T∕CI 026-2022 甘蔗白叶病病原检测与抗病性鉴定技术规程

《T∕CI 026-2022 甘蔗白叶病病原检测与抗病性鉴定技术规程》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在行业资料-天天文库。

ICS65.020CCSB15!"#$!"#$%&'(&%&&)*+,--./012-3456789Technicalspecificationsforpathogendetectionanddiseaseresistanceidentificationofsugarcanewhiteleaf2022-4-20:;2022-4-20<=全国团体标准信息平台>??@A6BCD:;

1!"#$%&'E&%&&FG前⾔..............................................................................................................................I1适⽤范围......................................................................................................................12引⽤标准......................................................................................................................13术语和定义...................................................................................................................14缩略语..........................................................................................................................15症状及流⾏特点...........................................................................................................26病原检测......................................................................................................................27抗病性鉴定...................................................................................................................3附录A（资料性附录）⽢蔗⽩叶病症状及流⾏特点.............................................6A.1⽢蔗⽩叶病症状....................................................................................................6A.2⽢蔗⽩叶病流⾏特点.............................................................................................6A....................................................................................................................................7A....................................................................................................................................7附录B（规范性附录）试剂配制和DNA提取......................................................7B.1DNA提取试剂配制...............................................................................................7B.2DNA提取..............................................................................................................7B....................................................................................................................................8B....................................................................................................................................8附录C（规范性附录）巢式PCR检测操作⽅法...................................................8C.1扩增试剂配制........................................................................................................8C.2对照.......................................................................................................................8C.3引物.......................................................................................................................8C.4巢式PCR扩增......................................................................................................9C.5琼脂糖电泳检测与凝胶成像分析...........................................................................9C.6⽢蔗⽩叶病植原体巢式PCR扩增电泳图..............................................................9全国团体标准信息平台I

2!"#$%&'E&%&&HI本标准按照GB/T1.1-2020《标准化⼯作导则第1部分：标准化⽂件的结构和起草规则》起草。本标准由中国国际科技促进会提出并归⼝。某些内容可能涉及专利，本标准的发布机构不承担识别这些专利的责任。本标准由云南省农业科学院⽢蔗研究所、临沧南华糖业有限公司、保⼭市农业技术推⼴中⼼、云南省农业科学院⽣物技术与种质资源研究所、耿⻢南华糖业有限公司、临沧市⽢蔗技术推⼴站、澜沧县⽢蔗技术推⼴站、⻄盟县经济作物⼯作站负责起草。本标准主要起草⼈：⻩应昆、李⽂凤、李婕、卢⽂洁、王晓燕、代光伟、段兆祜、张荣跃、单红丽、董有波、⻩丕忠、李银煳、罗志坚、林⽂根、南云刚、李茅苗、岩⽂、⽯红军、唐吉昌、鲁宾、段明雄、⽩升伟、董显华、周中、施永祥、者林成、李⽂富。本标准是⾸次发布。全国团体标准信息平台II

3!"#$%&'E&%&&)*+,--./012-3456789JKLMN本标准规定了⽢蔗⽩叶病病原检测与抗病性鉴定的术语定义、缩略语、症状及流⾏特点、病原检测与抗病性鉴定的技术⽅法和标准。本标准适⽤于⽢蔗⽩叶病的分⼦检测和⽢蔗种质资源对⽢蔗⽩叶病抗病性的⼈⼯接种鉴定与评价。&OLPQ下列⽂件中的条款，通过本标准的引⽤⽽成为本标准的条款。凡是注⽇期的引⽤⽂件，仅注⽇期的版本适⽤于本⽂件。凡是不注⽇期的引⽤⽂件，其最新版本（包括所有的修改单）适⽤于本⽂件。GB/T28067⽢蔗⻩叶病毒实时荧光RT-PCR检测⽅法R7ST5U3.1巢式PCR：巢式PCR是⼀种使⽤两对PCR引物扩增完整的⽚段，第⼀对PCR引物扩增⽚段和普通PCR相似，第⼆对引物结合在第⼀次PCR产物内部，使得⼆次PCR扩增灵敏度⾼于⼀次PCR扩增的变异聚合酶链式反应。3.2⽢蔗⽩叶病（Sugarcanewhiteleaf,SCWL）：由⽢蔗⽩叶病植原体（Sugarcanewhiteleafphytoplasma）系统性侵染⽢蔗使蔗叶上出现单条或数条⽩⾊条纹，甚⾄全叶变成⽩⾊，叶质柔软，病株分蘖增多并矮缩的⼀种种传植原体病害。3.3感病对照：受⽢蔗⽩叶病植原体（Sugarcanewhiteleafphytoplasma）侵染发病株率达20.1%以上的⽢蔗品种。3.4抗病对照：受⽢蔗⽩叶病植原体（Sugarcanewhiteleafphytoplasma）侵染发病株率在10%以下的⽢蔗品种。VWXSbp：碱基对（basepair）CTAB：⼗六烷基三甲基溴化铵（HexadecylTrimethylAmmoniumBromide）dNTPs：脱氧核苷三磷酸混合液（DeoxyribonucleosideTriphosphatesmixture）全国团体标准信息平台ddH2O：双蒸⽔EDTA：⼄⼆胺四⼄酸（EthyleneDiamineTetraaceticAcid）PCR：聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction）Tris-base：三羟甲基氨基甲烷[Tris（hydroxymethyl）aminomethane]1

4!"#$%&'E&%&&TAE：由三羟甲基氨基甲烷、⼄酸和⼄⼆胺四⼄酸组成的缓冲液。YZ[\]^_`⽢蔗⽩叶病症状及流⾏特点参⻅附录A。'-./0'aJbc1cd仪器与器材包括台式离⼼机、⼩型离⼼机、微量可调移液器、恒温⽔浴锅、旋涡混匀仪、核酸蛋⽩分析仪、PCR扩增仪、电泳槽、电泳仪等电泳装置、凝胶成像仪、冰箱（温控范围4℃和-20℃）、⾼压灭菌锅、⿎⻛⼲燥箱、液氮罐、电⼦天平、带滤芯移液头、PCR反应管等。'a&ef除另有规定外，所⽤试剂均为分析纯。6.2.1DNA提取试剂DNA提取试剂及配制⽅法⻅附录B。6.2.2PCR试剂PCR试剂及配制⽅法参⻅附录B。6.2.3电泳缓冲液6.2.3.150×TAE存储液取242gTris和37.2gEDTA，加⼊约800mLddH2O充分搅拌溶解；加⼊57.1mL冰⼄酸，充分溶解；⽤NaOH调节pH⾄8.3，加去ddH2O定容⾄1000mL，室温保存。6.2.3.21×TAE⼯作液⽤去离⼦⽔将50×TAE存储液稀释50倍制成1×TAE⼯作液。6.2.4扩增产物检测试剂琼脂糖、Goldenview核酸染料、6倍上样缓冲液、DNA分⼦量标记。'aRgh\hijk6.3.1采样⼯具采样⼯具处理按照GB/T28067的要求执⾏。6.3.2采样⽅法采样⽅法参照GB/T28067的要求执⾏。其中，叶⽚样品采集时⾸选疑似⽢蔗⽩叶病全国团体标准信息平台病株，具体参⻅附录A，样品独⽴分装，编号备⽤。6.3.3样品保存样品存放与运送按照GB/T28067要求执⾏。2

5'aVlmnopDNA提取⽅法参⻅附录B。'aYqrs#t/0巢式PCR检测⽅法参⻅附录C。'a'uvw5阳性对照有条带，阴性对照和空⽩对照⽆条带时，检测结果有效，当检测结果有效时，依据表1进⾏结果判定（⻅附录C）。表1判定表目的条带大小（bp）样品阳性对照阴性对照空白对照结果判定1240有有无无含白叶病植原体1240无有无无不含白叶病植原体x2-345xaJdyz{1jk7.1.1材料选择选择经巢式PCR检测不带SCWL植原体的成熟健壮蔗茎。7.1.2对照材料鉴定材料中加⼊⽢蔗品种粤糖86-368、新台糖25号作感病对照，粤糖83-88、云蔗05-51作抗病对照。7.1.3材料处理分别切成双芽段，在流动冷⽔中浸泡48h之后，⽤（50±0.5）℃热⽔处理2h，再⽤70%噻⾍嗪⽔分散剂和50%多菌灵可湿性粉剂1：800液浸种5min～10min。7.1.4⼟壤准备⼟壤经⾼温蒸煮消毒后，按消毒⼟壤和有机肥（3：1）混匀，装⼊（ø35cm×⾼30cm）塑料桶内，装⼊量为桶容量的三分之⼆。xa&|}-.~从⽢蔗⽩叶病发病区域选择具典型⽩叶病症状的⾼感品种粤糖86-368蔗株，经巢式PC全国团体标准信息平台R检测筛选含SCWL植原体的蔗茎作接种病原。xaR|}接种前通过压榨作接种病原的蔗茎获取携带SCWL植原体蔗汁，加⼊为携带SCWL植原体蔗汁体积10倍量的⽆菌⽔稀释混匀，⽤双层纱布过滤，滤液即为SCWL植原体3

6!"#$%&'E&%&&接种液，现配现⽤。xaV|}接种⽅法可选⽤包⾐接种法或切茎接种法。7.4.1包⾐接种法7.4.1.1包⾐接种处理好的蔗种置于塑料膜表⾯，按1000kg处理好的蔗种⽤15kg接种液的⽐例，采⽤电动喷雾器将接种液均匀喷洒置于塑料膜表⾯的蔗种，边喷边翻动蔗种，喷完后⽤塑料膜覆盖蔗种，于25℃下保湿24h。7.4.1.2材料种植接种后的供试材料分别种植在塑料桶内（ø35cm×⾼30cm），每份供试材料种植4桶，4次重复，每桶种植8芽，共32芽，置于20℃～30℃防⾍温室中培养。7.4.2切茎接种法7.4.2.1材料种植处理后的供试材料分别种植在塑料桶内（ø35cm×⾼30cm），每份供试材料种植4桶，4次重复，每桶种植8芽，共32芽，置于20℃～30℃防⾍温室中培养。接种时每桶选择⻓势较⼀致的8株，共32株。7.4.2.2切茎接种供试材料种植6个⽉后，在阴天的傍晚⽤灭菌锋利切⼑（或枝剪）把供试材料植株地上部分沿⼟表快速切去，⽤移液枪将100µLSCWL植原体接种液滴⼊蔗株根部切⼝上，每份供试材料接种32株，遮光24h。接种后置于20℃～30℃抗病⾍鉴定防⾍温室中培养观察。xaY-包⾐接种30d和切茎接种20d后，调查各供试材料发病株率，以后每隔15d调查1次，直⾄感病对照品种发病株率稳定为⽌。记录接种⽇期、接种芽（株）数、出苗数、病害症状始现期、累计发病株数。计算公式：累计发病株率（%）按公式（1）计算：BP=sn1/sn2×100%.............................................................（1）式中：BP——累计发病株率（%）全国团体标准信息平台sn1——累计发病株数sn2——累计总株数xa'2-3按以下分级标准进⾏抗病性评价，⻅表2。4

7表2⽢蔗抗⽩叶病鉴定评价标准级别发病株率%抗病性1级0-3.0⾼抗（HR）2级3.1-10.0抗病（R）3级10.1-20.0中抗（MR）4级20.1-40.0感病（S）5级40.1-100⾼感（HS）全国团体标准信息平台附录n（资y3附录)*+,-Z[\]^_`naJ⽢蔗⽩叶病症状5

8!"#$%&'E&%&&⽢蔗⽩叶病症状类型可归纳为⽩叶型和草苗型两类。⽩叶型病株叶⽚表现为叶质柔软，叶绿素含量减少⽽⽩化，⽩化症状可分为整叶⽩化、呈条纹状⽩化或呈斑驳状⽩化。草苗型病株茎部现⽩⾊⻓条纹，分蘖明显增多，病株矮缩，茎细，节间缩短，顶部叶⽚丛⽣，外观如草苗。草苗型病株和⽩叶型病株常混合出现，这种混合型病株最容易枯死，即使成活也常不成茎。仅叶⽚⽩化⽽⽆分蘖过多的病株虽可枯死，但不枯死的病株可恢复，有些恢复⽐例也较⾼，有些甚⾄恢复到与健株外观难以区别，但到宿根蔗⼜再现典型症状，⻅图A.1。ABCD图A.1⽢⽩叶病症状A：病叶；B：⽩叶型病株；C：草苗型病丛；D：病⽥na&⽢蔗⽩叶病流⾏特点⽢蔗⽩叶病（Sugarcanewhiteleaf,SCWL）是由16SrXI组中的⽢蔗⽩叶病植原体（Sugarcanewhiteleafphytoplasma）引起的⼀种检疫性⽢蔗重要病害。SCWL植原体为⽆细胞壁原核微⽣物，尚不能在⼈⼯培养基离体培养，潜育期较⻓，最短的约为30天（少数），⼀般为2～3个⽉，有的甚⾄⻓达⼀年之久。寄主主要有⽢蔗（Saccharumofficinarum）、狗⽛根(Cynodondactylon)，别名：百慕⼤草（Bermudagrass）。SCWL植原体存在于病株韧⽪部筛管中，⽢蔗是⽆性繁殖作物，SCWL可通过带病蔗种进⾏远距离传播，且传播性极强。此外，SCWL在⽥间还可通过细针叶蝉（MatsumuratettixhiroglyphicusMatsumura）和条纹闭颜叶蝉（YamatotettixflavovittatusMatsumura）传播。⽤病蔗留种，特别是基部数节留种，⻓出的幼苗⼏乎全为病苗，萌发后1个⽉左右就死亡。病害的发⽣受品种抗性，种蔗带毒率、传毒⾍媒叶蝉的数量及环境条件等诸因素的影响。如品种⾼度感病，种蔗带毒率⾼，加上环境条件⼜有利于介体昆⾍的繁殖和传毒活动，则病害往往发⽣较重，反之则发⽣较轻。宿根蔗⼀般⽐新植蔗发病重。全国团体标准信息平台6

9AA附录（M3附录ef配TDNAopaJDNA提取试剂配制DNA提取试剂配制⽅法⻅表B.1。B.12CTABo组分配制量（L）配制⽅法称取121.0gTris，溶解于800mL的ddH2O中，⽤6-11.0mol·LTris-HCl-11mol·L的HCl调节pH⾄8.0后，⽤ddH2O定容到1.0（pH8.0）⺟液L。称取186.0gNa2EDTA·2H2O，加⼊800mLddH2O，充-10.5mol·LEDTA-11分搅拌，⽤2mol·L的NaOH调节pH⾄8.0后，⽤（pH8.0）的⺟液ddH2O定容到1.0L。-1依次加⼊20g的CTAB粉末，100mL的1.0mol·L的-1Tris-HCl（pH8.0）⺟液，40mL的0.5mol·L的EDTA2倍CTAB抽提缓冲液1（pH8.0）的⺟液，81.8g的NaCl，⽤灭菌双蒸定容到1.0L。a&DNA提取DNA提取⽅法如下：a）取数⽀1.5mL⽆DNA酶的Eppendorf管，1管阳性对照、1管阴性对照，对每个管进⾏编号。b）称取0.2g新鲜叶⽚样品剪细，加液氮充分研磨成粉末状后，转⼊2.0mL灭菌离⼼管。c）⽴即加⼊1.0mL预热（约65°C）的2倍CTAB抽提缓冲液，震荡混匀，65°C⽔浴30min，室温12,000rpm离⼼10min。d）取上清加等体积的氯仿/异戊醇（V/V=24:1），剧烈振荡混匀，室温12,000rpm离⼼10min。e）取750µL上清⾄另⼀新的灭菌离⼼管中，加2/3体积异丙醇，颠倒混匀，-20°C放置1h，12,000rpm离⼼10min。f）沉淀加⼊70%⼄醇500µL，12,000rpm离⼼5min，弃上清，沉淀于中室温下1.5mL灭菌离⼼管⻛⼲，溶于50µLddH2O。g）⽤核酸蛋⽩分析仪测定波⻓260nm和280nm处吸光值，当A260/A280⽐值在1.8～2.0之间时，将样品于-20°C保存备⽤。全国团体标准信息平台7

10!"#$%&'E&%&&BB附录#（8M3附录rPCR/0操作#aJ扩增试剂配制PCR扩增试剂配制⽅法如下。C.1.1巢式第⼀次PCR反应混合液巢式第⼀次PCR反应混合液配制⻅表C.1。表C.1巢式PCR反应混合液（25µL体系）组分使⽤量（µL）终浓度DNA1.0--1-120µmol·L上游引物P11.00.4µmol·L-1-120µmol·L下游引物P71.00.4µmol·L10倍PCR缓冲液2.51倍-1-125mmol·LMgCl22.00.8µmol·L-1-110mmol·LdNTPs2.00.8µmol·L-1-15U·µLTaqDNA聚合酶0.20.32U·µLddH2O15.3-C.1.2巢式第⼆次PCR反应混合液巢式第⼀次PCR反应混合液配制⻅表C.2。表C.2巢式PCR反应混合液（25µL体系）组分使⽤量（µL）终浓度DNA1.0--1-120µmol·L上游引物R16F2n1.00.4µmol·L-1-120µmol·L下游引物R16R21.00.4µmol·L10倍PCR缓冲液2.51倍-1-125mmol·LMgCl22.00.8µmol·L-1-110mmol·LdNTPs2.00.8µmol·L-1-15U·µLTaqDNA聚合酶0.20.32U·µLddH2O15.3-#a&对照阳性对照：确认含⽢蔗⽩叶病植原体样品的DNA做阳性对照。阴性对照：确认不含⽢蔗⽩叶病植原体样品的DNA做阴性对照。空⽩对照：⽤等体积ddH2O替代样品做空⽩对照。#aR引物C.3.1引物序列巢式第⼀次PCR上游引物P1：5’-AAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATT-3’，下游引物全国团体标准信息平台P7：5’-CGTCCTTCATCGGCTCCT-3’。巢式第⼆次PCR上游引物R16F2n：5’-GAAACGACTGCTAAGACTGG-3’，下游引物R16R2：5’-TGACGGGCGGTGTGTACAAACCCCG-3’。C.3.2引物的配制上述巢式PCR引物⽤ddH-12O稀释⾄浓度为20µmol·L。8

11#aV巢式PCR扩增C.4.1巢式PCR体系配制巢式PCR体系配______________________________制⽅法如下：a在冰上融化各反应试剂组分，瞬间低速离⼼（2,000rpm下离⼼3s～5s），加⼊阳性对照、阴性对照和空⽩对照。根据测试样品数量，计算各试剂使⽤量，每份样品设置2个平⾏反应。b第⼀次PCR反应：25µLPCR反应体系，按表C.1依次加⼊反应试剂，瞬间低速离⼼混匀。c第⼆次PCR反应：取第⼀次PCR扩增产物稀释30倍，取1.0µL作扩增模板，按表C.2依次加⼊反应试剂，瞬间低速离⼼混匀。C.4.2巢式PCR扩增程序在Bio-RadC1000PCR扩增仪上进⾏扩增，巢式PCR扩增程序如下：a）第⼀次PCR反应程序：94°C预变性3min；94°C变性30s，55°C退⽕60s，72°C延伸1min，35个循环；72°C延伸10min。b）第⼆次反应程序：94°C预变性3min；94°C变性30s，57°C退⽕30s，72°C延伸1min，35个循环；72°C延伸10min。#aY琼脂糖电泳检测与凝胶成像分析琼脂糖电泳检测与凝胶成像分析⽅法如下：a）配制浓度为1.5%（W/V）的琼脂糖凝胶，即1倍TAE电泳缓冲液100mL加1.5g琼脂糖，加热融化混匀，冷却⾄60°C左右，加⼊浓度为0.005%Goldenview核酸染料（按每100mL琼脂糖溶液中加⼊5µL核酸染料溶液的⽐例），混匀后倒⼊胶槽，插上样品梳。b）室温下待凝胶凝固后，垂直向上拔出固定在凝胶中的样品梳，将琼脂糖凝胶和胶板置于电泳槽中，使样本孔位于电场负极，向电泳槽中加⼊1倍TAE电泳缓冲液。c）取10µLPCR反应产物，加2µL上样缓冲液并混匀，然后依次将DNA分⼦量标记、检测样品、阳性对照、阴性对照、空⽩对照上样到点样孔中。电泳电压为130V，当上样缓冲液中的溴酚蓝条带迁移⾄凝胶1/2的位置，停⽌电泳。d）取出琼脂糖凝胶，置于凝胶成像仪成像拍照、保存。#a'⽢蔗⽩叶病植原体巢式PCR扩增电泳图C.6)*+,-hiqrPCRM：DNA分⼦量标记；1-20：样品；PC：阳性对照；NC：阴性对照；CK：空⽩对照全国团体标准信息平台9