DB15∕T 2027—2020 马源性成分检测方法 实时荧光PCR法(内蒙古自治区)

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1、TCS07.080A40DB15古一东古~Á内自J口区地方标准DB15/T2027-2020马源性成分检测方法实时荧光PCR法Real-timePCRMethodforAuthentificationofHorseDerivedMaterials2020-10-20发布2020-11-20实施内蒙古自治区市场监督管理局发布DB15/T2027-2020目IJ1=1本文件按照GB/T1.1-2020((标准化工作导则第1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心提出

2、。本文件由内蒙古自治区肉乳标准化技术委员会CSAM/TC39)归口。本文件起草单位:锡林郭勒职业学院、锡林郭勒食品药品检验检测和风险评估中心。本文件主要起草人:郭梁、钱俊平、海小、徐伟良、刘国强、罗建兴。IDB15/T2027-2020马源性成分检测方法实时荧光PCR法1范围本文件描述了动物产品(肉、乳)中马源性成分的实时荧光PCR检测方法。本文件适用于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品中马源性成分的定性检测。本文件规定了鲜肉与加工肉制品的检出限为0.1%(质量分数);鲜乳与加工乳制品的检出限为5%(质量分数)。2规范性引用文件下

3、列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件:不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件CGB!T6682分析实验室用水规格和试验方法GB/T27403实验室质量控制规范食品分子生物学检测3术语和定义下列术语和主义适用于本文件。3.1实时荧光PCRrealtimePCR在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时检测整个PCR过程，对未知模板进行定性:gJG定量分析。3.2Gti直cyclethreshold每个反应管内的荧光信号

4、达到设定阔值时所经历的循环数。3.3~日性对照positivecontrol用己知含有马源性成分的样品作阳性对照。3.4阴性对照negativecontrol用己知不含有马源性成分的样品作阴性对照。DB15/T2027-20203.5空白对照blankcontrol用等体积的灭菌水代替模板DNA作空白对照。4原理利用不同荧光基团标记特异性马探针和质控探针，采用多重实时荧光PCR技术，对提取于鲜肉、鲜乳、加工肉制品、加工乳制品的DNA进行扩增。在同一反应中对马特异基因和质控基因同时扩增，两种荧光同时检测。其中，同管)贡控探针的检测旨

5、在监控扩增反应是否正常进行，避免假阴性结果。通过评价Ct值判断动物产品(肉、手L)是否含有马源性成分。5试剂和材料除另有规定外，所有试剂均为分析纯。实验用水为符合GB!T6682规定的一级水。5.1三氯甲:院。5.2异戊醇。5.3异丙醇。5.495%乙醇。5.575%乙醇。5.6CTAB提取液:称取10gCTAB(十六炕基三甲基澳化按)、40.6gNaCl、6.06gTrisbase(三捏甲基氨基甲炕)、3.94gNaÆDTA(乙二月安四乙酸二号巾，加入800mL的水，在65oc水浴加热溶解，用HCl调节pH至8.0，力口水定容至

6、1000mL，在121oc条件下，灭菌30millo使用前加入终浓度为2%的PZiii皂乙醇。5.7乳化剂:量取20mLTrit'J口X-100(聚乙二醇辛基苯基膛，90%)、125mL乙醇(95%)、855mLNaCl溶液(0.9g/U，力口水定容至1000mL，在121oc条件下，灭菌30millo5.8PBS缓冲液(磷酸缓冲液):称职8g~aCl、O.2gKCl、1.44gNaÆP04、0.24gKH2P04，加入800mL水溶解，用HCl调节pH至7.4，加水定容至1000mL，在121oc条件下，灭菌30mi口。5.9实

7、时荧光PCR反应混合液1U~2U的Taq酶、1XPCR缓冲液、2.5mmol/L~4.0mmol/L的Mg2、O.2U~lU的UNG酶、0.2mmol/L的dNTPo也可以使用同等效果的商品试剂盒。5.10马源性成分扩增号物和探针详见表10表1寻物和探针序列名称序列(5'~3')目标基因/大小Jf向引物TTGAATCAGGCCATGAAGC反向引物CTTACCTTGTTACGACTTGTCTC线粒体12SrRNA基因/121bp马特异性探针HEX-TTCATATGTTTGGGTCACGGTTTTATGT-TAMRA2DB15/T2

8、027-2020表1引物和探针序列(续)名称序列(5'~3')目标基因/大小质拉探针ROX-ACACACCGCCCGTCACCCT-BHQ-2注:用灭菌水分别将上述引物和探针稀释到10Jlmo1/L，探针需避光保存。6仪器和设备。1实时荧光PCR仪