番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定

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2014（12）：15-20中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒复合侵染的分子鉴定112331*赵黎明　李　刚　刘永光　国家进　魏家鹏　竺晓平12（山东农业大学植物保护学院，山东泰安271018；潍坊科技学院蔬菜花卉研究所，山东寿光262700；3山东省蔬菜工程中心，山东寿光262700）摘　要：2013年秋季，在山东寿光设施番茄植株上采集到叶片脉间褪绿黄化、叶片边缘卷曲、叶片皱缩，后期叶片变厚、变脆，并伴随着植株矮化的疑似番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒复合侵染的样本。分别利用番茄褪绿病毒（Tomatochlorosisvirus，ToCV）外壳蛋白基因（CP）序列引物CP-F/CP-R和番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，TYLCV）特异引物TY1-R/TY1-F、TY2-R/TY2-F、TY3-R/TY3-F对其进行检测、扩增，分别得到774bp（GenBank登录号KC709510）和2781bp（GenBank登录号KJ546418）的核苷酸序列。经序列测序后表明，KC709510与GenBank已登录的番茄褪绿病毒ToCV-BJ（KC311375）分离物相似性为99.6%，KJ546418与GenBank已登录的番茄黄化曲叶病毒TYLCV-SDWF-L7（KC999850）分离物相似性为99.6%。关键词：番茄褪绿病毒；番茄黄化曲叶病毒；RT-PCR检测；复合侵染番茄每年因病毒病减产30%以上，夏、秋番间，导致的番茄减产在30%以上。目前，仅在北茄损失更为严重，有的年份或有的地块几乎绝收（冯京、山东及南京三地有ToCV的相关报道（Karwitha兰香等，1987）。番茄褪绿病毒（Tomatochlorosisetal.，2013；Zhaoetal.，2013；Zhaoetal.，2014）。virus，ToCV）属于长线形病毒科（Closteroviridae）而番茄黄化曲叶病毒（Tomatoyellowleafcurlvirus，毛形病毒属（Crinivirus），于1998年在佛罗里达TYLCV）则属于双生病毒科（Geminiviridae）菜豆州首次报道，然后在法国、意大利、巴西、以色金色花叶病毒属（Begomovirus），于2005年传入我列等地相继发现（Wisleretal.，1998；Accottoetal.，国（Wuetal.，2006），并由点到面快速传播，是当2001；Segevetal.，2004；Dalmonetal.，2005；Freitas前保护地番茄生产上首要病害。两种病毒一个属于etal.，2012）。该病毒病害于2010年前后在山东设RNA病毒（ToCV），一个属于DNA病毒（TYLCV），施蔬菜产区即有发生，寿光当地菜农称之为“黄但都可以由烟粉虱传播。头”，由于其症状非常类似营养缺失的褪绿黄化，综上所述，明确我国保护地番茄是否遭受番最初被作为缺素症对待，后经分子鉴定该病毒病茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的复合侵染至关重害为番茄褪绿病毒病，2013年该病害在山东各地要，可为这两种病毒的综合防治提供预警。本试验保护地普遍发生和流行，病株率在20%～40%之对在山东寿光地区采集到的疑似两种病毒复合侵染症状的番茄样本开展了分子鉴定，以确定我国番茄赵黎明，女，硕士，专业方向：植物病理学，E-mail：708810891@qq.com植株上这两种病毒的复合侵染，为今后两种病毒病*通讯作者（Correspondingauthor）：竺晓平，男，教授，专业方向：植的致病机理研究和防治提供理论依据。物病理学，E-mail：zhuxp@sdau.edu.cn收稿日期：2014-03-28；接受日期：2014-07-011　材料和方法基金项目：国家公益性（农业）行业科研专项（201003065），山东1.1　材料省自然科学基金项目（ZR2012CM032），山东省科技发展计划项目（2014GNC111008）1.1.1　待测番茄样品　2013年秋，在山东寿光设施—15—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES番茄种植区的大红番茄、樱桃番茄和粉果番茄植株列进行比对。为便于鉴定分析，将得到的阳性样品上，采集疑似复合感染番茄褪绿病毒和番茄黄化曲再利用外壳蛋白基因（CP）序列引物CP-F/CP-R叶病毒的病株样本，保存在-80℃冰箱，用于DNA（Hirotaetal.，2010）反转录（体系同上）并进行与RNA提取等后续试验；以健康的番茄植株叶片外壳蛋白全基因特异扩增、克隆并测序。扩增体系：作为阴性对照。ddH2O17μL，10×Buffer2.5μL，dNTP1.0μL，1.1.2　菌株和载体　大肠杆菌（Escherichiacoli）上下游引物各1.0μL，cDNA2.0μL，TaqDNA聚DH5α菌株由山东农业大学园艺病害研究室保存，合酶0.5μL，总体积25μL。扩增条件：94℃3克隆载体pMD18-T购自TaKaRa公司。min；94℃45s，52℃45s，72℃90s，循环30次；1.1.3　生化试剂　RNA提取试剂、DNA提取试72℃10min。PCR扩增产物进行1.0％琼脂糖凝胶剂购自天根生化科技（北京）有限公司；RNase电泳检测并拍照。—Inhibitor、RTaseM-MLV（RNaseH）、T4DNA连1.2.2　番茄样品总DNA提取及PCR扩增　称取寄接酶购自TaKaRa公司；PCR产物胶回收试剂盒购主植物叶片0.1g，加液氮研磨成粉末，按Harrison自北京百泰克生物技术有限公司；TaqDNA聚合酶、等（1997）的CTAB法提取叶片总DNA，用于后dNTPs、DNA分子量标准Tran2Kplus、Tran2KⅡ续试验。病毒检测采用TYLCV特异引物TY3-R/plus均购自北京全式金生物技术有限公司；其他生TY3-F扩增（李刚等，2013），扩增体系：ddH2O化试剂及普通化学试剂均为进口或国产分析纯。18μL，10×Buffer2.5μL，dNTP1.0μL，上下游1.2　方法引物各1.0μL，DNA1.0μL，TaqDNA聚合酶0.51.2.1　番茄样品总RNA提取及RT-PCR扩增　称μL，总体积25μL。扩增条件：94℃3min；94℃取寄主植物叶片0.1g，加液氮研磨成粉末，按45s，58℃45s，72℃90s，循环30次；72℃10TRIzol法提取叶片总RNA，用于后续试验cDNA的min。得到的阳性样品，再通过引物TY1-R/TY1-F合成。反转录体系（10μL）：模板RNA3.0μL，和TY2-R/TY2-F（李刚等，2013）对感病样品全基下游引物ToCV21.0μL，RNase-FreeH2O2.0μL，因组序列进行PCR扩增。PCR扩增产物进行1.0％70℃变性10min，冰上放置2min，再加入下列试琼脂糖凝胶电泳检测并拍照。产物经测序后利用剂：5×M-MLVBuffer2μL，dNTPmixture（各10DNAMAN软件和GenBank中已经登录的TYLCV的-1-mmol·L）0.5μL，RTaseM-MLV（RNaseH）（200序列进行比对。本试验所用引物序列见表1。-1-1U·μL）0.5μL，RNaseInhibitor（40U·μL）0.251.2.3　PCR产物回收与测序　参照试剂盒说明将μL，RNase-FreeH2O0.75μL，总体积为10μL。PCR目的电泳带进行回收。回收的PCR产物与42℃保温60min，再70℃保温15min。pMD18-T连接，再转化DH5α，用含氨苄青霉素病毒检测采用ToCV特异引物ToCV1/ToCV2扩（Amp）的培养基进行筛选。阳性克隆经菌落PCR增（Pannoetal.，2012），扩增的产物经测序后利用后，将菌液送上海铂尚生物科技有限公司进行序列DNAMAN软件和GenBank中已经登录的ToCV的序测定。对测定的序列在GenBank进行BLAST比较。表1　引物信息引物序列（5′-3′）片段大小/bp退火温度/℃参考文献TY1-FTGAGGAAACTTACGAGCC136951.7李刚等，2013TY1-RCGCAAGTATCAATCAAGGTTY2-FCTCCAAAATCAATGAAGTCTCC75254.4李刚等，2013TY2-RGGGCTCGTAAGTTTCCTCTY3-FGGTCTACACGCTTACGCCTTATT83358.7李刚等，2013TY3-RTTCCATCCGAACATTCAGGCAGCToCV1CATTCCGGCTAATCCTAATCGA10150.0Pannoetal.，2012ToCV2CCCTAGTGGAGTGTACCTTCAATTTCCP-FGAATCTTTTAGAAGCTTTGGTTTAAGG77452.0Hirotaetal.，2010CP-RGATCCTCTTGATCCTCATAGATTTC—16—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文1.2.4　序列分析　ToCV序列分析：登录NCBI，表2　用于序列比较和进化分析的病毒信息利用BLAST（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分离物名称分离地点登录号ToCV-Amelia（CP）美国HQ879840进行病毒样品CP序列比较，分别选取NCBI上典ToCV-Tochigi（CP）日本AB513443型毛形病毒属的CP序列，用DNAStar软件中的ToCV-FL2（CP）美国DQ234675MegAlign对所选定的序列进行相似性比对，利用ToCV-IS（CP）以色列DQ234673TICV-SP5131（CP）西班牙FJ542305Mega4.0的ClustalW法进行多序列比较分析以及进ToCV-ToC-Br2（CP）巴西JQ952601化树的构建。用于CP序列比较和进化分析的病毒ToCV-Gr-535（CP）希腊EU284744信息见表2。ToCV-AT80/99（CP）西班牙DQ983480TYLCV序列分析：登录NCBI，利用BLASTToCV-SDSG（CP）中国KC709510ToCV-BJ（CP）中国KC311375（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）进行病毒样TYLCV-SDYT中国JX669544品全长的序列比较，分别选取NCBI上典型TYLCVTYLCV-Shouguang中国JQ411237的全长序列，用DNAStar软件中的MegAlign对TYLCV-SDWF-L7中国KC999850TYLCV-SDSGTO中国KJ546418所选定的序列进行相似性比对，利用Mega4.0TYLCV-HNZM中国JN990926的ClustalW法进行多序列比较分析以及进化树TYLCV-HBLF4中国HM208334的构建。用于序列比较和进化分析的病毒信息TYLCV-Tianjin中国GU563330见表2。TYLCV-IL埃及AY594174TYLCV-MILD西班牙AF071228TYLCV-Reunion留尼旺岛AJ8653372　结果与分析TYLCV-Gezira苏丹AY0441382.1　番茄疑似病株的田间症状TYLCV-Ker伊朗GU076448TYLCV-Kahnooj伊朗EU635776疑似复合感染ToCV和TYLCV的番茄植株会TYLCV-IR伊朗AJ132711表现出不同的发病症状，即同一植株上，有的枝条TYLCV-KW2阿曼苏丹国JN604485叶片表现褪绿变黄，并随着症状的发展除了叶脉仍TYLCV-Bidiya阿曼苏丹国HE819241保持绿色外，几乎整个叶片全变黄色，叶片变脆，TYLCV-Thailand泰国X63015同时还伴随部分叶片边缘卷曲，叶片黄化，有坏死2.2　番茄疑似病株样本的ToCV和TYLCV分子斑点等典型的ToCV症状；而有的枝条叶片则表现检测边缘黄化、叶片增厚皱缩等典型的TYLCV症状（图对采集的35个疑似病株样品，分别提取同1）。此外，在感病后期，植株叶片均向上纵卷。一植株样品的RNA和DNA，以其为模板利用引图1　复合感染番茄褪绿病毒和番茄黄化曲叶病毒不同表现症状的番茄植株粗箭头指示方向为ToCV症状，细箭头指示方向为TYLCV症状。—17—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLES物ToCV1/ToCV2和TY3-R/TY3-F进行RT-PCR及与GenBank上登录的ToCV的相似性均达到99.0%PCR扩增。用引物ToCV1/ToCV2及引物TY3-R/以上，扩增出833bp特异条带的分离物与GenBankTY3-F，在部分样品中可分别扩增出大小约为101上登录的TYLCV的相似性均达到99.0%以上。因bp和833bp的特异条带（图2-a、2-b）。测序后此，表明寿光地区番茄疑似病株样本已被ToCV与经BLAST比对，扩增出101bp特异条带的分离物TYLCV复合侵染。M12CKM12CKM12CKM12CK34CK5000bp5000bp5000bp5000bp3000bp3000bp3000bp3000bp2000bp2000bp2000bp2000bp1000bp1369bp750bp1000bp1000bp1000bp500bp750bp833bp750bp774bp750bp752bp500bp500bp500bp250bp250bp250bp250bp100bp101bp100bp100bp100bpabcd图2　不同引物PCR扩增山东寿光番茄疑似病株样本的结果a：引物ToCV1/ToCV2扩增结果，1、2为番茄样品，M为Trans2KⅡPlusDNAMarker，CK为阴性对照；b：引物TY3-F/TY3-R扩增结果，1、2为番茄样品，M为Trans2KPlusDNAMarker，CK为阴性对照；c：引物CP-F/CP-R扩增结果，1、2为番茄样品，M为Trans2KPlusDNAMarker，CK为阴性对照；d：引物TY1-F/TY1-R和引物TY2-F/TY2-R扩增结果，1～2为引物TY1-F/TY1-R扩增番茄样品结果，3～4为引物TY2-F/TY2-R扩增番茄样品结果，M为Trans2KPlusDNAMarker，CK为阴性对照（健康番茄叶片）。2.3　病毒基因扩增和序列测定表3　番茄褪绿病毒的RNA序列一致性的比较2.3.1　ToCV山东寿光番茄分离物CP序列扩增　利分离物名称分离地点登录号一致性/%ToCV-Amelia（CP）美国HQ87984092.8用特异性引物CP-F/CP-R（Hirotaetal.，2010）对ToCV-Tochigi（CP）日本AB51344398.9上述疑似样本进行RT-PCR扩增，得到大小约为ToCV-FL2（CP）美国DQ23467592.6774bp的特异性条带（图2-c），序列测定结果表ToCV-IS（CP）以色列DQ23467398.5TICV-SP5131（CP）西班牙FJ54230540.1明，该山东寿光地区番茄分离物的CP全长为774ToCV-ToC-Br2（CP）巴西JQ95260198.8个核苷酸，定名为山东寿光番茄ToCV-SDSG分离ToCV-Gr-535（CP）希腊EU28474498.6物（GenBank登录号KC709510）。ToCV-AT80/99（CP）西班牙DQ98348097.42.3.2　TYLCVDNA-A山东寿光番茄分离物全长序ToCV-BJ（CP）中国KC31137599.6列扩增　利用特异性引物TY1-R/TY1-F、TY2-R/日本和美国等报道的番茄褪绿病毒的相似性在TY2-F（李刚等，2013）对上述疑似样本的剩余92.6%～99.6%，并且与北京分离物ToCV-BJ的相全长序列进行PCR扩增和测序，分别得到大小似性最高，为99.6%，而与同一属的番茄侵染性褪约为1369、752bp的产物（图2-d），利用软件绿病毒（Tomatoinfectiouschlorosisvirus，TICV）DNAMAN对特异性引物TY1-R/TY1-F、TY2-R/的相似性则在41%以下。同时比对TYLCV的全序TY2-F、TY3-R/TY3-F扩增的序列进行拼接，拼列，发现山东寿光番茄TYLCV-SDSGTO分离物的接结果得到全长为2781个核苷酸，定名为山东寿全序列与山东潍坊、烟台等地的TYLCV的相似性光番茄TYLCV-SDSGTO分离物（GenBank登录号在90.2%～99.6%，并且与山东潍坊分离物TYLCV-KJ546418）。SDWF-L7的相似性最高，为99.6%（表4）。2.4　序列分析为了更好地分析其系统进化关系及分类地位，利用DNAStar软件的MegAlign方法，将选取国内外不同地区有代表性的引起番茄褪绿病ToCV-SDSG分离物的CP核苷酸序列与GenBank和番茄黄化曲叶病的病毒分离物，根据ToCVCP中已登录的有代表性的ToCV分离物及其他毛形核苷酸和TYLCV全长序列构建系统进化树（图病毒属的CP核苷酸序列，进行核苷酸相似性比3）。从构建的系统进化树图可以看出，山东寿光较。结果表明（表3），该样本的CP与北京、地区ToCV-SDSG分离物与北京ToCV-BJ分离物亲—18—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 中国蔬菜CHINAVEGETABLES研究论文87TYLCV-SDYT（JX669544）77TYLCV-Shouguang（JQ411237）100TYLCV-SDWF-L7（KC999850）100▲TYLCV-SDSGTO（KJ546418）TYLCV-HNZM（JN990926）100100TYLCV-HBLF4（HM208334）96TYLCV-Tianjin（GU563330）86ToCV-BJ（KC311375）100TYLCV-IL（AY594174）65▲ToCV-SDSG（KC709510）100TYLCV-MILD（AF071228）95ToCV-Japan/Tochigi（AB513443）TYLCV-Reunion（AJ865337）ToCV-USA/Amelia（HQ879840）100TYLCV-Gezira（AY044138）92ToCV-USA/FL2（DQ234675）TYLCV-Ker（GU076448）100ToCV-Isreal/IS（DQ234673）100TYLCV-Kahnooj（EU635776）7052ToCV-Brazil/ToC-Br2（JQ952601）TYLCV-IR（AJ132711）ToCV-Greece/Gr-535（EU284744）99TYLCV-KW2（JN604485）ToCV-Spain/AT80/99（DQ983480）93TYLCV-Bidiya（HE819241）TICV-SP5131（FJ542305）TYLCTHV-Thailand（X63015）ab图3ToCV和TYLCV系统进化树a：番茄褪绿病毒山东番茄分离物ToCV-SDSG与世界其他地区分离物的CP系统进化树；b：番茄黄化曲叶病毒山东番茄分离物TYLCV-SDSGTO与世界其他地区分离物全长系统进化树。表4　番茄黄化曲叶病毒的DNA序列一致性的比较由局部暴发扩展为全国普发，近几年由于物理防控分离物名称分离地点登录号一致性/%和抗TYLCV番茄品种等措施的应用，该病害得到TYLCV-SDYT中国JX66954499.5了一定程度的控制。但是现在抗TYLCV的番茄品TYLCV-Shouguang中国JQ41123799.5TYLCV-SDWF-L7中国KC99985099.6种是否都对ToCV表现抗病，或者是易于被ToCVTYLCV-HNZM中国JN99092690.9侵染，还需要进一步的研究。TYLCV-HBLF4中国HM20833491.0目前，我国对番茄褪绿病毒的研究尚处在开始TYLCV-Tianjin中国GU56333091.2阶段，对番茄褪绿病毒与番茄黄化曲叶病毒的协同TYLCV-IL埃及AY59417490.2TYLCV-MILD西班牙AF07122883.6传播机制及其协生作用了解甚少，今后需要进一步TYLCV-Reunion留尼旺岛AJ86533791.0的深入研究，但这两种同为烟粉虱传播的病毒的复TYLCV-Gezira苏丹AY04413881.3合侵染对番茄生产的潜在威胁应引起足够的重视。TYLCV-Ker伊朗GU07644882.5TYLCV-Kahnooj伊朗EU63577682.3TYLCV-IR伊朗AJ13271181.8参考文献TYLCV-KW2阿曼苏丹国JN60448580.4冯兰香，蔡少华，郑贵彬，龙明生，丁辛顺，姚文岳，郑品清，高乔TYLCV-Bidiya阿曼苏丹国HE81924179.3婉.1987.我国番茄病毒病的主要毒源种类和番茄上烟草花叶TYLCV-Thailand泰国X6301564.3病毒株系的鉴定.中国农业科学，20（3）：60-66.缘关系最近（图3-a）；而山东寿光番茄TYLCV-李刚，李现道，赵黎明，李景山，王云，竺晓平.2013.山东烟草番茄黄化曲叶病毒的分子检测和序列分析.中国烟草科学，34（6）：SDSGTO分离物全长与山东潍坊TYLCV-SDWF-L798-102.分离物亲缘关系最近，同属于以色列株系（图3-b）。AccottoGP，VairaAM，VecchiatiM，FinettiSialerMM，GallitelliD，DavinoM.2001.FirstreportofTomatochlorosisvirusinItaly.Plant3　结论与讨论Disease，85（11）：1208.本试验通过对寿光番茄感病样品分别用DalmonA，BouyerS，CaillyM，GirardM，LecoqH，DesbiezC，JacquemondM.2005.FirstreportofTomatochlorosisvirusandToCV1/ToCV2和TY3-R/TY3-F进行检测，证实TomatoinfectiouschlorosisvirusintomatocropsinFrance.PlantToCV与TYLCV复合侵染番茄。Disease，89（11）：1243.这也是在国内首次明确设施番茄受到番茄褪绿FreitasDMS，NardinI，ShimoyamaN，Souza-DiasJAC，RezendaJ病毒及番茄黄化曲叶病毒两种病毒的复合侵染。在AM.2012.FirstreportofTomatochlorosisvirusinpotatoinBrazil.国内发现番茄褪绿病毒前，番茄黄化曲叶病毒已经EuropeanJournalofPlantPathology，134（1）：81-86.—19—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org 研究论文中国蔬菜CHINAVEGETABLESHarrisonBD，LiuYL，KhalidS，HameedS，Otim-NapeGW，Robinsonpolymerasechainreactions.JournalofVirologicalMethods，186：DJ.1997.DetectionandrelationshipsofCottonleafcurlvirusand152-156.alliedwhitefly-transmittedgeminivirusesoccurringinPakistan.SegevL，WintermantelWM，PolstonJE，LapidotM.2004.FirstreportofAnnalsofAppliedBiology，130（1）：61-75.TomatochlorosisvirusinIsrael.PlantDisease，88（10）：1160.HirotaT，NatsuakiT，MuraiT，NishigawaH，NiiboriK，GotoK，WislerGC，LiRH，LiuHY，LowryDS，DuffusJE.1998.TomatoHartonoS，SuastikaG，OkudaS.2010.Yellowingdiseaseoftomatochlorosisvirus：anewwhitefly-transmitted，phloem-limited，causedbyTomatochlorosisvirusnewlyrecognizedinJapan.Journalbipartiteclosterovirusoftomato.Phytopathology，88（5）：402-409.ofGeneralPlantPathology，76（2）：168-171.WuJB，DaiFM，ZhouXP.2006.FirstreportofTomatoyellowleafcurlKarwithaM，FengZ，YaoM，ChenXJ，ZhangWN，LiuXF，TaoXR.virusinChina.PlantDisease，90（10）：1359.2013.ThecompletenucleotidesequenceoftheRNA1ofaChineseZhaoRN，WangR，WangN，FanZF，ZhouT，ShiYC，ChaiM.2013.isolateofTomatochlorosisvirus.JournalofPhytopathology，162（6）：FirstreportofTomatochlorosisvirusinChina.PlantDisease，97：8.411-415.ZhaoLM，LiG，GaoY，LiuYJ，SunGZ，ZhuXP.2014.MolecularPannoS，DavinoS，RubioL，RubioE，DavinoM，García-Hernán-detectionandcompletegenomesequencesofTomatochlorosisdezJ，OlmosA.2012.SimultaneousdetectionofthesevenmainvirusisolatesfrominfectiousoutbreaksinChina.Journaloftomato-infectingRNAvirusesbytwomultiplexreversetranscriptionPhytopathology，162（10）：627-634.MolecularIdentificationonMixedInfectionsofTomatochlorosisvirusandTomatoyellowleafcurlvirus112331*ZHAOLi-ming，LIGang，LIUYong-guang，GUOJia-jin，WEIJia-peng，ZHUXiao-ping12（CollegeofPlantProtection，ShandongAgriculturalUniversity，Tai’an271018，Shandong，China；InstituteofVegeta-3blesandFlowers，WeifangUniversityofScience&Technology，Shouguang262700，Shandong，China；ProvincialEngi-neeringResearchCentreforVegetablesofShandong，Shouguang262700，Shandong，China）Abstract：Intheautumnof2013，leavesofgreenhouse-growntomatoplantsshowedsymptomsofinterveinalchlorosis，andtogetherwithstunted，marginalcurlingandcrumpling.Asthediseaseprogressed，leavesbecomethickandcrisp，similartosymptomsinducedbyTomatochlorosisvirus（ToCV）andTomatoyellowleafcurlvirus（TYLCV）werecollectedfromgreenhouse-growntomatoplantsinShouguang，ShandongProvince.ThespecificprimerpairsofCP-F/CP-RspecifictoToCVandTY1-R/TY1-F，TY2-R/TY2-F，TY3-R/TY3-FspecifictoTYLCVwereusedtodetectToCVandTYLCV，respectively.774bp（GenBankaccessionnumber：KC709510）and2781bp（GenBankaccessionnumber：KJ546418）specificfragmentswereamplifiedfromthesamesymptomaticsamples.SequenceanalysisoftheamplifiedsequenceofKC709510showed99.6%nucleotidesequenceidentitywithToCV-BJ（KC311375）isolatesandthesequenceofKJ546418showed99.6%nucleotidesequenceidentitywithTYLCV-SDWF-L7（KC999850）isolatesregisteredintheGenBank.　Keywords：Tomatochlorosisvirus；Tomatoyellowleafcurlvirus；RT-PCRdetection；Mixedinfections·信息·老北京胡萝卜“北京鞭杆红”通过北京市非审定农作物品种鉴定“北京鞭杆红”胡萝卜为优良北京地方品种，其品质好、味道独特，但因产量低、抗性差，逐步被后来的杂交胡萝卜取代，在生产中消失已久。为恢复传统老品种，找回老口味，北京市海淀区农业科学研究所从收集品种资源开始，历经4年提纯、复壮终于选育成功，为老北京人找回了失去的记忆。“北京鞭杆红”胡萝卜生长期100天左右；地上部高50cm左右；2肉质根表皮紫红色，韧皮部、木质部均为橙红色；根长20～25cm，单根质量100～150g，每667m产量3000kg左右；干物质含量高，花青素、胡萝卜素显著高于对照黑田五寸；肉质硬脆，味甜，风味浓，适合北京地区秋季露地栽培。该品种于2014年11月14日通过北京市非审定农作物品种鉴定。（中国农业信息网）—20—《中国蔬菜》学术论文下载www.cnveg.org