内分泌细胞学技术

《内分泌细胞学技术》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。

1、第十一章内分泌细胞学技术细胞培养内分泌细胞培养的应用探索各种内分泌细胞的功能，各种激素的作用方式及其对机体的影响是内分泌基础研究的主要目标之一，而各种激素在发挥功能的过程中大多是与相应的靶细胞结合而发挥作用。体外细胞的培养，使上述研究更加直接和有效。【细胞培养】细胞培养（cellculture）：是指从体内分离细胞、在体外模拟体内的环境（包括无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件下等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。培养物常为单个细胞或单一细胞群，特殊情况下可用不同组织来源的细胞共同培养。细胞

2、培养的出现，开创了生命科学研究新的里程碑，使生命科学不再受组胚学、解剖学的局限，以活的有机体做研究对象。目前，细胞培养不仅是生命科学理论研究的重要技术方法，细胞移植和细胞治疗也逐渐应用于临床，而且日益成为生物工程和基因工程的生产手段。一、细胞分离细胞分离是指将细胞或细胞团从组织块中游离出来，而原已存在于体液中的细胞如血液中的细胞则不需分离，可直接纯化。一般采用机械法或酶消化法，前者指用机械手段如剪刀、玻璃注射器蕊、细胞匀浆器等将组织块变成小于2mm3的组织甚至单个的细胞或细胞团；后者指用能分散细胞外基质的酶将细胞

3、从其支持组织中分离出来。常用的酶有胰蛋白酶、胶原酶、高纯度分散酶，它们又有各种不同的类型。实际应用时，应针对不同的组织来源，采用不同的类型和酶浓度。经上述方法分离的细胞一般为多种细胞及细胞外基质的混合物，如果要得到单一细胞群，则需进一步纯化。（一）筛网过滤法选择孔径比细胞直径稍大的不锈钢或尼龙膜网，分离后的细胞经无菌的筛网过滤，孔径比细胞大的物质便留在筛网上。该方法只能对细胞进行初步纯化，对细胞类型比较单一的组织块如除去包膜的脾脏细胞等是有效的，而对于其他细胞如胰岛等则需进一步的纯化。（二）密度梯度离心使用不同浓

4、度的Ficoll（含葡聚糖）形成不同的密度梯度，细胞置于Ficoll上或与它们共同组成密度梯度，在适当离心力下进行离心，吸取特定细胞层，即可分离目的细胞[1]18。经密度梯度离心后的细胞已经达到了较高的纯度，为常用的一种细胞纯化方法。（三）显微镜下直接吸取细胞或刮取细胞层为获得单克隆细胞或排除其他细胞的污染，对于体积较大（如胰岛）或有显著特征（如ALP染色阳性细胞）的细胞，可在显微镜下无菌吸（刮）取细胞，以达到纯化目的[2]。（四）选择性培养在培养基中加入非目的细胞的特异性抑制物，使得非目的细胞不能增殖并诱发其凋

5、亡，从而使细胞达到纯化[3]。该方法常用在杂交瘤细胞或转基因细胞的选择性培养中。（五）流式细胞技术将细胞荧光染色（对细胞无毒，仍可存活）后，在稳定的液流推动装置作用下通过直径为50~100μm的小孔并排列成单行，每个细胞依次恒速通过激光束照射区，细胞受激光照射后发出散射光和荧光。通过检测散射光可知细胞的体积，检测荧光可知细胞DNA或RNA的含量。如果受检测的细胞特性与预定的细胞特性相符，则该细胞被收入到特定的容器中，从而将细胞分离[4]。（六）共聚焦激光扫描显微镜技术利用共聚焦激光扫描显微镜，在不改变培养环境及细

6、胞生长状态的情况下，利用高能激光自动杀灭非目的细胞，存留完整活细胞亚群继续培养，从而克隆粘附细胞。二、离体细胞的培养（一）培养液由基本培养基及补充物所组成，对来源于体液的细胞如外周血淋巴细胞而言，选用RPMI1640培养液较好。对贴壁培养的细胞，可选用DMEM、MEM、F12、McCoy’S5A,F10或DMEM/F12混合物。其中F12、F10较常用于成纤维细胞的培养，DMEM、MEM、McCoy’S5A较常用于上皮细胞的培养。同一类型的基本培养基其组成成份不同，有高糖型、低糖型，有些含有酚红。对于高糖需要型细

7、胞如胰岛培养，则选用高糖型培养液。而研究类固醇激素对细胞的影响时，应选用无酚红的培养液以排除酚红的类固醇激素样作用。补充物有动物血清、生长因子和激素等，部分生长因子与激素是醇溶性的，此时要注意培养液中的乙醇浓度不要超过0.1%（V/V），各种生长因子和激素的配制与使用方法如表1-14-1。表1-14-1生长因子及激素的配制和使用溶剂贮存浓度贮存温度(℃)使用浓度L-抗坏血酸PBS50mg/ml425μg/ml~100μg/ml上皮生长因子（EGF）H2O2μg/ml-201ng/ml成纤维细胞生长因子H2O2μg

8、/ml-205ng/ml丙酮酸钠H2O100mM41mM氢化可的松95%乙醇2×10-4M42×10-6M地塞米松PBS10-5M410-7-10-8M雌激素95%乙醇10-3M410-8M维生素A酸95%乙醇2×10-6M-202×10-8M胰岛素0.01NHCl1mg/ml45μg/ml18动物血清常用5%~15%小牛血清或胎牛血清（FBS），必要时可用活性炭将血清中