫草子实体的培养基。1941年，Kobayasi发现可以在大米上培养出蛹虫草子实体[4]，自此，大米便成为蛹虫草子实体培养基质中最主要的原料。随着对蛹虫草子实体的不断了解，人工培养技术也日臻成熟。目前蛹虫草的人工培养主要包括：菌丝体液体发酵培养，人工子实体培养和昆虫活体人工培养[5]。蛹虫草人工培养基的碳源、氮源、无机元素等因素以及培1 吉林大学博士学位论文养时间、温度、光照、空气交换和湿度等条件对蛹虫草菌丝体或子实体的产量及活性物质的含量都有重要的影响[6]。由于市场对蛹虫草子实体产量或活性成分含量的要求，研究者通过选择不同基质的培养基或在培养基中加入某一些元素来满足市场的需求。例如，在蛹虫草子实体培养基中加入激素玉米素、吲哚乙酸可以提高蛹虫草子实体的生长速度和多糖含量[7]；以大米和纯柞蚕蛹为培养基可以获得虫草素和腺苷含量较高的蛹虫草[8]，并且在培养基中加入硒元素，会提高蛹虫草子实体中虫草素和虫草酸含量[9]。1.1.3蛹虫草的主要活性成分及药效1.1.3.1虫草素虫草素，即3’-脱氧腺苷，是蛹虫草中最主要的核苷类成分，由Cunningham等人从蛹虫草的培养滤液中首次分离[10]，虫草素因其通过甲基化发挥毒性而著名[11]。研究表明，虫草素具有抑菌、免疫调节和抗肿瘤等作用。Ahn等人研究发现虫草素可以抑制梭形或梭状的芽孢杆菌的生长[12]；同时虫草素也可以抑制胶原蛋白诱导的血小板凝集[13]，并且可以通过成熟树突状细胞调节T细胞的增殖[14]；虫草素可以抑制移植在小鼠体内B16黑色素瘤的生长[15]，Kodama等人发现虫草素可以有效地治疗白血病，对TdT阳性的白血病效果更明显[16]。1.1.3.2蛹虫草多糖蛹虫草多糖是蛹虫草含量最多的活性成分，主要是由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、葡萄糖、海藻糖等组成的多聚糖[17]。由于多糖成分的复杂性，虫草多糖显示出多种药理活性。研究表明蛹虫草多糖具有抗炎、抑菌、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等作用。Liu等人发现蛹虫草多糖在小鼠体内具有抗炎和抑制体液免疫的作用[16]；Jing等人发现蛹虫草子实体多糖可以清除氧自由基并抑制A549肿瘤细胞的增殖[18]；孟兆丽等人发现蛹虫草多糖具有抗氧化和抑菌的能力[19]；孙纳新发现蛹虫草子实体多糖可以降低STZ诱导糖尿病小鼠中的血糖[20]。1.1.3.3虫草酸虫草酸，于1957年首次被推断出化学结构，后被证实为D-甘露醇[21]，具有利尿脱水、提高血浆渗透压、镇喘祛痰、抗自由基等药理作用[1]，目前主要用于2 第一章绪论擦伤材料和药物添加剂[22]，虫草酸主要通过高碘酸钠比色法进行含量测定[23]。1.1.3.4腺苷腺苷是人体的一种内源性核苷，具有广泛的生理作用。腺苷可以在心肌细胞中磷酸化生成腺苷酸，参与心肌细胞的能量代谢，还可以促进冠脉血管的扩张，增加血流量；同时腺苷还参与机体的呼吸系统、血液循环系统、激素分泌等生理过程，在机体的生理过程中起着非常重要的作用[24]。在蛹虫草子实体中，腺苷因其相对较多的含量，在蛹虫草子实体药效活性中发挥着重要的作用。1.1.3.5虫草多肽目前，从虫草中分离出的多肽主要有ES-242S和两种环形多肽，即虫草多肽A和虫草多肽B[25]。ES-242S，作为N-甲基-D天冬氨酸（NMDA）的受体拮抗剂表现了很强的活性[26]。虫草多肽A则表现出抗疟疾活性，虫草多肽B活性并不显著，并且两种环形多肽都表现出温和的细胞毒性[27]。1.1.3.6凝集素Jung等人在蛹虫草中发现了凝集素，这种凝集素对小鼠或大鼠中的红细胞具有凝集活性[28]，并且可以促进小鼠脾细胞的有丝分裂[13]，但是蛹虫草中凝集素的N-端氨基酸序列不同于其它凝集素。1.1.3.7其他成分蛹虫草中还含有无机元素、超氧化物歧化酶、黄酮类物质、维生素等重要活性成分，每种活性成分都有自己独特的生物活性，它们共同参与着蛹虫草的多种药效活性。1.1.4蛹虫草产品由于蛹虫草的成分复杂，药理活性较多，蛹虫草作为滋补的药食真菌在食品保健和医药领域发挥着重要的作用。1997年，美国FDA正式批准虫草素为抗肿瘤新药，目前已经进入三期临床，由于目前虫草素化学合成产率很低，蛹虫草仍是虫草素主要的原料来源。我国对于蛹虫草的开发相较国外要晚一些，目前，蛹虫草主要作为功能食品或中药复方产品活跃在市场上，如蛹虫草饮料、蛹虫草膏、蛹虫草保健黄酒等保3 吉林大学博士学位论文健食品和蛹虫草含片、北虫草止痒露、虫草罗汉精等虫草复方药物，对多种疾病具有治疗或辅助治疗效果[29]。1.2氧化应激1.2.1氧化应激概述一百多年前，MosesGomberg首次提出了自由基的概念；30年之后，LeonorMichaelis提出了自由基参与所有的氧化反应，包括器官分子；20世纪50年代，在生物系统中发现了自由基，随后进一步发现自由基参与多种疾病病理的发生以及衰老；在1985年，H.Sies首次定义了氧化应激。目前，氧化应激被定义为细胞内的氧化-还原系统失衡，导致活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）处于较高的浓度，进而造成细胞和结构损伤[30]。外源的氧化剂或复合物、ROS的过度产生和抗氧化系统的减弱都会造成氧化应激的发生。Lushchak将氧化应激分为三种形式，即急性氧化应激、慢性氧化应激和拟-稳态水平[31]。在正常生理条件下，生物体内的ROS维持在一定浓度，由于某些原因，比如特定氧化剂的进入，导致生物体内ROS含量急剧上升，此时生物体内抗氧化防御系统，如抗氧化物或抗氧化酶，能够抵御急剧上升的ROS，使其恢复到最初生理状态下浓度，即为“急性氧化应激”；如果生物体内抗氧化系统不能使ROS迅速恢复到最初生理状态下浓度，那么恢复到最初浓度的时间会被延长，此时为“慢性氧化应激”；如果在慢性应激的状态下，外界氧化物质又在不断地侵入生物体内，此时，ROS会不断积累，生物体为适应这种状态会将最初生理状态下的ROS浓度上升，这种状态被称为“拟-稳态水平”[31-32]。1.2.2氧化应激机制目前将氧化应激严重程度分为4个阶段：最初阶段、轻度氧化应激、中度氧化应激和严重氧化应激[31,33]。当氧化应激发生时，生物体会采用中断生物循环过程中所需大量生物物质合成的方式，去阻止或消除ROS带给生物体的负面影响，为应对ROS的过度产生，机体会调节各种信号分子或基因来促进抗氧化物或相关抗氧化酶的表达[31]，进而提高生物体内的抗氧化能力，消除多余的ROS，使其恢复到最初的稳定浓度。4 第一章绪论哺乳动物对氧化应激的反应是一种复杂的级联反应，并且对不同程度的氧化应激所作出的生理反应也是不同的。在轻度或中度氧化应激时，生物体会通过激活Nrf2/Keap1系统来调节氧化应激。核因子相关因子（NF-E2-relatedfactor2，Nrf2）是亮氨酸拉链家族的转录因子，与Kelch-likeECH-associatedProtein1（Keap1）蛋白相互结合，Nrf2和Keap1蛋白共同作用调节抗氧化系统，进而阻止过氧化物或亲电外源物质对生物体的破坏[34-36]。正常生理状态下，Nrf2蛋白与Keap1相互结合在一起，是E3泛素连接酶链接的CUL3和RBX1复合物的底物适配蛋白。当生物体内ROS大量增加时，Keap1蛋白的硫醇部分被氧化，使Nrf2脱离Keap1蛋白进入细胞核，促进靶向目的基因对抗氧化物和相关酶类的表达，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、GST转移酶，或γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶等，进而提高生物体体内的抗氧化能力[32,35]，Nrf2/Keap1途径是细胞调节氧化应激的重要途径。在氧化应激严重时，至少有三种调节系统参与到氧化应激反应中，分别是以核转录因子（NF-κB）、AP-1和MAP激酶为中心的三种调节系统[31]。这些系统可以通过上调抗氧化物或抗氧化酶的表达进而提高生物体的抗氧化能力，但同时也会上调炎症相关基因，促进炎症相关因子的表达[37]。生物体内，大部分ROS是在线粒体内产生的，ROS的产生主要依赖于线粒体内膜的电化学梯度[31]。当生物体内Nrf2/Keap1、NF-κB、AP-1和MAP激酶相关系统不足以抵抗氧化应激时，生物体会通过调节线粒体通透性转换孔来抑制ROS的产生，如果此时仍不能有效的控制氧化应激，细胞会发出最后一道防御措施，即细胞凋亡。总之，生物体会根据不同程度的氧化应激产生不同的生理机制，做出不同的生理反应。1.2.3氧化应激介导的疾病在生物体内，由于外源的氧化剂、ROS的过度产生和抗氧化系统的减弱等原因造成氧化应激的发生，使生物体内ROS处于较高水平，造成细胞和组织最初生理平衡状态被打乱，引起细胞和组织的损伤，进而造成各种疾病的发生，例如癌症[34,38]、心脑血管疾病[39-40]、糖尿病[41]、神经退行性疾病[42-43]等等，严重威胁着人类的身体健康。5 吉林大学博士学位论文1.2.3.1氧化应激与疲劳疲劳没有确切的定义，因为疲劳的感觉是很主观的，在劳累引起的疲劳和临床上相关疾病引起的疲劳很难确切定义。目前临床上，疲劳被定义为在启动或维持自己的活动时存在困难[44]，一般分为心理疲劳和身体疲劳，身体疲劳又可以分为中枢疲劳和外周疲劳[45]。随着社会的发展，人们的心理和工作压力越来越大，疲劳已经成为一种普遍的社会现象，严重影响人们的生活质量。疲劳使人精神涣散，注意力不集中[46-47]，并且长期处于疲劳状态，会导致精神类和其它健康疾病，如抑郁症、疲劳综合征和过劳死[48-49]。研究表明，目前有63.4%的年轻人正处于疲劳状态或经受着疲劳引起的疾病[46]，疲劳已经成为威胁人类健康的重要因素。疲劳是一个复杂的身体反应变化过程，从中枢到外周，包括整个机体、组织器官和细胞分子都参与了疲劳的发生。在机体代谢过程中，2-3%的氧进入机体后转变为氧自由基，这些氧自由基一方面作为信号转导分子参与人体的正常生理过程；另一方面，氧自由基又极为活跃和不稳定，过量的氧自由基会造成细胞结构和功能的破坏，进而引起氧化应激反应[50]。研究表明，氧化应激对疲劳的发生起着非常重要的影响，ROS可以作为信号分子参与葡萄糖和脂质的代谢[51-52]，但在运动过程中，肌肉和肝脏会产生大量的ROS[53-54]，造成机体氧化-还原系统的失衡，进而影响肌肉对葡萄糖的摄取[55]，最终导致运动能量不足，引发疲劳；另一+面，在运动过程中，会造成乳酸、H等代谢产物的积累，导致细胞内环境失衡，+线粒体是产生ROS的主要场所，由于运动造成乳酸、H等代谢产物的积累，以2+2+及Ca、Mg等浓度的失调对线粒体膜电位造成影响，进而导致ROS的大量产生，进一步加重氧化应激。研究表明，槲皮素-3-O-葡萄糖苷可以通过提高抗氧化酶的活性，进而抑制氧化应激，延长小鼠的运动时间[56]；并且人参皂苷Rb1可以通过调节PI3K/Akt/Nrf2途径，增强抗氧化物和抗氧化酶的表达进而抑制氧化应激，从而表现出抗疲劳活性[57]。目前疲劳的恢复和治疗一般可以分为物理治疗、心理治疗和药物治疗。物理治疗，通过外界给予光、电、温度、压力等物理刺激，加速体内微循环，促进疲劳的恢复[58]；心理治疗，通过对患者给予语言暗示、音乐、气功训练、生物反馈等方法来调节大脑皮层的功能，恢复或消除疲劳[58]；药物治疗：主要分为化学药物治疗和天然药物治疗，目前化学药物主要作用于大脑皮层，通过提高中枢神经6 第一章绪论系统功能，使大脑一直处于兴奋状态从而提高连续工作能力，但是这种中枢兴奋类抗疲劳药物多具有成瘾性，副作用很大[59]；天然抗疲劳药物，如玛咖、人参、红景天等主要是通过抑制氧化应激，增加糖原储备、减少疲劳代谢产物积累来表现抗疲劳活性[60-62]。由于天然药物的副作用较少，所以相比化学药物，天然药物更受到人们的青睐。1.2.3.2氧化应激与糖尿病糖尿病（DiabetesMellitus）是一种慢性代谢紊乱性疾病，由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍导致，致使机体内的空腹血糖（FastingBloodGlucose,FBG）持续升高，进而引发机体内糖类、蛋白质、脂肪、水合电解质等代谢紊乱，严重威胁人类的健康和生命[63]。根据1997年美国糖尿病协会（AmericanDiabetesAssociation,ADA）制定的糖尿病分型，糖尿病主要分为Ⅰ型糖尿病、Ⅱ型糖尿病、妊娠糖尿病和其他类型[63]。Ⅱ型糖尿病(type2diabetesmellitus，T2DM)在糖尿病患者中所占比例最大，占糖尿病患者人数的90%以上[64]。根据国际糖尿病联盟（InternationalDiabetesFederation,IDF）发布数据，2013年全球糖尿病20-79岁患者人数为3.82亿，占世界人数的8.3%，以目前糖尿病增长趋势，估计到2035年患者人数将会增加到5.92亿[65]。2010年，全世界11.6%的医疗卫生费被用于防治糖尿病，每年有460万人死于糖尿病，糖尿病已成为了继癌症、心血管疾病之后威胁人类健康的第三大杀手。目前，糖尿病并没有根治方法，是伴随患者的终身性疾病。由于糖尿病患者机体内血糖含量持续过高，对其它器官组织造成损伤进而引起其它并发症疾病，如心脑血管疾病、糖尿病性神经病、视网膜病变、糖尿病肾病、糖尿病足、高血脂或其他并发症[66]。其中，由于高病发率和高致死率，糖尿病肾病成为糖尿病中最严重的并发症[67]，其引发的终末期肾功能衰竭成为诱发糖尿病患者死亡的主要原因。糖尿病及其并发症肾病已经成为严重威胁人类健康的重大疾病。在糖尿病综合征的发展中，氧化应激起到非常关键的作用[68]。由于机体长期处于高糖环境中，会造成器官的功能下降和损伤，并且长期的高糖环境有利于ROS的形成，会造成多元醇通路通量，终末端糖基化产物（Angiotensinconvertingenzyme,AGEs）、AGEs受体和配体的过表达，蛋白激酶C（ProteinkinaseC,PKC）的激活以及己糖胺途径的过度活跃[69-70]，进而改变胰岛素的敏感性、造成胰岛素7 吉林大学博士学位论文抵抗和葡萄糖耐受量降低[68]；另一方面，ROS及丙二醛（Methanedicarboxylicaldehyde,MDA）的过度积累会导致肾小管阻塞、肾小球渗透率下降和系膜细胞收缩，最终导致肾脏损伤，造成肾功能下降[71]；同时，氧化应激会激活炎症通路，促进炎症相关因子的表达[37]，肾脏中炎症因子的过表达进而对肾脏造成二次损伤。其次，有研究表明，氧化应激会抑制内皮一氧化氮合成酶（Endothelialnitricoxidesynthase,eNOS）的活性，进而引起血管内皮损伤、氧化低密度脂蛋白受体表达和脂质代谢异常，同时会进一步促进炎症因子的释放[72]，促进糖尿病及并发症肾病的病理发展。研究表明，骆驼刺提取物可以通过提高抗氧化酶的活性，抑制氧化应激进而降低STZ诱导的糖尿病大鼠的血糖和血脂[73]；并且长期服用血管紧张素（1-7）可以通过抑制氧化应激和炎症进而保护Ⅱ型糖尿病db/db小鼠的心肺功能[74]；Wang等人发现通过抑制P13K/Akt/GSK-3β信号通路，可以促进抗氧化酶的活性表达，抑制氧化应激，进而对糖尿病起到治疗作用[75]。目前并没有治疗糖尿病的特效方法，现阶段治疗糖尿病的药物主要是通过刺激胰岛β细胞分泌胰岛素、延缓葡萄糖的吸收、促进肝糖原合成和抑制肝糖原分解、抑制促进血糖升高的相关激素和改善氧化应激的作用来达到降低血糖的目的，主要是通过注射胰岛素和口服降糖药物进行治疗，如二甲双胍类、二肽基肽酶-4-(DPP-4)抑制剂、胰高血糖素样肽1(GLP-1)类似物、曲格列酮类等[76]，但是这些降糖药物会产生很多副作用，如胃肠紊乱、低血糖和胰岛素抵抗、厌食、恶心和腹泻[77]。并且由于糖尿病有很多并发症，这些降糖药物在治疗糖尿病时，对糖尿病的并发症却鲜有治疗效果，甚者会加重糖尿病的并发症。由于天然药物的高疗效和低副作用，已成为治疗糖尿病最有潜力的候选药物。目前表明，已经有1200种植物具有降糖作用，其中400多种植物已经进行了治疗糖尿病的药效评价[78]，由于天然药物在糖尿病的治疗中出色的疗效，已经成为治疗糖尿病及其并发症的首选药物。1.2.3.3氧化应激与肾炎膜性肾小球肾炎（Membranousglomerulonephritis,MGN）是由免疫复合物沉积在肾小球基膜（Glomerularbasementmembrane,GBM）和脏层上皮之间，并引起基底膜弥漫性增厚的慢性原发性肾小球疾病，又称膜性肾病（Membranousnephropathy,MN）[79]。1977年WHO正式将其划归为原发性肾小球疾病的一个独8 第一章绪论立的病理类型[80]，MGN主要临床表现为水肿、蛋白尿、血尿、高脂血症、高血压等。据我国流行病学调查结果显示，在原发性肾小球疾病中，原发性肾小球肾炎的发生率为76.8-81.7%，其中MGN约占29.7-59.6%[81]。MGN可发生于任何年龄，但是男性多发于女性，比例为2:1，40-50岁为MGN的高发期[82]，有30-40%的病人在5-15年内会转为终末期肾功能衰竭[83]，严重影响人类的身体健康。MGN是由肾小球基底膜免疫复合物沉积，引发T辅助（Th）型免疫应答，进而引起相关炎症因子的分泌，对肾脏造成炎症损伤；另一方面，ROS在MN的发展中起到非常关键的作用，过量的ROS会造成系膜细胞和内皮细胞损伤，造成肾小球滤过作用下降，引起蛋白尿；同时，由于内皮细胞的损伤会进一步导致炎症因子的聚集，引起炎症反应。另外有研究表明，线粒体抗氧化物在特发性MN病人中是自我免疫的靶向目标[84]，在足细胞中，线粒体内酶SOD2会在lgG4的介导下发生外化，造成线粒体的功能缺失，膜通透性改变，线粒体内ROS会大量产生，进而引起氧化应激[85]。ROS的大量产生会促进NF-κB的活性表达，激活的NF-κB从细胞核中释放出来，编码炎症相关的基因，促进炎症因子的表达[86-87]，如IL-6、COX-1和TNF-α，进而对肾脏造成损伤。研究表明，槲皮素可以通过抑制ROS介导的NF-κB活性，进而减少炎症因子的表达，减弱铅诱导的肾损伤[88]；同时，Jiang等人发现大黄鱼鱼鳔可以通过下调NF-κBp65而抑制IL-6和TNF-α的表达，从而对肾炎表现出治疗作用[89]。因此，NF-κB在氧化应激和炎症反应介导的肾病中起到非常关键的作用。随着对氧化应激、炎症和免疫分子通路等MGN病理机制的不断了解，目前主要通过调节病理抗原的免疫应答、抑制B和T细胞的激活、及抑制肾小球基底膜上脂质复合物形成和肾脏纤维化的方法来治疗肾炎[90-91]。治疗方式以服用药物为主，目前治疗MGN的药物主要有糖皮质激素和烷化剂、血管紧张素转换酶抑制剂、血管紧张素肽受体阻断剂、钙神经蛋白抑制剂等[90-92]，尽管这些药物可以缓解70%MGN病人的蛋白尿等临床症状，但是其中60%患者不得不忍受这些药物较高的复发率和依赖性[92]。由于天然药物的低副作用和高疗效，已成为治疗肾炎的首要候选药物。1.2.3.4氧化应激与肿瘤乳腺癌是女性常见恶性肿瘤，是引起女性死亡主要癌症之一[93]。2010年，有9 吉林大学博士学位论文150万女性被诊断为乳腺癌，每四位被诊断癌症的女性，其中一位就是乳腺癌患者，全球每年有40万女性死于乳腺癌[94]。乳腺癌患者多发于40岁以上，但随着生活方式的改变，乳腺癌患者逐渐偏于年轻化[95]。中国乳腺癌病发率为42.55/10万，且成逐年上升趋势。目前，肝癌主要分为肝细胞癌（Hepatocellularcarcinoma,HCC）和肝内胆管癌（Intrahepaticcholangiocarcinoma,iCCA），其中由HCC导致的死亡人数在世界癌症死亡人数中排名第三，每年将近80万例癌症患者死于肝癌[94,96]，并且肝癌的5年存活期低于10%[97]。我国的HCC患者人数约占全球的55%，在癌症导致的死亡中排名第二。全球范围内，癌症是导致死亡的主要原因，每年有700万人死于癌症，占死亡人数的13%[98]。随着世界人口老龄化、环境的逐年恶劣，癌症的类型和死亡人数在不断增加，预计2030年，癌症患者将超过1310万[98]，癌症已成为人类所面临的最严峻的健康问题。细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，细胞主要是通过调节信号分子的表达来控制自身的凋亡[99]。细胞凋亡对于机体细胞和组织正常的功能代谢是非常重要的，是非常严密的程序调控。在脊椎动物中，线粒体是细胞凋亡的重要参与者[100]，线粒体凋亡途径是细胞凋亡途径之一。研究表明氧化应激可以通过激活线粒体凋亡途径介导肿瘤细胞的凋亡[101-103]。细胞内ROS的增加可以直接或间接的损伤线粒体，造成线粒体膜电位的下降，导致线粒体膜通透性下降，线粒体外膜通透性（Mitochondrialoutermembranepermeabilization,MOMP）改变是线粒体凋亡途径的开始[98]。MOMP的改变，会导致线粒体内的细胞色素C、caspases或其它细胞凋亡蛋白释放到细胞质中，促进细胞的凋亡；同时，凋亡蛋白Bcl-2家族在凋亡前期可以调节和介导MOMP的改变，而凋亡后期可以通过激活caspases，造成细胞的自行拆解和凋亡[100]。Zhang等人发现土木香内酯可以通过抑制硫氧还蛋白还原酶的活性，促进Hela细胞中的氧化应激进而介导细胞的凋亡[102]；Tor发现星果木的乙酸乙酯提取物可以通过促进MCF-7细胞氧化应激的产生，进而引起线粒体依赖caspase途径的细胞凋亡[101]；同时，Siddiqui等人发现鱼藤酮可以提高HepG2细胞中ROS的含量，促进细胞内氧化应激，进而促进p53,Bax/Bcl-2和10 第一章绪论caspase-3蛋白的表达而激活HepG2细胞的线粒体凋亡途径[103]。目前治疗肿瘤的方法主要有：手术治疗、放疗或化疗以及药物治疗。手术治疗在肿瘤早期可以起到很好的治疗作用，甚至不再复发。放疗和化疗一般针对于中期或晚期手术治疗后的辅助治疗，也可以作为独自治疗方式，但是，其副作用非常大，除对肿瘤细胞可以杀伤外，还可以对正常细胞进行杀伤，对患者造成二次伤害[104-105]。药物治疗在肿瘤早、中和晚期均可适用，虽然目前对细胞内信号转导分子机制逐步阐明，肿瘤靶向药物研究受到热捧，但目前市场上治疗肿瘤药物还是以无靶向或低靶向的化学药物为主。由于化学药物的副作用很大，对肿瘤患者的身体带来严重的二次负担，而天然药物的副作用较少，天然药物治疗肿瘤逐渐成为肿瘤治疗的一个新领域。国内外临床研究表明：单独使用天然药物治疗或中西医结合治疗肿瘤具有确切的疗效，同时能有效降低放疗、化疗的毒副作用[106-107]。1.3蛹虫草子实体对氧化应激介导疾病的研究目前在蛹虫草对氧化应激的研究中，主要以蛹虫草乙酸乙酯提取物、蛹虫草多糖和蛹虫草水提物为研究对象，发现蛹虫草可以通过降低ROS含量和提高抗氧化酶活性，进而减弱或抑制氧化应激，对氧化应激介导的疾病起到一定程度的治疗作用。Chu和叶章正等人发现，蛹虫草乙酸乙酯提取物可以通过降低细胞内ROS水平，减弱氧化应激进而对高糖诱导的人脐静脉内皮细胞起到保护作用、抑制细胞的衰老[108-110]。Liu和Wang等人发现蛹虫草多糖可以通过提高抗氧化酶的活性，进而抑制氧化应激，从而起到降脂、保肝和提高免疫力的作用[17,111]。Park等人发现蛹虫草水提物可以抑制氧化应激诱导的凋亡和早衰对人成纤维细胞起到保护作用[112]；同时，Li等人发现蛹虫草水提物可以通过提高过氧化酶活性，减弱氧化应激进而干预D-甘露醇诱导的小鼠记忆损伤[113]。另一方面，Fu等人发现红景天、蛹虫草和大黄的复合物可以通过调节葡萄糖脂类代谢、局部微环境和抑制氧化应激，进而对STZ诱导的Ⅰ型糖尿病及其并发症肾病起到治疗作用[114]。1.4立题背景与意义1.4.1立题背景11 吉林大学博士学位论文冬虫夏草是我国传统的名贵中药材，是滋补身体和治疗疾病的佳品，主要分布于我国青海、西藏和四川等省份。随着人们保健意识的逐渐增强，导致冬虫夏草需求量急剧增加，加之盲目的采挖，冬虫夏草资源已濒临灭绝。为了保护冬虫夏草资源，2007年3月，包括虫草在内的“特殊生物资源替代产品及规模化生产技术”被列为863计划重点项目。蛹虫草，与冬虫夏草同属的真菌，研究表明蛹虫草和冬虫夏草具有相同的活性成分和药理活性。在韩国和日本，蛹虫草已被用作冬虫夏草的替代品，开发出多种产品。但我国对蛹虫草子实体的开发时间相对比较晚，人们对蛹虫草子实体的认可度还不是很高，市场上蛹虫草子实体的产品相对比较少，因而蛹虫草子实体的可开发空间很大，具有广阔的利用前景。氧化应激是指机体内氧化-还原系统的失衡，产生的过多氧自由基不能被消除，造成细胞或组织损伤，进而引发相关疾病的发生。随着生活节奏的加快、生活方式的改变和生存环境的污染，氧化应激介导的疾病，如疲劳、糖尿病、肾炎和肿瘤的患病人数逐渐增加，严重影响了人们的身体健康、生活质量和生存寿命。因此，开展抑制氧化应激的相关产品，治疗或辅助治疗氧化应激介导的疾病是非常重要和必要的。1.4.2研究意义1、本研究通过对蛹虫草子实体活性成分进行提取工艺优化，确定蛹虫草子实体的水提工艺和水提物中有效成分的含量，为之后工业化生产提供实验参数和可控的生产工艺流程。2、虽然目前有蛹虫草子实体的药效活性研究报道，但其研究的深度和广度尚不够，作用机制尚不明确，有待于进一步深入系统的研究。本研究从氧化应激方面着手，开展蛹虫草子实体多种药效活性的研究，拓宽蛹虫草子实体药效活性领域，阐明蛹虫草子实体药效相关的作用机制，为蛹虫草子实体进一步开发利用提供理论依据。3、本研究以氧化应激为中心点，围绕此中心点对蛹虫草子实体开展多种药效活性的研究，为之后中药药效活性的研究开发提供新的思路。12 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化由于蛹虫草子实体（CM）含有多种有效活性成分，如虫草多糖、核苷类成分、糖醇类等，如果只针对某一种成分提取会造成其它活性成分的丢失，使CM不能充分发挥其药效活性。本实验同时以多糖、虫草素、腺苷和虫草酸为主要提取成分，建立满意度函数，以期望值为考察指标，对CM进行水提工艺优化。响应面分析（Responsesurfaceanalysis，RSA）是将数学和统计学相结合，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，并通过响应面的等值线分析来寻求最优工艺参数的分析方法[115]。采用单因素和响应面相结合的方法获得最优水提工艺，最后通过验证实验对优化方法进行评价，进一步确定优化方法的可靠性和准确性，为之后工业化生产提供实验参数。2.1仪器与材料2.1.1主要仪器仪器名称型号规格生产厂家紫外、可见、分光光度计UV-2401PC日本岛津公司离心机MIKRO12-24德国Eppendorf公司电子恒温水浴锅HH-S4江苏金坛医疗仪器厂旋转蒸发仪R1002B上海申生公司循环水式多用真空泵SHB-Ⅲ郑州长城科工贸有限公司电热恒温鼓风干燥箱SKPC-01湖北省黄石市医疗器械厂电子天平BP221S德国塞多利斯高效液相色谱仪LC-10ATVPplus日本岛津超滤系统SartoconSlice200德国赛多利斯公司超纯水系统Elix/Rios美国密理博公司2.1.2主要试剂蛹虫草子实体，购自沈阳乾翔北虫草繁育基地；腺苷、虫草素和D-甘露醇13 吉林大学博士学位论文标准品购自北京中科质检生物技术有限公司；甲醇（色谱级），购自美国Sigma-Aldrich公司；磷酸氢二钠、尿素、磷酸二氢钠、鼠李糖、乙酰丙酮、醋酸铵、高碘酸钠、盐酸、蒽酮、浓硫酸等其他生化试剂均为国产生化试剂，分析纯。2.2实验方法2.2.1有效成分含量的检测方法2.2.1.1多糖检测采用蒽酮硫酸法进行多糖含量测定[116]，分别取0.1g/L的葡萄糖溶液0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.60、0.80mL置于试管中，用蒸馏水补足至1.00mL，然后分别加入4.00mL蒽酮试剂混匀，并迅速置于冰水浴中冷却。将8支试管一并置于沸水浴反应10min，立刻冷却，室温放置10min，以同样方法处理的蒸馏水为空白，测定620nm处吸光度值。以葡萄糖质量为横坐标，以620nm处的吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。将制备好的CM水提液1.00mL置于试管中，空白对照组加入1.00mL蒸馏水，加入4.00mL蒽酮试剂混匀，迅速置于冰水浴中冷却，一并浸于沸水浴反应10min，冷却后室温放置10min，测定620nm处吸光度值，根据标准曲线计算浓度。2.2.1.2HPLC测定腺苷和虫草素HPLC色谱条件[117]色谱柱：C18柱(4.6mm×250mm，5μm)；流动相：pH6.5磷酸缓冲溶液：甲醇（85:15）；流速：1mL/min；检测波长：260nm；柱温：35℃；进样量：20μL。以对照品溶液中腺苷和虫草素浓度为横坐标，以峰面积值为纵坐标绘制标准曲线。将制备好的CM水提液过0.22μm滤膜后进行HPLC检测，将得到的峰面14 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化积带入标准曲线，计算得到腺苷和虫草素浓度。2.2.1.3虫草酸检测采用高碘酸钠法进行虫草酸含量测定[118]，精密称取0.05gD-甘露醇标准品，溶解于蒸馏水，定容至50.00mL，配制成1.00g/L的对照品母液。精密吸取1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00mL母液分别置于100.00mL容量瓶中，定容后摇匀，分别配制成10、20、30、40、50和60mg/L对照品溶液。精密移取1.00mL各浓度的对照品溶液于试管中，分别加入1.00mL15mmol/L高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，加入2.00mL0.1%的L-鼠李糖溶液，混匀后加入4.00mL新配制Nash试剂，混匀，53℃水浴中保温15min，显色后，立即冷却至室温，以蒸馏水作为空白，测定412nm处吸光度值，以甘露醇浓度为横坐标，412nm处吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。取制备好的CM水提液1.00mL，加入1.00mL高碘酸钠溶液，混匀，室温放置10min，加入2.00mL的L-鼠李糖溶液，混匀，加入4.00mL新配制Nash试剂，混匀，53℃水浴中保温15min，显色后，立即冷却至室温，测定412nm处吸光度值，根据标准曲线计算浓度。2.2.2满意度函数的建立为了同时提高CM水提物中的多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，本章将满意度函数引入CM水提物的提取工艺优化中，这种方法可以将4个考察指标综合为一个考察指标即期望值（Dv）。满意度函数涉及到将任一考察指标转变成为无量纲的部分期望值，而本章的四个考察指标均是含量越高越好，为了达到这一目的，将满意度函数定义如下[119]：………………………………………………………(2.1)其中Yi代表的是第i个考察指标的实验所得响应值；yi是人为设定的第i个考察指标的最低响应值；Li是第i个考察指标设定的最高响应值；di是第i个考察指标的期望值。由公式可以看出，di范围为0~1，di=0是不期望的，表明响应15 吉林大学博士学位论文值与目标值相差甚远，而di=1是被期望的，表明响应值与目标值最为接近。当每一个考察指标均被转化为di后，将其组合成一个Dv值，代表总体的期望值，Dv被定义为：………………………………………………………(2.2)………………………………………………………………(2.3)在公式2.2中，wi是每一个考察指标的权重值，反映的是不同响应值在重要性上的差别；n是考察变量的总数。显然，考察指标越重要，其权重值越高。di值越高，Dv值越大。根据水提物中的多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，本文四个研究指标的最低响应值、期望得到的最高响应值以及相应的权重值设定如下表2.1。表2.1满意度函数参数表Table2.1Theparametersofthedesirabilityfunctionincurrentstudy参数多糖(mg/g)腺苷(mg/g)虫草素(mg/g)虫草酸(mg/g)yi1001110Li10001010100wi0.3000.3000.2000.2002.2.3单因素实验优化CM水提工艺2.2.3.1低温下CM提取工艺优化2.2.3.1.1提取温度对期望值的影响精确称取5份1.0gCM，按料液比1:20（g/mL）加入去离子水，分别在30、40、50、60和70℃下提取3h，提取结束后，4000rpm离心10min获得CM提取液，分别测定提取液中多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，考察温度对期望值的影响。2.2.3.1.2提取时间对期望值的影响精确称取5份1.0gCM，按料液比1:20（g/mL）加入去离子水，40℃下提16 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化取，分别提取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0h，提取结束后，4000rpm离心10min获得CM提取液，分别测定提取液中多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，考察提取时间对期望值的影响。2.3.3.1.3料液比对期望值的影响精确称取5份1.0gCM，分别按料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、l:50（g/mL）加入去离子水，40℃下提取3.0h，提取结束后，4000rpm离心10min获得CM提取液，分别测定提取液中多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，考察料液比对期望值的影响。2.2.3.2高温下CM提取工艺优化2.2.3.2.1提取温度对期望值的影响精确称取5份1.0gCM，按料液比1:30（g/mL）加入去离子水，在40℃下提取3.0h后，离心，以沉淀为优化目标，按料液比1:30（g/mL）加入去离子水，分别在60、70、80、90和100℃下提取3.0h，提取结束后，4000rpm离心10min获得CM提取液，分别测定提取液中多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，考察温度对期望值的影响。2.2.3.2.2提取时间对期望值的影响精确称取5份1.0gCM，按料液比1:30（g/mL）加入去离子水，在40℃下提取3.0h后，离心，以沉淀为优化目标，按料液比1:30（g/mL）加入去离子水，80℃下提取，分别提取1.0、2.0、3.0、4.0和5.0h，提取结束后，4000rpm离心10min获得CM提取液，分别测定提取液中多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，考察提取时间对期望值的影响。2.2.3.2.3料液比对期望值的影响精确称取5份1.0gCM，按料液比1:30（g/mL）加入去离子水，在40℃下提取3.0h后，离心，以沉淀为优化目标，分别按料液比为1:10、1:20、1:30、1:40、l:50（g/mL）加入去离子水，80℃下提取3.0h，提取结束后，4000rpm离心10min获得CM提取液，分别测定提取液中多糖、腺苷、虫草素和虫草酸的含量，考察料液比对期望值的影响。2.2.4响应面法优化CM水提工艺17 吉林大学博士学位论文根据单因素实验确定的提取条件范围，采用Box-Benhnken的中心组合实验设计原理，以提取温度、提取时间和料液比参数作为自变量，以期望值为响应值，采用SASV8.02软件对实验结果进行一元线性回归分析，并利用软件Origin8.0绘制三维响应面图，直观的分析各考察因子对期望值Dv的影响。2.2.5验证实验采用以上实验方法对优化的最优CM水提条件，进行3次平行验证实验，以确定得到的模型和优化方法的可靠性和准确性。2.3实验结果2.3.1单因素实验优化结果2.3.1.1低温下单因素优化结果低温下，以腺苷为主要提取活性物质，通过单因素实验对提取温度、提取时间和料液比进行优化，结果如图2.1、2.2和2.3所示。如图2.1显示，随着温度的升高，响应值在不断升高，但是到60℃后，响应值又降低，之后又在升高，考虑60℃时，腺苷失活，而此时多糖的提取率也没有相应升高，因此此时响应值最低，随着温度的升高，多糖提取变多，因而响应值又得到回升。如图2.2和图2.3显示，随着提取时间和料液比比例的增加，响应值也在逐渐增加，提取时间为3.0h，在料液比为1:30时，响应值变化幅度很小，说明此时蛹虫草子实体有效成分基本提取完全。总结如下，低温下通过单因素优化实验得到的最优条件为：提取温度40℃，提取时间为3.0h，料液比为1:30。18 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化图2.1提取温度对响应值的影响Fig2.1Theeffectofextracttemperatureondesirabilityvalue图2.2提取时间对响应值的影响Fig2.2Theeffectofextracttimeondesirabilityvalue19 吉林大学博士学位论文图2.3料液比对响应值的影响Fig2.3Theeffectofratioofmaterialtoliquidondesirabilityvalue2.3.1.2高温下单因素优化结果高温下，以多糖为主要提取活性物质，通过单因素实验对提取温度、提取时间和料液比进行优化，结果如图2.4、2.5和2.6所示。结果显示，随着提取温度的升高、提取时间的延长和料液比的增加，响应值在逐渐升高，但在提取温度为80℃、提取时间为3.0h和料液比为1:30时，响应值已经达到平稳状态。因此，在较高温度下，单因素优化实验得到的最优条件为：提取温度80℃，提取时间为3.0h，料液比为1:30。20 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化图2.4提取温度对响应值的影响Fig2.4Theeffectofdifferentextracttemperatureondesirabilityvalue图2.5提取时间对响应值的影响Fig2.5Theeffectofdifferentextracttimeondesirabilityvalue21 吉林大学博士学位论文图2.6料液比对响应值的影响Fig2.6Theeffectofratioofmaterialtoliquidondesirabilityvalue2.3.2响应面法优化结果2.3.2.1低温下响应面优化结果在单因素优化的结果上，采用3因素3水平的Box-Behnken设计实验，进一步优化提取温度、料液比和提取时间。通过SASV8.02进行实验方案设计，实验水平设置、设计方案及相应的结果如下所示：表2.2Box-Behnken设计实验因素水平表Table2.2ThelevelsofvariablestestedinBox-Behnkendesign(BBD)水平因素-101温度（X1）/℃354045时间（X2）/h2.53.03.5料液比（X3）/g/mL1:251:301:3522 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化表2.3Box-Behnken设计实验的方案及结果Table2.3ThedesignmatrixandtheresultsofBox-BehnkendesignexperimentRunX1X2X3Y(Dv)1-1-100.2592-1100.32431-100.32341100.30150-1-10.27460-110.274701-10.29180110.3349-10-10.3011010-10.29511-1010.300121010.336130000.338140000.335150000.334采用SASV8.02对BBD实验所得数据进行响应面回归分析，以分析得到的多元二次回归方程来拟合实验结果。Y=0.335667+0.008875*X1+0.015*X2+0.010375*X3-0.009583*X1*X1-0.02175*X1*X2+0.0105*X1*X3-0.024333*X2*X2+0.01075*X2*X3-0.018083*X3*X32该模型决定系数R为0.9823，说明98.23%的期望值变化可以用这一多项22式解释。该模型的调整决定系数（Radj）为0.9505，与R值非常接近，说明该模型具有很好的拟合度，预测值与实验值二者间有高度相关性。模型的P<0.01证明了二次回归模型高度显著。模型的失拟项的F值和P值分别为12.36和0.075，证明失拟项为不显著项。利用t检验分析模型中的各项系数的显著性（表2.4）。22其中，一次项X1、X2和X3，交互项X1*X2以及二次项X2和X3对响应值的影响23 吉林大学博士学位论文2极其显著，P值小于0.01；交互项X1*X3和X2*X3，二次项X1对响应值的影响一般显著。三维的响应面图以及二维的等高线图可以更为直观的显示两两因素间的交互效应（图2.7），可见响应面和等高线图分析结果与统计分析结果一样，变量与响应值之间不是简单的线性关系。软件工具箱给出最大响应值Y(Dv)=0.3419及其对应的X1、X2、X3编码值：X1=0.527，X2=0.18，X3=0.49，所对应的最优条件为：提取温度为42.6℃，提取时间为3.09h，料液比为1:32.45。表2.4Box−Behnken设计回归分析结果Table2.4RegressionanalysisofBox−Behnkendesign来源自由度平方和均方FPr>FX110.000630.0006318.59690.007625X210.00180.001853.123460.000761X310.0008610.00086125.414410.003963X1×X110.0003390.00033910.007950.024996X1×X210.0018920.00189255.846040.000678X1×X310.0004410.00044113.015250.015418X2×X210.0021860.00218664.523060.000484X2×X310.0004620.00046213.64240.014093X3×X310.0012070.00120735.634340.001889模型90.009410.00104630.855930.000741线性30.0032910.00109732.378260.001061平方30.0033230.00110832.688310.001038交互项30.0027960.00093227.501230.001557参差50.0001690.000034失拟项30.0001610.00005412.365380.075744纯误差28.667E-64.333E-6总离差140.00957924 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化图2.7各因素之间的响应面和等高线图Fig.2.7Theresponsesurfaceandcontourplotsbetweencandidatevariablesanddesirabilityvalue2.3.2.2高温下响应面优化结果如2.4.2.1所示，在单因素优化的结果上，通过SASV8.02对提取工艺进一步优化，结果如下所示：表2.5Box-Behnken设计实验因素水平表Table2.5ThelevelsofvariablestestedinBox-Behnkendesign水平因素-101温度（X1）/℃758085时间（X2）/h2.53.03.5料液比（X3）/g/mL1:251:301:35表2.6Box-Behnken设计实验的方案及结果Table2.6ThedesignmatrixandtheresultsofBox-BehnkendesignexperimentRunX1X2X3Y(Dv)1-1-100.1872-1100.21231-100.17541100.20550-1-10.19160-110.184701-10.21525 吉林大学博士学位论文续表RunX1X2X3Y(Dv)80110.2059-10-10.2111010-10.21611-1010.226121010.201130000.232140000.230150000.230采用SASV8.02对BBD实验所得数据进行响应面回归分析，以分析得到的多元二次回归方程来拟合实验结果。Y=0.230667-0.004875*X1+0.0125*X2-0.002125*X3-0.010583*X1*X1+0.00125*X1*X2-0.0075*X1*X3-0.025333*X2*X2-0.00075*X2*X3-0.006583*X3*X32该模型决定系数R为0.9885，说明98.85%的期望值变化可以用这一多项22式解释，该模型的调整决定系数(Radj)为0.9678，与R值非常接近，说明该模型具有很好的拟合度，预测值与实验值二者间有高度相关性。模型的P值为0.005，证明了二次回归模型高度显著。模型的失拟项的F值和P值分别为12.19和0.0768，证明失拟项为不显著项。利用t检验分析模型中的各项系数的显著性（表222.7），其中，一次项X1和X2，二次项X1和X2以及交互项X1X3对响应值的影响非常显著，P值小于0.01。三维的响应面图以及二维的等高线图可以更为直观的显示两两因素间的交互效应（图2.8），可见响应面和等高线图分析结果与统计分析结果一样，变量与响应值之间不是简单的线性关系。软件工具箱给出最大响应值Y(Dv)=0.233，及其对应的X1、X2、X3编码值：X1=-0.193，X2=0.245，X3=-0.065，所对应的最优条件为：提取温度为79.04℃，提取时间为3.12h，料液比为1:29.68。26 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化表2.7Box−Behnken设计回归分析结果Table2.7RegressionanalysisofBox−Behnkendesign来源自由度平方和均方FPr>FX110.000190.0001918.488650.007717X210.001250.00125121.55590.000107X310.0000360.0000363.5129660.119752X1×X110.0004140.00041440.216930.001439X1×X216.25E-66.25E-60.607780.470898X1×X310.0002250.00022521.880060.005445X2×X210.002370.00237230.43510.0001X2×X312.25E-62.25E-60.2188010.659634X3×X310.000160.0001615.561650.010907模型90.0044170.00049147.721050.000257线性30.0014760.00049247.852510.000418平方30.0027070.00090287.741760.0001交互项30.0002340.0000787.5688820.026298参差50.0000510.00001失拟项30.0000490.00001612.18750.076778纯误差22.667E-61.333E-6总离差140.004468图2.9各因素之间的响应面和等高线图Fig.2.9Theresponsesurfaceandcontourplotsbetweencandidatevariablesanddesirabilityvalue2.3.3验证实验27 吉林大学博士学位论文对单因素和响应面方法优化的CM最佳水提工艺进行验证：低温下CM优化的最佳提取条件为：提取温度为42.61℃，提取时间为3.09h，料液比为1:32.45，预测最大响应值为0.342；高温下CM优化的最佳提取条件为：提取温度为79.04℃，提取时间为3.13h，料液比为1:29.68。预测最大响应值为0.233，验证实验结果误差分别为6.24%和5.15%，说明模型和优化方法具有一定的可靠性和准确性。表2.8验证实验结果Table2.8Theresultsofvalidationexperiment预测值实际值误差平均误差10.3245.26%低温提取20.3420.3157.89%6.24%30.3235.56%10.2234.29%高温提取20.2330.2215.15%5.15%30.2196.01%2.4实验讨论之前已有文献报导了对多糖、腺苷或虫草素等CM单一成分的提取工艺优化[115,120-121]，但本实验同时以多糖、腺苷、虫草素和虫草酸为主要提取活性成分，能够对CM进行活性成分的充分提取，通过建立满意度函数，以期望值为考察指标，对其提取工艺进行优化。文献报道，蛹虫草菌丝体的腺苷最佳提取温度为45℃，并且随着温度的升高，腺苷提取率逐渐降低[121]，而多糖的最佳提取温度均偏高，为保证对CM活性成分提取完全，本实验中对CM进行两次提取，低温下以腺苷为主的提取和高温下以多糖为主的提取。本实验采用单因素和响应面相结合的方法，对CM进行水提工艺优化，得到的CM的最佳提取工艺为：首先是CM第一次低温提取，提取温度为45℃，提取时间为3.0h，料液比为1:30，提取之后，4000rpm离心10min，保留上清液Ⅰ，继续对沉淀进行第二次高温提取，提取温度为79.04℃，提取时间3.13h，28 第二章蛹虫草子实体有效成分水提工艺优化料液比1:29.68，提取之后，4000rpm离心10min，保留上清液Ⅱ，合并两次上清液，所得上清液即为最佳条件下提取的CM水提物。此时得到的CM水提物多糖含量为28.58%、腺苷含量为0.22%、虫草素含量为0.41%和虫草酸含量为6.09%。通过验证实验得到的响应值与预测响应值的实验误差比较接近，分别为6.24%和5.15%，说明模型和优化方法具有一定的可靠性和准确性。为方便CM的提取，我们将工艺简化为低温提取条件为：提取温度为45℃、提取时间为3.0h、料液比为1:30；高温提取条件为：提取温度为80℃、提取时间为3.5h、料液比为1:30，此时得到的CM水提物多糖含量为29.01%、腺苷含量为0.21%、虫草素含量为0.42%和虫草酸含量为6.13%，以下生物活性实验中采用简化工艺进行提取。2.5本章小结对CM进行水提工艺优化，得到的最优提取工艺为：低温下提取温度为42.6℃、提取时间为3.09h、料液比为1:32.45；高温下最优提取工艺为：提取温度为79.04℃、提取时间为3.13h、料液比为1:29.68。此时，CM水提物多糖含量为28.58%、腺苷含量为0.22%、虫草素含量为0.41%和虫草酸含量为6.09%。最终简化工艺是低温提取条件为：提取温度为45℃、提取时间为3.0h、料液比为1:30；高温提取条件为：提取温度为80℃、提取时间为3.5h、料液比为1:30，此时得到的CM水提物多糖含量为29.01%、腺苷含量为0.21%、虫草素含量为0.42%和虫草酸含量为6.13%。29 吉林大学博士学位论文30 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究随着社会的发展，人们的心理和工作压力越来越大，疲劳已经成为一种普遍的社会现象，严重影响人们的生活质量。疲劳的发生没有年龄限制，从学龄儿童到耄耋老人都有可能发生。研究表明，目前有63.4%的年轻人正处于疲劳状态或经受着疲劳引起的疾病[46]，疲劳已经成为威胁人类健康的重要因素。目前认为疲劳的发生与生物代谢产物的积累、糖原的消耗、兴奋收缩偶联障碍、内环境的改变、氧化应激的发生及内分泌紊乱有关[122]。其中氧化应激在疲劳的发生中起着关键作用。在机体代谢过程中，2-3%的氧进入机体后转变为氧自由基，这些氧自由基一方面作为信号转导分子参与人体的正常生理过程；另一方面，过量的氧自由基会造成细胞结构和功能的破坏[50]。研究表明，在运动过程中，肌肉和肝脏会产生大量的ROS[53-54]，造成机体氧化-还原系统的失衡，影响肌肉对葡萄糖的摄取[55]，最终导致运动能量不足，引发疲劳；另一面，线粒体是产生+2+2+ROS的主要场所，在运动过程中，H、Ca、Mg等浓度的失调对线粒体膜电位造成影响，线粒体膜通透性改变，进而导致ROS的大量释放，进一步加重氧化应激，造成疲劳的恶性循环。目前对于疲劳的药物治疗主要为化学药物和天然药物。但由于化学药物主要通过提高中枢神经系统功能，使大脑一直处于兴奋状态而提高连续工作能力，而且这种中枢兴奋类抗疲劳药物多具有成瘾性，副作用很大。目前，天然药物因其较少的副作用和显著的疗效已经成为研究抗疲劳药物的首选。CM药食同源，作为冬虫草夏的同属种具有多种药理活性。本实验以小鼠为模型，考察CM的抗疲劳活性，以及通过对运动前后小鼠血清、肝脏和肌肉中相关生化指标的检测，初步判定CM抗疲劳活性的相关机制。3.1仪器与材料3.1.1主要仪器仪器名称型号规格生产厂家酶标仪ELX800美国BIOTEK公司31 吉林大学博士学位论文紫外、可见、分光光度计UV-2401PC日本岛津公司高速离心机MiniSpin德国Eppendorf公司电子恒温水浴锅HH-S4江苏金坛医疗仪器厂旋转蒸发仪R1002B上海申生公司冷冻干燥机GENESISSQ25ES美国VIRTIS公司超低温冰箱MDF-492日本三洋公司冰箱海尔Ⅲ青岛海尔有限公司动物跑步机FT-200成都泰盟公司疲劳转棒仪ZB-200成都泰盟公司ZW-A型微量振荡器THZ-82江苏省荣华仪器制造公司水平电泳槽DYCP-31DN美国Bio-Bad公司电泳仪电源-IIEPS301美国Bio-Bad公司凝胶成像系统Biospectrum600美国UVP公司3.1.2主要试剂Si-Ki时健红景天软胶囊，购自吉林大药房；GAPDH、Total(T)-AMPK、T-mTOR、T-Akt、T-ERK和Phosphor(P)-AMPK、P-mTOR、P-Akt、P-ERK抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体、羊抗小鼠多克隆抗体购自Abcam公司；蛋白酶抑制剂、RIPABuffer购自美国Sigma-Aldrich公司；PVDF膜，购自德国MerkMillipore公司；30%丙烯酰胺，购自美国Bio-Rad公司；氯化钾、氯化钠、十二水磷酸氢二钠等其它常规化学试剂均为国产，分析纯。3.1.3主要检测试剂盒试剂盒名称生产厂家超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒南京建成生物工程研究所谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒南京建成生物工程研究所丙二醛（MDA）检测试剂盒南京建成生物工程研究所活性氧（ROS）检测试剂盒南京建成生物工程研究所乳酸（LD）检测试剂盒南京建成生物工程研究所32 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒南京建成生物工程研究所小鼠睾酮（T）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司小鼠皮质醇ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司ECLAdvanceWB检测试剂盒美国GE公司3.1.4实验动物实验动物为昆明种小白鼠，清洁级，体重18～22g，6周龄，雄性，购自吉林大学医学部实验动物中心（许可证号：SCXK（吉）2011～0003）。实验动物使用遵照实验动物使用条例进行，动物饲养保证12h/12h光暗循环，温度为23±1℃，湿度65±5%，自由饮食，所有的动物实验在安静环境下进行，并且每只小鼠只使用一次。3.2实验方法3.2.1CM水提物制备按照上述2.4讨论中简化的最优工艺对CM进行提取，将提取后的上清液旋转浓缩蒸发，将得到的提取物浓缩液冷冻干燥后置-20℃冰箱中，保存备用，用前使用去离子水按所需浓度进行溶解，现用现配。3.2.2CM对小鼠抗疲劳能力的测试小鼠适应饲养一周后，将小鼠随机分为5组，每组10只：空白组（给予对应的蒸馏水），CM水提物低、中、高剂量组，剂量分别为0.5、1.0和2.0g/kg（CM质量/小鼠体重），和红景天（Pro）阳性对照组，0.5g/kg（红景天胶囊内含物/小鼠体重），口服灌胃给药2周，给药结束后进行抗疲劳能力测试。3.2.2.1跑步实验给药期间，将小鼠置于FT-200动物跑步机中进行3次跑步训练，转速为15rpm，每次训练1min。末次给药结束1h后，将小鼠置于FT-200动物跑步机中，转速为20rpm，电流调到最高，以小鼠被连续电击5次以上后，小鼠仍不能起身的时间记录为小鼠跑步时间。33 吉林大学博士学位论文3.2.2.2疲劳转棒实验给药期间，将小鼠置于疲劳转棒仪上进行3次滚轴训练，转速为15rpm，每次训练1min。末次给药结束1h后，进行正式实验，转速为20rpm，记录小鼠转棒的时间。3.2.2.3负重游泳实验末次给药结束1h后，小鼠尾部系以体重15%的负荷，放入水温22±1℃，水深为小鼠3倍体长的桶式游泳池中（d=50cm），测定各组小鼠持续游泳力竭时间，以小鼠头部沉入水中5s而不能浮出水面的时间为持续游泳时间。3.2.3样品收集小鼠随机分为5组，每组20只：空白组（给予对应的蒸馏水）、CM水提物低、中、高剂量组（剂量分别为0.5、1.0和2.0g/kg）和Pro阳性对照组（0.5g/kg），口服灌胃给药2周。游泳前样品收集：末次给药结束1h后，每组取10只小鼠进行眼眶静脉丛取血，4000rpm离心10min，血清-80℃保存备用；眼眶静脉丛取血结束后，小鼠颈椎脱臼处死，取肝脏和肌肉，-80℃保存备用。游泳后样品收集：剩余10只小鼠，末次给药结束1h后，在水温22±1℃下，无负重固定游泳20min，游泳结束后，眼眶静脉丛取血，4000rpm离心10min，血清-80℃保存备用；小鼠眼眶静脉丛取血结束后，颈椎脱臼处死，摘取肝脏和肌肉组织，-80℃保存备用。3.2.4ATP、乳酸和LDH含量测定按照相关试剂盒的操作方法，对游泳前后小鼠血清中LD和LDH以及肝脏和肌肉中ATP、LD和LDH的含量进行测定。3.2.5CM对小鼠抗氧化能力的影响34 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究按照相关试剂盒的操作方法，对游泳前后小鼠血清、肝脏和肌肉中的SOD和GSH-Px活性，以及MDA含量进行检测，同时对肝脏和肌肉中的ROS含量进行测定。3.2.6CM对小鼠体内激素水平的影响按照睾酮和皮质醇ELISA试剂盒的操作方法，对游泳前后小鼠血清中睾酮和皮质醇的含量进行测定，观察CM对小鼠游泳前后体内睾酮和皮质醇含量的影响。3.2.7Westernblot实验对游泳后小鼠肝脏进行westernblot实验，将保存在-80℃的肝脏取出，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，冰浴上裂解30min，4℃10000rpm离心10min，吸取上清液，测定蛋白浓度，取等量蛋白加入2×加样缓冲液，然后95℃变性处理5min，SDS-PAGE电泳每孔等量蛋白上样，90V电压下至所有样品压成一条直线，然后调到120V，至溴酚兰跑出终止电泳，然后100V冰盒转膜120min，之后在5%BSA4℃下封闭4h，分别用AKT，AMPK，ERK，mTOR以及Phosphor(P)-AKT，P-AMPK，P-ERK，P-mTOR一抗4℃孵育过夜，二抗孵育4h，然后显影，强度量化通过QuantityOne-4.5.0定量扫描光密度。3.2.8统计方法学分析数据处理应用SPSS13.0软件，进行ANOVA单因素方差分析，数据以x±S.D.表示，双t-t检验显著性水平，当P<0.05时表示具有显著差异性。3.3实验结果3.3.1抗疲劳能力测定3.3.1.1跑步实验根据方法3.2.2.1进行跑步实验，考察CM对小鼠跑步时间的影响，结果如图3.1。结果显示，0.5、1.0和2.0g/kgCM和0.5g/kgPro均能显著提高小鼠的35 吉林大学博士学位论文跑步时间（P<0.01），与空白组相比，跑步时间分别提高了62.5%、47.0%、37.7%和54.9%。图3.1CM对小鼠跑步时间的影响Fig.3.1TheeffectofCMonforcedrunningtestofthemice*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.1.2疲劳转棒实验根据方法3.2.2.2进行疲劳转棒实验，考察CM对小鼠转棒时间的影响，结果如图3.2。0.5和2.0g/kgCM和0.5g/kgPro均可以明显提高小鼠转棒的时间，分别是空白组小鼠的1.63倍（P<0.05）、2.16倍（P<0.01）和2.46倍（P<0.01）。其中，1.0g/kgCM剂量组小鼠的转棒时间均值虽然较空白组提高了1.79倍，但是由于小鼠的转棒时间个体间差异较大，造成统计分析结果不显著。36 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究图3.2CM对小鼠转棒时间的影响Fig.3.2TheeffectofCMonrotatingrodtestofthemice*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.1.3负重游泳实验根据方法3.2.2.3所述，进行小鼠负重游泳实验，考察CM对小鼠负重游泳时间的影响，结果如图3.3。0.5、1.0和2.0g/kgCM和0.5g/kgPro均能显著的延长小鼠的负重游泳时间，较空白组相比，游泳时间分别提高了135.9%（P<0.01）、79.7%（P<0.01）、278.3%（P<0.01）和171.3%（P<0.01）。图3.3CM对小鼠负重游泳时间的影响Fig.3.3TheeffectofCMonforcedswimmingtestofthemice*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup37 吉林大学博士学位论文3.3.2CM对游泳前后小鼠体内ATP含量的影响给药2周后，通过检测小鼠肝脏和肌肉中ATP含量，考察CM对游泳前和游泳后小鼠体内ATP含量变化的影响。3.3.2.1CM对游泳前后小鼠肝脏中ATP含量的影响结果如图3.4，CM对游泳前小鼠肝脏中ATP的含量与空白组相比没有显著影响，而游泳20min后，1.0和2.0g/kgCM剂量组的小鼠肝脏中ATP含量较空白组相比明显增加，分别提高了62.6%（P<0.05）和90.5%（P<0.01）。与空白组相比，Pro阳性对照组小鼠肝脏中的ATP含量在游泳前和游泳后均有明显增加（P<0.01）。图3.4CM对游泳前后小鼠肝脏中ATP含量的影响Fig.3.4TheeffectsofCMonATPmetabolisminliverofthemicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.2.2CM对游泳前后小鼠肌肉中ATP含量的影响结果如图3.5，与空白组相比，CM对游泳前小鼠肌肉中ATP含量没有显著影响，而游泳20min后，1.0g/kgCM剂量组小鼠肌肉中的ATP含量显著增加，较空白组提高了65.2%（P<0.01）；虽然0.5g/kgCM剂量组小鼠肌肉中的ATP含量较空白组升高了33.0%，但由于个体差异较大，并没有显示出统计学差异。38 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究与空白组相比，Pro阳性对照组小鼠肌肉中的ATP含量在游泳前和游泳后均有显著增强（P<0.01）。图3.5CM对游泳前后小鼠肌肉中ATP含量的影响Fig.3.5TheeffectsofCMonATPmetabolisminmuscleofthemicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.3CM对游泳前后小鼠LD含量的影响给药2周后，通过检测小鼠血清、肝脏和肌肉中LD的含量，观察CM对游泳前和游泳后小鼠体内LD含量的影响。3.3.3.1CM对游泳前后小鼠血清中LD含量的影响结果如图3.6所示：与空白组相比，CM对游泳前小鼠血清中LD的含量没有明显影响，而游泳20min后，1.0g/kgCM可以显著降低血清中LD的含量，比空白组降低了16.9%（P<0.05），而且2.0g/kgCM剂量组小鼠血清中的LD含量较空白组相比也降低了12.8%；但Pro阳性对照组小鼠血清中的LD与空白组相比没有明显差异。结果表明，CM可以降低游泳后小鼠血清中的LD含量，其中1.0g/kgCM剂量效果最为明显。39 吉林大学博士学位论文图3.6CM对游泳前后小鼠血清中LD含量的影响Fig.3.6TheeffectsofCMonthelevelsoflacticacidinserumofthemicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.3.2CM对游泳前后小鼠肝脏中LD含量的影响结果如图3.7所示，与空白组相比，CM和Pro对游泳前和游泳后的小鼠肝脏中LD的含量并没有明显影响。40 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究图3.7CM对游泳前后小鼠肝脏中LD含量的影响Fig.3.7TheeffectsofCMonthelevelsoflacticacidinliverofthemicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.3.3CM对游泳前后小鼠肌肉中LD含量的影响结果如图3.8所示，游泳前，1.0g/kgCM剂量组小鼠肌肉中的LD含量明显低于空白组（P<0.05），并且游泳20min后，1.0和2.0g/kgCM剂量组小鼠肌肉中的LD含量同空白组相比也显著降低，分别降低了38.5%和37.9%（P<0.05）。Pro对游泳前后小鼠肌肉中的LD含量没有明显影响。结果表明，CM可以降低游泳后肌肉中的LD含量，减少运动引起的LD积累，缓解LD过多积累造成的疲劳。41 吉林大学博士学位论文图3.8CM对游泳前后小鼠肌肉中LD含量的影响Fig.3.8TheeffectsofCMonthelevelsoflacticacidinmuscleofthemicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.4CM对游泳前后小鼠LDH活性的影响给药2周后，通过检测小鼠血清、肝脏和肌肉中LDH的活性，观察CM对游泳前和游泳后小鼠体内LDH活性的影响。3.3.4.1CM对小鼠血清中LDH活性的影响结果如图3.9所示，1.0g/kgCM可以降低游泳前小鼠血清中的LDH的活性（P<0.05），游泳后，2.0g/kgCM剂量组小鼠血清中的LDH活性也显著低于空白组（P<0.01）；同时与空白组相比，Pro阳性对照组游泳前后小鼠血清中的LDH活性也显著降低（P<0.01）。结果表明，CM可以降低游泳后血清中的LDH活性，减少运动引起的细胞损伤，其中2.0g/kgCM剂量对小鼠血清中LDH活性的影响更为明显。42 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究图3.9CM对游泳前后小鼠血清中LDH活性的影响Fig.3.9TheeffectsofCMontheactivitiesoflactatedehydrogenaseinserumofthemicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.4.2CM对小鼠肝脏中LDH活性的影响结果如图3.10所示，与空白组相比，CM对游泳前小鼠肝脏中LDH的活性没有显著影响。0.5和1.0g/kgCM剂量组游泳后小鼠肝脏中的LDH活性明显低于空白组，与空白组相比，分别降低了21.4%（P<0.05）和24.9%（P<0.05），虽然2.0g/kgCM剂量也可以降低游泳后小鼠肝脏中的LDH活性，但由于小鼠间的个体差异较大，并未产生统计学差异；同时与空白组相比，Pro对游泳前小鼠肝脏中的LDH活性没有明显影响，但游泳后小鼠肝脏中的LDH活性降低了30.9%（P<0.01）。结果表明，CM可以降低游泳后小鼠肝脏中的LDH活性。43 吉林大学博士学位论文图3.10CM对游泳前后小鼠肝脏中LDH活性的影响Fig.3.10TheeffectsofCMontheactivitiesoflactatedehydrogenaseinliverofthemicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.4.3CM对小鼠肌肉中LDH活性的影响结果如图3.11所示，与空白组相比，CM对游泳前小鼠肌肉中的LDH活性没有明显影响，但2.0g/kgCM可以显著降低游泳后小鼠肌肉中的LDH活性，与空白组相比降低了29.3%（P<0.01），但Pro对游泳前后小鼠肌肉中的LDH活性并没有显著影响。结果表明，CM可以降低游泳后小鼠肌肉中的LDH活性，减少运动引起的肌细胞损伤，其中2.0g/kgCM对游泳后小鼠肌肉中LDH活性影响更为明显。44 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究图3.11CM对小鼠肌肉中LDH活性的影响Fig.3.11TheeffectsofCMontheactivitiesoflactatedehydrogenaseinmuscleofthemice*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.5CM对小鼠抗氧化能力的影响抗氧化酶如SOD和GSH-Px在机体的抗氧化损伤中起到非常重要的防御作用，过量的脂质化合物的积累会引起氧化应激和组织的损伤。3.3.5.1CM对小鼠血清抗氧化能力的影响表3.1结果显示，1.0和2.0g/kgCM剂量组游泳前小鼠血清中的GSH-Px活性明显高于空白组（P<0.05），同时0.5、1.0和2.0g/kgCM剂量也可以显著提高游泳后小鼠血清中的GSH-Px活性（P<0.01）；与空白组相比，CM对游泳前小鼠血清中的SOD活性没有明显影响，但是却可以明显提高游泳后小鼠血清中的SOD活性（P<0.05）；并且CM也可以明显降低游泳前后小鼠血清的MDA含量（P<0.05）。Pro较空白组相比也可以明显提高SOD和GSH-Px的活性，降低MDA的含量（P<0.05），但是对游泳后小鼠中的MDA含量和SOD活性影响并不明显。结果表明，CM可以提高游泳前后小鼠血清中的抗氧化能力。3.3.5.2CM对小鼠肝脏抗氧化能力的影响45 吉林大学博士学位论文表3.2结果显示，游泳前，2.0g/kgCM剂量组小鼠肝脏中的ROS含量明显低于空白组（P<0.05），并且与空白组相比，GSH-Px活性也有明显的增强（P<0.05）；游泳后，与空白组相比，0.5、1.0和2.0g/kgCM剂量组小鼠肝脏中的MDA和ROS的含量都有显著的下降（P<0.05），并且1.0和2.0g/kgCM剂量组小鼠肝脏中的SOD活性也有显著增强（P<0.05），但是结果显示CM对游泳后小鼠肝脏中的GSH-Px活性影响并不明显。Pro对游泳前小鼠肝脏中的抗氧化能力并没有明显影响，但是可以降低游泳后小鼠肝脏中的ROS含量和提高SOD活性（P<0.05）。结果表明，CM可以提高游泳前后小鼠肝脏的抗氧化能力。3.3.5.3CM对小鼠肌肉抗氧化能力的影响表3.3结果显示，2.0g/kgCM剂量组游泳前小鼠肌肉中的GSH-Px活性明显高于空白组（P<0.05）；游泳后，与空白组相比，1.0g/kgCM剂量组小鼠肌肉中的MDA含量显著降低（P<0.05），1.0和2.0g/kgCM剂量组小鼠肌肉中的ROS含量也有明显下降（P<0.05），GSH-Px和SOD活性分别在1.0g/kg和2.0g/kgCM剂量时明显增强（P<0.05）。与空白组相比，Pro对游泳前后小鼠肌肉中的MDA和ROS含量没有显著影响，但是对GSH-Px和SOD活性表现出明显增强（P<0.05）。结果表明，CM可以提高游泳前后小鼠肌肉的抗氧化能力。3.3.6Westernblot实验根据方法3.2.7对各组小鼠肝脏进行westernblot实验，结果如图3.12。结果显示，在GAPDH参比基本相近的情况下，与空白组相比，CM剂量组小鼠肝脏中的AMPK、AKT、ERKs和mTOR的磷酸化表达明显增强（P<0.05），最高增幅分别达到160.5%、79.6%、96.2%和32.9%。同时，Pro阳性对照组小鼠肝脏中的AMPK、AKT、ERKs和mTOR的活性也明显增强（P<0.05）。46 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究表3.1CM对游泳前后小鼠血清中抗氧化能力的影响Table3.1TheeffectsofCMonantioxidantstatusinserumofmicebeforeandafterswimmingCM(g/kg)Pro(g/kg)CTRL0.51.02.00.5MDA*******38.70±4.0420.5±6.8124.76±9.529.52±3.3318.79±4.91(nmol/mL)BeforeSOD*115.87±20.20112.92±24.1995.23±20.4588.76±15.58119.77±22.72Swimming(U/mL)GSH-Px*****60.35±4.5764.60±23.34149.88±36.38139.40±42.31225.81±34.23(μmol/mL)MDA****33.90±4.2932.38±5.8913.97±4.8621.67±5.2127.43±3.94(nmol/mL)AfterSOD*****72.68±21.46140.32±17.20134.14±9.23102.17±22.2681.72±16.55Swimming(U/mL)GSH-Px********138.07±45.36269.31±45.88319.89±60.10294.92±53.16386.90±45.23(μmol/mL)Valuesareexpressedasmean±S.D.(n=6).*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup47 吉林大学博士学位论文表3.2CM对游泳前后小鼠肝脏中抗氧化能力的影响Table3.2TheeffectsofCMonliverantioxidantstatusinmicebeforeandafterswimmingCM(g/kg)Pro(g/kg)CTRL0.51.02.00.5MDA0.50±0.170.39±0.100.31±0.120.30±0.110.51±0.09(nmol/mgprot)ROS*1836±1471680±2031687±2561598±1081806±217Before(FI/gprot)SwimmingSOD199.03±15.55193.91±20.30179.50±15.09173.82±9.11199.02±15.08(U/mgprot)GSH-Px*23.56±4.5726.46±4.3529.36±6.3829.40±3.3125.81±5.23(μmol/gprot)MDA*****0.76±0.1510.35±0.0890.43±0.1320.32±0.0820.50±0.18(nmol/mgprot)ROS******2158±3331590±1651580±3361317±1081606±323After(FI/gprot)SwimmingSOD*****146.45±36.32152.25±47.02231.11±65.90302.46±35.46348.62±60.46(U/mgprot)GSH-Px29.98±4.6433.99±8.1929.65±2.9830.26±5.6635.61±7.57(μmol/gprot)Valuesareexpressedasmean±S.D.(n=6).*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup48 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究表3.3CM对游泳前后小鼠肌肉中抗氧化能力的影响Table3.3TheeffectsofCMonskeletalmuscleantioxidantstatusinmicebeforeandafterswimmingCM(g/kg)Pro(g/kg)CTRL0.51.02.00.5MDA0.80±0.250.75±0.140.70±0.190.69±0.170.72±0.16(nmol/mgprot)ROS16023±189115698±254115036±201315786±168914563±1048Before(FI/gprot)SwimmingSOD*116.61±12.67119.35±27.49117.48±11.48123.98±11.46156.55±21.45(U/mgprot)GSH-Px**8.99±2.2511.45±2.3511.35±3.2812.89±1.3612.78±1.45(μmol/gprot)MDA**1.16±0.451.07±0.420.62±0.180.89±0.130.79±0.17(nmol/mgprot)ROS***23018±149122846±149618057±231017038±211917313±3852After(FI/gprot)SwimmingSOD***100.78±4.5397.56±13.76100.06±10.10111.27±8.08119.93±9.45(U/mgprot)GSH-Px**8.69±0.9810.29±1.1911.34±2.1810.49±1.9811.23±1.59(μmol/gprot)Valuesareexpressedasmean±S.D.(n=6).*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup49 吉林大学博士学位论文图3.12肝脏中mTOR、AMPK、AKT和ERKs蛋白表达及量化分析Fig.3.12TheexpressionsandquantitativeanalysisofmTOR,AMPK,AKTandERKsinlivertissue*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.7CM对游泳前后小鼠激素水平的影响50 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究通过对游泳前后小鼠血清中睾酮和皮质醇的含量进行检测，考察CM对运动前后小鼠体内睾酮和皮质醇含量的影响。3.3.7.1CM对游泳前后小鼠睾酮含量的影响通过ELISA方法对小鼠血清中T含量进行检测，结果如图3.13所示。结果显示CM可以显著提高游泳前小鼠体内的T含量，0.5、1.0和2.0g/kgCM剂量组小鼠血清中的T含量与空白组相比分别提高了4.7%（P<0.01）、7.0%（P<0.01）和19.1%（P<0.01），但是游泳后，只有2.0g/kgCM剂量组小鼠血清中的T含量显著提高（P<0.01），虽然0.5和1.0g/kgCM剂量组小鼠血清中的T含量均值（495.9±109.6和510.1±77.8）较空白组均值（466.25±38.8）也有所升高，但由于个体差异较大，并未有显著差异；与空白组相比，Pro阳性对照组小鼠血清中的T含量在游泳前后均有显著升高（P<0.01）。结果表明，CM可以提高游泳前后小鼠血清中的T含量。图3.13CM对游泳前后小鼠血清中睾酮的影响Fig.3.13TheeffectsofCMontheserumlevelsofTinmicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.3.7.2CM对游泳前后小鼠皮质醇含量的影响51 吉林大学博士学位论文通过ELISA方法对小鼠血清中皮质醇的含量进行检测，结果如图3.14所示。结果显示2.0g/kgCM剂量组小鼠血清中的皮质醇含量在游泳前和游泳后均有显著提高，分别较空白组小鼠中的皮质醇含量提高了34.1%（P<0.01）和23.5%（P<0.01）；与空白组相比，Pro阳性对照组小鼠血清中皮质醇的含量在游泳前后均有显著升高（P<0.01）。结果表明，CM可以提高游泳前后小鼠血清中的皮质醇含量，其中在高剂量CM中效果更明显。图3.14CM对游泳前后小鼠血清中皮质醇的影响Fig.3.14TheeffectsofCMontheserumlevelsofcortisolinmicebeforeandafterswimming*P<0.05and**P<0.01versusvehicle-treatedcontrolgroup3.4实验讨论研究表明，随着生活节奏的加快，生活压力和过度疲劳会造成机体内大量ROS的产生，对组织造成不可逆的损伤[53,123]，因此，预防或缓解疲劳非常重要。近年来，由于天然药物的高疗效和低副作用，已成为抗疲劳最有力的候选药物[124]。CM作为一种独特的药用滋补真菌被人们广泛使用，本研究以CM为原料，考察其抗疲劳的活性，并初步阐明其相关的作用机制。在机体代谢过程中，2-3%的氧进入机体后转变为氧自由基，这些氧自由基一方面作为信号转导分子参与人体的正常生理过程；另一方面，氧自由基又极为活跃和不稳定，过量的氧自由基会造成细胞结构和功能的破坏，进而引起氧化应52 第三章蛹虫草子实体抗疲劳活性的研究激反应[50]。因此，为维持体内氧化-还原系统的平衡，生物体内自带抗氧化防御系统，包括抗氧化酶和抗氧化物，例如，SOD可以催化过氧化物转换成过氧化氢和氧，而GSH-Px可以清除羟基自由基，通过体内的抗氧化系统可以消除过量的氧自由基，维持体内氧自由基的平衡[50,125]。在本实验中，空白组小鼠运动后体内SOD和GSH-Px的活性降低，MDA和ROS含量升高，说明高密度运动或过度疲劳会造成生物体内过多的ROS产生，引起氧化应激[53,123]。与空白组相比，CM剂量组小鼠体内的SOD和GSH-Px的活性显著增强，MDA和ROS的含量明显降低。SOD和GSH-Px的活性升高可以增强对过量的MDA和ROS的清除，进而提高机体抵抗氧化应激损伤的能力。有文献报道，一些口服抗氧化剂可以通过抑制氧化应激，进而缓解肌肉疲劳和提高运动能力[126-127]。众所周知，ATP是生物体内最直接和最迅速的能量来源，而剧烈和过度运+动会导致肌肉中过多H的积累，造成pH的改变，抑制肌纤维腺苷三磷酸酶的活性，造成ATP合成减少，引起能量供给不足，进而引发疲劳[128]。LD，无氧条件糖酵解产生的碳水化合物，LD的积累，是引起疲劳反应发生的主要原因[129]。LDH，正常情况下存在于细胞胞质内，当细胞受到损伤时，会从胞质内释放出来转移到胞外[130]。在血液系统中，LDH可以氧化LD，进而减少H+的积累，使pH值改变，缓解LD积累造成的细胞损伤[131]，因此，LDH可以作为疲劳测定的指标[130]。线粒体是生产ROS的主要场所，当pH改变时，会直接或间接造成线粒体膜损伤，导致线粒体内膜电化学梯度改变，进而导致大量的ROS产生，造成氧化应激损伤。本实验结果表明，CM可以减少LD的积累，抑制氧化应激和增加ATP含量储备。在饥饿和氧化应激条件下，AMPK的激活能够增强细胞的存活能力[132]，研究表明，AMPK激动剂AICIR可以通过调节AMPK进而调节代谢基因的表达而提高运动能力[133]；另一方面，AMPK作为“细胞能量开关”可以通过抑制糖原、胆固醇和脂肪的形成，促进脂肪酸的氧化和葡萄糖的转运来维持生物体内ATP的平衡[134]，但是当机体处于异常细胞激活能量状态时，AMPK又可以通过激活正常代谢途径去调节ATP的合成和代谢[135]。有研究报道，AMPK的激活可以抑制ROS[136]积累和增强SOD和GSH-Px活性进而抑制肝脏中氧化应激的发生。综上所述，53 吉林大学博士学位论文AMPK在对CM介导的体内抗氧化能力增强和ATP含量增加过程中扮演着重要的角色。同时，在westernblot结果中可以看到CM剂量组中P-AKT和P-mTOR的活性表达增加，mTOR作为AKT的下游蛋白，是调节生长与能量代谢的一个枢纽分子[137]，在运动过程中，通过激活AKT/mTOR信号通路可以促进相关蛋白的合成进而影响能量代谢和疲劳的发生[138]。本实验中，虽然没有做出AMPK、AKT/mTOR和ERK之间具体的信号蛋白通路，但westernblot实验结果表明AMPK、AKT/mTOR和ERK均参与了CM介导的抗疲劳活性。为了对CM抗疲劳的机制作出更全面的解释，我们对血清中睾酮和皮质醇进行了含量测定。在运动过程中，下丘脑-垂体-睾丸轴的活性增强，睾酮的合成增加，睾酮具有提高运动能力，增强肌肉强度和延缓疲劳发生的作用[139]，目前已经确定外用雄性激素具有促进疲劳恢复的作用[140]。血液中皮质醇浓度通常与运动的形式、运动强度以及运动的持续性相关[141]，在运动初期，肾上腺皮质轴的兴奋性增强，下丘脑分泌的促肾上腺皮质激素释放激素进入垂体前叶增多，促进皮质醇的分泌，使机体处于最佳运动状态。因此，CM也以通过调节激素水平增强机体的运动能力，延缓疲劳的发生。3.5本章小结在CM介导的抗疲劳活性中，CM可以通过增强AMPK、AKT/mTOR和ERK蛋白的表达，增强抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性、减少氧自由基对细胞和组织的损伤，进而提高机体的ATP供给能力，延长小鼠的运动时间，表现出抗疲劳活性。54 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究糖尿病是由胰岛素分泌缺陷或胰岛素作用障碍导致的，以机体内空腹血糖（FastingBloodGlucose,FBG）升高为特征的代谢紊乱性疾病，由于胰岛素分泌或作用的异常，进而导致了与胰岛素相关的脂类和蛋白的代谢紊乱[63]。在糖尿病患者中，Ⅱ型糖尿病占90%以上，目前认为Ⅱ型糖尿病主要是由遗传基因、生活方式、肠道微生物和维生素D等因素造成的[142]。由于生物体长期处于高糖环境中，导致生物体内各种器官发生不同程度的损伤，进而引起各种糖尿病并发症，如心血管疾病、肾病、视网膜病变等疾病[66]。其中，由于糖尿病肾病的高病发率和高致死率，使其成为糖尿病中最严重的并发症[67]。在糖尿病的发展中，氧化应激起到非常关键的作用。长期的高糖环境有利于ROS的形成，会造成AGEs、AGEs受体和配体的过表达以及PKC的激活等，进而会改变胰岛素的敏感性，造成胰岛素抵抗和葡萄糖耐受量降低[72]；另一方面，ROS及其MDA的过度积累会导致肾小管阻塞，最终导致肾脏损伤[71]。同时，氧化应激会激活炎症通路，促进炎症相关因子的表达[37]。氧化应激在糖尿病及并发症肾炎的病理发展中起到非常重要的作用。在现代社会中，糖尿病已成为21世纪一个主要的全球流行病，全球20亿人口受其影响，预计在20年内，患病人数将增加50%。鉴于临床上使用的胰岛素和各种化学合成的降糖药物在一定程度上存在着副作用，如胰岛素抵抗、低血糖症、肠道紊乱、食欲不振等[77]。所以寻找副作用低或没有副作用的天然药物治疗糖尿病显得额外重要，CM作为一种滋补药用真菌，具有多种活性成分和药理活性，具有极大的开发应用前景。本章通过高糖高脂饲料（HFHSD）喂养联合链脲佐菌素（STZ）尾静脉低剂量注射建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，考察CM对Ⅱ型糖尿病及并发症肾病的治疗活性及可能的作用机制。55 吉林大学博士学位论文4.1仪器与材料4.1.1主要仪器仪器名称型号规格生产厂家酶标仪ELX800美国BIOTEK公司三诺血糖仪三诺安准长沙三诺生物有限公司紫外、可见、分光光度计UV-2401PC日本岛津公司高速离心机MiniSpin德国Eppendorf超低温冰箱MDF-492日本三洋数码显微镜E200日本NIKON冰箱海尔Ⅲ青岛海尔有限公司ZW-A型微量振荡器THZ-82江苏省荣华仪器制造公司水平电泳槽DYCP-31DN美国Bio-Bad公司电泳仪电源-IIEPS301美国Bio-Bad公司凝胶成像系统Biospectrum600美国UVP公司4.1.2主要试剂盐酸二甲双胍片购自北京京丰制药有限公司；GAPDH、Total(T)-Akt、T-GSK-3β和Phosphor(P)-Akt、P-GSK-3β抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体购自Abcam公司；链脲佐菌素（Streptozotocin,STZ）、蛋白酶抑制剂、RIPABuffer购自美国Sigma-Aldrich公司；PVDF膜，购自德国MerkMillipore公司；30%丙烯酰胺，购自美国Bio-Rad公司；氯化钾、氯化钠、十二水磷酸氢二钠、柠檬酸、柠檬酸三钠、甲醛等其它常规化学试剂均为国产，分析纯。0.1mol/L柠檬酸缓冲液配制方法：（A）准确称量2.10g柠檬酸，溶于100mL蒸馏水；（B）准确称取2.94g柠檬酸三钠，溶于100mL蒸馏水；A液与B液1:1.32混合，即28mLA液与22mLB液混合后，蒸馏水定溶至100mL，备用。4.1.3主要检测试剂盒试剂盒名称生产厂家超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒南京建成生物工程研究所谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒南京建成生物工程研究所56 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究丙二醛（MDA）检测试剂盒南京建成生物工程研究所活性氧（ROS）检测试剂盒南京建成生物工程研究所丙酮酸激酶（PK）检测试剂盒南京建成生物工程研究所尿素氮（BUN）检测试剂盒南京建成生物工程研究所血尿肌酐（Scr）检测试剂盒南京建成生物工程研究所总胆固醇（TC）检测试剂盒南京建成生物工程研究所甘油三酯（TG）检测试剂盒南京建成生物工程研究所高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）检测试剂盒南京建成生物工程研究所低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）检测试剂盒南京建成生物工程研究所N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶（NAG）检测试剂盒南京建成生物工程研究所考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒南京建成生物工程研究所白蛋白检测试剂盒南京建成生物工程研究所胰岛素（INS）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司大鼠白介素-2（IL-2）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司大鼠IL-6ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司4.1.4实验动物雄性SD大鼠，清洁级，体重180~220g，购于吉林大学实验动物中心（许可证号：SCXK（吉）2011～0003）。高脂饲料含有22%脂肪，20%蛋白和48%碳水化合物，总热量为44.3kJ/kg，标准饲料含有5%脂肪，23%蛋白，53%碳水化合物，总热量为25kJ/kg，均购自吉林大学实验动物中心。实验动物使用遵照实验动物使用条例进行，动物饲养保证12h/12h光暗循环，温度为23±1℃，湿度65±5%，自由饮食。4.2实验方法4.2.1HFHSD喂养联合STZ注射建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型健康雄性SD大鼠，适应性喂养2天，HFHSD喂养8周后，连续7天尾静脉注射预冷的2%STZ（STZ溶解于0.1mol/L的柠檬酸缓冲液中，现用现配）建57 吉林大学博士学位论文模，每天注射剂量为25mg/kg（STZ/体重），注射3h后灌胃给予25%葡萄糖溶液（0.5ml/100g,V/体重）。3天后尾静脉采血，血糖值≥11.1mmol/L视为建模成功。同时空白对照组注射等体积柠檬酸缓冲液。4.2.2给药与分组按体重和血糖值对建模成功的大鼠进行重新分组，保证每组糖尿病大鼠的体重和血糖的平均值相似，每组10只，分为5组，即CM低、中、高剂量组，剂量分别为0.5、1.0和2.0g/kg（CM/大鼠体重），二甲双胍片（Metformin,Met）阳性对照组，剂量为100mg/kg（Met质量/大鼠体重，按照人体剂量换算得到），和模型对照组，同时以健康的SD雄性大鼠作为空白组。给药方法：口服灌胃给药，每天一次，空白组和模型对照组给予等量生理盐水。给药期间，监控大鼠体重和空腹血糖。4.2.3大鼠饮食、饮水、尿量测定末次给药结束后，将大鼠分别置于代谢笼内，记录每组大鼠24h内的饮食、饮水和排尿量，对收集的尿液进行尿蛋白含量测定。4.2.4糖耐量实验各组大鼠给药4周结束后，禁食不禁水16h后，尾静脉采血测定血糖值作为初始血糖值，之后口服灌胃2.0g/kg的葡萄糖溶液，在灌胃葡萄糖溶液0.5、1、2和4h后分别再测定血糖值，考察大鼠调节血糖的能力。大鼠口服葡萄糖耐量曲线下面积（AUC）采用梯形法进行计算。4.2.5样品收集糖耐量实验结束后大鼠腹腔注射水合氯醛麻醉，然后进行心脏取血，4000rpm离心10min，收集血清，-80℃保存备用；对大鼠取血结束后，颈椎脱臼处死，解剖取双肾，一个置于10%福尔马林中，另一个保存于-80℃中，保存备用。4.2.6生化指标检测58 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究按照相关试剂盒的操作方法，对收集血清中的SOD、GSH-Px和PK活性，以及MDA、TC、TG、LDL-C、HDL-C、Scr、BUN和NAG的含量进行检测。将保存在-80℃中的肾脏取出一块组织，加入生理盐水研磨搅碎，4000rpm离心10min，测定上清液中的SOD和GSH-Px活性，以及MDA和ROS含量，按照试剂盒的操作方法进行。4.2.7ELISA检测按照ELISA试剂盒的操作方法对血清中INS、IL-2、IL-6以及TNF-α的含量进行测定。4.2.8病理形态学观察肾脏标本固定于10%中性福尔马林中，4℃保存。常规石蜡包埋、切片，采用HE染色，通过光镜观察进行病理分析。4.2.9Westernblot实验对糖尿病大鼠肾脏进行westernblot实验，将保存在-80℃的肾脏取出一小块组织，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，冰浴上裂解30min，4℃10000rpm离心10min，吸取上清液，测定蛋白浓度，取等量蛋白加入2×加样缓冲液，然后95℃变性处理5min，SDS-PAGE电泳每孔等量蛋白上样，90V电压下至所有样品压成一条直线，然后调到120V，至溴酚兰跑出终止电泳，然后100V冰盒转膜120min，之后在5%BSA4℃下封闭4h，分别AKT，GSK-3β以及P-AKT，P-GSK-3β一抗4℃孵育过夜，二抗孵育4h，然后显影，强度量化通过QuantityOne-4.5.0定量扫描光密度。4.2.10统计方法学分析数据处理应用SPSS13.0软件，进行ANOVA单因素方差分析，数据以x±S.E.M.表示，双t-t检验显著性水平，当P<0.05时表示具有显著差异性。59 吉林大学博士学位论文4.3实验结果4.3.1CM对糖尿病大鼠体重的影响通过监测大鼠体重，考察CM对糖尿病大鼠体重的影响，结果如表4.1所示。结果显示，经过8周HFHSD喂养的糖尿病大鼠在注射STZ后体重骤降，与空白组有显著差异（P<0.01）。与模型组相比，CM和Met给药4周治疗后，糖尿病大鼠的体重明显回升（P<0.05）。结果表明，CM可以改善糖尿病的体重降低，随着给药时间的延长，CM对糖尿病大鼠的体重改善效果就越明显。4.3.2蛹虫草子实体对大鼠饮食、饮水和尿量的影响给药4周结束后，将大鼠置于代谢笼内观察各组大鼠摄食量、摄水量和尿量的变化，结果如表4.2所示。与空白组相比，模型组大鼠每百克的摄食量、摄水量和排尿量均明显增加（P<0.01）。与模型组相比，CM治疗4周后，糖尿病大鼠的摄食量和摄水量明显减少（P<0.05），接近空白组大鼠的摄食量和摄水量，同时CM和Met给药组糖尿病大鼠的排尿量也明显降低。表4.2蛹虫草子实体对大鼠摄水量、摄食量和排尿量的影响Table4.2TheeffectsofCMandMetondailyfoodintake,waterintake,andurineoutputineachexperimentalrat.FoodintakeWaterintakeUrineoutput(g/100g)(g/100g)(mL/100g)CTRL--14.0±2.014.5±3.64.1±1.2######Model--19.5±3.263.8±6.851.1±5.8***0.513.3±1.942.3±5.940.3±6.7****CM(g/kg)1.015.7±1.832.6±3.630.7±7.1***2.013.6±0.737.1±4.239.0±3.6**Met(mg/kg)10016.6±2.138.9±6.441.7±6.6Dailyfoodintake,waterintake,andurineoutputwerenormalizedtoratbodyweight，g/100gormL/100gbodyweight.DataareexpressedasmeanS.E.M.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.60 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究表4.1CM对糖尿病大鼠体重的影响Table4.1TheeffectofCMonbodyweightofthediabeticrats8-week7-day4-weekdrugtreatmentInitialHFHSDfeedingSTZinjection1234CTRL--140.2±25.1445.3±33.9468.3±32.8464.3±29.8470.3±30.9480.2±28.4485.2±32.4#########Model--139.2±26.8450.1±35.9386.2±35.1326.0±39.1315.7±25.9303.9±38.8297.0±32.4*Body0.5145.1±29.2455.3±33.8381.7±31.5348.3±32.7339.2±42.1347.9±59.2361.7±27.8weightCM*1143.2±30.7456.3±30.0388.6±30.5320.0±42.6335.7±41.1355.9±31.9373.7±30.2(g/kg)(g)*2140.1±25.1475.1±35.9385.1±31.9373.8±23.5355.2±28.9345.2±30.7390.0±22.0Met*100139.6±22.1462.4±32.3391.9±30.2326.4±37.9345.1±32.1344.0±38.2349.0±35.6(mg/kg)DataareexpressedasmeanS.E.M.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.61 吉林大学博士学位论文4.3.3CM对糖尿病大鼠空腹血糖的影响考察CM对糖尿病大鼠空腹血糖（FBG）的影响，结果如表4.3所示。正常大鼠的FBG没有很大的变化幅度，一直保持在正常水平，并且HFHSD喂养对大鼠FBG没有明显影响（P>0.05）。STZ尾静脉注射1周后，与空白组相比，糖尿病大鼠FBG显著升高（P<0.001），说明糖尿病模型建模成功。与模型组相比，CM给药治疗1周的降糖效果并不明显，但随着给药时间的延长，糖尿病大鼠的FBG明显降低（P<0.05），降糖效果甚至要优于Met。4.3.4CM对糖尿病大鼠糖耐量的影响按照4.2.4所述的方法对各组大鼠进行糖耐量实验，结果如图4.1和图4.2所示。结果显示，各组大鼠在给予葡萄糖溶液后，血糖于1h左右达到峰值，空白组大鼠的血糖水平略有上升，但上升幅度并不大；糖尿病大鼠的血糖值变化幅度比较大，与模型组相比，CM实验组的糖尿病大鼠血糖值有明显降低（P<0.05），说明CM可以改善糖尿病大鼠由外源葡萄糖导致的血糖升高。图4.1CM对糖尿病大鼠口服糖耐量的影响Fig.4.1TheeffectofCMonoralglucosetoleranceofthediabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.62 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究表4.3CM对糖尿病大鼠FBG的影响Table4.3TheeffectofCMonFBGlevelofthediabeticrats8-week4-weekdrugtreatment7-dayInitialHFHSDSTZinjection1234feedingCTRL--4.1±0.74.3±0.64.6±0.84.6±0.74.7±0.64.69±0.894.8±0.7##########Model--4.2±0.64.6±0.518.1±1.519.2±1.419.1±2.221.0±1.918.9±1.9Fasting0.54.0±0.54.5±0.718.3±1.615.2±2.113.7±1.712.3±1.9*10.8±1.8*blood**glucoseCM(g/kg)13.9±0.74.2±0.917.7±1.616.1±1.713.9±1.411.6±1.712.2±1.9(mmol/L)***24.1±0.74.5±0.618.0±2.114.8±1.612.5±1.911.9±1.914.7±1.7Met**1004.2±0.6134.4±0.717.6±2.117.1±2.114.7±1.613.8±1.712.9±1.8(mg/kg)DataareexpressedasmeanS.E.M.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.63 吉林大学博士学位论文图4.2糖耐量实验AUC结果Fig.4.2Theareaunderthecurveofglucoseoforalglucosetoleranceofthediabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup4.3.5CM对糖尿病大鼠胰岛素含量的影响给药结束后，对大鼠血清中的胰岛素含量进行测定，考察CM对糖尿病大鼠胰岛素的影响，结果如图4.3所示。结果显示，HFHSD联合STZ诱导的糖尿病大鼠的胰岛素水平显著低于空白组（P<0.01），对糖尿病大鼠灌胃给予4周CM治疗后，0.5g/kgCM剂量组糖尿病大鼠的胰岛素水平有明显回升（P<0.05）。结果表明，CM具有提高糖尿病大鼠胰岛素含量的能力。64 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究图4.3CM对糖尿病大鼠胰岛素含量的影响Fig.4.3TheeffectofCMonthelevelofinsulinindiabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.4.3.6CM对糖尿病大鼠PK活力的影响糖尿病大鼠给药结束后，对大鼠血清中的PK活力进行测定，考察CM对糖尿病大鼠PK活力的影响，结果如图4.4所示。模型组大鼠的PK活力显著低于空白组（P<0.01），灌胃给予4周CM和Met治疗后，1.0g/kgCM剂量组大鼠的PK活力明显回升，较模型组相比，活力分别提高了15.9%（P<0.01）和10.6%（P<0.05），虽然0.5g/kg和2.0g/kgCM剂量组的大鼠的PK活力与模型组相比没有明显差异，但均值均有所上升。结果表明，CM可以提高糖尿病大鼠的PK活力，进而提高其调节血糖的代谢能力。65 吉林大学博士学位论文图4.4CM对糖尿病大鼠PK活力的影响Fig.4.4TheeffectofCMonthelevelofpyruvatekinaseindiabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.4.3.7CM对糖尿病大鼠血脂代谢的影响在糖尿病过程中通常会伴随着脂质的代谢紊乱，CM和Met灌胃给药4周结束后，分别测定各组大鼠血清中的TC、TG、LDL-C和HDL-C的含量，考察CM对糖尿病大鼠血脂代谢的影响，结果如图4.5、4.6、4.7和4.8所示。结果显示，模型组糖尿病大鼠的TC、TG和LDL-C含量显著高于空白组（P<0.01），并且HDL-C含量显著低于空白组（P<0.01），对糖尿病大鼠给予4周CM和Met治疗后，可以发现其血脂代谢紊乱情况得到明显改善。与模型组相比，0.5、1.0和2.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠的TC含量分别降低了18.1%、38.2%（P<0.05）和61.5%（P<0.01），TG含量分别降低了51.3%（P<0.05）、71.1%（P<0.01）和41.1%（P<0.05），同时Met剂量组的大鼠TC和TG的含量也分别降低了50.1%（P<0.05）和34.0%（P<0.05）；0.5和2.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠中LDL-C较模型组糖尿病大鼠有明显的降低（P<0.05）；2.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠中的HDL-C与模型组相比升高了47.8%（P<0.05），但Met对LDL-C和HDL-C的改善效果并不明显。结果表明，CM可以明显改善糖尿病过程中血脂代谢紊乱。66 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究图4.5CM对糖尿病大鼠血清中TC含量的影响Fig.4.5TheeffectofCMonthelevelofTCinserumofdiabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.图4.6CM对糖尿病大鼠血清中TG含量的影响Fig.4.6TheeffectofCMonthelevelofTGinserumofdiabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.67 吉林大学博士学位论文图4.7CM对糖尿病大鼠血清中LDL-C含量的影响Fig.4.7TheeffectofCMonthelevelofLDL-Cinserumofdiabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.图4.8CM对糖尿病大鼠血清中HDL-C含量的影响Fig.4.8TheeffectofCMonthelevelofHDL-Cinserumofdiabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.4.3.8CM对血清中Scr、BUN和NAG以及尿蛋白含量的影响在糖尿病过程中，由于肾脏长期处于高血糖的状态下，会导致肾脏损伤，因此在给药4周结束后，通过测定血清中Scr、BUN和NAG含量以及尿蛋白含量的变化，考察CM对糖尿病肾脏的影响，结果如表4.4所示。结果显示，模型组68 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究糖尿病大鼠中的Scr、BUN、NAG和尿蛋白含量显著高于空白组（P<0.01），CM给药4周治疗后，与模型组相比，1.0和2.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠的Scr含量显著降低（P<0.01），并且1.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠的BUN含量和尿蛋白含量也显著降低（P<0.01），但是CM对NAG的影响并不明显；Met对于Scr，BUN、NAG和尿蛋白的含量没有显示出明显影响。结果表明，CM可以降低血清中的Scr、BUN和尿蛋白含量，对于高糖引起的肾损伤有一定的改善作用。表4.4蛹虫草子实体对血清中Scr、BUN、NAG和尿蛋白含量的影响Table4.4TheeffectsofCMandMetonthelevelsofScr,BUN,NAGandAlbuminuriainurineofdiabeticrats.ScrBUNNAGAlbuminuria(μmol/L)(mmol/L)(U/L)(mg/mL)CTRL--143.8±31.35.1±0.530.2±6.40.9±0.05########Model--338.8±32.310.2±0.775.7±7.72.6±0.30.5328.4±22.29.2±1.060.8±7.52.0±0.3*****CM(g/kg)1.0228.5±54.68.2±0.568.9±8.11.8±0.2**2.0226.3±32.18.6±1.273.2±9.01.9±0.3Met(mg/kg)100288.5±74.99.3±1.162.9±9.12.0±0.3DataareexpressedasmeanS.E.M.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.4.3.9CM对大鼠抗氧化能力的影响在糖尿病发展过程中，机体氧化-还原系统出现异常，发生氧化应激现象，而且由于氧化应激的发生进而会引起糖尿病其他并发症的发生，因此在给药4周结束后，对血清和肾脏中SOD和GSH-Px活性，以及MDA或ROS的含量进行测定，结果如表4.5和4.6所示。4.3.9.1CM对糖尿病大鼠血清抗氧化能力的影响与空白相比，模型组糖尿病大鼠血清中SOD和GSH-Px活性明显下降69 吉林大学博士学位论文（P<0.05），并且MDA含量也显著上升（P<0.01）；CM给药4周治疗后，与模型组相比，1.0和2.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠血清中SOD活性明显上升（P<0.05），1.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠血清中GSH-Px活性也明显提高（P<0.05），虽然0.5和2.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠血清中GSH-Px活性均值高于模型组糖尿病大鼠，但由于个体差异较大，并没有明显差异；与模型组相比，在给药4周CM和Met治疗后，1.0和2.0g/kgCM剂量组和Met阳性对照组糖尿病大鼠血清中的MDA含量也显著地下降（P<0.01）。结果表明，CM可以提高糖尿病大鼠血清中的SOD和GSH-Px活性，降低MDA含量，抑制氧化应激。表4.5CM对大鼠血清中SOD和GSH-Px的活性以及MDA含量的影响Table4.5TheeffectsofCMandMetontheactivitiesofSODandGSH-Px,andthelevelofMDAinserumofdiabeticratsSODGSH-PxMDA(U/mL)(μmol/L)(nmol/mL)CTRL--245±151116±418.7±0.8####Model--201±12944±3728.0±0.70.5223±111000±5121.9±2.7*****CM(g/kg)1.0248±161053±2512.4±2.7***2.0237±17994±3310.7±1.8**Met(mg/kg)100215±17994±915.0±2.5DataareexpressedasmeanS.E.M.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.#P<0.05and##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.4.3.9.2CM对糖尿病大鼠肾脏抗氧化能力的影响将-80℃保存的肾脏取出一小块组织，加入生理盐水匀浆，离心，测定上清液中的SOD和GSH-Px活性以及MDA和ROS含量，考察CM对肾脏抗氧化能力的影响，结果如表4.6所示。与空白组相比，模型组糖尿病大鼠肾脏中的SOD和GSH-Px活性明显下降（P<0.01），并且MDA和ROS含量也显著上升（P<0.01）；CM和Met给药4周治疗后，与模型组相比，大鼠肾脏中的SOD和GSH-Px活70 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究性明显上升（P<0.05），并且MDA和ROS含量也明显下降（P<0.05）。结果表明，CM可以提高肾脏组织中SOD和GSH-Px活性，降低MDA和ROS含量，提高抗氧化能力，抑制肾脏的氧化应激。表4.6CM对大鼠血清中SOD和GSH-Px的活性以及MDA和ROS含量的影响Table4.6TheeffectsofCMandMetontheactivitiesofSODandGSH-Px,andthelevelofMDAinkidneyofdiabeticratsSODGSH-PxMDAROS(U/mgprot)(μmol/gprot)(nmol/mgprot)(FI/gprot)CTRL--134±146987±3187.0±1.4815±32########Model--84±114925±40211.3±2.6988±550.5110±185236±21011.2±2.7903±31*****CM(g/kg)1.0122±136012±4628.2±1.2895±28**2.0105±145985±4339.3±2.0865±48****Met(mg/kg)100111±115784±2238.5±1.5875±36DataareexpressedasmeanS.E.M.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.#P<0.05and##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.4.3.10CM对大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α含量的影响糖尿病中的高糖会对肾脏造成一定的肾毒性，引起肾脏损伤，因而导致炎症因子的释放。因此，通过检测血清中的IL-2、IL-6和TNF-α的含量变化，考察CM对糖尿病肾脏的影响，结果如图4.9、4.10和4.11所示。结果显示，与空白组相比，模型组糖尿病大鼠血清中的IL-2、IL-6和TNF-α含量明显升高（P<0.01）；CM给药4周治疗后，与模型组相比，CM剂量组糖尿病大鼠血清中IL-2、IL-6和TNF-α的含量显著降低，其中1.0g/kgCM剂量组糖尿病大鼠血清中的IL-2水平下降了35.1%（P<0.01），0.5、1.0和2.0g/kgCM剂量组的IL-6含量分别降低了25.8%（P<0.01）、27.1%（P<0.01）和21.9%（P<0.01），TNF-α含量分别降低了27.5%（P<0.05）、31.2%（P<0.01）和21.3%（P<0.05）。Met阳性对照组糖尿病大鼠血清中的IL-2、IL-6和TNF-α含量与模型组相比也有明显的下降，分71 吉林大学博士学位论文别下降了26.2%（P<0.01）、17.4%（P<0.01）和20.4%（P<0.05）。结果表明，CM可以降低血清中IL-2、IL-6和TNF-α的含量，减少炎症因子的释放，进而缓解肾脏损伤。图4.9CM对大鼠血清中IL-2含量的影响Fig.4.9TheeffectofCMonthelevelofIL-2inserumofthediabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,**P<0.01versusmodelgroup图4.10CM对大鼠血清中IL-6含量的影响Fig.4.10TheeffectofCMonthelevelofIL-6inserumofthediabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,**P<0.01versusmodelgroup72 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究图4.11CM对大鼠血清中TNF-α含量的影响Fig.4.11TheeffectofCMonthelevelofTNF-αinserumofthediabeticrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.4.3.11H&E染色对肾脏病理学变化的观察通过H&E染色考察CM对糖尿病大鼠肾脏病理学的影响，结果如图4.12所示。从肾脏组织切片中可以看出，正常大鼠肾小球呈椭圆形，无明显增大或缩小，系膜细胞无增厚，细胞外基质无明显增多，并且没有炎性细胞浸润，而模型组肾脏出现了严重损伤，系膜细胞明显增厚，肾小球细胞明显增大，同时伴随着严重的炎性细胞浸润现象。CM给药4周治疗后，肾脏组织损伤有明显改善，肾小球系膜增厚和炎症浸润现象得到缓解，表明CM可以缓解高糖引起的肾脏损伤，对糖尿病肾病有一定的治疗作用。73 吉林大学博士学位论文图4.12H&E染色对肾脏病理学变化的观察Fig.4.12ThehistopathologicalchangesinkidneywereobservedthroughH&Estaining4.3.12Westernblot实验通过westernblot实验对各组大鼠肾脏组织中AKT和GSK-3β的表达进行分析，结果如图4.13所示。结果显示，与空白组相比，模型组糖尿病大鼠肾脏中AKT和GSK-3β的活性表达显著上升（P<0.01），4周CM给药结束后，AKT和GSK-3β的活性表达明显下降，最高分别下调了86.8%（P<0.01）和58.6%（P<0.01），同时Met阳性对照组的AKT和GSK-3β的活性表达也表现出明显的降低（P<0.01）。74 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究图4.13肾脏中GSK-3β和AKT蛋白表达及量化分析Fig.4.13TheexpressionsandquantitativeanalysisofAKT,GSK-3βinkidneytissue##P<0.01versusnormalcontrols,**P<0.01versusmodelgroup.4.4实验讨论HFHSD喂养联合低剂量STZ注射建立的糖尿病模型在临床上很接近人类Ⅱ型糖尿病[143]，本实验研究了CM对糖尿病大鼠的降糖及并发症肾病的治疗活性。结果表明，CM与阳性对照药Met的降血糖效果相似，与模型组相比，二者均可以明显降低糖尿病大鼠的空腹血糖；并且CM可以明显缓解由糖尿病造成的饮75 吉林大学博士学位论文食、饮水和排尿量增加，同时还可以缓解糖尿病引起的体重降低。在糖尿病患者中可以观察到不正常糖代谢情况，如糖酵解能力下降、糖原生成阻碍和糖异生增加等[144]，PK激酶是葡萄糖代谢和能量生成的关键酶[145]，CM可以通过提高胰岛素含量和增强PK活性，进而促进体内葡萄糖的吸收和代谢。在糖尿病患者中，血糖升高会引起葡萄糖自动氧化和蛋白质糖基化，打破自由基产生和清除的平衡，使自由基在糖尿病患者体内过多积累，进而促进了糖尿病并发症的产生，尤其是肾病[72,146]。ROS，在氧化应激引起的损伤过程中起到关键作用，ROS可与细胞膜表面的多不饱和脂肪酸发生连续的氧化反应而降解细胞膜[146]；同时MDA含量增加通常被作为组织氧化应激的标记[147]，肾脏中ROS和MDA的过度积累会导致肾小管阻塞，肾小球渗透率下降和系膜细胞收缩，最终导致肾功能指标，如尿蛋白、Scr和BUN等的异常[71]。然而，生物体可以通过提高过氧化物或过氧化酶的表达来抵抗氧化应激，SOD可以催化过氧化物转换为过氧化氢和氧气，同时GSH-Px也可以清除羟基自由基，进而减少体内过氧自由基的积累。研究表明，抗氧化物可以抑制四氧嘧啶引起的胰腺β细胞损伤[148]。本实验中，CM可以通过增强血清和肾脏中SOD和GSH-Px的活性，增加体内抗氧化能力，进而减少ROS和MDA的积累，维持体内氧化-还原系统的平衡。研究表明，氧化应激会抑制eNOS的活性，导致氧化低密度脂蛋白受体表达和脂质代谢异常，因此在糖尿病患者中通常伴随着脂质的代谢紊乱。血脂异常通常表现为血浆和组织中TG、TC和LDL含量的升高，是糖尿病中主要的并发症[149]。实验中，与空白组相比，模型组糖尿病大鼠的TC、TG和LDL-C的含量显著升高，并且HDL-C的含量明显下降，脂质代谢发生异常，相反，经过CM和Met治疗后的糖尿病大鼠，高血脂现象得到明显抑制。同时，脂质的代谢异常会加速肾脏的损伤，对糖尿病肾病的发展起着推动作用。糖尿病血脂代谢紊乱会引起脂质在肾脏的积累，进而引发胰岛素抵抗、炎症反应和氧化应激现象[150]。胰岛素抵抗会导致脂肪因子的释放，进而导致输入小动脉松弛，最终导致肾小球的通透性增加、血管增生和系膜细胞增殖[151]。由于CM对高血脂的抑制，进而对肾脏起到了保护作用。当机体中ROS含量过高时，机体可以通过调节Nrf2的活性促进抗氧化物和抗氧化酶的表达，GSK-3β磷酸化失活对Nrf2起到负向调节作用，AKT磷酸化76 第四章蛹虫草子实体对高糖高脂联合STZ诱导的Ⅱ型糖尿病大鼠模型保护作用的研究的抑制可以下调GSK-3β磷酸化[152]。Westernblot实验结果显示，与模型组相比，CM和Met给药组糖尿病大鼠肾脏中的AKT和GSK-3β的磷酸化活性降低，表明CM和Met给药组糖尿病大鼠肾脏中的氧化应激现象得到了抑制。之前有研究报道，氧化应激可以介导糖尿病肾病中足细胞的凋亡[153]，并且通过抑制氧化应激进而抑制肾脏间质的纤维化[154]。CM可以抑制氧化应激，进而对糖尿病肾病表现出治疗活性。氧化应激会导致内皮细胞的损伤，造成内皮细胞功能紊乱，引起炎症因子的聚集[155]。白介素在炎症发展过程中扮演着重要的角色，IL-2的过量表达会激活CD4+T细胞，促进巨噬细胞和中性粒细胞在肾小球的聚集，继而加剧肾小球损伤[156]。肾小球膜细胞因子分泌系统可以分泌IL-6，它可以刺激系膜细胞的增殖，促进炎症介质的释放[157]。足细胞和肾小球内皮细胞可以分泌TNF-α，TNF-α可以通过调节炎症化内皮细胞，促进中性粒细胞的聚集[158]。因此，由内皮细胞损伤介导的炎症反应会进一步加剧肾脏损伤。CM可以减少IL-2、IL-6和TNF-α的表达，进而缓解炎症因子对肾脏的损伤，对糖尿病肾病显示出治疗作用。4.5本章小结采用HFHSD喂养联合STZ低剂量尾静脉注射建立Ⅱ型糖尿病大鼠模型，实验结果表明CM可以明显地降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖和血脂，并且可以通过抑制AKT/GSK-3β的活性表达进而抑制氧化应激，增强氧化酶SOD和GSH-Px的活性、减少氧自由基的含量和炎症因子的表达，从而对Ⅱ型糖尿病及并发症肾病表现出治疗作用。77 吉林大学博士学位论文78 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究膜性肾小球肾炎（MGN）被定义为肾小球基底膜上皮IgG免疫复合物沉积，被认为是原发性肾病综合征的重要诱因之一[159]。内源或外源抗原会诱导免疫复合物的原位产生，导致弥散性肾小球基底膜增厚，进而引发T辅助（Th）型免疫应答，接下来是肾小球毛细血管壁损伤及蛋白尿现象，并最终导致肾功能不足[119]。引起MGN的主要原因有遗传因素、免疫调节紊乱和足细胞损伤[83]。目前，研究表明ROS在MGN的发展中起到非常关键的作用，过量的ROS会沉积在足细胞表面，ROS可与细胞膜表面的多不饱和脂肪酸发生连续的氧化反应而降解细胞膜[146]，造成足细胞损伤，进而造成肾小球滤过作用下降，引起蛋白尿，最终导致肾炎。据我国流行病学调查结果显示，在原发性肾小球疾病中，原发性MGN的发生率为76.8-81.7%，其中MGN约占29.7-59.6%[81]。MGN可发生于任何年龄，但是男性多发于女性，比例为2:1，40-50岁为MGN的高发期[82]，有30-40%的病人在5-15年内会转为终末期肾功能衰竭[83]，严重影响人类的身体健康。目前，血管紧张素转换酶（ACE）和受体拮抗剂是临床上治疗膜性肾病的主要药物[90-92]，但是由于其本身的副作用和使用周期较长，对肾脏造成很大的慢性毒性，因此开发一种副作用小，治疗效果好的肾炎药物至关重要。实验中最常用的膜性肾病模型是鼠Heymann’s肾炎和C−BSA反复诱导的肾炎模型，其发病机制与慢性肾小球肾炎的发病机理最为相似[119]。本实验研究CM对C-BSA诱导的肾炎的治疗作用，通过肾脏相关生化指标检测、病理切片观察和westernblot实验来评价CM的抗肾炎活性，初步阐明CM对MGN的治疗活性及可能的作用机制。5.1仪器与材料5.1.1主要仪器仪器名称型号规格生产厂家79 吉林大学博士学位论文酶标仪ELX800美国BIOTEK公司紫外、可见、分光光度计UV-2401PC日本岛津公司高速离心机MiniSpin德国Eppendorf冷冻干燥机GENESISSQ25ES美国VIRTIS公司超低温冰箱MDF-492日本三洋数码显微镜E200日本NIKON冰箱海尔Ⅲ青岛海尔有限公司超低温冰箱MDF-492日本三洋ZW-A型微量振荡器THZ-82江苏省荣华仪器制造公司水平电泳槽DYCP-31DN美国Bio-Bad电泳仪电源-IIEPS301美国Bio-Bad凝胶成像系统Biospectrum600美国UVP公司5.1.2主要试剂雷公藤多苷片购于上海复旦复华药业有限公司；牛血清白蛋白（BSA）购于美国Invitrogen；GAPDH、Total(T)-Akt、T-NF-κBp65和Phosphor(P)-Akt、P-NF-κBp65抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体购自Abcam公司；蛋白酶抑制剂、RIPABuffer购自美国Sigma-Aldrich公司；PVDF膜，购自德国MerkMillipore公司；30%丙烯酰胺，购自美国Bio-Rad公司；氯化钾（KCl）、氯化钠（NaCl）、十二水磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）、磷酸二氢钾（KH2PO4）无水乙二胺（EDA）、碳化二亚胺（EDC）、盐酸、乙酸、乙酸胺、水合氯醛等其它常规化学试剂均为国产，分析纯。0.01mol/LPBS的配制方法：KCl0.20g、KH2PO40.20g、NaCl8.00g、Na2HPO4·12H2O2.90g，溶于蒸馏水中，调节pH值至7.4，定容到1L。5.1.3主要检测试剂盒试剂盒名称生产厂家超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒南京建成生物工程研究所谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒南京建成生物工程研究所80 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究丙二醛（MDA）检测试剂盒南京建成生物工程研究所活性氧（ROS）检测试剂盒南京建成生物工程研究所尿素氮（BUN）检测试剂盒南京建成生物工程研究所血尿肌酐（Scr）检测试剂盒南京建成生物工程研究所总胆固醇（TC）检测试剂盒南京建成生物工程研究所甘油三酯（TG）检测试剂盒南京建成生物工程研究所考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒南京建成生物工程研究所白蛋白检测试剂盒南京建成生物工程研究所核转录因子（NF-κB）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司细胞间黏附分子-1（ICAM-1）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司血管内皮细胞粘附分子-1（VCAM-1）上海源叶生物科技有限公司ELISA试剂盒大鼠白介素-2（IL-2）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司大鼠IL-6ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司大鼠肿瘤坏死因子（TNF-α）ELISA试剂盒上海源叶生物科技有限公司5.1.4实验动物Wistar大鼠，清洁级，雄性，体重140~180g，购自吉林大学实验动物中心（许可证号：SCXK（吉）2011～0003）。实验动物使用遵照实验动物使用条例进行，动物饲养保证12h/12h光暗循环，温度为23±1℃，湿度65±5%，自由饮食。5.2实验方法5.2.1阳离子化牛血清白蛋白（C−BSA）的制备称取67mLEDA，加入500mL去离子水，再缓慢加入350mL6mol/L盐酸，控制溶液温度为25℃，将溶液pH调至4.75，然后缓慢加入0.2g/mLBSA溶液25mL，不断搅拌，使溶液温度维持在25℃，加入1.8gEDC，维持温度和pH不变，搅拌2h，加入30mL醋酸缓冲液（4mol/L，pH4.75）终止反应，即81 吉林大学博士学位论文得C−BSA。C−BSA溶液用去离子水于4℃透析72h，之后冷冻干燥得C−BSA干粉，−20℃保存备用。5.2.2MGN大鼠模型的建立和分组给药Wistar大鼠适应性喂养1周，随机选出10只作为空白组，剩余进行C-BSA建模。模型建立：采用0.01mmol/L无菌PBS配制2.5mg/mLC−BSA溶液，再加入等量弗氏不完全佐剂，研磨至白色悬液，建模大鼠多点皮下预免疫注射，每只大鼠注射0.1mL悬液。1周后尾静脉免疫注射，每只大鼠每天注射剂量为40mg/kg，连续注射3周。建模期间监测大鼠体重和尿蛋白，对建模成功的大鼠以尿蛋白含量分组（每组尿蛋白含量均值相似），平均分为5组，即模型组，雷公藤多苷片（Tripterygiumwilfordiiglycosides,TWG）阳性对照组，CM低、中、高剂量组。给药方法：空白组和模型组每天口服给予生理盐水，5mL/kg；阳性对照组每天口服灌胃TWG10mg/kg（TWG质量/大鼠体重，按照人体剂量换算得到）；CM低、中、高剂量组，剂量分别为0.5、1.0、2.0g/kg（CM/大鼠体重），连续给药4周，期间监测大鼠体重和24-h尿蛋白。5.2.3样品收集尿液收集：将大鼠置于代谢笼内，禁食不禁水，收集24h尿液，-80℃保存备用。血样收集：在给药4周结束后，腹腔注射水合氯醛麻醉后，对大鼠进行心脏取血，静置凝固后于4000rpm离心10min，收集血清，分装后−80℃保存备用。肾脏采集：对大鼠取血结束后，颈椎脱臼处死，解剖取双肾，一个置于10%福尔马林中，另一个保存于-80℃中，保存备用。5.2.4生化指标检测按照相关试剂盒的测定方法，对收集的血清进行总蛋白(Totalprotein)、白蛋白(Albumin)、Scr、BUN、TC、TG和MDA的含量测定，SOD和GSH-Px活性82 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究测定，以及对保存尿液中的蛋白含量进行测定。将保存在-80℃中的肾脏取出一块组织，加入生理盐水研磨搅碎，4000rpm离心10min，测定上清液中的SOD和GSH-Px活性，以及MDA和ROS含量，按照试剂盒的操作方法进行。5.2.5ELISA检测按照相关ELISA试剂盒的测定方法，对血清中的IL-2、IL−6、TNF−α、VCAM-1、MCP-1、ICAM-1和NF−κB进行含量测定。5.2.6病理形态学观察肾脏标本在10%中性福尔马林中固定，4℃保存。常规石蜡包埋、切片，采用HE染色，通过光镜观察进行病理分析。5.2.7Westernblot实验对MGN大鼠肾脏进行westernblot实验，取出一块保存在-80℃的肾脏组织，加入RIPA裂解液及蛋白酶抑制剂，冰浴上裂解30min，4℃10000rpm离心10min，吸取上清液，测定蛋白浓度，取等量蛋白加入2×加样缓冲液，然后95℃变性处理5min，SDS-PAGE电泳每孔等量蛋白上样，90V电压下至所有样品压成一条直线，然后调到120V，至溴酚兰跑出终止电泳，然后100V冰盒转膜120min，之后在5%BSA4℃下封闭4h，分别在P-AKT，T-AKT，P-NF-κBp65，T-NF-κBp65，以及GAPDH一抗4℃孵育过夜，二抗孵育4h，然后显影，强度量化通过QuantityOne-4.5.0定量扫描光密度。5.2.8统计方法学分析数据处理应用SPSS13.0软件，进行ANOVA单因素方差分析，数据以x±S.D.表示，双t-t检验显著性水平，当P<0.05时表示具有显著差异性。5.3实验结果5.3.1CM对MGN大鼠体重的影响83 吉林大学博士学位论文实验期间对体重进行监测，结果如图5.1所示。结果显示，在C-BSA建模期间，各组大鼠体重没有明显差异；给药期间，CM和TWG给药组、模型组以及空白组大鼠之间体重也没有明显差异。结果说明，CM和TWG给药对大鼠体重并没有影响。图5.1CM对MGN大鼠体重的影响Fig.5.1TheeffectofCMonthebodyweightsofMGNrats5.3.2CM对MGN大鼠24-h尿蛋白的影响大鼠实验期间，对各组大鼠24-h尿蛋白进行了监测，结果如图5.2所示。结果显示，刚开始建模时，大鼠的24-h尿蛋白含量与空白组相比没有明显变化，在建模结束时，建模大鼠的24-h尿蛋白浓度显著上升（P<0.01）。与模型组相比，CM和TWG给药初期，MGN大鼠24-h尿蛋白含量并没有明显下降，在给药4周结束时，CM和TWG给药组的MGN大鼠24-h尿蛋白含量明显下降，0.5、1.0和2.0g/kgCM剂量组的MGN大鼠24-h尿蛋白含量分别下降了43.3%、30.0%和47.1%，TWG阳性对照组的MGN大鼠24-h尿蛋白含量也下降了50.9%。结果表明，CM可以显著降低C-BSA诱导的MGN大鼠的24-h尿蛋白含量。84 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究图5.2CM对MGN大鼠24-h尿蛋白浓度的影响Fig.5.2TheeffectofCMonthelevelof24-hurineproteinofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup5.3.3CM对MGN大鼠血清中蛋白含量的影响给药结束后，对大鼠血清中的总蛋白和白蛋白含量进行检测，结果如图表5.1所示。结果显示，与空白组相比，模型组MGN大鼠血清中的总蛋白和白蛋白含量显著降低（P<0.01），给药4周CM和TWG治疗后，大鼠血清中的总蛋白含量明显上升（P<0.01），同时，白蛋白含量也明显上升（P<0.05）。结果表明，CM可以明显提高MGN大鼠血清中总蛋白和白蛋白的含量。85 吉林大学博士学位论文表5.1CM对MGN大鼠血清中总蛋白和白蛋白含量的测定Table5.1TheeffectsofCMonthelevelsoftotalproteinandalbumininserumDoseTotalprotein(mg/mL)Albumin(mg/mL)CTRL--73.59±6.2433.81±2.76####Model--63.42±1.3524.30±3.53***0.574.66±4.0031.23±3.19**CM(g/kg)1.069.90±1.8924.46±3.51***2.072.10±0.0530.06±2.36****TWG(mg/kg)1076.56±4.6031.68±1.74DataareexpressedasmeanS.D.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.5.3.4CM对MGN大鼠Scr和BUN含量的影响在给药结束后，对MGN大鼠血清中的Scr和BUN进行含量检测，结果如图5.3和5.4所示。结果显示，与空白组相比，模型组MGN大鼠血清中的Scr和BUN含量明显升高（P<0.01）；CM给药4周后，与模型组相比，Scr和BUN含量明显降低，0.5、1.0和2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中的Scr含量分别降低了51.4%（P<0.01）、41.4%（P<0.01）和50.7%（P<0.01），同时1.0和2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中的BUN含量降低了43.7%（P<0.01）和23.2%（P<0.05），TWG阳性对照组中MGN大鼠血清中的Scr和BUN含量分别降低了49.9%（P<0.01）和37.1%（P<0.01）。结果表明，CM可以降低MGN大鼠血清中的Scr和BUN含量，改善肾脏组织损伤。86 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究图5.3CM对肾炎大鼠血清中Scr含量的影响Fig.5.3TheeffectofCMonthelevelofScrinserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,**P<0.01versusmodelgroup图5.4CM对肾炎大鼠血清中BUN含量的影响Fig.5.4TheeffectofCMonthelevelofBUNinserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup5.3.5CM对MGN大鼠血脂代谢的影响考察CM对MGN大鼠血脂代谢影响，在CM给药4周结束后，分别测定了血清中的TC和TG含量，结果如图5.5和5.6所示。结果显示，模型组MGN大鼠血清中的TC和TG含量明显高于空白组（P<0.01）；CM给药4周结束后，与模型组相比，MGN大鼠血清中的TC和TG含量明显下降，其中2.0g/kgCM87 吉林大学博士学位论文剂量组MGN大鼠血清中的TC和TG含量与模型组相比分别下降了31.3%（P<0.01）和19.7%（P<0.01）；TWG可以明显降低MGN大鼠血清中TC的含量（P<0.01），但对TG含量的影响并不明显。结果表明，CM可以降低MGN大鼠血清中的TC和TG含量，改善MGN大鼠的脂质代谢紊乱。图5.5CM对MGN大鼠血清中总胆固醇含量的影响Fig.5.5TheeffectofCMonthelevelofTCinserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,**P<0.01versusmodelgroup图5.6CM对MGN大鼠血清中甘油三脂含量的影响Fig.5.6TheeffectofCMonthelevelofTGinserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,**P<0.01versusmodelgroup5.3.6CM对MGN大鼠抗氧化能力的影响88 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究考察CM对肾炎大鼠抗氧化能力的影响，在CM给药4周结束后，分别测定了血清和肾脏中SOD和GSH-Px活性以及MDA含量。5.3.6.1CM对血清抗氧化能力的影响如表5.2所示，与空白组相比，模型组MGN大鼠血清中的SOD和GSH-Px活性明显降低（P<0.05），并且MDA含量显著升高（P<0.01）；CM给药4周治疗后，与模型组相比，1.0和2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中的GSH-Px活性明显升高（P<0.01），并且MDA含量也显著下降（P<0.01），但是CM对SOD活性的影响并不明显；同时TWG也可以明显提高MGN大鼠血清中的GSH-Px活性（P<0.01）和降低MDA含量（P<0.01）。结果表明，CM可以明显提高MGN大鼠血清中的GSH-Px活性，降低MDA含量，虽然SOD活性有所提升，但差异并不显著。表5.2CM对大鼠血清中SOD和GSH-Px的活性以及MDA含量的影响Table5.2TheeffectsofCMandMetontheactivitiesofSODandGSH-Px,andthelevelofMDAinserumofMGNratsSODGSH-PxMDAGroupDose(U/mL)(nmol/mL)(μmol/L)CTRL318±51458±1167.81±0.88#####Model228±47267±4314.90±2.220.5251±52307±6913.40±2.75****CM(g/kg)1.0258±51363±4410.05±2.42****2.0273±41365±537.95±1.22****TWG(mg/kg)10273±37394±627.66±3.42DataareexpressedasmeanS.D.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.#P<0.05and##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.5.3.6.2CM对肾脏抗氧化能力的影响如表5.3所示，与空白组相比，模型组的SOD和GSH-Px活性明显降低（P<0.05），并且MDA含量显著升高（P<0.01）；CM给药4周治疗后，与模型89 吉林大学博士学位论文组相比，2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠中肾脏的SOD和GSH-Px活性明显升高（P<0.05），并且1.0和2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠中肾脏的ROS和MDA含量也显著下降（P<0.05）；TWG阳性对照组MGN大鼠肾脏中SOD和GSH-Px活性显著升高（P<0.01），MDA和ROS含量明显下降（P<0.05）。结果表明，CM可以提高MGN大鼠中肾脏的SOD和GSH-Px活性，降低ROS和MDA含量，提高肾脏的抗氧化能力，减少氧化应激对MGN大鼠肾脏的伤害。表5.3CM对大鼠血清中SOD和GSH-Px的活性以及MDA和ROS含量的影响Table5.3TheeffectsofCMandMetontheactivitiesofSODandGSH-Px,andthelevelsofMDAandROSinkidneyofMGNratsSODGSH-PxMDAROSGroupDose(U/mgprot)(μmol/gprot)(nmol/mgprot)(FI/gprot)CTRL121±345879±5897.00±1.36989±55#######Model75±133793±42011.33±2.561391±67*0.5122±484015±66211.22±2.691233±69***CM(g/kg)1.093±334054±6068.19±1.231098±56******2.0100±165143±7337.31±2.031153±74*******TWG(mg/kg)10121±215371±6237.48±1.541201±49DataareexpressedasmeanS.D.(n=6)andanalyzedbyusingaone-wayANOVA.#P<0.05and##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup.5.3.7CM对MGN大鼠血清ELISA检测采用ELISA方法对血清中的IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1和NF-κB的含量进行检测，观察CM对血清中炎症相关因子的影响。5.3.7.1CM对MGN大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的影响按照相关ELISA试剂盒的测定方法，对MGN大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1含量进行检测，考察CM对肾炎炎症相关因子的影响，结果如图5.7、5.8、5.9、5.10、5.11和5.12所示。90 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究结果显示，与空白组相比，模型组肾炎大鼠血清中IL-2、IL-6、TNF-α、MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的含量均有显著的增加（P<0.01），但在CM和TWG给药4周治疗后，其含量均有不同程度的下降。在图5.7中，0.5和2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中的IL-2含量明显下降（P<0.05），与模型组相比，最大降低幅度为40.6%（P<0.05），同时TWG剂量组MGN大鼠血清中的IL-2含量也降低了45.1%（P<0.01）；在图5.8和5.9中，与模型组相比，0.5、10和2.0g/kgCM剂量组和10mg/kgTWG剂量组MGN大鼠血清中的IL-6和TNF-α含量均有显著下降，其中0.5g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中的IL-6和TNF-α含量下降幅度最大，分别降低了50.3%（P<0.01）和30.1%（P<0.01）；在图5.10、5.11和5.12中，与模型组相比，CM和TWG均可以不同程度地抑制炎症引起的MCP-1、ICAM-1和VCAM-1的增加，其中0.5g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中MCP-1和ICAM-1含量分别下降了29.3%（P<0.05）和24.3%（P<0.01），2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中VCAM-1含量下降了17.3%（P<0.05），TWG阳性对照组的MGN大鼠血清中的MCP-1和VCAM-1的含量也有明显下降（P<0.05），但TWG对ICAM-1的影响并不明显。结果表明，CM可以降低MGN大鼠中炎症相关因子的含量，有效地抑制炎症的发生。图5.7CM对MGN大鼠血清IL-2含量的影响Fig.5.7TheeffectofCMonthelevelofIL-2inserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup91 吉林大学博士学位论文图5.8CM对MGN大鼠血清IL-6含量的影响Fig.5.8TheeffectofCMonthelevelofIL-6inserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup图5.9CM对MGN大鼠血清TNF-α含量的影响Fig.5.9TheeffectofCMonthelevelofTNF-αinserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,**P<0.01versusmodelgroup92 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究图5.10CM对MGN大鼠血清MCP-1含量的影响Fig.5.10TheeffectofCMonthelevelofMCP-1inserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05versusmodelgroup图5.11CM对MGN大鼠血清ICAM-1含量的影响Fig.5.11TheeffectofCMonthelevelofICAM-1inserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup93 吉林大学博士学位论文图5.12CM对MGN大鼠血清VCAM-1含量的影响Fig.5.12TheeffectofCMonthelevelofVCAM-1inserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05versusmodelgroup5.3.7.2CM对MGN大鼠血清中NF-κB含量的影响采用ELISA方法对MGN大鼠血清中的NF-κB含量进行检测，结果如图5.13所示。结果显示，与空白组相比，模型组MGN大鼠血清中NF-κB含量显著增加（P<0.01），但CM和TWG给药4周治疗后，其NF-κB含量明显下降。与模型组相比，1.0和2.0g/kgCM剂量组MGN大鼠血清中的NF-κB含量分别下降了43.8%（P<0.01）和57.2%（P<0.01），同时，TWG给药组MGN大鼠血清中NF-κB含量也下降了29.4%（P<0.01）。结果表明，CM可以降低MGN大鼠血清中NF-κB的含量，进而对NF-κB促进相关炎症因子表达的活性也起到了抑制作用。94 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究图5.13CM对肾炎大鼠血清NF-κB含量的影响Fig.5.13TheeffectofCMonthelevelofNF-κBinserumofMGNrats##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup5.3.8H&E染色对肾脏病理形态学观察通过H&E染色考察CM对C−BSA诱导的MGN模型大鼠的肾脏病理学的改变，结果如图5.14所示。从肾脏组织切片中可以看出，正常大鼠肾脏皮质与髓质分界清楚，肾小球呈椭圆形，无明显增大或缩小，系膜细胞无增厚，并且没有炎性细胞浸润。模型组肾小球明显肿胀，肾小球体积增大，球囊腔变窄，系膜细胞增生严重，同时伴随着严重的炎性细胞浸润现象；CM和TWG给药4周治疗后，肾脏组织损伤有明显改善，CM可以明显抑制肾小球体积变大，缓解系膜细胞增生和毛细血管壁增厚，对C-BSA诱导的肾脏损伤起到明显的改善作用。95 吉林大学博士学位论文图5.14H&E染色对肾脏病理学变化的观察Fig.5.14ThehistopathologicalchangesinkidneywereobservedthroughH&Estaining5.3.9Westernblot实验根据方法5.3.7对各组大鼠肾脏组织进行相关蛋白westernblot表达分析，结果如图5.15。结果显示，在GAPDH参比基本相近的情况下，与空白组相比，模型组P-AKT和P-NF-κBp65的表达显著增强（P<0.01），CM和TWG给药4周治疗后，AKT和NF-κBp65的磷酸化表达受到明显抑制。在MGN大鼠肾脏中，CM对AKT和NF-κBp65的磷酸化抑制率最高达到33.5%（P<0.05）和42.3%（P<0.01），但TWG的抑制效果更为显著，抑制率分别54.1%（P<0.01）和64.5%（P<0.01）。结果表明，CM可以抑制AKT和NF-κBp65的磷酸化活性表达，进而抑制相关炎症因子的表达，改善炎症损伤。96 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究图5.15肾脏中NF-κBp65和AKT的蛋白表达及量化分析Fig.5.15TheexpressionsandquantitativeanalysisofAKTandNF-κBp65inkidneytissue##P<0.01versusnormalcontrols,*P<0.05and**P<0.01versusmodelgroup5.4实验讨论慢性肾脏疾病通常伴随着蛋白尿、血清白蛋白、Scr、BUN和血脂的异常[89,160-161]。血清中白蛋白含量降低，是肾脏功能不佳的表现[162]，在临床上，白蛋白可以用来治疗肾病引起的水肿。在MGN大鼠中，由于免疫复合物沉积导致肾小球损伤，致使其滤过作用降低，因而可以观察到尿蛋白、Scr和BUN含量增加、血清总蛋白和白蛋白含量降低，实验结果表明CM可以改善肾功能相关指标，缓97 吉林大学博士学位论文解C-BSA导致的肾脏损伤；同时，通过肾脏的病理切片观察，发现CM可以改善C-BSA诱导引起的肾小球肿胀，肾小球体积增大，球囊腔变窄，系膜细胞增生等症状，说明CM对C-BSA诱导的MGN可以起到一定程度的治疗作用。实验中，模型组MGN大鼠肾脏中的ROS含量明显高于空白组，过多的ROS可与细胞膜表面的多不饱和脂肪酸发生连续的氧化反应而降解细胞膜[146]，进一步造成足细胞结构的破坏，已知足细胞附着于肾小球基底膜的外侧，是肾小球过滤蛋白的屏障和肾小球的结构支撑、并且可以合成正常的肾小球基底膜，足细胞对维持肾脏的正常功能发挥着重要作用[163]。足细胞结构的破坏会导致肾小球通透性升高，对蛋白滤过作用下降，进而引起蛋白尿；由于蛋白尿造成生物体内蛋白的大量流失，使生物体内血清总蛋白和白蛋白含量降低。同时，由于过量的ROS和MDA会引起系膜细胞和内皮细胞的损伤，进而引起肾脏损伤，造成肾功能指标的异常[71,155]。抗氧化酶SOD和GSH-Px活性的提高，可以抑制氧化应激，减少氧化应激对肾脏的损伤。百里香醌，一种抗氧化剂，可以通过它的抗氧化活性而对肾脏起到保护作用[164]。在本实验中，CM可以提高MGN大鼠体内的SOD和GSH-Px活性，减少ROS和MDA的积累，抑制氧化应激进而对肾脏起到保护作用。大鼠尾静脉注射C-BSA，一种外源免疫抗原，会造成肾小球基底膜免疫复合物沉积，进而引发T辅助（Th）型免疫应答，进而引起体液免疫反应，造成炎症细胞聚集，激活CD4+T细胞[165]。研究表明，在肾炎中，lgG4免疫球蛋白可以靶向与线粒体内酶SOD2结合，导致SOD2细胞外化[85]，促进线粒体内膜电化学梯度改变，导致大量ROS产生，进而引发氧化应激的发生。氧化应激会对内皮造成损伤，进而引起炎症的聚集，引发炎症反应。另一方面，活化的CD4+T细胞可以分泌IL-2，而过量的IL-2又会激活CD4+T细胞，CD8+T细胞，辅助T细胞和NK细胞[156]，加剧炎症反应，造成肾脏损伤；同时，由于免疫复合物的沉积会引发足细胞分泌IL-6，而IL-6作为免疫和炎症反应中一个重要的调节器可以刺激系膜细胞的增殖[158]；TNF-α又可以通过调节炎症化的内皮细胞，促进中性粒细胞的聚集[157]，进而加剧炎症反应。在机体免疫应对微生物感染和组织损伤的保护性炎症反应中，会造成白细胞的聚集。内皮细胞会通过上调粘附因子（如ICAM-1和VCAM-1）去“捕捉”白细胞，同时内皮细胞又会分泌趋化因子（如98 第五章蛹虫草子实体对C-BSA诱导的大鼠肾炎模型保护作用的研究MCP-1）和相关脂质信号来稳定粘附因子与白细胞的粘附力进而保持运动和迁移[166]，但是当这种调节出现异常时，会导致白细胞持续渗透到炎症组织中，进而导致慢性炎症疾病。CM可以降低这些炎症相关因子的表达，进而抑制炎症反应对肾脏的损伤。ROS和相关炎症因子的过表达会激活NF-κB，westernblot实验表明在MGN大鼠中NF-κB活性明显增强，与Pan等人研究相似，在MN病人中，NF-κB活性表达明显增多[162]，NF-κB作为核转录因子在肾脏疾病发展中起到非常重要的作用。激活的NF-κB可以调节炎症因子相关基因的表达，进而提高炎症因子的含量，同时NF-κB可以激活足细胞内羟基自由基和细胞因子表达，进而对GBM造成直接损伤而影响肾小球的滤过作用[167]。在人类蛋白尿肾脏疾病中，氢化波尼松，一种糖皮质激素，可以通过抑制NF-κB的活性而改善肾小球损伤[168]；Bertelli等人发现通过抑制NF-κB的活性，可以减弱氧化应激，降低脂多糖对于肾脏的损伤[156]；二氯化钴也可以通过抑制NF-κB的活性进而减弱人肾近端小管上皮细胞的氧化应激和炎症反应[169]。大量实验结果表明，通过抑制NF-κB的活性表达可以减弱肾脏中的氧化应激和炎症反应，进而对肾脏起到保护作用。AKT作为NF-κB的上游，AKT的磷酸化会激活NF-κB，因而可以通过抑制AKT的磷酸化进而抑制NF-κB的活性。研究表明，姜黄素可以通过抑制AKT/NF-κB信号通路进而抑制氧化应激和炎症因子的表达，对阿尔茨海默病表现出治疗作用[170]。5.5本章小结C-BSA作为外源抗原注射到大鼠体内，会导致大鼠体内ROS和炎症因子的过表达，对大鼠肾脏造成损伤，导致大鼠肾脏功能不全，CM可以通过抑制AKT/NF-κB的表达，进而抑制氧化应激，减少炎症因子的表达，从而对MGN大鼠表现出治疗作用。99 吉林大学博士学位论文100 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究乳腺癌是女性最常见的癌症之一，虽然医疗条件在不断进步，但是乳腺癌仍是全球女性所面临的疾病。据统计，在2010年有150万例乳腺癌患者确诊，占整个女性癌症患者的四分之一，每年全世界有40万女性死于乳腺癌[94]。肝癌，尤其是原发性肝癌，在世界肿瘤死亡中排名第三，每年肝癌死亡人数超过80万[96]，并且肝癌的五年生存率低于10%[97]。由于化学药物和化/放疗治疗对患者所产生的副作用极大，其治疗效果并不能使人满意[104-105]，由于天然药物对肿瘤的高疗效和较低的副作用，以及逐渐明晰的分子机制，天然药物俨然已成为治疗或辅助治疗肿瘤的首选药物。细胞凋亡是指细胞在一定的生理或病理条件下，为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主有序的死亡，细胞主要是通过调节信号分子的表达来控制自身的凋亡[99]。细胞凋亡对于机体细胞和组织的正常功能代谢是非常重要的，是非常严密可控的程序调控。细胞凋亡途径主要分为三种：线粒体凋亡途径、内质网凋亡途径和死亡受体凋亡途径[106]。已知线粒体是生产ROS的主要场所，ROS的过量产生会造成线粒体膜损伤，线粒体膜电位下降，进而激活线粒体凋亡途径。研究表明，蛹虫草菌粉水提物可以通过调节PI3K/AKT线粒体凋亡途径促进MDA-MB-231（人乳腺癌）肿瘤细胞的凋亡[171]，也可以通过抑制血管生成进而抑制B16-F10裸鼠异位模型中肿瘤的生长[172]。本实验通过体外和体内实验，研究CM对MCF-7和HepG2细胞的作用，考察CM对氧化应激介导线粒体凋亡途径的影响。6.1仪器与材料6.1.1主要仪器仪器名称型号规格生产厂家酶标仪ELX800美国BIOTEK公司高速离心机MiniSpin德国Eppendorf公司离心机MIKRO12-24德国Eppendorf公司二氧化碳培养箱MCO175日本三洋公司101 吉林大学博士学位论文超净工作台SW-CJ-1C苏州安泰空气技术设备公司倒置显微镜CKX41日本OLYMPUS数码显微镜E200日本NIKON冰箱海尔Ⅲ青岛海尔有限公司超低温冰箱MDF-492日本三洋公司超低温冰箱MDF-C2156VAN日本三洋公司ZW-A型微量振荡器THZ-82江苏省荣华仪器制造公司水平电泳槽DYCP-31DN美国Bio-Bad公司电泳仪电源-IIEPS301美国Bio-Bad公司凝胶成像系统Biospectrum600美国UVP公司6.1.2主要试剂胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶、青霉素-链霉素双抗、DMEM高糖培养基，购自美国Invitrogen公司；GAPDH、CleavedPARP、CleavedCaspase3、CleavedCaspase8和Bax抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗兔多克隆抗体购自Abcam公司；3（-4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐（MTT）、二甲基亚砜（DMSO）、四氯-四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1）、蛋白酶抑制剂、RIPABuffer购自美国Sigma-Aldrich公司；PVDF膜，购自德国MerkMillipore公司；30%丙烯酰胺，购自美国Bio-Rad公司；结晶紫、KCl、NaCl等均为国产生化试剂，分析纯。细胞冻存液的配制方法：FBS:DMEM培养基:DMSO体积比为7:2:1。细胞实验所需不同浓度的CM溶液：将CM粉末按照所需浓度采用DMEM高糖基本培养基进行配置，并采用0.22μm无菌滤膜过滤，所得滤液即为细胞给药CM溶液。6.1.3主要检测试剂盒试剂盒名称生产厂家乳酸脱氢酶（LDH）检测试剂盒南京建成生物工程研究所102 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究活性氧（ROS）检测试剂盒南京建成生物工程研究所Hoechst33342检测试剂盒美国BD（BectonDickinson）公司6.1.4细胞株人乳腺癌MCF-7细胞株和人肝癌HepG2细胞株，均来源于美国菌种保藏中心（AmericanTypeCultureCollection，ATCC）。细胞培养条件：以含有10%胎牛血清（56℃，灭活30min），和1%的青霉素-链霉素的DMEM高糖培养基为完全培养基，置于37℃5%CO2恒湿恒温的培养箱中培养，根据细胞生长情况进行培养基更换或传代。6.1.5实验动物6周雄性BALB/c裸鼠，购自北京恒通利华实验动物科技公司（合格证：SCXK（京）2012-0001）。全部裸鼠均在SPF级实验室饲养，全部笼具、垫料、饲料、饮水均经过高压灭菌消毒，定期更换。实验动物使用遵照实验动物使用条例进行，动物饲养保证12h/12h光暗循环，温度为23±1℃，湿度65±5%，自由饮食。6.2实验方法6.2.1MTT实验54分别将MCF-7和HepG2细胞以1.0×10和8.0×10个/mL的浓度接种于96孔培养板中，每孔100μL，培养24h后，加入不同浓度CM，继续孵育24h或48h，然后每孔加入5mg/mL的MTT溶液10μL，孵育4h后移除上清液，每孔加入100μLDMSO，充分振摇10min，酶标仪测定每孔490nm下的吸光度值，计算细胞活力。6.2.2结晶紫实验4将MCF-7和HepG2细胞以5×10个/孔接种于6孔培养板中，培养24h，在不同浓度CM的完全培养基中孵育7天，每2天更换一次完全培养基，结束后，吸去培养基，PBS冲洗2次，加入75%甲醇在4℃下固定10min，固定之后，加103 吉林大学博士学位论文入0.1%的结晶紫溶液染色30min，染色后PBS冲洗，直到冲洗颜色至无色为止，进行拍照记录。6.2.3细胞迁移实验66分别将MCF-7和HepG2细胞以6.0×10和4.0×10个/孔接种于6孔培养板中，培养24h，吸出培养液，用10µL白色枪头沿孔板中央轻轻地做一直线划痕，之后用PBS缓冲液冲洗细胞表面3次，除去细胞残骸和碎片，之后在含不同浓度CM的完全培养基中继续孵育24h，采用倒置显微镜观察细胞的迁移变化。6.2.4LDH活性测定6将MCF-7和HepG2细胞以4×10个/孔接种于24孔培养板中，孵育24h，然后加入不同浓度CM，培养24h，然后吸取培养板中的细胞培养液，4000rpm离心10min，取上清液，按照LDH试剂盒的操作方法对上清液进行LDH活性测定。6.2.5Hoechst染色66分别将MCF-7和HepG2细胞以3.0×10和2.0×10个/孔接种于6孔培养板中，孵育24h，然后加入不同浓度的CM，继续孵育24h，吸出培养液，PBS冲洗2次，按照Hoechst试剂盒的操作方法加入荧光染料，染色15min，然后PBS冲洗2次，采用荧光显微镜观察染色状态。6.2.6ROS实验66分别将MCF-7和HepG2细胞以3.0×10和2.0×10个/孔接种于6孔培养板中，孵育24h，然后加入不同浓度的CM，继续孵育12h，吸出培养液，PBS冲洗2次，按照ROS试剂盒的操作方法加入ROS荧光染料，染色15min，然后PBS冲洗2次，采用荧光显微镜观察染色状态。6.2.7线粒体膜电位实验104 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究66分别将MCF-7和HepG2细胞以3.0×10和2.0×10个/孔接种于6孔培养板中，孵育24h，然后加入不同浓度的CM，继续孵育12h，吸出培养液，PBS冲洗2次，之后加入2μMJC-1阳离子染料100μL，在37°C黑暗条件下孵育20min，之后用PBS洗涤3次后，荧光显微镜下观察荧光颜色的变化。6.2.8Westernblot实验66分别将MCF-7和HepG2细胞以6.0×10和4.0×10个/孔接种于6孔培养板中，孵育24h，加入不同浓度的CM，继续孵育24h，吸去培养基，用4℃预冷的PBS洗涤3次之后，加入100μL细胞裂解液，于冰上裂解30min，裂解完后，将细胞碎片和裂解液移至1.5mL离心管中（整个操作在冰上进行），4℃10000rpm离心10min，吸取上清液，测定蛋白浓度，取等量蛋白加入2×加样缓冲液，然后95℃变性处理5min，SDS-PAGE电泳每孔等量蛋白上样，90V电压下至所有样品压成一条直线，然后调到120V，至溴酚兰跑出终止电泳，然后100V冰盒转膜120min，之后在5%BSA4℃下封闭4h，分别在CleavedPARP、CleavedCaspase3、CleavedCaspase8、Bax和GAPDH一抗4℃孵育过夜，二抗孵育4h，然后显影，强度量化通过QuantityOne-4.5.0定量扫描光密度。6.2.9体内裸鼠实验7将MCF-7和HepG2细胞7.0×10个/mL0.1mL体积接种于裸鼠体内，于接种3天后观察成瘤效果，将接种成功小鼠每组3只分为2组，即模型组和给药组给药剂量为1.0g/kg（CM/裸鼠体重），每隔一天口服灌胃给药，连续给药2周。于给药前称量并记录裸鼠肿瘤的大小和裸鼠体重。给药结束后，取出肿瘤组织，加入细胞裂解液匀浆，冰上裂解30min，方法同6.3.8，westernblot测定肿瘤组织中细胞凋亡蛋白的表达。6.2.10统计方法学分析数据处理应用SPSS13.0软件，进行ANOVA单因素方差分析，数据以x±S.D.表示，双t-t检验显著性水平，当P<0.05时表示具有显著差异性。105 吉林大学博士学位论文6.3实验结果6.3.1MTT实验通过MTT实验考察CM对MCF-7和HepG2细胞增殖的影响，结果如图6.1和6.2所示。结果显示，CM可以显著抑制MCF-7和HepG2细胞的增殖（P<0.01），并且呈现时间和剂量依赖关系，随着剂量的增大和给药时间的延长，CM对MCF-7和HepG2细胞的增殖抑制率越大。细胞给药48h时，当加入CM浓度大于0.4mg/mL时，对MCF-7和HepG2细胞的增殖抑制率已经达到50%；当加入CM的浓度为2.0mg/mL时，给药时间为48h，HepG2细胞的增值率仅为26.4%（P<0.01）。结果表明，CM可以显著抑制MCF-7和HepG2细胞的体外增殖。图6.1CM对MCF-7细胞增殖的影响Fig.6.1TheeffectofCMoncellviabilityreductioninMCF-7cells*P<0.05and**P<0.01versusnon-treatedcells106 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究图6.2CM对HepG2细胞增殖的影响Fig.6.2TheeffectofCMoncellviabilityreductioninHepG2cells*P<0.05and**P<0.01versusnon-treatedcells6.3.2结晶紫实验结晶紫染料可以与细胞结合，颜色的深浅代表着细胞数量的多少，因此可以用来检测细胞增殖的效果。通过结晶紫实验考察不同浓度CM对MCF-7和HepG2细胞增殖的影响，结果如图6.3和6.4所示。结果显示，CM可以明显地抑制MCF-7和HepG2细胞的增殖，并且CM浓度越大，效果越显著，与MTT实验结果一致。图6.3CM对MCF-7细胞结晶紫实验的影响Fig.6.3TheeffectofCMoncrystalvioletstaininginMCF-7cells107 吉林大学博士学位论文图6.4CM对HepG2细胞结晶紫实验的影响Fig.6.4TheeffectofCMoncrystalvioletstaininginHepG2cells6.3.3细胞迁移实验肿瘤细胞具有很强的转移能力，在体内从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，造成更为严重的肿瘤扩散，因此检验药物对肿瘤细胞迁移能力的影响，对肿瘤的防治具有很重要的意义。本实验通过划痕实验考察不同浓度CM对MCF-7和HepG2细胞迁移能力的影响，结果如图6.5和6.6所示。从结果可以看出，与空白组相比，CM可以显著地抑制MCF-7和HepG2的迁移，并且随着CM浓度的增加，效果越显著。图6.5CM对MCF-7细胞迁移能力的影响Fig.6.5TheeffectofCMonmigrationabilityinMCF-7cells108 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究图6.6CM对HepG2细胞迁移能力的影响Fig.6.6TheeffectofCMonmigrationabilityinHepG2cells6.3.4LDH活性测定LDH存在于细胞的胞质内，当细胞完整时，细胞培养液中不存在LDH，当细胞凋亡时，细胞胞质内的LDH就会释放出来。通过检测细胞培养液中LDH的活性，考察CM对MCF-7和HepG2细胞的影响，结果如图6.7和6.8所示。结果显示，当加入CM浓度大于0.2mg/mL时，MCF-7和HepG2细胞培养液中的LDH活性明显增强（P<0.05），表明细胞凋亡越多。结果表明，CM可以促进细胞的凋亡，并且与CM呈剂量依赖关系。109 吉林大学博士学位论文图6.7CM对MCF-7细胞释放LDH的影响Fig.6.7TheeffectofCMonLDHreleaseinMCF-7cells*P<0.05and**P<0.01versusnon-treatedcells图6.8CM对HepG2细胞释放LDH的影响Fig.6.8TheeffectofCMonLDHreleaseinHepG2cells*P<0.05and**P<0.01versusnon-treatedcells6.3.5Hoechst实验荧光染料Hoechst能够少许进入正常细胞膜，而凋亡细胞的膜通透性增强，因此凋亡细胞的荧光强度要比正常细胞中要高。通过Hoechst实验可以观察到不同CM浓度对MCF-7和HepG2细胞凋亡的影响，结果如图6.9和6.10所示。CM110 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究给药组荧光强度显著高于空白组，说明CM给药组凋亡的细胞比较多，并且随着CM浓度增加，细胞凋亡效果也越明显。结果表明，CM可以促进MCF-7和HepG2细胞的凋亡，凋亡效果与CM浓度呈正向关系。图6.9MCF-7细胞Hoechst实验结果Fig.6.9TheHoechsttestofMCF-7cellsafterCMtreatment图6.10HepG2细胞Hoechst实验结果Fig.6.10TheHoechsttestofHepG2cellsafterCMtreatment6.3.6ROS实验通过对MCF-7和HepG2细胞中ROS进行荧光标记，考察CM对肿瘤细胞内ROS的影响，结果如图6.11和6.12所示。结果显示，CM可以明显提高细胞内的ROS含量，并且随着细胞内CM浓度的增加，细胞内ROS荧光强度逐渐增111 吉林大学博士学位论文强，ROS产生逐渐增加。结果表明，CM可以增强MCF-7和HepG2细胞内ROS的产生，促进氧化应激反应。图6.11MCF-7细胞ROS实验结果Fig.6.11TheROStestofMCF-7cellsafterCMtreatment图6.12HepG2细胞ROS实验结果Fig.6.12TheROStestofHepG2cellsafterCMtreatment6.3.7线粒体膜电位实验细胞凋亡的早期标志之一是线粒体膜电位下降，线粒体膜电位较高时，JC-1染色为红色荧光，当时线粒体膜电位下降时，便会变为绿色荧光，因此JC-1染色可以直观地观察到不同浓度CM对MCF-7和HepG2细胞早期凋亡的影响，结112 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究果如图6.13和6.14所示。与空白组相比，CM给药组MCF-7和HepG2细胞中绿色荧光逐渐增强、膜电位逐渐下降，说明早期凋亡细胞逐渐增多，凋亡程度与CM浓度呈正向关系。图6.13CM对MCF-7细胞线粒体膜电位的影响Fig.6.13TheeffectofCMonmitochondrialmembranepotentialinMCF-7cells图6.14CM对HepG2细胞线粒体膜电位的影响Fig.6.14TheeffectofCMonmitochondrialmembranepotentialinHepG2cells6.3.8Westernblot实验通过westernblot实验观察CM对MCF-7和HepG2细胞线粒体凋亡相关蛋113 吉林大学博士学位论文白的影响，结果如图6.15和6.16所示。结果显示，与空白组相比，CM给药组CleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8和Bax的表达显著增强，并且与CM浓度成正向关系，说明CM可以促进线粒体相关凋亡蛋白的表达，进而促进MCF-7和HepG2细胞的凋亡。图6.15CM对MCF-7细胞内CleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8和Bax蛋白表达的影响Fig.6.15TheexpressionsofCleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8andBaxinMCF-7cellsafterCMtreatment图6.16CM对HepG2细胞内CleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8和Bax蛋白表达的影响Fig.6.16TheexpressionsofCleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8andBaxinHepG2cellsafterCMtreatment114 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究6.3.9裸鼠体内实验肿瘤细胞体外实验表明CM可以促进MCF-7和HepG2细胞的凋亡，通过体内实验进一步验证CM对MCF-7和HepG2肿瘤细胞的凋亡效果。考察CM对MCF-7和HepG2异位肿瘤裸鼠的体重、肿瘤大小以及线粒体相关凋亡蛋白表达的影响。6.3.9.1CM对MCF-7异位肿瘤模型裸鼠的影响图6.17结果显示，CM给药治疗2周后，裸鼠体重与模型组肿瘤裸鼠之间没有差异，说明CM对裸鼠体重没有影响。图6.18结果显示，CM可以明显地抑制MCF-7肿瘤组织的生长，随着CM给药时间的延长，CM对MCF-7肿瘤组织生长的抑制作用就越显著。给药2周结束后，与模型组相比，CM对MCF-7肿瘤组织生长的抑制率达到188.2%（P<0.05）。图6.19结果表明，CM可以促进MCF-7肿瘤组织中CleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8和Bax促凋亡蛋白的表达，进而介导MCF-7肿瘤细胞的凋亡。图6.17CM对裸鼠体重的影响Fig.6.17TheeffectofCMonbodyweightinnudemice115 吉林大学博士学位论文图6.18CM对裸鼠肿瘤大小的影响Fig.6.18TheeffectofCMontumorsizeinnudemice*P<0.05and**P<0.01versusnon-treatednudemice图6.19CM对裸鼠肿瘤组织中CleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8和Bax蛋白表达的影响Fig.6.19TheexpressionsofCleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8andBaxintumortissueofnudemiceafterCMtreatment6.3.9.2CM对HepG2异位肿瘤模型裸鼠的影响图6.20结果显示，与模型组肿瘤裸鼠相比，CM对HepG2异位肿瘤模型裸鼠的体重并没有影响，结果同MCF-7异位肿瘤模型裸鼠结果一致。图6.21结果116 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究显示，CM可以明显抑制HepG2肿瘤组织的生长，随着CM给药时间的延长，CM对HepG2肿瘤组织生长的抑制作用就越显著，给药2周结束后，与模型组相比，CM对HepG2肿瘤组织生长的抑制率达到82.7%（P<0.05）。图6.22结果表明，CM可以促进肿瘤组织中CleavedPARP、CleavedCaspase-3、CleavedCaspase-8和Bax促凋亡蛋白表达，进而介导HepG2肿瘤细胞的凋亡。图6.20CM对裸鼠体重的影响Fig.6.20TheeffectofCMonbodyweightinnudemice图6.21CM对裸鼠肿瘤大小的影响Fig.6.21TheeffectofCMontumorsizeinnudemice*P<0.05and**P<0.01versusnon-treatednudemice117 吉林大学博士学位论文图6.22CM对裸鼠肿瘤组织中cleavedPARP、cleavedCaspase-3、cleavedCaspase-8和Bax蛋白表达的影响Fig.6.22TheexpressionsofcleavedPARP、cleavedCaspase-3、cleavedCaspase-8andBaxintumortissueofnudemiceafterCMtreatment6.4实验讨论通过MTT和结晶紫实验，表明CM可以抑制MCF-7和HepG2细胞的增殖，同时CM也可以抑制MCF-7和HepG2细胞的迁移；在LDH活性检测和Hoechst实验中，表明CM可以促进MCF-7和HepG2细胞的凋亡；在ROS、线粒体膜电位和westernblot实验中，表明CM可能是促进ROS产生导致线粒体膜电位下降，进而激活线粒体凋亡途径，促进MCF-7和HepG2细胞的凋亡。细胞凋亡是指为维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，期间细胞通过调节信号分子的表达控制自身的凋亡[99]。线粒体凋亡途径是细胞凋亡途径之一[173]，是一种内源性细胞凋亡，伴随着线粒体的去极化、Bcl-2家族蛋白的异常表达、细胞色素C的过量释放和caspase-3的激活[174]。研究表明氧化应激可以通过激活线粒体凋亡途径促进细胞的凋亡，细胞内ROS的增加可以直接或间接损伤线粒体，造成线粒体膜电位的下降和膜通透性改变。在肿瘤细胞中，细胞本身的氧化-还原系统处于失衡状态，细胞内氧自由基表达比正常细胞要多。在本实验中，CM可以通过进一步增加肿瘤细胞内的ROS含量，促使细胞发出最后一道自我防御机制，即自我凋亡。CM通过促进肿瘤细胞内ROS的产生，118 第六章蛹虫草子实体对MCF-7和HepG2凋亡作用的研究导致线粒体膜电位下降，进而激活线粒体凋亡途径。研究表明，肿瘤细胞内ROS的产生能够增强氧化应激，促进Bax、Bcl-2、caspase-3、caspase-8促凋亡蛋白的表达，进而引发线粒体凋亡途径[101-103]，介导肿瘤细胞凋亡。Caspase-8主要位于线粒体上，活化的caspase-8与Bid结合为复合蛋白进而引起线粒体膜通透性改变，导致凋亡相关因子的释放[175]，激活caspase-9，最后激活效应器caspase-3，进入内源性线粒体凋亡通路。Caspase-3在细胞形态学和凋亡进程中起着非常重要的作用，通常认为是凋亡程序中的效应蛋白激酶[176]。Caspase-3缺乏的胚胎干细胞对紫外线照射和渗压震扰引起的凋亡有明显的抵抗作用[177]。另一方面，线粒体膜电位的下降，会激活位于线粒体膜上的Bcl-2家族蛋白[178]，Bax作为Bcl-2家族的促凋亡蛋白，可以调节线粒体介导的凋亡过程[178]。研究表明，通过激活Bax基因可以激活线粒体凋亡途径，进而介导胆管癌细胞凋亡[179]。PARP作为caspase-3的切割底物，在DNA的损伤修复与细胞凋亡中发挥着重要作用[180]，PARP活性的表达依赖于DNA断裂的数量[181]，PARP的过量表[182]达会引起一系列凋亡级联反应，进而促进肿瘤细胞的凋亡。6.5本章小结CM通过促进MCF-7和HepG2细胞内ROS的产生，增强肿瘤细胞内的氧化应激，导致线粒体膜电位下降，进而激活线粒体凋亡途径，促进促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-8和PARP的表达，最终导致肿瘤细胞的凋亡。119 吉林大学博士学位论文120 第七章结论和展望第七章结论与展望7.1结论1、对蛹虫草子实体进行水提工艺优化，得到的最优提取工艺为低温下提取温度为42.6℃、料液比为1:32.45、提取时间为3.09h；高温下最优提取工艺为：提取温度为79.04℃、料液比为1:29.68、提取时间为3.13h。此时，蛹虫草子实体水提物多糖含量为28.58%、腺苷含量为0.22%、虫草素含量为0.41%、虫草酸含量为6.09%。2、在CM介导的抗疲劳活性中，CM可以通过增强AMPK、AKT/mTOR和ERK蛋白的表达，增强抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性、减少氧自由基对细胞和组织的损伤，进而提高机体的ATP供给能力，延长小鼠的运动时间，表现出抗疲劳活性。3、在CM的抗糖尿病活性中，CM可以明显地降低Ⅱ型糖尿病大鼠的血糖和血脂，并且可以通过抑制AKT/GSK-3β的活性表达进而抑制氧化应激，增强氧化酶SOD和GSH-Px的活性、减少氧自由基的含量和炎症因子的表达，从而对Ⅱ型糖尿病及并发症肾病表现出治疗作用。4、在CM的抗肾炎活性中，CM可以通过抑制AKT/NF-κB的表达进而抑制氧化应激，增强抗氧化酶的活性、减少氧自由基和炎症相关因子的表达，从而对C-BSA诱导的肾炎表现出治疗作用。5、在CM的抗肿瘤活性中，CM通过促进MCF-7和HepG2肿瘤细胞内ROS的产生，导致线粒体膜电位下降，进而激活线粒体凋亡途径，促进促凋亡蛋白Bax、caspase-3、caspase-8和PARP的表达，最终导致MCF-7和HepG2细胞的凋亡。CM可以通过调节氧化应激反应进而对氧化应激介导的疾病，如疲劳、糖尿病、肾炎和肿瘤，表现出治疗活性。7.2展望本研究通过对蛹虫草子实体活性成分进行提取工艺优化和含量测定，确定蛹虫草子实体的水提工艺和蛹虫草子实体水提物中有效成分含量，为之后工业化生121 吉林大学博士学位论文产提供实验参数和可控的生产工艺流程。同时以氧化应激为治疗靶点，为开发治疗或辅助治疗疲劳、糖尿病、膜性肾病和肿瘤等疾病的药物或保健品提供理论依据。CM对氧化应激介导的疲劳、糖尿病、肾炎和肿瘤具有明显的治疗效果，但是由于氧化应激的机制很复杂，并且每种疾病发病机理也不尽相同，CM主要是通过哪些途径对氧化应激介导的疾病进行治疗的，这些将会在之后的研究中开展。122 参考文献参考文献[1]王月明,石杰,张正海,等.蛹虫草的研究进展与开发现状[J].黑龙江科学,2013,(07):54-56.[2]葛晓宇.蛹虫草子实体多糖提取及功能活性研究[D].福建农林大学,2013.[3]HongIP,KangPD,KimKY,etal.FruitBodyFormationonSilkwormbyCordycepsmilitaris[J].Mycobiology,2010,38(2):128-132.[4]LiangZQ,LiuAY,LiuMH,etal.ThegenusCordycepsanditsalliesfromtheKuankuoshuiReserveinGuizhouIII[J].FungalDivers,2003,14:95-101.[5]周思静,刘桂君,尚宏忠,等.蛹虫草人工培养技术研究进展[J].江苏农业科学,2014,(07):13-17.[6]ShresthaB,ZhangWM,ZhangYJ,etal.ThemedicinalfungusCordycepsmilitaris:researchanddevelopment[J].MycolProg,2012,11(3):599-614.[7]张慧锋.北冬虫夏草子实体培养条件的探索[J].吉林医药学院学报,2005,(04):192-194.[8]郭涛,张龙,王兵,等.不同培养基培育蛹虫草中的虫草素和腺苷含量测定[J].蚕业科学,2011,(06):1117-1122.[9]王志高,温鲁,袁小转,等.加硒对蛹虫草主要活性成分含量的影响[J].安徽农业科学,2007,(29):9293-9294.[10]CunninghamKG,MansonW,SpringFS,etal.Cordycepin,ametabolicproductisolatedfromculturesofCordycepsmilitaris(Linn.)Link[J].Nature,1950,166(4231):949.[11]KredichNM.Inhibitionofnucleicacidmethylationbycordycepin.InvivosynthesisofS-3'-DEOXYADENOSYLMETHIONINEBYWI-L2humanlymphoblasts[J].TheJournalofbiologicalchemistry,1980,255(15):7380-7385.[12]AhnYJ,ParkSJ,LeeSG,etal.Cordycepin:selectivegrowthinhibitorderivedfromliquidcultureofCordycepsmilitarisagainstClostridiumspp[J].Journalofagriculturalandfoodchemistry,2000,48(7):2744-2748.123 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攻读学位期间学术成果作者简介及在学期间所取得的科研成果一、作者简介宋静静，女，1988年出生于河北省衡水市。2007年考入吉林大学生命科学学院生命科学与技术基地班，于2011年毕业获得理学学士学位。同年保送吉林大学生命科学学院微生物与生化药学专业攻读硕士学位，2013年获得本专业直博资格，攻读博士学位，在王英武教授和滕利荣教授的指导下从事天然药物研发工作。二、博士在读期间发表的论文及申请专利学术论文：1.JingjingSong,YingwuWang,ChungangLiu,YanHuang,LiyingHe,XueyingCai,JiahuiLu,YanLiu,DiWang,CordycepsmilitarisFruitBodyExtractamelioratesmembranousglomerulonephritisbyattenuatingoxidativestressandrenalinflammationviaNF-κBpathway,Food&Function,2016,7(4):2006-2015,doi:10.1039/C5FO01017A.2.JingjingSong,XintongHou,XinyuHu,ChengyuLu,ChungangLiu,JuanWang,WeiLiu,LirongTeng,DiWang,Notonlyserotonergicsystem,butalsodopaminergicsysteminvolvedinalbiflorinagainstchronicunpredictablemildstress-induceddepression-likebehaviorinrats,Chemico-BiologicalInteractions,2015,Vol242:211-217,doi:110.1016/j.cbi.2015.10.001.3.JingjingSong,YingwuWang,MeiyuTeng,GuangshengCai,HongkaiXu,HanxiaoGuo,YangLiu,DiWang,LeshengTeng,StudiesontheAnti-fatigueActivitiesofCordycepsmilitarisFruitBodyExtractinMouseModel,Evidence-BasedComplementaryandAlternativeMedicine,2015,Vol2015:174616,doi:10.1155/2015/174616.4.JingjingSong,YingwuWang,MeiyuTeng,ShiqiangZhang,MengyaYin,JiahuiLu,YanLiu,RobertJ.Lee,DiWang,LeshengTeng,CordycepsMilitarisInducesTumorCellDeathviaCaspase-dependentMitochondrialPathwayinHepG2and141 吉林大学博士学位论文MCF-7cells,MolecularMedicineReports,2016,13(6):5132-5140,doi:10.3892/mmr.2016.5175,IF:1.554.5.ChungangLiu,JingjingSong,MeiyuTeng,XiaoyiZheng,XiangmeiLi,YueTian,MinlianPan,YuhuanLi,RobertJ.Lee,DiWang,AntidiabeticandAntinephriticActivitiesofAqueousExtractofCordycepsmilitarisFruitBodyinDiet-Streptozotocin-InducedDiabeticSpragueDawleyRats,OxidativeMedicineandCellularLongevity,Vol2016,doi:org/10.1155/2016/9685257,IF:3.516.6.JuanWang,JingjingSong,DiWang,NaZhang,JiahuiLu,QingfanMeng,YulinZhou,NingWang,YangLiu,DiWang,LeshengTeng,Theanti-membranousglomerulonephriticactivityofpurifiedpolysaccharidesfromIrpexlacteusFr.,InternationalJournalofBiologicalMacromolecules,2016,Vol84:87–93,doi:10.1016/j.ijbiomac.2015.11.087.7.YeTian,Li-rongTeng,Jing-jingSong,Qing-fanMeng,Jia-huiLu,Wei-weiZhang,KangWei,NingWang,DiWang,StudiesontheanalgesicactivitiesofJia-Yuan-Qingpillanditssafetyevaluationinmice,Protoplasma,2014,Vol251:1245-1253,doi:10.1007/s00709-014-0637-9.8.LinnaDu,YanLiu,ChungangLiu,QingfanMeng,JingjingSong,DiWang,JiahuiLu,LirongTeng,YulinZhouandLeshengTeng,AcuteandsubchronictoxicitystudiesonsafetyassessmentofPaecilomycestenuipesN45extracts,Combinatorialchemistry&highthroughputscreening,2015,Vol18,2015,809–818,doi:10.2174/1386207318666150803141448.9.JingjingSong,XueWang,YanLiu,XinyuHu,XiufenGuo,DiWang,StudiesontheAnti-FatigueEffectsofCordycepsMilitarisFruitingBody,JournalofInvestigativeMedicine,63(8),Supplement,2015,IF:1.688,ISTP.10.赵敏，宋静静，王贞佐，刘伟，刘艳，复方灰兜巴预防及治疗糖尿病的实验研究[J]，食品与药品，2011,13(7),254-257.11.孟凡欣，王立英，宋静静，郑丹，滕利荣，灰兜巴多糖对糖尿病降糖作用的研究[J]，时珍国医国药，2012,23(6),1557-1558.142 攻读学位期间学术成果发明专利1.一种鹿脾提取物制剂及其制备方法，发明人：滕利荣，宋静静，程瑛琨，逯家辉，孟庆繁，郭璇，刘艳，闫国栋，周毓麟，申请号：CN201210171730.9，授权日：2013-9-18.2.复方鼠妇提取物及制备方法和在镇痛药物中的应用，发明人：滕利荣，王贞佐，田野，沈畏，宋静静，吴凌，赵敏，孟庆繁，逯家辉，申请号：CN201110147689.7，授权日：2012-12-19.3.一种镇痛消炎的复方马齿苋中药制剂及其制备方法，发明人：金元宝，黄学勤，王亮，滕利荣，吴丽艳，赵明智，宋静静，申请号：CN201510307557.4.4.一种提高免疫力和延缓衰老的保健品及其制备方法，发明人：吴丽艳，刘明石，刘雨萌，滕利荣，王亮，赵成国，宋静静，申请号：CN201510310780.4.143 吉林大学博士学位论文144 致谢致谢时光飞逝，日月穿梭，不知不觉已在吉林大学度过九年，心中万分感慨，九年的时间，吉林大学让一个懵懂的孩子变成一个可以回馈社会的独立意识个体。临行之际，心中有很多感谢的话语，感谢吉林大学，教予我知识的力量和做人的态度，是这纷繁复杂世界里吉大学子的乌托邦，而这样的乌托邦城墙确是由那些可爱的吉大老师筑起的！在吉大九年，实验室八年，非常幸运地加入滕利荣教授的大家庭。在这里非常感谢滕利荣教授和王英武教授，他们丰富的专业知识、创新的科研思维和严谨的治学态度让我受益匪浅。同时滕老师在生活、工作等其他方面给予我极大的帮助和关心，非常感谢您，您教予我的不仅是学术研究，更是立人为世的情怀，这些让我受益终生，在此，对您表示崇高的敬意和真诚的谢意。感谢孟庆繁老师，给予我科研工作的支持和指导；感谢逯家辉老师，在科研上给我指引，生活上给予关怀；感谢王迪老师，在专业知识和实验技术上给予指导；感谢程瑛琨老师和王贞佐老师，给予我科研和生活上的无私的关怀和帮助；特别感谢刘艳老师，在我的成长过程中，给予我姐姐般的关心、鼓励和帮助；同时感谢闫国栋老师、姜丹老师、孟令军老师及吉林大学生物实验教学示范中心的所有老师对我的指导与帮助。感谢实验组的师兄师姐、师弟师妹给予的帮助，感谢滕美玉师妹、黄妍师妹、殷梦雅师妹、郭含笑师妹、何俐颖师妹、许红凯师弟、张世强师弟等对课题上给我帮助，感谢李玉环、杨爽、郑彬，是你们陪我度过了一段愉快而又难忘的时光。特别感谢我的家人，感谢父母多年的养育之恩，感谢丈夫给予的呵护，正是您们无私关爱和全力支持使我得以专心学习，顺利完成学业，您们是给我庇护的最安全港湾，非常感谢，我最爱的爸爸妈妈和相扶一生的爱人！145
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