平板菌落的辨别计数和细菌染色

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1、环工综合实验平板菌落的辨别计数和细菌染色实验报告环境科学与工程学院实验中心实验题目平板菌落的辨别计数和细菌染色实验类别综合实验室实验时间实验环境温度:湿度:同组人数一、实验目的1.学习平板菌落计数的基本原理和方法 2.掌握倒平板的方法和几种常用的分离纯化微生物的基本操作技术； 3.了解简单染色法的原理，并掌握其操作方法。 4.学习并掌握微生物涂片、革兰氏染色的基本技术和无菌操作技术 二、实验仪器及设备活材料：培养的菌落 染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、沙黄、蒸馏水 器材：废液缸、洗瓶、载玻片、盖玻片、接种环、煤气灯、擦镜纸、显微镜三、实

2、验原理实验原理问答题：1.如何对微生物菌落进行鉴别？答：细菌：湿润，粘稠，易挑起，一般形成较小的圆形菌落，颜色有白色、黄色等，表面光滑或不光滑放线菌：干燥，多皱，难挑起，菌落较小，多有色素，菌落背面有同心圆形纹路。这点可以和细菌菌落区分。酵母菌：湿润，粘稠，易挑起，表面光华，比细菌的菌落大而厚，菌落为淡黄色，光滑，半透明，比细菌菌落大。霉菌：菌丝细长，菌落疏松，成绒毛状、蜘蛛网状、棉絮状，菌落大型，肉眼可见许多毛状物，棕色、青色等，可见黑色的分生孢子群。2.如何通过对平板微生物菌落进行计数知道湖水、自来水和空气中细菌的数量？答：选择平均菌落数在

3、30～300间的平板⑴若只有一个稀释度符合，以该稀释度的平均菌落数乘以稀释倍数报告⑵若有两个稀释度符合，取决于二者比值（高稀释度的菌落数除以低稀释度的菌落数的值）：若0.5≤比值≤2，以两稀释度的菌落数乘稀释倍数所得的值的均值报告；若2≤比值或比值≤0.5，则取其中较少的菌落总数进行报告。⑶所有菌落数均不在30～300间以最接近30或300的平均菌落数乘稀释倍数:若所有稀释度的菌落平均数均大于300，则按稀释倍数最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告;若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告。空气中细菌含量的测

4、定:X=100×100×N／(πr2)X—每m3空气中的细菌数；N：平板暴露5min，置37℃培养24h后生长的菌落数；r：平皿底半径（cm）3.微生物的染色机理是什么？（单染和革兰氏染色）答：⑴简单染色法：所谓单染色法是利用单一染料对细菌进行染色的一种方法。此法操作简便，适用于菌体一般形态的观察。在中性、碱性或弱酸性溶液中，细菌细胞通常带负电荷，所以常用碱性染料进行染色。碱性染料并不是碱，和其他染料一样是一种盐，电离时染料离子带正电，易与带负电荷的细菌结合而使细菌着色。例如，美蓝（亚甲蓝）实际上是氯化亚甲蓝盐，它可被电离成正、负离子：带正电荷

5、的染料离子可使细菌细胞染成蓝色。常用的碱性染料除美蓝外，还有结晶紫、碱性复红、番红（又称沙黄）等。细菌体积小，较透明，如未经染色常不易识别，而经着色后，与背景形成鲜明的对比，使易于在显微镜下进行观察。⑵革兰氏染色法：是1884年由丹麦病理学家C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最常用的鉴别染色法。该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时

6、溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料（初染液）；媒染剂；脱色剂和复染液。碱性染料初染液的作用象在细菌的单染色法基本原理中所述的那样，而用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和性或附着力，即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落，碘是常用的媒染剂。脱色剂是将被染色的细

7、胞进行脱色，不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不能，脱色剂常用95％的酒精。复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，从而将细胞区分成G+和G-两大类群，常用的复染液是沙黄。四、实验步骤1.对培养的平板菌落（湖水、自来水、空气）进行计数并辨别菌落形态。 2.革兰氏染色： （1）涂片：取干净载玻片一块，在载玻片中央加一滴蒸馏水，按无菌操作法挑取菌落，调匀并涂成薄膜，涂片必须均匀。 （2）晾干：让涂片自然晾干或者在酒精灯火焰上方文火烘干。 （3）固

8、定：手执玻片一端，让菌膜朝上，通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜），使细胞质凝固，以固定细菌的形态，并使其不易脱落。但不能在火焰上烤，否则细菌形态将毁