DB34∕T 1376-2022 鸡蛋中氟苯尼考残留量的测定(安徽省)

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ICS67.120.20CCSX1834安徽省地方标准DB34/T1376—2022代替DB34/T1376-2011鸡蛋中氟苯尼考残留量的测定Determinationofflorfenicolresiduesineggs2022-06-29发布2022-07-29实施安徽省市场监督管理局发布

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2DB34/T1376—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件代替DB34/T1376-2011《鸡蛋中氟苯尼考的残留测定-高效液相色谱法》，除编辑性修改外主要技术变化如下：a)增加高效液相色谱-串联质谱法（见第5章）；b)更改范围为：本文件规定了鸡蛋中氟苯尼考残留量的测定方法。本标准适用于鸡蛋中氟苯尼考残留量的测定；c)删除2规范性引用文件中GB/T14699.1。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由安徽省兽药饲料监察所提出。本文件由安徽省农业农村厅归口。本文件起草单位：安徽省兽药饲料监察所、安徽赛如分析检测科技有限公司、宁国市民鸿农业科技有限公司、桐城市畜牧兽医管理中心、泗县草沟镇畜牧兽医水产站、宣城市宣州区市场监督管理局、合肥市动物疫病预防控制中心、望江县农产品质量安全中心、淮北市畜牧中心、安徽农业大学、安徽省农业科学院畜牧兽医研究所。本文件起草人：李珲、董尚青、朱明齐、韩素珍、操军、王雨霜、吴昊、许世富、程莹、侯亚飞、郝金华、左爱民、钱志松、刘发全、祁钊、潘孝成、宋亚伟。——2011年首次发布为DB34/T1376-2011，2022年第一次修订。I

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4DB34/T1376—2022鸡蛋中氟苯尼考残留量的测定1范围本文件规定了鸡蛋中氟苯尼考残留量的测定方法。本文件适用于鸡蛋中氟苯尼考残留量的测定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义本文件没有需要界定的术语和定义。4高效液相色谱法原理试样中残留的氟苯尼考经乙酸乙酯提取，正己烷脱脂，高效液相色谱仪测定，外标法定量。试剂和材料除非另有说明，本法所用试剂均为分析纯，水为符合GB/T6682规定的二级水。4.2.1氟苯尼考标准品：纯度≥98％。4.2.2甲醇：色谱纯。4.2.3乙酸乙酯。4.2.4正己烷。4.2.5氢氧化铵：25％～28％。4.2.6无水硫酸钠：经300℃灼烧4小时，置于干燥器中备用。4.2.7流动相：甲醇：水（40：60）。4.2.8聚丙烯离心管：50mL，1.5mL。4.2.9比色管：50mL，具塞。4.2.10梨形瓶：25mL。4.2.11滤膜：0.45μm，无机相。4.2.12氟苯尼考标准储备液（1mg/mL）：准确称取氟苯尼考标准品100mg，用甲醇稀释至100mL，摇匀，-18℃保存，有效期90天。4.2.13氟苯尼考工作液（10μg/mL）：准确移取（4.2.12）中氟苯尼考标准储备液1.0mL，用甲醇稀释配制成100mL，摇匀，-4℃保存，有效期30天。1

5DB34/T1376—20224.2.14氟苯尼考标准溶液：取氟苯尼考工作液（4.2.13）适量，分别用流动相（4.2.7）稀释为0、20ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、200ng/mL、400ng/mL的标准溶液，摇匀，4℃保存，有效期7天。仪器和设备4.3.1高效液相色谱仪，配二极管阵列检测器或紫外检测器。4.3.2离心机，转速不低于4000r/min。4.3.3振荡器。4.3.4涡旋混合器。4.3.5分析天平：感量0.0001g，0.01g。4.3.6超声波清洗器。4.3.7组织匀浆机。4.3.8旋转蒸发仪。测定步骤4.4.1试样提取称取均质后的试样5g（精确至0.01g），置于50mL聚丙烯离心管中，依次加入30mL乙酸乙酯（4.2.3），0.9mL氢氧化铵（4.2.5），5g无水硫酸钠，振荡提取30s，以4000r/min离心5min，上清液转移至50mL比色管中，用乙酸乙酯定容至刻度，摇匀后取10mL乙酸乙酯提取液到25mL梨形瓶中，45℃水浴中旋转浓缩至干。4.4.2试样净化梨形瓶中的残渣用3mL水溶解，超声5min，加入3mL正己烷（4.2.4）涡旋混合30s，静置分层，弃掉上层的正己烷，再加3mL正己烷（4.2.4）涡旋混合30s，静置分层，移取1mL水相于1.5mL的聚丙烯离心管中，以8000r/min离心5min，经0.45μm滤膜过滤，供高效液相色谱仪分析。4.4.3色谱测定色谱柱：C18（4.6×250mm，5μm），或相当者。柱温：40℃。进样体积：20μL。流速：1.0mL/min。检测波长：365nm。流动相：甲醇-水（40：60）。4.4.4上机测定取适量试样溶液和相应浓度的标准溶液，作单点或多点校准，以色谱峰面积积分值定量。标准溶液及试样液中氟苯尼考的相应值均在仪器检测的线性范围内，标准溶液高效液相色谱图见附录A中图A.2。结果计算按照下式计算试样中各种药物的含量：2

6DB34/T1376—2022�×��×�×����X=·····································································(1)��×�×����式中：X——试样中各种药物的含量，单位为毫克每千克（mg/kg）；A——试样溶液对应的色谱峰面积响应值；As——标准溶液对应的色谱峰面积响应值；V——定容体积，单位为毫升（mL）；Cs——标准溶液的浓度，单位为微克每毫升（μg/mL）；m——试样质量，单位为克（g）。平行测定结果用算术平均值表示，结果保留三位有效数字。检测方法灵敏度、准确度、精密度4.6.1灵敏度本方法在鸡蛋中的检出限为20μg/kg。4.6.2准确度本方法在添加浓度为80μg/kg添加水平的回收率均为70％～110％。4.6.3精密度本方法的批内变异系数小于等于10％，批间变异系数小于等于15％。5高效液相色谱-串联质谱法原理试样经过80％乙腈水溶液提取，HLB固相萃取柱净化，高效液相色谱串联质谱法测定，外标法定量。试剂和材料除特殊说明外，本方法所用试剂均为分析纯，用水符合GB/T6682中一级水的规定。5.2.1乙腈：色谱纯。5.2.2甲醇：色谱纯。5.2.3乙酸铵。5.2.45mmol/L乙酸铵水溶液：准确称取0.385g乙酸铵，用水定容到1L。5.2.580％乙腈水溶液：准确量取800ml乙腈（色谱纯），用水定容至1L。5.2.610％甲醇水溶液：准确量取100ml甲醇（色谱纯），用水定容至1L。5.2.7氟苯尼考标准品：纯度≥99.0％，CAS号：73231-34-2。5.2.8标准溶液制备如下：a)氟苯尼考标准储备液（400μg/mL）：精确称取20mg氟苯尼考标准品（精确至0.01mg），置于50mL容量瓶中，用乙腈溶解，此溶液浓度为，-18℃保存，有效期6个月。b)氟苯尼考标准工作溶液：分别吸取氟苯尼考标准储备液（5.2.8—a））10μL、50μL、0.1mL、0.25mL、0.5mL、1mL于10mL容量瓶中，用乙腈定容，标准工作溶液系列浓度分别为0.4μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、10μg/mL、20μg/mL、40μg/mL，4℃保存，有效期一周。3

7DB34/T1376—2022仪器和设备5.3.1高效液相色谱串联质谱仪：配电喷雾离子源（ESI）。5.3.2分析天平：感量0.1g、0.1mg、0.01mg。5.3.3离心机：≥10000r/min。5.3.4微孔滤膜：0.22μm有机滤膜。5.3.5涡动仪。5.3.6水平摇床。5.3.7氮吹仪。5.3.8固相萃取柱：HLB（60mg/3mL）或相当者。分析步骤5.4.1提取称取2.00g（±0.1g）试样，置于50mL离心管内，加入8.0mL80％乙腈水溶液（5.2.5），涡旋1min混匀，振荡10min，10000r/min离心10min，取上清液备用。5.4.2净化准确量取4.0mL上清液（5.4.1），置于HLB固相萃取柱中，保持每秒一滴，收集全部的流出液。45℃水浴氮气吹干，用1.0mL10％甲醇水溶液（5.2.2）溶解，涡旋混匀，0.22μm滤膜过滤，供高效液相色谱-串联质谱仪测定。5.4.3液相色谱参考条件色谱柱：C18（2.1mm×50mm，1.8μm）或相当者；流动相：A：5mmol/L乙酸铵水溶液，B：乙腈；采用梯度洗脱见表1；流速：0.3mL/min；进样量：5μL；柱温：35℃。表1液相色谱梯度洗脱方式时间AB（min）（％）（％）0-29552.0195585958.0195510955氟苯尼考标准工作溶液和试液分别注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积定量。5.4.4质谱参考条件检测方法：多离子反应监测（MRM），详见表2中母离子、子离子和碰撞能量。质谱离子源参考条件：氮气温度（GasTemp）：260℃；氮气流速（GasFlow）：40L/min;4

8DB34/T1376—2022雾化器压力（Nebulizer）：40psi;鞘气温度（ShealthGasTemp）：300℃;鞘气流速（ShealthGasFlow）：17L/min；毛细管电压（Capillary）：3000V;喷嘴电压（NozzleVoltage）：1700V.表2定性、定量离子对及其他参数条件裂解电压碰撞能量药物名称定性、定量离子对扫描模式（E/V）（E/V）356.1/119*23-氟苯尼考ESI380356.1/184.912注：其中356.1/119*为定量离子对。5.4.5定性试样中氟苯尼考色谱峰的保留时间与标准色谱峰的保留时间相比较，变化范围应在±2.5％之内。氟苯尼考的定性离子色谱峰的信噪比应大于等于3（S/N≥3），氟苯尼考的定量离子色谱峰的信噪比应大于等于10（S/N≥10）。每种化合物的质谱定性离子必须出现，至少应包括一个母离子和两个子离子，而且同一检测批次，对同一化合物，样品中目标化合物的两个子离子的相对丰度比与浓度相当的标准溶液相比，其允许偏差不超过表3规定的范围。色谱图参见附录A的图A.4。表3定性时相对离子丰度的最大允许偏差相对离子丰度＞50％＞20至50％＞10至20％≤10％允许相对偏差±20±25％±30％±50％各检测目标化合物以保留时间和两对离子（特征离子对/定量离子对）所对应的液相色谱串联质谱法色谱峰面积相对丰度进行定性，要求被测试样中目标化合物的保留时间与标准溶液中目标化合物的保留时间一致（一致的条件是偏差小于20％），同时要求被测试样中目标化合物的两对离子对应液相色谱串联质谱法色谱峰面积比与标准溶液中目标化合物的面积比一致。5.4.6试样测定按照5.4.3和5.4.4确立的条件，测定试液（5.4.2）和标准系列溶液（5.2.8—b））中氟苯尼考的离子强度，外标法定量，色谱图参见附录A的图A.5。色谱参考保留时间：氟苯尼考4.34min。5.4.7空白试验不称取试样，按5.4.5的步骤做空白实验。应确认不含有干扰被测组分的物质。5.4.8标准曲线绘制将标准系列溶液（5.2.8—b））由低到高浓度进样检测，以峰面积-浓度作图，得到标准曲线回归方程。5.4.9定量测定5

9DB34/T1376—2022待测样液中被测组分的响应值应在标准曲线线性范围内，超过线性范围时，则应将液样用空白基质溶液稀释后重新进样分析或减少取样量，重新按照5.4.1进行处理后再进样分析。6分析结果的表述外标法定量，按式（2）计算氟苯尼考的残留量。�×�×����?=×?······································································(2)�×����式中：X——试样中氟苯尼考含量，单位为毫克/每千克（mg/kg）；C——试液色谱峰对应的氟苯尼考浓度，单位为微克/每毫升（μg/mL）；m——试样质量，单位为克（g）；V——定容体积，单位为毫升（mL）f——稀释倍数。以重复性条件下获得的两次独立测定结果的算术平均值表示，结果保留三位有效数字。检测方法的灵敏度、准确度和精密度6.1.1灵敏度本方法检出限为0.2μg/kg，定量限为0.5μg/kg。6.1.2准确度本方法在添加浓度水平上的回收率为70％～110％。6.1.3精密度本方法的批内变异系数小于等于10％，批间变异系数小于等于15％。6

10DB34/T1376—2022附录A（资料性）色谱图A.1空白鸡蛋样品溶液色谱图图A.1空白鸡蛋样品溶液色谱图A.2标准物质溶液色谱图图A.2标准物质溶液色谱图A.3空白鸡蛋中添加标准物质溶液色谱图图A.3空白鸡蛋中添加标准物质溶液色谱图7

11DB34/T1376—2022A.4氟苯尼考定性离子对色谱图图A.4氟苯尼考定性离子对色谱图A.5氟苯尼考定量离子对色谱图图A.5氟苯尼考定量离子对色谱图8