DB41∕T 2273-2022 肉牛快速扩繁技术规程(河南省)

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ICS65.020.30CCSB4341河南省地方标准DB41/T2273—2022肉牛快速扩繁技术规程2022-06-29发布2022-09-28实施河南省市场监督管理局发布

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2DB41/T2273—2022目次前言.................................................................................II1范围...............................................................................12规范性引用文件.....................................................................13术语和定义.........................................................................14同期发情和人工授精.................................................................15胚胎生产与移植.....................................................................26妊娠牛饲养管理.....................................................................5附录A（资料性）供体牛信息记录表及胚胎冷冻记录表样式.................................6附录B（资料性）早期胚胎发育形态图...................................................7附录C（资料性）受体牛胚胎移植记录表.................................................8I

3DB41/T2273—2022前言本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。本文件由河南省农业农村厅提出并归口。本文件起草单位：河南省畜牧总站、河南省农业科学院畜牧兽医研究所。本文件主要起草人：张子敬、刘贤、吕世杰、王二耀、茹宝瑞、李志明、王李辉、吴胜军、蔡雯雯、施巧婷、郎利敏、黄辉、夏宗军、丁涵、徐美芳、赵杨杨、马超峰、辛晓玲、于翔、王献伟、马文涛、李静、王培育、朱肖亭、楚秋霞、付泰、王欧阳、余亚飞、李惠、刘艳丽、蔡顺姬、余洪涛、周应海、黄永震、徐照学。II

4DB41/T2273—2022肉牛快速扩繁技术规程1范围本文件规定了肉牛快速扩繁中同期发情、超数排卵、胚胎移植等要求和方法。本文件适用于规模化肉牛养殖的快速扩繁。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T4143牛冷冻精液NY/T1335牛人工授精技术规程3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1供体牛提供胚胎的母牛。3.2受体牛接受胚胎的母牛。3.3同期发情利用外源激素控制并调整母牛群体发情周期进程，使其在规定时间内集中发情。3.4超数排卵利用外源激素诱发母牛卵巢多个卵泡发育，并同时排出多个具有受精能力的卵子。3.5人工授精借助专门器械将公牛精液输入发情母牛的生殖道内使其受孕的过程。3.6胚胎移植将供体牛体内或其它方式获得的早期胚胎，移植到对应生殖周期的受体牛体内，使之继续发育的生物技术。4同期发情和人工授精1

5DB41/T2273—20224.1同期发情方法4.1.1二次前列腺素（PG）法适配母牛任选一天肌肉注射PG，9d～13d进行第二次注射，24h～72h观察发情。4.1.2黄体酮缓释阴道栓法适配母牛任选一天放入黄体酮缓释阴道栓，5d～7d撤栓并注射PG，24h～72h观察发情。4.2人工授精冷冻精液应符合GB/T4143的要求。人工授精操作按照NY/T1335的规定。5胚胎生产与移植5.1供体牛选择与饲养管理5.1.1供体牛选择品种优良，系谱清晰，体型外貌和生产性能评级一级以上，生殖器官正常，无繁殖障碍疾病。年龄15月龄至8周岁。青年牛应为15月龄～18月龄，体况中上等且至少有两次正常发情记录；经产牛应为产后60d以上，有两次正常发情记录且子宫恢复正常。确定为供体牛前应进行检疫，有传染性疾病的母牛不能作为供体。5.1.2供体牛饲养管理保持饲养环境良好，避免应激反应。提供合理的配合日粮和清洁饮水。超数排卵前3周加强饲养管理，补充维生素和微量元素，保持中等以上膘情。5.2供体牛超数排卵及人工授精5.2.1超数排卵5.2.1.1同期发情方法准备工作完成后，同期发情方法按照4.1的规定。5.2.1.2超数排卵方法以母牛发情当天为0d，第9d～13d中的任意一天开始，每天早（7:00～8:00）和晚（19:00～20:00）各注射1次促卵泡素（FSH），连续4d递减注射。注射FSH期间第3d晚和第4d早同时注射0.4mg～0.6mgPG。超数排卵药品使用根据不同生产厂家的推荐量结合体重稍作调整。5.2.1.3供体牛发情鉴定最后一次注射FSH后，每隔6h观察是否发情，每次观察不少于30min。以母牛被跨稳定作为发情标准，准确记录时间。5.2.2人工授精精液剂量加倍，按照4.1.2规定操作，间隔12h重复操作一次。5.3非手术冲胚及胚胎质量鉴定2

6DB41/T2273—20225.3.1冲胚步骤5.3.1.1供体牛人工授精后6d～7d冲胚。冲胚前，所用仪器、器皿等应经过严格的消毒灭菌处理。冲胚管应检查气囊是否漏气。5.3.1.2将供体牛保定，清除粪便，在荐椎和第一尾椎结合处或第一尾椎和第二尾椎结合处注射普鲁卡因实行硬膜外麻醉，直至尾巴松弛柔软无张力。普鲁卡因用量依据说明书。5.3.1.3麻醉后将牛尾固定，清洁会阴部及外阴，酒精棉球或喷雾消毒外阴，用灭菌卫生纸擦干。5.3.1.4用扩张棒扩张子宫颈，再用黏液棒抽出黏液。5.3.1.5此时直肠易进空气形成空洞，使用抽气筒排出空气，利于直肠把握。5.3.1.6冲胚管装配内芯，并用冲胚液润滑，慢慢插入一侧子宫角，当冲胚管到达子宫角大弯处，旋开内芯旋钮，拔出内芯5cm左右，握紧内芯和冲胚管并向前推进，使内芯再次到达子宫角大弯处。重复内芯拔出和一体前进1～3次。给冲胚管气囊充气5mL确定冲胚管到达子宫角前端。冲胚液可用杜氏磷酸盐缓冲液（D-PBS）或商用冲胚液。5.3.1.7给冲胚管气囊充气约8mL～14mL，抽出内芯，把三通管与冲胚管连接，连上集卵滤皿。5.3.1.8夹住三通管的回流端，将20mL～30mL冲胚液通过注入端注入子宫角。夹住注入端，松开回流端使子宫角液体回流到集卵滤皿。重复几次，每次增加冲胚液5mL～10mL，每个子宫角总用量400mL～500mL。5.3.1.9完成后排出气囊空气，另一侧子宫进行相同操作。抽出冲胚管，使前端位于子宫体，灌注抗生素，肌注PG，做好采胚记录（见表A.1）。5.3.2胚胎质量鉴定5.3.2.1搜集胚胎集卵滤皿放在40～100倍体视显微镜下，逐格检查，捡出的胚胎用培养液清洗3次，放入盖有矿物油的培养液中35℃～37℃暂存，捡胚完成后进行等级鉴定。培养液可用10%牛血清M199或其它商用培养液。5.3.2.2胚胎发育期此时胚胎处于以下发育期：桑椹胚(M)、致密桑椹胚(CM)、囊胚(B)、扩张囊胚(EXB)。胚胎发育形态图见附录B。5.3.2.3胚胎质量等级鉴定根据胚胎形态将胚胎依次分为A、B、C、D四级。A级：优秀胚。胚胎整体边缘轮廓清晰，透明带完整光滑，立体结构明显，实质均匀，透明度适中，碎片量少于10%或者没有，胚胎的发育阶段与预期的发育阶段一致。B级：良好胚。胚胎整体边缘轮廓清晰，立体结构明显，碎片小于20%，透明度稍暗或稍浅。C级：一般胚。轮廓不清晰，透明度过暗或过淡，碎片化超过30%～40%。D级：不可用胚。未受精的卵子、16细胞以下和碎片化率50%以上的受精卵。5.4胚胎冷冻保存及解冻5.4.1胚胎冷冻与保存5.4.1.1胚胎清洗A级、B级胚胎在保持液中清洗4～6次。保持液使用商用保持液。3

7DB41/T2273—20225.4.1.2胚胎平衡胚胎用冷冻液清洗4～6次，室温下平衡5min。冷冻液使用乙二醇商用冷冻液。5.4.1.3胚胎装管将平衡后的胚胎装入0.25mL细管，装管顺序见图1。标引序号说明：1——棉栓；2——保持液；3——空气；4——冷冻液；5——含有胚胎的冷冻液；6——封口。图1胚胎装管图装管后做好胚胎情况标记，内容包括：生产日期、母牛号、公牛号、数量、发育期、质量。示例：1枚A级桑椹胚标记为1MA，其中“1”表示数量，M表示发育期，“A”表示质量。5.4.1.4胚胎冷冻冷冻仪降温至-6℃，放入装有胚胎的细管平衡5min，用液氮冷冻后的镊子轻触细管植冰，继续平衡5min，以0.6℃/min的速率下降至-35℃，平衡5min后投入液氮，记录冷冻情况（见表A.2）。5.4.2胚胎解冻取出装有胚胎的细管，空气中停留5s～10s后，迅速放入35℃～37℃水浴45s。擦干细管，拔出细管塞，装入移植枪并移植。5.5受体牛选择及饲养管理5.5.1受体牛选择骨盆较宽，体型匀称，体高130cm以上，乳房发育良好，性情温顺，营养良好，中等膘情。青年牛体重达到成年母牛体重的75%；经产牛3胎以下，应有两个以上连续的正常发情周期，泌乳性能、产犊性能良好，无连续两次人工授精未孕记录。牛体健康，子宫弹性、厚薄正常，卵巢发育正常。5.5.2受体牛饲养管理单独分群、编号、饲养，保持环境良好，避免应激反应，保证必要运动，满足营养需要。移植前6～8周开始补饲，日增重应保持在0.3kg～0.4kg。移植前5周补充维生素A、维生素D、维生素E及硒、锌等微量元素。5.6胚胎移植5.6.1受体牛同期发情4

8DB41/T2273—2022按照4.1的规定。5.6.2受体牛发情鉴定按照NY/T1335的规定。5.6.3受体牛胚胎移植方法5.6.3.1以发情当天定为0d，于7d～8d进行移植。移植前对受体牛进行直肠检査，黄体达到A级的母牛用于移植。5.6.3.2受体牛麻醉，按照5.3.1.2的规定。5.6.3.3清洗消毒外阴部并擦干。对照胚胎记录表和受体牛发情记录，胚胎发育期与受体牛生理时间相对应：桑椹胚、致密桑椹胚、囊胚对应受体牛发情后7d；扩张囊胚对应受体牛发情后8d。5.6.3.4装好胚胎的移植枪套上硬外套管，再套上无菌外套膜。于子宫颈口撕破外套膜，使移植枪前段到达黄体侧子宫角前端，注入胚胎。5.6.3.5做好移植记录。胚胎移植记录表见附录C。6妊娠牛饲养管理人工授精或移植后30d～60d进行妊娠检查，对妊娠牛加强护理，防止应激。产前2个月适当限制能量摄入，保持适量运动，同时保证足量的维生素和微量元素。围产期加强管理。分娩时做好护理，必要时助产或剖腹产。超出预产期10d的母牛应诱导分娩。5

9DB41/T2273—2022A附录A（资料性）供体牛信息记录表及胚胎冷冻记录表样式A.1供体牛信息记录见表A.1。表A.1供体牛信息记录表牛号品种牛场出生日期胎次产犊日期上次发情日期最近发情日期直肠检查情况同期发情程序第一次处理第二次处理发情情况药物超排处理程序日期药物厂家批号及规格早FSH午晚PG午其他发情时间输精时间公牛号剂量活力配种员备注冲胚日期冲胚液回收黄体卵巢子宫直肠检查结果左右左右左右冲胚结果获胚总数可用胚胎数不可用胚胎数备注A.2胚胎冷冻记录表见表A.2。表A.2胚胎冷冻记录表小筒编号供体牛号公牛号细管号细管颜色胚胎数量胚胎质量冷冻日期备注BB6

10DB41/T2273—2022附录B（资料性）早期胚胎发育形态图早期胚胎发育形态见图B.1。a）未受精卵或1细胞胚胎b）2细胞胚胎c)4细胞胚胎d)8细胞胚胎e)桑葚胚f)致密桑葚胚、囊胚、扩张囊胚图B.1早期胚胎发育形态图CC7

11DB41/T2273—2022附录C（资料性）受体牛胚胎移植记录表受体牛胚胎移植记录表见表C.1。表C.1受体牛胚胎移植记录表胚胎数量序号受体号发情日期移植日期子宫情况黄体状况胚胎编号移植情况移植人备注等级8