一株多重耐药牛源大肠杆菌的分离鉴定

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1、第12期2014年吉林畜牧兽医实验研究SHiYanYanJiu一株多重耐药牛源大肠杆菌的分离鉴定1,231111＊孙武文，袁媛，王姣姣，崔冰冰，单晓枫，钱爱东1.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春130118；2.吉林省洮南市动物疫病预防控制中心，吉林洮南137100；3.长春博瑞饲料集团有限公司，吉林长春130114摘要：从吉林省长春市某奶牛场患病犊牛腹泻样品中分离一株疑似病原菌，经致病性实验、理化特性观察、16SrRNA基因序列分析等实验，证实该菌为致病性大肠杆菌，并命名为ND131111-1。药敏试验显示，菌

2、株ND131111-1对大多数抗生素具有较强的耐药性，只有头孢唑林、头孢噻肟、磷霉素、呋喃妥因、多粘菌素B等5种抗生素对其敏感，头孢噻吩对其中度敏感。关键词：犊牛；腹泻；大肠杆菌；多重耐药犊牛腹泻是新生犊牛的一种急性传染病，其敏纸片、细菌微量生化反应管购自杭州微生物试病原以大肠杆菌为主，该病主要感染10日龄内剂有限公司。的犊牛，1～3日龄的犊牛更易发病，临床表征以1.1.3实验动物腹泻、脱水等为主，也有表现为败血症，本病一年昆明系小鼠12只，18g左右/只，购自吉林省[1～3]均可见，但以气温较低的冬春多发。实验动物中

3、心。2013年11月份，长春某奶牛养殖场发生一1.2方法起犊牛严重腹泻的疾病，多种常见药物治疗无1.2.1细菌的分离效。经临床初步诊断为大肠杆菌引起的犊牛腹取发病犊牛腹泻粪样，无菌操作，接种营养泻。笔者对发病犊牛进行了病原的分离、鉴定，肉汤中增菌，并于EMB平板和麦康凯琼脂平板，并对分离菌株进行了药敏试验，为临床用药的划线分离，37℃培养18～24h，挑取特征性菌落选择以及犊牛腹泻疾病的防治，提供一些数据进行纯化，4℃保存备用。支持。1.2.2细菌的致病性试验1材料与方法将纯化的细菌接种于营养肉汤中，培养24h，1.1

4、材料稀释至1.0×108CFU/mL，以每只0.2mL的剂量接1.1.1病料来源种于小鼠，对照组接种0.2mL的无菌营养肉汤，犊牛腹泻粪样取自吉林省长春市某奶牛养每组接种5只，分别饲养，观察并记录小鼠发病殖场，低温保存运至实验室。及死亡情况。1.1.2主要试剂1.2.3菌体形态与理化特性观察EMB鉴别培养基、MH琼脂、麦康凯琼脂、营将1.2.2证明有致病性的细菌纯化并革兰氏养肉汤购自北京陆桥技术有限责任公司；TaqDNA染色，观察菌体形态；同时将细菌纯培养物接种聚合酶、dNTP、DNAMarker(DL2000)、细菌

5、基因组于细菌微量生化反应管，具体操作见说明书。提取试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司；药1.2.416SrRNA基因序列分析取细菌纯培养物接种于营养肉汤，培养，按细菌基因组提取试剂盒提取其基因组DNA，并以此为模板，进行PCR扩增，引物为细菌通用引*通讯作者物，反应条件：94℃5min；94℃1min；55℃1min，实验研究吉林畜牧兽医2014年第12期ZHSuHainYLaunnYZaonnJgiuSHu72℃1min，30循环；最后72℃10min，取PCR产M1物经琼脂糖凝胶电泳检测，将PCR产物提交于TaK

6、aRa公司，完成测序。2000bp测序结果通过NCBI的BLAST检索系统进1000bp行序列相似性比较，并结合菌体形态与理化特性750bp进行细菌的最终鉴定。500bp1.2.5药敏试验250bp8将细菌稀释成1×10cfu/mL浓度，取0.1mL100bp菌液涂布于MH平板上，干燥后贴上药敏纸片，37℃培养24h，观察抑菌圈并测量抑菌圈直径。图1菌株ND131111-116SrRNA基因PCR扩增结果判定结果参照CLSI制定的药敏标准。2.5药物敏感性试验2结果表2为大肠杆菌ND131111-1对22种抗生素2.1

7、菌落形态观察的药敏试验结果，从表中可以看出，该菌对大部分离细菌在EMB琼脂平板长成圆形、中等分抗生素强耐药，只有头孢唑林、头孢噻肟、磷霉大小、黑色呈金属光泽的菌落；在麦康凯琼脂平素、呋喃妥因、多粘菌素B等5种抗生素对其敏板上为圆形、中等大小、粉红色菌落。感，头孢噻吩对其中度敏感。2.2致病性实验结果表2大肠杆菌ND131111-1药敏试验结果分离菌株经小鼠攻毒发现，该菌对小鼠具有抑菌圈直判定标准判定药品名称致病性，试验组小鼠均死亡，对照组无变化。因径（mm）耐药（R）中敏（I）敏感（S）结果氨苄西林0≤1314～16≥

8、17R此，将该株细菌暂命名为ND131111-1。阿莫西林0≤1314～16≥18R头孢唑林22≤1415～17≥18S2.3病原菌菌体形态与理化特性头孢噻吩15≤1415～17≥18I显微镜下，菌体为革兰氏阴性杆菌、两端钝头孢噻肟30≤1314～22≥23S庆大霉素0≤1213～14≥15R圆、双在或散在。链霉素0≤1112～1