不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠脑功能的影响

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分类号密级国际十进分类号（UDC）第四军医大学学位论文不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠脑功能的影响（题名和副题名）周宁（作者姓名）段云友教授（主任医师）指导教师姓名第四军医大学唐都医院超声科指导教师单位博士影像医学与核医学（超声）申请学位级别专业名称2008.042008.05论文提交日期答辩日期2006年4月至2008年5月论文起止时间第四军医大学学位授予单位 独创性声明秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本人或他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：保护知识产权声明本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容（含电子版，保密内容除外），可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和下载服务。论文作者签名：导师签名：日期： 不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠脑功能的影响研究生：周宁学科专业：影像医学与核医学（超声）所在单位：第四军医大学唐都医院超声科导师：段云友教授（主任医师）资助基金项目：国家自然科学基金（30571966）关键词：超声检查；彩色多普勒超声；开场实验；自发活动；Morris水迷宫；学习，记忆；超微结构中国人民解放军第四军医大学2008年05月 第四军医大学博士学位论文目录缩略语表················································································································1中文摘要················································································································2英文摘要················································································································4前言················································································································6文献回顾················································································································8正文··············································································································31实验一不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠自发活动的影响·················311材料·········································································································311.1动物模型制备····················································································311.2辐照条件···························································································322方法·········································································································322.2实验装置图·······················································································322.1开场实验···························································································322.2统计学处理·······················································································333结果·········································································································333.1早孕各组在开场实验中获得数据·····················································333.2中孕各组在开场实验中获得数据·····················································333.3晚孕各组在开场实验中获得数据·····················································343.4照射组与对照组轨迹图····································································344讨论·········································································································35实验二不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠学习记忆能力的影响·······371材料·········································································································371.1动物模型制备···················································································371.2辐照条件···························································································382方法·········································································································382.1Morris水迷宫实验装置图·································································382.2Morris水迷宫实验·············································································382.3定位航行实验····················································································392.4空间探索实验····················································································392.5仔鼠海马区HE切片及电镜检测······················································39 第四军医大学博士学位论文2.6统计学处理························································································403结果·········································································································403.1早孕各组在MWM实验中获得数据··················································413.2中孕各组在MWM实验中获得数据··················································423.3晚孕各组在MWM实验中获得数据··················································443.4各孕期30min组组间相比较数据·····················································453.5各组海马区光镜及电镜结果····························································463.5各组在MWM实验中轨迹图······························································484讨论·········································································································49小结··············································································································53参考文献··············································································································54个人简历和研究成果··························································································70致谢··············································································································73 第四军医大学博士学位论文缩略语表缩略词英文全称中文全称CDUSColorDopplerultrasound彩色多普勒超声MImechanicalindex机械指数TIthermalindex热指数空间峰值时间平均值Isptaspatialpeaktemporalaverageintensity声强空间峰值脉冲平均值Isppaspatialpeakpulseaverageintensity声强spatialpeakmaximumhalfCycle空间峰值最大半周期Imaverageintensity声强空间峰值时间峰值声Isptaspatialpeaktemporalpeakintensity强OFOpenfield开场MWMMorriswatermazeMorris水迷宫HIFUhigh-intensityfocusedultrasound高强度聚焦超声-1- 第四军医大学博士学位论文不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠脑功能的影响博士研究生：周宁导师：段云友教授第四军医大学唐都医院超声科，西安710038中文摘要目的彩色多普勒超声检查已成为产前检查的一项重要手段。发育中的胎脑对超声非常敏感，已有研究表明孕期彩色多普勒超声照射后可引起脑组织细胞凋亡以及超微结构的变化，但是凋亡和超微结构的变化是否会影响子代的脑功能，目前尚无系统性研究。本实验旨在探讨孕期诊断剂量彩色多普勒超声辐照孕鼠子宫投影区一定时间，是否对仔鼠脑功能产生影响，以及观察海马区超微结构的变化，从而为彩色多普勒超声的产科安全应用提供有价值的实验依据。方法通过观察阴栓及镜检活精子，结合触诊胎囊大小的方法，成功获得孕6d，12d，18dSD大鼠作为早、中、晚孕模型。各孕期孕鼠按照辐照时间随机分为4组：10min，20min，30min组和假辐照组。待其产下仔鼠后，仔鼠成长至90d，每组挑选健康仔鼠10只（体质量220-250g），先进行OF实验，之后进行Morris水迷宫测试。仪器采用Acuson公司Sequoia-512型彩色电脑声像仪，照射条件：4V1探头，二维频率H3.0MHz，彩色频率3.0MHz，Tis=1.8，MIcd=1.6。实验各组仔鼠生后90d分别进行开场实验(上海吉量软件科技有限公司研制的开场实验视频分析系统）及Morris水迷宫(上海吉量-2- 第四军医大学博士学位论文软件科技有限公司研制的全自动Morris水迷宫视频分析系统）测试。统计各组在开场实验中活动总路程、活动度、中央区时间、中央区路程以及平均运动速度以及在MWM实验中上台潜伏期及目标象限游泳时间的百分比。所得分数用统计软件spss13.0进行评价。行为学实验后，取仔鼠脑组织进行HE染色及电子显微镜观察海马区超微结构的变化。结果开场实验中：与对照组相比，各孕期辐照10min，20min及30min组仔鼠的活动总路程、活动度、中央区时间、中央区路程以及平均运动速度均无明显差异（P>0.05）。MWM实验中：与对照组（10.78±3.89,37.42%±2.37％）相比，各孕期接受辐照30min组(21.96±5.29)仔鼠的上台潜伏期明显延长（P<0.05），目标象限游泳时间的百分比（27.89％±2.14％）显著降低（P<0.05）；而10min（9.98±2.12，37.42％±1.89％）和20min（12.23±2.56，34.11％±2.65％）组与对照组相比则无明显差异（P>0.05）。光镜与电镜观察结果发现辐照组与对照组仔鼠海马区神经细胞超微结构并无明显差异。结论各孕期诊断剂量彩超照射对仔鼠的自发活动不产生明显影响。然而各孕期30min彩色多普勒超声照射虽然形态学上对仔鼠的神经细胞并未造成影响，但在功能上可能对仔鼠的学习记忆能力产生影响。因此产科检查时，建议应当避免对胎儿的长时间照射。关键词：超声检查；彩色多普勒超声；开场实验；自发活动；Morris水迷宫；学习，记忆；超微结构-3- 第四军医大学博士学位论文TheeffectofColorDopplerultrasoundduringdifferentdurationsofpregnancyonoffspring's’brainfunctionsCandidateformaster:ZhouNingSupervisor:DuanYunyouDepartmentofultrasound,Tangduhospital,FourthMilitaryMedicalUniversity,Xi’an710038,ChinaAbstractObjectiveThesafetyofdiagnosticultrasoundisanarisingimportanttopicinmedicalresearch.Therefore,thepossibilityofdiagnosticCDUScausingadverseeffectsonfetalbrainfunctionsisanimportantbutlittle-studiedquestion.Mostresearchfocusesonthemolecularlevelorexaminesthebrain’smicrostructure,whileexperimentalstudiesonfunctionarealmostnonexistent.Theintentofthisstudyistobegintobridgethatgap.TheobjectiveofthisexperimentistostudytheeffectofcolorDopplerultrasound(CDUS)duringdifferentdurationsofpregnancyonoffspring’sbrainfunctionsandultrastructureofhippocampusinrats.MethodsPregnantSprague-Dawley(SD)ratswererandomlydividedintofourgroupsaccordingtotheexposuretime:controlgroup(0mingroup),10mingroup,20mingroupand30mingroup,andwereexposedtoultrasound(3.0MHz,MI=1.6,Tis=1.8)differentlyon6th,12th,and18thdaysofgestation.Ineachgroup,neonatalratswereselectedtoopenfieldtestforlocomotionactivityandthentoMorriswatermazetestforlearningandmemoryabilitiesatninetydaysold.Thenmorphologyofhippocampuswasobservedbytransmission-4- 第四军医大学博士学位论文electronmicroscope.ResultsIntheopenfieldtest,tothetotaldistance，averagevelocity，activity，centraldistanceandcentraltime，therewerenodifferencesbetweenthe10mingroup,20mingroup,30minandthecontrolgroup（P>0.05）.IntheMorriswatermazetest,theescapelatenciesofratsin30mingroup(21.96±5.29)weresignificantlylongerthanthoseofthecontrolgroup(10.78±3.89)(P<0.05),theratiooftimespentinthetargetquadrantin30mingroup(27.89％±2.14％）weresignificantlylowerthanthatofthecontrolgroup（37.42%±2.37％）;andtherewerenosignificantdifferencesbetweenthe10mingroup（9.98±2.12，37.42％±1.89％）,20min（12.23±2.56，34.11％±2.65％）andthecontrol(10.78±3.89,37.42%±2.37％)group（P>0.05）.Totheultrastructure,therewerenodifferencesbetweentheexposedgroupandthecontrolgroup.ConclusionsColorDopplerultrasoundduringdifferentdurationsofpregnancydoesn'thaveanyeffectonoffspring'locomotionactivity.Whilethirty-minexposurestoCDUSinuteroduringdifferentdurationsofpregnancycouldadverselyaffectthelearningandmemorizingabilityoftheratoffspring,andthe10minexposureshadnodemonstrableeffect.Keywords：ColorDopplerultrasound;Rats;Openfieldtest；Locomotionactivity;Morriswatermaze；Learning，Memorizing；Ultrastructure-5- 第四军医大学博士学位论文前言超声诊断法在妇产科方面广泛应用，成为无法替代的影像学检查方法。超声不仅可以诊断早孕，而且可对胚胎、胎儿发育以及卵泡发育和排卵进行监测，临床应用日益广泛。而超声波作为一种形式的能量，必然存在能量的安全阈值问题。至今国际上还未建立起一个严格的科学标准意义上的安全剂量，因此医学超声诊断的安全性仍是人们所关注的重要课题。尤其彩色多普勒超声已经成为产科检查的常规手段，在疾病诊断、胎儿发育及脑动力学监测方面具有重要意义。发育中的胎儿中枢神经系统对超声非常敏感，孕期超声照射对子代脑功能是否有影响，这一问题长久受到普遍关注，而又是悬而未决的课题，已有20项流行病学调查资料表明孕期超声检查可能对子代脑高级功能存在潜在影响，近几年也有研究表明孕晚期超声辐照可对仔鼠的学习记忆能力产生影响，因而使人们对超声产科应用的安全性问题产生质疑，但目前缺乏系统性研究，因此远未能得出令人信服的结论。本实验根据临床超声产科应用的实际声场条件，对不同孕期的胎鼠分别予以不同时间的彩超照射，并观察仔鼠出生后是否有神经行为学变化，揭示不同剂量的彩超照射对子代脑功能的影响及可逆性，从而为彩超在产科的安全应用提供具有临床价值的实验依据。90年代以来，新的检查技术不断出现，超声探头的输出能量大幅度提高，二维增加了6倍，彩超增加了3倍，与此同时，超声的产科应用更为普[1]及，早期化、多次化的现象也较常见，因此，超声产科应用的安全性迫切需要系统的重新评价。国内外很多学者已经做了大量动物实验，已有很多实验证明超声检查能引起脑组织细胞凋亡的变化，那么就有可能影响到脑的整体功能。Barnett等[2]提出，不同组织对超声的敏感性是不同的，分化活跃的胎儿中枢神经系统[3]更易受到干扰。Jacques认为，胚胎体温超过41℃持续5分钟以上被认为-6- 第四军医大学博士学位论文是有害的；超声检查，尤其是彩色多普勒超声，引起孕妇体温升高可能导致胚胎的损伤。文献报道超声可引起胎脑组织温度升高，引起胎脑损伤的潜在[4]危险需特别注意。而且我国学者利用计划生育的条件对人体胚胎组织做了一定的观测，尽管科研人员在活体动物及人体胚胎上发现较长时间超声照射可能会引起超微结构及分子生物学的改变，但是由于受到伦理学的限制，相关科研颇为有限，对脑与功能的研究尚未见报道，这些超声引起的改变是否能导致胎儿行为学的异常，我们不得而知，这是人体胚胎研究上的一个无法逾越的障碍。虽有一系列超声宫内安全性流行病学研究，指出虽然在一些研究中观察到出生时低体重、说活迟、左力手增多等情况，但只有出生时低体重重复性较好；可见，孕期超声检查的潜在副作用还需要进一步确证，以往的流行病学调查均采用回顾性群组研究，此研究的先决条件是过去的有关暴露信息与发病之间的记录必须完整，而这些研究资料的声场参数、照射时间等重要因素远不够详实可靠，这就大大增加了偏倚的产生，故而也就降低了这些流行病学研究的可靠性。同时流行病学研究中还要注意排除混合变量的影响，如人群选择、医疗情况、产科危险因素等，还要测量输出声能、描述超声检查的时间、次数及所处的孕期等。综合以上的分析，流行病学的临床回顾性研究无法准确定量彩超检查的详细声场参数和具体的检查时间，直接针对人体胚胎组织的研究，又无法知晓对胎儿神经行为学的最终影响。而开场实验和MWM实验均为脑功能行为学方面经典，且较为客观真实的评价方法。在本课题中我们选取孕鼠为研究对象，模拟人体检查的时间和剂量，对不同孕龄胎鼠给与不同时间的彩超照射，用OF实验和Morris水迷宫的方法，观察仔鼠出生后是否具有神经行为的变化，同时观察形态学上大脑神经细胞的变化，有望阐明超声产科应用的安全性以及超声脑损伤机制，从而为彩超产科应用的安全性提供系统的、有价值的实验依据。-7- 第四军医大学博士学位论文文献回顾[5]20世纪70年代中期，Carstensen等发现诊断用超声照射可引起果蝇幼虫死亡，从而揭开了诊断用超声安全性研究的序幕。诊断用超声的安全性研究是超声应用基础研究的一大热点，其核心是研究超声照射对胚胎的安全性。国内外学者们为了解答这一课题付出了巨大的努力，虽然目前还不能对这一课题做出确切回答，但却为超声安全应用及超声安全性这一课题的最终解答提供了有益的信息。以下是对既往超声安全性研究做出的回顾，同时介绍OF实验及Morris水迷宫在动物脑功能方面研究的应用以及动物的学习记忆功能与海马的关系。1超声生物效应的可能机制及实验依据超声波作为诊断学的基础在于它的二重物理属性，即：波动属性和能量属性。当超声波通过人体时，波动属性为探查与负载信息的载体，使超声波成为一种影像诊断的方法，达到了诊断的目的；而能量属性使超声波成为一种形式的能量，与其他形式的能量一样，作用于人体组织，通过与生物媒质的相互作用，引起生物体系的功能和结构的变化，产生超声生物效应。当超声波超过一定的剂量时，也必然会对生物体产生危害。1970年Macintosh和Davey发现诊断超声可使人白细胞染色体畸变。这提醒人们，超声可能对生物体存在潜在的危险性，由此引发了一系列的安全性研究。超声引起生物体结构或功能的变化即生物学效应，与由声强和辐照时间决定的超声剂量有关。现代超声诊断仪理论上可能通过热效应、机械效应和空化效应对生物体产生作用，以下分述这几种机制的相关研究。1.1热效应超声是一种机械压力波，在机体组织内传播的过程中，部分声能被吸收后转化为热能，从而引起组织温度升高。Koch认为现代超声诊断仪穿透力增-8- 第四军医大学博士学位论文[6][7]强，组织吸收超声后产生的温升足以引起潜在的有害效应。Barnett等提出B型超声不会引起明显的组织温升，脉冲多普勒超声有引起组织温升的潜在可能，特别是当其作用在骨和软组织界面时，引起组织温升的可能性更大；频谱多普勒技术对组织的检查是定点高声能，远比B型超声及彩色多普勒超声强，作用在骨和软组织界面容易引起明显的温升，如果引起检查部位组织温度超过41°C持续5min以上，则有可能引起潜在损伤，频谱多普勒超声对[8]感兴趣区检查时应当注意这个问题。[9]22Suresh等用3.5MHz，声强65mW，Isptp1W/cm，Isata240W/cm诊断超声对孕14d大鼠持续照射，记录孕鼠阴道温度、小鼠出生6W后的生理反射及死亡率、4个月及1岁时的运动能力及学习记忆功能，结果发现，照射20min以上，孕鼠阴道温度升高，但是小鼠生理反射及死亡率没有变化；持续照射10min，可引起仔鼠运动及学习记忆功能的变化，且随照射时间延[10]2长变化更趋明显。Horder等用3.5MHz、声输出功率240mW、Ispta2.8W/cm的超声照射豚鼠胎儿，观察活体状态和死亡后蝶骨附近的温升以及对胎儿心率的影响，结果发现活体状态下温升为1.5°C，死亡后温升为2.0°C，血流有[11]一定的降温作用。Doody等用微测温技术测量了脉冲多普勒超声照射胎龄14W到29W所引起的胎儿椎骨的温升，在295s照射时间内，引起小孕龄胎儿椎骨温升为0.6°C，引起大孕龄胎儿椎骨温升为1.8°C，照射第一分钟内的[12]温升约占总温升的70%；Barnett认为，中枢神经系统对热和超声等物理因子引起的损伤非常敏感，脉冲多普勒超声检查过程中要保持声束静止并且采用相对较高的强度，这样就会引起生物组织较高的温升，在进行胎儿脑血管频谱多普勒研究时，就有可能引起胎儿损伤。[13]生物体对超声热效应有一定的防护机制。Silverman等用高频超声（50MHz）进行眼球前节的检查，探头的输出功率高于临床常规应用条件4-5倍，用此探头照射兔眼30min，照射后即刻及24h后光镜检查未发现角膜损害，局部组织温升不超过1°C，认为这种情况与眼球散热面积相对较大以及房水-9- 第四军医大学博士学位论文[14]循环引起的降温作用有关；Duggan等用3.5MHz，脉冲重复频率8KHz的固定稳态脉冲多普勒超声照射新生猪脑，照射条件分别为：窄带（束宽0.3cm,22-6db），Ispta1.4W/cm；宽带（束宽1.6cm,-6db），Ispta3.6W/cm，照射时间为90s，按照血流状态的不同分为基态（正常血碳酸及血氧状态）、血流增加状态（高血碳酸及血氧状态）及缺血状态（死亡后），用放射标记微球技术测量血流；在窄带超声照射下，三种状态下的温升没有显著差异，平均温升为1.5°C；在宽带超声照射条件下，三种状态下的温升有显著差异，温升分别为基态1.9°C，血流增加状态1.7°C,死后温升为2.4℃。提示血流能缓解超声引起的组织温升。[15]Miller等认为，超声对哺乳动物的热效应与组织的温升程度及温升持续时间有关。人的体温正常时恒定在36.5-37.5ºC,当体温低于39ºC时，未发现超声对哺乳动物产生生物效应。已有的超声热效应报告，实验动物的基础体温都高于人的体温，因此，把这些结果外推到人应持谨慎态度。研究表[16]明，热是一种致畸因素。文献报道热可以导致流产、神经管缺陷、无眼畸形、白内障、心脏畸形、唇裂、腭裂，脊柱、椎骨、牙齿等发育缺陷。超声是一种局部作用，而热致畸实验的文献多是一些全身发热的结果；人和动物的核心温度及对高温的耐受能力都是不同的。但是，不能排除超声热效应对胎儿的潜在损伤，尤其是超声在骨和软组织界面可以引起更大的温升，随胎龄增大，胎儿骨化增快，在孕晚期，超声可能会引起较大的温升，可能会对脑、骨髓等构成影响。超声的热效应有利的一面是目前为肿瘤的局部治疗提供了一条崭新的[17]途径，开创了一种新的治疗方法。Krantz和Beck最先于1939年报告了每[18]秒300kHz频率的超声可产生热效应，从此开始了超声治疗的研究。Lynn在1942年报道高强度聚焦超声（high-intensityfocusedultrasound，HIFU）定位作用于实验动物的中枢神经系统并观察了其生物学效应，发现其具有破[19]坏组织的效应。1961年，Hickey等首次用HIFU对5例晚期乳腺癌患者进-10- 第四军医大学博士学位论文行脑垂体的破坏术，作为晚期乳腺癌的辅助治疗。HIFU逐渐得以发展并被尝试用于肿瘤的治疗中。体外HIFU治疗仪治疗体内深部肿瘤已成为人们关注的一个新热点。1.2机械效应超声机械效应涉及到声辐射张力、声射力矩及声场微流等，声辐射张力可能是其中最重要的因素。当超声作用于体内界面，如水界面、骨和软组织界面、组织和气体界面时，会产生一种将组织推离声束的力量，称为声辐射张力。这种力量很小，理论上不会对晚孕胎儿及成人组织构成损伤，但是，在胎儿发育早期细胞间基质尚未形成、特别是在组织分化迁徙的过程中，这[20][21]种力很可能是一种潜在的损伤因素。Dalecki等将声反射器直接安装在蛙心表面，实验性排除了热效应和空化作用，通过调节超声频率和声束宽度改变声辐射张力，观察了超声对蛙心的影响，研究表明主动脉压力降低的程[22]度与声辐射张力成正比；Nightingale等在临床超声检查时观察到，在超声作用下，乳腺囊性病变中有微弱的液体流动，并利用此现象鉴别囊实性病变；[23]Pohl等发现在超声作用下，脂质双分子层局部变薄，渗透性增高；Dalecki[24]等用超声照射孕鼠，在胎鼠骨、软骨和软组织界面发现出血。这些现象都认为是声辐射张力作用的结果。在声辐射力作用下，会产生声场微流，引起液体移位，微流边界会产生剪切力，但相关研究表明这种剪切力未能引起悬[25]液中的细胞损伤。近年来出现的剪力波弹性显像技术是利用超声对组织的剪切力产生的剪切模量来成像的新技术，可以显示组织的粘弹特性，预期有广阔的临床应用价值，其输出功率比多普勒模式小，但其安全性的评价资料[26]还相当匮乏。声场微流是指介质中的质点在声波作用下产生的位移，认为[27][28][29]可引起细胞跨膜转运能力变化，并可导致红细胞聚集。Salz等研究了超声对Wistar大鼠孤立心肌细胞收缩的影响，发现10MHz超声可引起刺激阈值的降低，低频超声不能引起这种变化，认为声场微流可能是刺激阈值漂移的原因。声射力矩是指声波遇到悬浮物体时，由于声射张力而产生扭转的现-11- 第四军医大学博士学位论文象，目前尚无证据表明超声生物效应与此物理现象有直接关系。1.3空化效应超声是一种压力波，空化气泡来源于已有气体存在的情况或者在组织的薄弱点，超声引起空化的阈值与超声频率及脉冲长度有关，与作用时间无关，气泡在超声作用下，可能发生瞬态空化和稳态空化。瞬态空化可以引起[30]机械、高温以及声化学产物损伤，而稳态空化似乎没有损伤作用。空化效应产生的前提条件是微气泡的存在，研究表明，在界面张力极低的情况下，组织内局部区域可能自发产生足够大的气泡成为空化核，如果没有声波或其他机械压力，这些空化核很快融解消失。但是在有声波作用的条件下，这些微气泡能比其初始态增大很多倍，而后突发破裂，即发生瞬态空化。Church[31]等以生物组织是同质液体为前提假设，研究了体内空化过程的能量学及动力学，发现负压下的液体是亚稳态的，当压力上升到与气体平衡压相等时，气泡就会自发形成，即成核。成核率依赖于负压幅度、液体表面张力以及温度三者的相互关系。另有研究表明，空化微泡可能在已有气体存在的部位或组织软弱的部位产生，仅当超过阈值负压时，才会产生空化作用。空化作用[32]随频率增高、波长减小而增加，且与作用时间无关。Holland等用4MHz诊断用脉冲多普勒超声和彩色多普勒超声（MI0.8-1.6）照射新生鼠，用活性空化探测仪证实了诊断用超声可以引起动物组织发生声学空化，同时观察到超声照射后，新生鼠出现肺出血；还有学者认为，由于空化核存在的时间极短，即使没有发现明确的空化核，也不能排除空化现象的存在。与空化效应联系在一起的主要是小动物组织出血，溶血现象和声化学产物引起的损伤，目前主要关注的是出血和溶血反应。在新生鼠、成年鼠、猪、兔等动物实验时，观察到超声照射可以引起上述动物肺、小肠毛细血管红细[33-37]胞析出。诊断用脉冲超声可引起胸膜下肺出血的先决条件是有肺通气，胸膜下出血的阈值与超声频率及肺泡大小有一定的关系，尚未见引起胎肺、人肺出血-12- 第四军医大学博士学位论文的报道，小哺乳动物存在的胸膜较薄等组织薄弱因素可能与其对超声的高敏[38][39]性有关。Penny等报道，肺毛细血管出血是在超声暴露后即刻出现的，照射后即刻和照射后5min取材的结果显示出血面积无差异，照射后1W和12W再进行光镜及电镜观察，发现损伤已完全消失，说明超声引起的组织出血[40]是一种短暂可复的效应。Dalecki等用0.7、1.1、2.4和3.6MHz的超声照射大鼠腹部，每只大鼠照射4-5个区域，每个点照射5min，引起肠道瘀点和4mm大小的肠道出血区，低频超声引起的损伤比高频超声大；用峰值负压为10MPa的超声照射孕18d大鼠，所有大鼠肠道出现数厘米大小的出血区，43只胎鼠中只有一只出现小于1mm的出血点，胎鼠肠道理论上不含气体，大鼠与胎鼠肠道对超声反应的差异提示肠出血效应可能由空化作用引起。Milier等[41-42]用频率1.035MHz、峰值负压0.4-0.57MPa非聚焦超声照射放入温控水箱中的大鼠2min，肠道出现瘀点，出血点主要集中在粘膜固有层；当水温从32°C升到42°C，瘀点增多。10.35MHz的射频波可引起相同变化，热电偶测温发现出血处局部温度达42-43°C，认为超声引起肠道瘀血点是热效应所致；将水箱中的大鼠暴露于400KHz超声，水温37°C，在同样声强暴露条件下，脉冲波可以起瘀点减少而出血增加，水温升高可引起瘀点明显增加及出血程度的轻度增加，这说明热效应和空化效应对肠道的作用可能是相互独立的。[43]Dalecki等用腔内超声碎石仪照射大鼠，超声峰值压力为3.6MPa，注射超声造影剂的大鼠比未注射组肠道等组织出血的比例明显升高，超声负压比正[44,45]压更容易引起出血。Miller等在大鼠注射造影剂后，立即用2.5MHz超声照射，15min后观察肠道及腹部肌肉，发现超声峰值压力0.64MPa以上可引起腹部肌肉瘀血，1.0MPa以上可引起肠道瘀血；如果照射时间推迟5min，则与未注射造影剂组无显著差异；进一步研究发现，注射超声造影剂Albunex，不同频率的超声引起大鼠肠道出血的峰值负压阈值不同，高频超[46]声较低频阈值高，注射造影剂组比未注射造影剂组更易出血。Dalecki等分别用1.15MHz、2.35MHz超声照射鼠心脏5min，照射后心脏穿刺抽血检查-13- 第四军医大学博士学位论文血浆血红蛋白含量，加入造影剂Albunex组血浆血红蛋白含量较对照组明显[47]增加，说明引起溶血。Miller等研究了超声对人胎血与成人血所致溶血反应的差异，所用超声最大正压为4.8MPa，最大负压为2.7MPa，暴露时间为60-200S，不用造影剂，两者溶血反应无差异，使用造影剂，胎血溶血反应[48]加重，溶血反应强度与红细胞平均容积相关。但Suhr等用2.5-6.5MHz脉冲多普勒超声，照射体外培养的红细胞30min，未能引起声化学反应产物增加，未能引起红细胞破坏及血红蛋白释放，未能引起光镜及电镜下结构的变化。[49]张彩霞等用超声照射体外培养的L-929细胞株，随超声剂量的增加，细胞有增殖趋势，细胞DNA含量增加，多次照射还能引起细胞核面积增大；超声照射可引起细胞超微结构的微小变化，多次照射可引起细胞超微结构的较明显变化。用诊断超声照射离体细胞，发现超声照射可引起DNA断裂、嘌呤、嘧啶堆积，自由基水平的升高，认为是超声空化作用产生自由基，进一步损[50，51]伤DNA。2超声生物效应动物实验研究在以上超声生物效应的物理机制回顾中，已经提到了超声对部分组织、细胞的影响，在此，对这些实验研究做系统性总结回顾。2.1动物组织2.1.1脑组织哺乳动物的组织对超声有不同的敏感性，胚胎分化活跃的组织和胎儿的中枢神经系统最易受到干扰。孕期超声照射超过90秒，可以产生明显的组织升温，包围在骨内的处于发育期的脑组织更为敏感，就有可能受损。有报[52]道称接受超声检查，可能使颅骨下的脑组织因组织升温而造成影响。还有研究表明，中枢神经系统对热和超声等物理因子特别敏感，胚胎及胎儿脑组[53][54]织温升达4℃，持续5min以上可引起脑组织不可复性损伤。Beckett等用20KHz的超声辐照小鼠，发现脑组织中许多区域呈现浓密的即刻早期基因[55]（c-fos）蛋白的表达；孟素云等用诊断超声(5.0MHz，输出功率1.1mW，-14- 第四军医大学博士学位论文2Isata4.7mW/cm)照射孕14d大鼠子宫体表投影区，照射30min组胎鼠脑海马区可见有群集分布，着色深的FOS蛋白强阳性标记的神经细胞，认为诊断超声辐照孕鼠超过30min，可致胎鼠海马区神经元c-fos基因激活，其表达产[56，57]物FOS蛋白增加，表明超声照射对胎鼠中枢神经元构成刺激。程颜苓等用3.5MHz，MI1.7，TI0.9彩超照射孕18d胎鼠，发现彩超照射20min以上，海马神经元Fos蛋白表达增加，进一步研究发现，彩超照射20min以上，胎鼠脑组织凋亡细胞明显增多。辐照30min组胎鼠辐照30min组胎鼠脑神经元体积缩小,胞浆内有大量空泡,线粒体、内质网、高尔基体等基本正常,结构完整清晰,细胞核呈高电子密度,染色体向核膜靠拢聚集成块状或环状。赵晶[58]等用诊断剂量彩超照射孕16天SD大鼠子宫体表投影区，按照射次数分为单次照射和重复照射两大组，重复照射组为首次照射间隔48h后，相同声场条件下再照射一次；以上两大组再按每次照射时限的不同各自划分为照射10min组、20min组、30min组及对照组，各组于既定时间照射后24h取胎鼠脑组织标本，免疫组化方法检测P53蛋白的表达，透射电镜观察超微结构的变化.结果照射10min时：单次照射组、重复照射组P53蛋白表达与对照组无显著差异(P＞0.05)超微结构亦未见明显异常.照射20min、30min时：单次照射组及重复照射组P53蛋白表达均增强，与对照组有显著差异(P<0.05)；且重复照射组与单次照射组之间也有显著性差异(P<0.05)。电镜观察见神经元染色质浓缩边集、线粒体肿胀变性及神经元突起肿胀变性，重复照射30min组表现最为明显且伴有血管内皮细胞的超微结构改变，得出结论：晚孕期彩超照射SD大鼠子宫投影区超过20min，胎鼠大脑皮层神经元p53表达增加，超微结构出现改变；相同照射时限内重复照射对胎鼠脑组织p53表达及超微结[59]构的改变明显高于单次照射。Hynynen等用3.5-17.5W的超声照射兔脑，对4-5个部位分别用不同剂量超声照射，然后在不同时间点用温敏型核磁共振观察兔脑组织的温度变化，并进行组织学观察，结果发现，超声照射可引起脑组织温度升高，但未能观察到组织学损害。-15- 第四军医大学博士学位论文2.1.2动物神经行为及畸形学研究[60]22Jensh等用5.0MHz超声（Isptp500W/cm，Isppa100W/cm，Ispta2422mW/cm，Im230W/cm）照射孕5d、17d、19d的孕鼠，仔鼠的多项生理反[61]射指标与假辐照组无显著差异。Ramnarine等用1-4MHz的超声照射胎龄29.5d的胎鼠30min，48h后观察，在环境温度37℃、Ispta低于4W/cm或峰值负压低于1.9MPa条件下，没有观察到明显的生物效应；在更高的声能水平，[62]死胎数及畸胎数增多，头尾屈曲畸形及头部发育畸形最为常见。O'Brien等22用7.5MHz超声(Ispta27mW/cm，Isppa85W/cm)照射怀孕的恒河猴，孕20-35d每周照射5次，孕36-60d每周照射3次，每次照射10min；孕60-150d每周照射1次，每次照射20min，结果发现，幼猴出生后暂时性体重降低，白细胞减少，骨髓抽取物检查未发现明确异常，肌张力减退；重复实验验证了[63]出生时低体重及白细胞减少，但肌张力减退未能得到验证。Carnes等用2Ispta1-10W/cm的连续波超声照射孕9d、12d、15d的孕鼠，发现死胎数及224产后幼仔死亡数增多；当It≥1125Ws/cm时，新生鼠数目明显减少；各照射组幼仔出生体重明显降低，雄性小鼠睾丸变小，精子数目减少9-36％。Hande[64]2等用3.5MHz超声（Isata40mW/cm）重复照射孕6.5d和11.5d的胎鼠10min，发现仔鼠死亡率明显升高，运动能力、神经行为能力（包括学习、记忆力）下降，说明在胚胎器官发育阶段，孕鼠重复暴露于超声，则胎鼠脑功[65]能有可能受损。Devi等用同样剂量的超声照射妊娠14.5d的孕鼠，时间分别为10、20、30min，发现三组仔鼠的运动力、神经行为能力均比对照组明显下降；同时，怀孕早期超声暴露，会导致孕鼠脑功能障碍，表现为活动和[66]探究动作减少，学习能力降低。Vorhees等用3MHz，Ispta分别为0、2、10、220、30W/cm的连续波超声，在孕4-20d时每天照射CD大鼠10min，照射强2[67]度30W/cm组的仔鼠出现运动能力及学习记忆能力的变化。张振荣等用平2均声强为0.67mW/cm的超声照射孕5d的wistar大鼠，发现照射20min以上，可引起仔鼠体重、体格发育、神经反射、感觉和运动协调能力的明显变化。-16- 第四军医大学博士学位论文[68]Frizzell等用50MHz以下的低频超声照射出生24h内的新生鼠，引起新生鼠肺出血、后肢瘫痪。[69]周宁等对孕18d的SD大鼠分别给予10min，20min，30min的诊断剂量（3.0MHz,,MI=1.6,Tis=1.8）超声辐照，对照组进行假辐照。仔鼠出生后20d及60d进行Morris水迷宫行为测试，评价其学习记忆能力。结果发现30min组仔鼠在水迷宫测试中内环得分(0.1193±0.0810)及第Ⅰ象限游泳时间得分（0.5233±0.1375）与对照组(0.2128±0.0841,0.2312±0.1495)之间的差异具有显著性意义（P<0.05）,内环得分降低。而20分钟以下照射组与对照组的内环得分及第Ⅰ象限游泳时间得分差异无显著性意义（P>0.05）。说明诊断剂量的超声辐照孕鼠30min可对仔鼠的学习记忆能力产生影响。2.1.3其他组织[70-75]杜联芳等系统研究了超声照射对大鼠睾丸生殖细胞凋亡及其相关基因表达的影响。使用HP8000多普勒超声诊断仪，探头频率7.5MHz，输2出功率6.8mW，Isata3.4mW/cm，直接接触大鼠睾丸进行照射，24h后取睾丸组织，用免疫组织化学方法观察标本中Fas/FasL表达情况，发现超声辐照20min以上，Fas和FasL的表达率均明显增高，其表达率随辐照时间延长而增加；应用原位杂交技术检测P53及bcl-2mRNA表达改变，发现诊断超声辐照大鼠睾丸组织超过10min可引起凋亡诱导因子P53mRNA高表达,凋亡抑制因子bcl-2mRNA低表达；用彩色血流超声持续辐照不同年龄大鼠的睾丸组织30min，24h后取睾丸组织，观察标本中P53、bcl-2表达情况以及Fas和FasL的表达率，结果发现，各年龄组大鼠睾丸组织生精细胞同时表达P53和Bcl-2,随年龄增长P53蛋白表达有下降趋势,bcl-2蛋白表达有上升趋势；超声辐照后各组P53表达呈上升趋势,表现最明显，bcl-2表达呈下降趋势。各年龄组大鼠睾丸组织生精细胞同时表达Fas和FasL,其表达率随年龄增长有所增加，超声照射后各组Fas和FasL表达率均明显增高，照射时间超过30min引起Fas和FasL高表达；进一步研究发现，不同年龄组大鼠生精细胞均有不-17- 第四军医大学博士学位论文同程度的细胞凋亡,年轻组凋亡细胞最多,随年龄增长凋亡细胞有减少趋势；超声照射30min，各实验组凋亡细胞数均有显著增加。用彩色多普勒超声持续照射幼鼠睾丸30min，照射后不同时间取标本，用原位末端脱氧核糖核苷酸转移酶标记技术(TUNEL)检测上述各组细胞凋亡发生率，结果发现，照射后即刻，睾丸组织细胞凋亡率与对照组无差异，照射4h后凋亡细胞开始增加，12h继续增加，24h达高峰，48h开始下降，96h恢复至与对照组相同水[76、77]平。曹敏丽等应用EUB26黑白超声诊断仪，探头频率3.5MHz,超声输2出功率6.0mW，空间平均声强（Isata）为1.03mW/cm,分别予以5min、10min、20min、30min和60min的持续照射，7d后取其卵巢，检测bcl-2蛋白及c-fos的表达，结果表明：诊断超声照射大鼠卵巢10min内bcl-2呈低表达，而20min呈高表达，但随着照射时间的延长，30min后bcl-2表达阳性率随之减低，与照射时间呈负相关。高水平的bcl-2存在能维持细胞的存活，可抵制由于超声照射引起的细胞凋亡，但随着超声次数、时间的增加bcl-2抑制细胞凋亡的作用也随之减弱，卵巢细胞开始向凋亡的方向转化，该结果提示：bcl-2具有抑制因超声照射引起的细胞凋亡的作用。连续照射20min以上可促使c-fos蛋白的表达，表明连续照射20min以上对正常卵巢产生影响；持续照射大鼠卵巢20min以内c-fosmRNA表达呈阴性，与对照组无明显差异，持续照射30min后阳性表达增加，当照射60min后c-fosmRNA呈阳性表达明显高于[78]2其它组。陈文雪等用7.5MHz，功率3.9mW，Ispta13mW/cm超声持续辐照80-85d大鼠卵巢30min，于辐照后12h、24h、48h取材，输出功率2.02mW,Ispta7mW/cm持续辐照30min，辐照后24h取材，对照组为空照组。结果表明，对照组和各辐照组大鼠卵巢组织细胞凋亡率差异显著，12h细胞凋亡率增加，24h增加最多，48h细胞凋亡率下降；透射电镜观察到细胞凋亡的形态学改变：染色质致密，固缩聚集于细胞核核膜，呈境界分明的块状或新月形小体，细胞核裂解。认为诊断超声辐照大鼠卵巢可诱导细胞凋亡增加，但存在一定的可复性，且细胞凋亡率与超声输出功率呈正相关。他们又-18- 第四军医大学博士学位论文进一步研究了超声照射对大鼠输卵管组织细胞凋亡的影响，结果发现，7.52MHz（Ispta13mW/cm）诊断超声照射大鼠输卵管组织，照射时间超过30min[79]可引起细胞凋亡率明显升高。[80]Ryo等将含有两个细胞的鼠胚取出后置于特殊装置中，用频率1.8752MHz，Ispta2.96W/cm的脉冲超声照射，观察其发育成为囊胚的比率和囊胚摄取脱氧葡萄糖的能力，结果发现：照射1min组发育成囊胚的比率及囊胚摄取脱氧葡萄糖的能力与对照组无差异；照射5min组发育成囊胚的比率及囊胚摄取脱氧葡萄糖的能力均比对照组低，提示超声照射超过5min可引[81,82]起早孕组织活力降低。王锦惠等用频率3.5MHz，输出功率62.5mW，2Isata4.9mW/cm超声持续照射受孕6-7d的小鼠腹部子宫投影区，辐照时间分别为0min，5min，15min，30min，24h后取出早孕组织，琼脂糖凝胶电泳观察不同照射时间的DNA片段情况，电镜观察细胞超微结构的变化。结果显示：琼脂糖凝胶电泳除对照组外，其余3组均出现凋亡梯形，且随时间的延长，梯形越明显。电镜检查除对照组外，其余各组均可见不同程度的凋亡特征改变：细胞核变形，染色质稀疏；线粒体变形、肿胀、嵴模糊、消失、部分空泡化；内质网腔扩张，核糖体部分脱落；凋亡小体形成。他们又进一步研究了不同频率超声对小鼠早孕胚胎组织细胞凋亡影响，照射条件：频率3.5MHz、6.5MHz，输出功率分别为62.5mW、8.1mW，Isata分别为4.922mW/cm，3.34mW/cm，分别照射孕6-7d雌鼠0min、5min、15min、30min，24h后取出早孕组织，琼脂糖凝胶电泳观察DNA片段形成情况，结果显示：频率3.5MHz辐照5min以上各组均可以见明显的凋亡梯型，而频率为6.5MHz辐照15min以上才出现与前两组有差别的凋亡梯型，这可能与低频超声的发射功率大,因而在相同照射时间内其辐射剂量更大有关。[83,84]贾化平等用3.0MHz、热指数1.8，机械指数1.6彩色多普勒超声照射中孕大鼠子宫投影区20min以上可引起胎鼠小肠粘膜上皮细胞凋亡，30min以上可引起胎鼠心肌细胞凋亡增多，照射30min胎鼠心肌及小肠标本电-19- 第四军医大学博士学位论文镜检查发现核染色质浓缩、边集，内质网及线粒体肿胀等超微结构变化。贾化平等还对孕14天SD大鼠按彩超辐照时间不同随机等分为四组：对照组，照射10min组，照射20min组，照射30min组。采用Accuson公司Sequeoia-512型彩色电脑声像仪，照射条件：4V1探头，二维频率H3.0MHz，彩色频率3.0MHz，Tis=1.8，Micd=1.6。照射后24h取胎鼠小肠标本，结果发现：各鼢组光镜下观察均未见异常，TUNEL法检测结果，对照组与照射10min组胎鼠小肠上皮可见散在凋亡细胞,照射20min组及30min组凋亡细胞明显增多。照射20min组及30min组荧光强度与对照组组有显著差异，荧光强度与照射时间呈正相关(P＜0.01)，(r=0.571)。照射30min组标本电镜检查发现核染色质浓缩边集，内质网及线粒体肿胀等超微结构变化。说明：彩色多普勒超声照射孕鼠20min以上可引起胎鼠小肠粘膜上皮细胞凋亡。[85,86]周海燕等用彩超辐照孕14dSD大鼠子宫体表投影区，按照射时间不同分为对照组、照射10min组、20min组、30min组。仪器采用Acuson公司Sequoia-512型彩色电脑声像仪，照射条件：4V1探头，二维频率H3.0MHz，彩色频率3.0MHz，热指数(TI)=1.8，机械指数(MI)=1.6。各组于既定照射结束后24h取胎鼠肾脏标本，HE染色光镜下观察肾脏组织结构，免疫组化方法检测P53蛋白的表达，免疫组化ABC法检测肾脏bcl-2蛋白的表达。结果采用统计软件SPSS11.0行多组均数比较的方差分析，结果发现：光镜观察各组胎鼠肾脏组织均未见明显损伤；免疫组化法检测，各组胎鼠肾小管上皮细胞内可见均匀散在的胞核棕黄色淡染的P53蛋白阳性表达及bcl-2蛋白阳性表达。照射10min、20min组P53蛋白表达与对照组无显著差异(P＞0.05)；照射30min组P53蛋白及bcl-2表达增强，与对照组有显著差异(P＜0.05)。说明彩超辐照中孕期SD大鼠子宫投影区30min内，不会引起胎鼠肾脏明显的组织学损伤；照射30min，胎鼠肾脏P53蛋白表达增加及胎鼠肾小管上皮细胞bcl-2蛋白表达减少。[87]Stanton等用8MHz线阵探头照射大鼠腹部15min，4.5h后发现小肠上-20- 第四军医大学博士学位论文皮细胞有丝分裂相明显减少，凋亡小体的数目随时间延长而逐渐增多；张淑[88]梅等用脉冲超声每日照射家兔心前区10min，连续七次，声强分别为1.022222W/cm，1.75W/cm，2.0W/cm，2.25W/cm，2.5W/cm，对心电图无显著2[73]影响，但照射声强为2.5W/cm的家兔出现肌溶坏死灶。杜联芳等用HP-8500超声诊断仪，探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW，ISATA3.42mW/cm，探头直接接触出生后28-30d大鼠眼球，固定持续照射30min，12h后角膜凋亡细胞增加，24h达峰值，48h下降，说明超声引起角膜细胞凋亡是短暂可复的。3超声生物效应人胚胎组织研究3.1早孕绒毛组织[89]2Heffer-Lauc等用4MHz、Ispta59W/cm超声照射人体早孕子宫投影[90]区，引起人绒毛膜神经节甘脂和糖蛋白含量变化。Zur等用3.5MHz、输2出功率0.2mW/cm超声照射培养的羊水细胞30min，60min，120min，照射后1min、1h用3-H尿苷检测RNA合成的变化，发现照射后1minRNA含[91]量减少了53-75%，1h后恢复到正常水平。崔运河等用诊断超声照射孕6-8W拟行人工流产的胚胎，照射后1h内取绒毛组织检测，发现诊断剂量超声辐照20min以上，宫内绒毛组织丙二醛(MDA)含量随照射时间增加而升高，而超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-px)活性随照射时间增加而下降。辐照30min，7-10d后取绒毛检测，与对照组无差别，提示损伤[92]作用是可逆的；Zhang等研究发现超声照射早孕孕囊20min以上，绒毛膜[93]caspase-3活性增高，细胞色素C释放增多；黄凤华等用诊断超声照射早孕胎囊组织，24h后取绒毛组织,发现诊断超声照射10min以内，DNA单链断裂及双链断裂均无增加，照射20min以上，DNA单链断裂和双链断裂增加。[94-97]杜联芳等用彩色多普勒超声（探头频率7.5MHz，超声输出功率6.8mW，2Isata.4mW/cm）照射拟行人工流产的早孕(45-60d)孕囊，照射后24h取材，发现超声照射10min组绒毛滋养层细胞bcl-2蛋白表达率与对照组无差别,-21- 第四军医大学博士学位论文照射20min组和30min组滋养层细胞表达率明显减少；超声照射10min组绒毛滋养层细胞Fas/FasL蛋白表达率与对照组无差别，照射20min组和30min组滋养层细胞Fas/FasL蛋白表达率明显增加；超声照射10min组绒毛滋养层细胞p53mRNA和bcl-2mRNA表达率与对照组差异无显著性(P>0.05)，20min组和30min组滋养层细胞p53mRNA表达率明显增加，显著大于对照组和10min组；而bcl-2mRNA表达率却明显下降，显著低于对照组和10min组；持[98]续照射早孕孕囊组织超过10min可引起绒毛滋养层细胞凋亡。邓文慧等用3.5MHz诊断用B型超声持续照射6-8周的孕囊，照射后不同时间取绒毛组织，用流式细胞仪定量检测绒毛增殖细胞核抗原(PCNA)表达水平，结果显示：超声照射10min、24h后取材及照射20min，1h、4h、8h、16h、24h后取[99]材，绒毛PCNA表达水平与对照组无显著性差异。王彩凤等用3.0MHz、2Isata.17mW/cm超声照射早孕胚囊10min，用点杂交法检测DNA断链，未[100]发现超声照射引起绒毛细胞DNA损伤。霍丽蓉等用5MHz超声在人工流产前2h持续照射孕40-60d健康妇女宫内胚胎，人流后吸取、挑选绒毛组织，用流式细胞仪(FCM)分析凋亡发生情况，辐照5min组的凋亡峰明显高于对照组，辐照10min组的凋亡率更大；电子显微镜检查可见实验组细胞核固缩、染色质边集、内质网空泡化。3.2胎儿组织受到医学伦理的制约，直接针对胎儿组织的研究很少。现有研究多基于[101]我国计划生育政策的条件所做。Fatemi等研究了超声照射对宫内胎动的影[102]响，发现脉冲超声可引起胎动增加，认为超声对胎儿构成刺激。彭朗鸣等用诊断超声辐照孕8-12W宫内胎儿，24h后取胎儿角膜做透射电镜及组织化学研究，发现诊断超声辐照3min,胎儿角膜出现水肿，SDH活性下降，辐照20min,角膜组织结构明显损伤，SDH活性下降。[103-107]2冯则平等用诊断超声（3.5MHz,输出功率0.41mW/cm）辐照中孕宫内胎儿，观察胎儿不同组织超微结构的变化，发现辐照30min组心肌细胞-22- 第四军医大学博士学位论文核染色质细颗粒状分布稀少，胞浆中心肌纤维分布量少，线粒体嵴模糊，结构不清楚，部分胞浆区缺乏细胞器，细胞间隙增宽，靠近毛细血管的组织结构疏松；照射30min组腺垂体细胞核卵圆形，染色质分布不均匀，细胞核靠边，粗面内质网、溶酶体及线粒体分散，线粒体嵴模糊，细胞间隙增宽，毛细血管壁完整，内皮细胞五明显改变，近血管旁组织结构疏松有水肿现象；神经垂体细胞核较大，染色质较稀疏，细胞有大量无髓神经纤维，胞浆内线粒体稀少，靠近毛细血管旁的组织结构疏松，有水肿现象；照射30min可引起胎肾肾小球与肾小管细胞核染色质不规则稀疏，线粒体肿胀，嵴模糊，内质网稍扩张；发现男性胎儿睾丸精原细胞肿胀，女性胎儿卵巢卵母细胞肿胀，核染色质稀疏，线粒体肿胀，嵴模糊、消失、空泡变。4超声生物效应人类流行病学研究以往关于超声孕期安全性的研究多基于流行病学回顾性研究。Moore等[108]调查了1万名接受超声检查的孕妇及对照组500人，对其后代共2428名儿童进行随访，分析照射组及对照组儿童间染色体畸变、语言、听觉缺陷以及[109]发育畸形等的发生情况，结果显示两组间以上指标均无差异。Stark等的[110]一项调查发现孕期超声照射引起后代诵读困难。Newnham等进行了1400多人的流行病学调查，发现孕18W到38W做5次以上超声检查与孕期只做一[111]次超声检查相比，胎儿出现明显的宫内生长迟缓；.Campbell等对72例说话迟的小孩进行了回顾性配对研究，这些孩子在发音清晰度与语言理解、构词、语言记忆等方面都与其他孩子有差异，调查发现于其母亲在孕期接受超声检查的次数是对照组的2倍以上。还有学者用病例对照的方法研究了孕期超声检查和儿童癌症患病率的关系，结果表明，孕期超声检查与儿童癌症患[112][113]病率无关。Naumburg等作的一项前瞻性对照研究，没有发现淋巴星及[114]髓样白血病与超声检查时间及次数间有任何关联。Kieler等采用问卷形式跟踪调查了4637名中孕早期做过B型超声检查者其后代的视力、听力、身高、[115]体重，没有发现差异。崔运河等对1568例婴儿的出生时身高、体重与母-23- 第四军医大学博士学位论文亲孕期B型超声检查史进行调查,简单相关分析显示婴儿体重与母亲B型超声检查呈正相关关系,多元逐步回归分析，婴儿身高、体重与母亲孕期B型超声检查无关，认为孕期诊断用B型超声检查对胎儿发育无明显影响；Kieler等[116,117]还采用问卷形式跟踪调查了4637名中孕早期做过B型超声检查者其后代说话迟、运动发育迟的发生情况，没有差别；其后代的利手、利脚，发现[118]总体上无差别，进一步分析，发现男孩左利手比例增高。Salvesen等对2161名8-9岁儿童的母亲进行随访，通过对约10个问题的回答来确定其子女使用正利手的情况，meta分析发现孕期进行常规超声检查组的后代男孩中左利手的比例高于对照组。[119]Abramowicz等分析了超声检查与出生后左利手的流行病学资料，指出了它们在实验设计方面存在的缺陷，主要是声场参数不明确，人群选择不合理，观察指标欠妥当等，认为超声检查引起左利手增多上需进一步确证，否则不能说明超声对脑功能构成影响，因为表征脑功能的其他指标并没有差[120]异。Salvesen分析了超声照射引起左利手增多的文献，认为从总体上来讲，存在许多偏倚因素和统计方法的不当应用，尤为重要的是，作者提出，左利手在正常人群众有一定比例，同时左利手也有病理性及生理性之分，并且在研究中不能仅凭用手习惯变化这一个因素来判断超声照射对胎儿脑功能的[121]影响，要多种指标综合分析。Salvesen回顾了超声生物效应研究的流行病学研究，分析了孕期超声照射与出生时体重、神经发育和诵读困难、儿童恶性肿瘤、左利手、语言能力等方面的资料，认为目前的流行病学资料尚不能[122]证明孕期超声照射会对后代构成确定影响。Ziskin总结一系列超声宫内安全性流行病学研究，包括病例对照研究、前瞻性随机对照研究等，指出虽然在一些研究中观察到出生时低体重、说活迟、左力手增多等情况，但只有出生时低体重重复性较好；可见，孕期超声检查的潜在副作用还需要进一步确证，流行病学研究中要注意排除混合变量的影响，如人群选择、医疗情况、产科危险因素等，还要测量输出声能、描述超声检查的时间、次数及所处的-24- 第四军医大学博士学位论文[123]孕期等。5OF实验在评价自发活动的应用自发活动是评价动物是否抑郁的重要指标之一,它的减少,即表明动物可能处于行为性抑郁状态。开场实验主要是检测大鼠在新异环境中的活动度、兴奋性、探究行为、紧张恐惧状态和对新环境的警觉性，早在20世纪[124]70年代就被用于评价动物的焦虑心理。自发活动（openfieldtest）开场实验、旷场实验、自主活动视频分析系统是观察研究实验动物神经精神变化、进入开阔环境后的各种行为，例如动物对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域活动，在中央区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，也可观察由此而产生的焦虑心理。应用领域包括：戒毒学、药理学、毒理学、学习记忆/老年痴呆、新药开发/筛选/评价、预防医学、神经生物学、动物心理学、行为生物学等多个学科的科学研究和计算机辅助教学。[125]通常用于评价慢性应激对精神神经系统的影响。其特点：最多可支持16只动物同时实验。创新的遥控启动、关闭功能，分析时间更可靠。采用视频摄像跟踪技术，实现了实验过程的自动化，避免了人工计数引入的主观误差和对实验动物的干扰，增加实验结果的真实可靠性。该装置具有领先的核心算法，有效保证识别的抗干扰性和准确性。且可定时录制视频图像，以多种方式显示指标，提供轨迹图、轨迹坐标点和指标结果的导出功能。可在光线暗淡的条件下进行视频分析对动物的干扰更小，昏暗条件更加符合啮齿类动物的生活习性。该系统可提供指标以下多种指标：观察时间、总路程（总活动度）、平均速度、休息时间、活动时间、线性度、区域分布指标（四边、角、四周、中央的活动情况）、运动轨迹图等。实验者可根据需求选取不同的参数进行统计，目前较为有意义的、常用的指标包括：总路程、平均速度、活动度、中央路程、中央时间。这主要是根据大鼠在进入新的开阔环境后其心理变化而选取，大鼠具有对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域-25- 第四军医大学博士学位论文活动，在中央区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的特点。6Morris水迷宫在评价学习、记忆能力的应用Morris水迷宫是英国心理学家Morris于20世纪80年代初设计并应用于[126]学习记忆脑机制研究的。它包括一个盛有水的圆形水池、隐藏在水面下的平台以及一套图象自动采集和处理系统(摄像机、录像机、显示器和分析软件等)。此后,该迷宫系统被广泛运用在神经生物学领域的基础和应用研究中,实验动物主要是大鼠。较为经典的Morris水迷宫测试程序主要包括定位航行试验和空间探索试验两个部分。其中定位航行试验(placenavigation)历时数天,每天将大鼠面向池壁分别从4个入水点放入水中若干次,记录其寻找到隐藏在水面下平台的时间(逃避潜伏期,escapelatency)。空间探索试验(spatialprobe)是在定位航行试验后去除平台,然后任选一个入水点将大鼠放入水池中,记录其在一定时间内的游泳轨迹,考察大鼠对原平台的记忆。实验可供分析的参数较多,包括逃避潜伏期、各象限游泳距离、目标象限游泳距离与总距离之比、目标象限游泳时间与总时间之比、平台偏离角、40cm穿环时间、跨平台次数以及内、中、外环游泳距离百分比等。具体选择哪种参数可根据具体的实验来选择误差最小的。在Morris水迷宫测试中,实验环境对结果影响较大的主要是迷宫周围的物品甚至挂物所提供的空间线索必须保持固定不变,即认知的“参照系”要一致。这里面最容易被忽视的是实验者在实验过程中所处的位置,因为实验者如果在实验动物视野之内的话,也就自然成了实验动物所记忆的参照物之一。假如在实验过程中,实验者经常变换位置或不停地走动,对实验结果自然会有较大的影响。其次,在我们的实验中还观察到,迷宫的水温也是影响实验动物的“逃避动机”进而影响实验结果的重要因素。一般要求,水温应该略低,而且在实验期间应尽量保持恒定。另外,在实验过程中保持安静及光线的一致也是很重要的。除此之外,很多研究者还强调应该在迷宫的水中加入墨汁等使之浑浊,-26- 第四军医大学博士学位论文以帮助隐藏水面下的平台。Morris水迷宫测试的周期往往根据实验要求来确定,一般为7～15ｄ。目前的主要问题是在定位航行试验中允许实验动物寻找平台的最大时限取多少(即最大潜伏期)合适。现在有的取120ｓ,有的取180ｓ,最近的文献报告则[127]以60ｓ居多。但究竟取多少合适,大都是实验者根据个人的经验来确定,[128]并无统计学的结果支持。据胡镜清初步统计结果显示,大鼠在60～120ｓ之间能够找到隐藏平台的次数差异大约只占其找到平台总次数的5%,这在统计学上,可以看作是“小概率事件”。也就是说,大鼠在60ｓ内找不到隐藏平台的话,再延长到120ｓ也很难找到。从这一点考虑,似乎最大潜伏期取60ｓ可以节约实验时间。但问题并非如此简单,由于在统计时,很多研究将最大潜伏期直接纳入统计,显然,最大潜伏期的不同将不可避免地影响统计结果。所以从统计学上了解不同的最大潜伏期到底对Morris水迷宫实验结果有多大的影响,如何避免因此带来的系统误差等问题尚有待进一步研究。本实验中我们选取60s作为一个周期。目前,Morris水迷宫主要应用在学习记忆的神经生物学机制探讨和神经药理(包括中药药理)的研究。与过去的水迷宫及跳台、避暗等检测工具相比,其主要的优点包括:能提供较多的实验参数,系统全面地考察实验动物空间认知加工的过程,客观地反映其认知水平;将实验动物的学习记忆障碍和感觉、运动缺陷等分离开来,减少它们对学习记忆过程检测的干扰;操作简便,数据误差较小。7海马神经元与学习记忆学习记忆是大脑最基本也是最重要的的高级神经功能之一，与学习记忆有关的结构已研究了一百多年，自从1957年Scoville报道了一位双侧内侧颞叶切除的病人出现了严重的近期记忆丧失后，神经科学家们开始相信不同的脑部结构在学习记忆过程中扮演着不同的角色，随后内侧颞叶系统（包括海马和相邻有关皮层）、前额叶、间脑、小脑及Meynert基底核等相继都被证-27- 第四军医大学博士学位论文实了参与学习记忆的过程。事实表明，学习和记忆在脑内有一定的功能定位。目前已知，与记忆功能有密切关系的脑内结构有大脑皮层联络区、海马及其邻近结构、杏仁核、丘脑和脑干网状结构等。7.1大脑皮层联络区：大脑皮层联络区是指感觉区、运动区以外的广大新皮层区，它接受来自多方面的信息，通过区内广泛的纤维联系，可对信息进行加工、处理，成为记忆的最后储存区域。破坏联络区的不同部分，可引起各种选择性的遗忘症(包括各种失语症和失用症，见后文)，而电刺激清醒的癫痫病人颞叶皮层外侧表面，能诱发对往事的回忆；刺激颞上回，病人似乎听到了以往曾听过的音乐演奏，甚至还似乎看到乐队的影像。顶叶皮层可能储存有关地点的影像记忆。额叶皮层在短时程记忆中起重要作用。7.2海马及其邻近结构：大量实验资料和临床观察表明，海马与学习记忆有关。如损伤海马、穹窿、下丘脑乳头体或乳头体丘脑束及其邻近结构，可引起近期记忆功能的丧失。目前认为，与近期记忆有关的神经结构是海马回路(hippocampalcircuit)：诲马通过穹隆与下丘脑乳头体相连，再通过乳头体-丘脑束抵达丘脑前核，后者发出纤维投射到扣带回，扣带回则发出纤维又回到海马。7.3其他脑区：丘脑的损伤也可引起记忆丧失，但主要引起顺行性遗忘，而对已经形成的久远记忆影响较小。杏仁核参与和情绪有关的记忆，主要是通过对海马活动的控制而实现的。海马是学习记忆的关键结构，已知海马的中间神经元主要是抑制性的，它们在锥体细胞周围形成局部神经元回路，其末梢释放GABA。在中枢神经系统中，海马是与学习记忆和情绪、行为功能密切相关的重要脑区，海马发育是否完善，可直接影响到个体的生命和生活质量。海马脑区与空间学习记忆功能高度相关，水迷宫试验主要检测动物的空间学习记忆能力。在已有实验表明晚孕期超声照射30min可引起学习记忆能力受损的前提下，我们在本实验中也对仔鼠海马区的超微结构进行观察，以-28- 第四军医大学博士学位论文求证是否海马结构受到损害引起的学习记忆功能受到影响。8既往研究方法的不足及未来研究展望目前所用仪器探头频率、扫查途径不同，声强又有多个参数，如空间峰值时间平均值声强（ISPTA），空间峰值脉冲平均声强（ISPPA）、最大声强（IM）等为研究带来困难。因而有必要寻找一个安全阈值。美国食品和药物管理局推荐使用热指数和机械指数，要求超声诊断仪能够实时显示输出声能指标，必须在仪器屏幕上标明热指数（TI）和机械指数(MI)。它们虽然不是表征超声热效应和机械效应精确指标，但却是最实用和便于理解的估价超声检查潜在危险性的指标，超声生物效应研究应当给出所用检查条件的热指数和机械指数值。虽然在超声学中提出以机械指数（Medicalindex,MI)<1和热指数（Thermalindex,TI)<1为安全性参数，但仍需进一步完善。而且对产科诊断性超声的安全性做了一些研究，但至今未能从生物反应机理角度作出满意解释。超声生物学效应与剂量相关，基本上认为照射时间越长，声强越高，生物学效应越大。但不同孕期，不同剂量，单次或多次照射对胚胎胎儿有无影响及如何影响，有学者提出低剂量适应性反应来解释其不同孕期多次照射的结果，这其中多因素条件的影响及其机制有待于进一步研究，这将对毒理学和遗传学均有意义。[129]Barnett等认为，超声安全性的早期研究针对的大多是孤立的现象，一些效应重复性差，尚未得到公认；已基本确认的效应，其机制还不清楚；研究所用的暴露条件缺乏准确的剂量测定手段，使用的照射条件有很大差异，容易让人产生模糊印象。我们认为，人类流行病学研究和基于人胚胎组织的研究，研究过程中存在复杂的干扰因素，研究对象及对照的选择上存在诸多难以克服的偏倚因素，观察指标的选取也很困难，不好排除生活环境及诸多后天因素的影响；多数流行病学观察所用的照射条件与现在所使用的新的剂量标准有很大差距，实验中选用的声场参数混乱。基于伦理要求，对人体的照射时间受到限制，无法提示照射与效应的量效关系，这些因素严重影-29- 第四军医大学博士学位论文响了实验结果的信度。动物实验研究所选用的声场参数比较混乱，不少研究所用的声场条件与临床产科检查条件不符；研究还远不够系统，缺乏连续性；实验方法不够标准化，观察指标的选取欠妥当，尤其是对于脑功能的研究方[130]面缺乏客观的评价指标。欧洲放射防护委员会认为，解决超声安全性这一问题还得依靠体内及体外实验，目前资料表明，B型超声临床应用基本上可以认为是安全的，但是一些新技术的安全性有待进一步研究。以往的大量研究大多都是对动物细胞、组织的超微结构及分子学水平所开展的。而对于这些已经证实了的孕期彩超照射引起的细胞、组织的超微结构及分子学水平的改变，是否会造成子代脑功能方面的影响，目前的研究还都是流行病研究较为多。本实验就是志力于对此课题做系统性研究，并选用在脑功能评价上较为客观的OF实验及Morris水迷宫实验，为临床彩色多普勒超声的在产科的安全应用提供新的实验依据。-30- 第四军医大学博士学位论文正文实验一不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠自发活动的影响彩色多普勒超声已经成为产科检查的常规手段，在疾病诊断，胎儿发育及脑动力学检测方面具有重要意义。已有20项流行病学调查资料表明孕期超声检查可能对子代脑功能存在潜在影响，国内研究发现晚孕期诊断剂量彩色[131]超声照射30min即可引起仔鼠学习记忆能力的改变。但是超声是否还能影响其它脑功能，尤其是是否会引起子代心理情绪的变化，目前尚未见报道。自发活动是评价动物精神变化，尤其是是否抑郁的重要指标之一,它的减少,即表明动物可能处于行为性抑郁状态。为此,我们模拟孕期超声检查研究了诊断剂量彩色超声在不同孕期辐射对仔鼠自发活动的影响。1材料1.1动物模型制备健康性成熟SD大鼠75只(由第四军医大学实验动物中心提供)，其中雄性25只，雌性50只。将雌雄按2：1比例合笼后，次日起每日查阴栓及阴道涂片，镜检到活精子之日为受孕0天，并结合触摸孕囊，依次推算孕龄。按完全随机的方法将50只孕鼠分为早孕组、中孕组及晚孕组及对照组。各照射组又按照照射时间分为照射10min组、照射20min及照射30min。受孕的母鼠分别在孕6天、12天及18天，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量30mg/kg，麻醉满意后，将孕鼠绑缚于实验台上，下腹部涂耦合剂，用超声探头在孕鼠下腹部子宫投影区按既定时间进行滑行扫查，对照组进行假辐照，其余条件一律相同。让母鼠自然分娩哺育幼仔，在生后的第3天，将各-31- 第四军医大学博士学位论文窝仔鼠随机减少到最多10只。待仔鼠生长至90d，每组随机选取10只（体重230g±20g）进行OF实验。1.2辐照条件仪器采用AcusonSequoia-512型彩色电脑声像仪，辐照条件：4V1探头，二维频率3.0MHz,彩色频率3.0MHz,机械指数（MI）=1.6，热指数（Tis）＝1.8。2方法2.2实验装置图图1开场实验装置图2.1开场实验开场实验通过测试大鼠对陌生环境的行为反应（每组随机挑选10只动物）来评价动物的自发活动能力。开场实验装置（上海吉量软件科技有限公司）为一个高80cm，底为80cm×80cm的黑箱，置于一个独立的隔音箱中，系统上方用40w荧光灯提供照明。动物置于黑箱中央并允许在15min内自由探索环境，由于白色大鼠在黑色背景上的高对比度，其活动情况可以由一个与计算机相连的摄像系统纪录下来，并由计算机分析系统进行分析。实验中保持周围环境安静，测试时间相同。实验用来评价仔鼠自发活动的参数包括总路程、平均速度、活动度、中央路程以及中央时间。-32- 第四军医大学博士学位论文2.2统计学处理用SPSS13.0forwindows软件，实验所获的数据采用x±s表示，主要统计分析采用t检验，P<0.05被认为具有统计学意义。3结果实验数据见表1-3，各实验组在开场实验中各项结果均无明显差异（P均>0.05），虽然就个别数据实验组较对照组增高或减低，但统计学上并无差异。3.1早孕各组在开场实验中获得数据表1早孕不同剂量彩色超声辐照对仔鼠自发活动的影响(x±s)组别总路程（mm）平均速度(mm/s)活动度中央路程(mm)中央时间(s)10min10578.76±1108.1311.75±1.23242.00±14.111003.98±163.8074.93±41.1220min14014.93±1340.1615.57±14.93202.50±23.921058.85±235.6432.15±26.5630min11480.03±954.6411.37±6.68233.38±15.321104.57±116.3445.96±17.31对照组11368.74±419.0112.63±0.47248.60±11.381044.49±474.6456.57±5.57注：P>0.053.2中孕各组在开场实验中获得数据表2中孕不同剂量彩色超声辐照对仔鼠自发活动的影响(x±s)组别总路程（mm）平均速度(mm/s)活动度中央路程(mm)中央时间(s)10min11603.87±1208.1713.25±1.56239.44±14.921035.58±278.8349.00±21.1820min11395.96±1150.6212.66±1.21236.22±23.761094.33±373.5354.32±15.8630min11844.41±1147.8613.16±1.28263.24±28.361097.31±449.2462.76±11.24对照组11368.74±419.0112.63±0.47248.60±11.381044.49±474.6456.57±5.57注：P>0.05-33- 第四军医大学博士学位论文3.3晚孕各组在开场实验中获得数据表3晚孕不同剂量彩色超声辐照对仔鼠自发活动的影响(x±s)组别总路程（mm）平均速度(mm/s)活动度中央路程(mm)中央时间(s)10min13707.11±1281.7915.23±6.83231.00±21.611013.62±494.8239.08±25.2420min12919.94±1397.0213.28±8.92257.08±17.411241.16±529.4049.8±20.4830min10717.60±1288.8512.30±3.21241.32±16.511017.28±490.2644.32±22.88对照组11368.74±419.0112.63±0.47248.60±11.381044.49±474.6456.57±5.57注：P>0.053.4照射组与对照组轨迹图图2为对照组与照射组中各选取具有代表性的一只大鼠的运动轨迹，可观察到各实验组大鼠与对照组相比，其在开场实验中的自发活动活动并无明显差异，均大部分分布于周边。对照组照射组图2对照组与照射组大鼠典型自发活动轨迹图（图中大的正方形代表开场实验所用黑箱，系统自动将其划分为16个相等的方格，黑色曲线代表一只大鼠在开场实验中由系统自动识别的运动轨迹。中间四个方格代表中央区。）-34- 第四军医大学博士学位论文4讨论超声技术在产科应用渐渐趋于早期化和多次化，不仅在早孕、中孕、晚孕甚至从孕卵、胚胎发育进行监测，产期超声使用的安全性问题，越来越受[132]到关注。国外BarnettSB等证明了孕期超声辐照可引起脑组织细胞的凋亡[131]以及脑组织损伤，国内周宁等发现晚孕期，30min的诊断剂量的超声辐照[133]可对子代的学习、记忆能力造成影响。Hande等发现孕期重复超声辐射会对仔鼠成年后的脑功能产生损伤。然而各孕期彩超照射后仔鼠脑功能是否还可能产生其它方面的影响，尚未见明确报道。开场实验通常被用来观察大鼠的神经精神变化、进入新环境后的各种行为，观察实验动物对新环境的适应[134-137]能力以及由此而产生的情绪变化。动物情绪的变化，进入新环境的适应能力也属于脑功能的很重要部分，因此本实验选用开场实验视频分析系统，观察各孕期接受彩超照射后仔鼠的自发活动，评价其情绪方面是否受到影响。对彩超照射后仔鼠的自发活动的改变做出系统评价。该实验视频系统采用全程电脑收集分析数据，能较为客观而准确的对仔鼠的自发活动进行评定。本实验对各组大鼠在开场实验中的总路程、平均速度、活动度、中央路程以及中央时间进行了观察，并对数据进行统计学分析，发现各组大鼠的各个指标之间无显著性差异，因此我们可以认为不同孕期接受彩超照射后，出生后各组仔鼠的自发活动并未受到明显影响。实验动物对新开阔环境的恐惧而主要在周边区域活动，在中央区域活动较少，但动物的探究特性又促使其产生在中央区域活动的动机，也可观察由此而产生的焦虑心理。总路程、活动度、平均速度、以及中央区的停留时间、路程增加或减少可说明大鼠的自发活动增加或减少，以及大鼠的情绪兴奋或抑郁。实验结果孕期接受超声辐照并未影响仔鼠的自发活动增加或减少；对新环境的探究行为也未受到影响；且仔鼠情绪没有过度抑郁或者兴奋。[138][139]超声辐射会对仔鼠的生长发育产生影响。Duggan等报道接受超-35- 第四军医大学博士学位论文[140]声检查，可能使颅骨下的脑组织因组织升温而造成影响。Beckett研究表明，中枢神经系统对热和超声等物理因子特别敏感，胚胎及胎儿脑组织温升[141]达4℃，持续5min以上可引起脑组织不可复性损伤。赵晶等实验研究表明孕期重复照射可引起脑细胞凋亡增多。处于发育期的脑组织对超声较为敏感，超声的热效应、空化作用和其他机械作用都有可能导致了如蛋白质变化、细胞膜破裂、染色体断裂、细胞凋亡、脑组织受损等生物效应。虽然已有文献报道孕期接受超声辐照可减低仔鼠的学习、记忆能力，但是大脑是机体最为复杂的器官，大脑因其功能也被分为很多脑区，大脑功能包括很多方面，其中空间学习记忆能力依赖于大脑中多个脑区以及不同神经递质系统的协同作用，大脑的一些脑区（如海马、纹状体、基底前脑、小脑、大脑皮层等）的损害都会对动物学习记忆能力影响。但是这并不意味在孕期接受超声辐照后，大脑的各个脑区均受到损害，以及各脑区的功能都受损。有可能与动物的自发活动以及情绪相关的脑区并未受到影响，或其受到的损伤是可逆的。下一步我们将选用合适的研究方法，对孕期接受超声辐照后仔鼠大脑的其它脑功能进行研究，以期为孕期接受超声辐照对大脑功能的影响做出系统的评价。大脑的功能是复杂的，虽然孕期接受超声辐照不会对仔鼠自发活动及情绪产生影响，但其它的脑功能可能受到影响，因此提示我们孕期监测胎儿时，仍应尽量减少和避免长时间超声辐射。-36- 第四军医大学博士学位论文实验二不同孕期彩色多普勒超声辐照对仔鼠学习记忆能力的影响随着超声在产科的广泛应用，孕期超声检查的时间越来越早，频次越来越多，孕期超声诊断的安全性备受关注。超声安全性是关系到优生优育以及社会可持续发展的重大问题。国外学者报道孕期接受超声检查对仔鼠的生长[142-143]发育成熟有不同程度的影响，国内研究发现孕期诊断剂量超声辐照[144]30min可引起脑细胞凋亡增多。而针对子代脑功能是否受到影响的研究相对匮乏。虽有报道可引起学习记忆功能受到影响，但也仅是晚孕期照射的结果，是否各孕期的彩超照射都会引起仔鼠的学习记忆能力的改变，现在尚无系统的研究，因此我们模拟早、中、及晚孕期超声检查，研究了诊断剂量彩色超声不同孕期辐照对仔鼠学习记忆能力的影响。并观察与学习记忆能力密切关联的仔鼠海马区超微结构的改变。1材料1.1动物模型制备健康性成熟SD大鼠75只(由第四军医大学实验动物中心提供)，其中雄性25只，雌性50只。将雌雄按2：1比例合笼后，次日起每日查阴栓及阴道涂片，镜检到活精子之日为受孕0天，并结合触摸孕囊，依次推算孕龄。按完全随机的方法将50只孕鼠分为早孕组、中孕组及晚孕组及对照组。各照射组又按照照射时间分为照射10min组、照射20min及照射30min。受孕的母鼠分别在孕6天、12天及18天，1％戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，剂量30mg/kg，麻醉满意后，将孕鼠绑缚于实验台上，下腹部涂耦合剂，用超声探头在孕鼠下腹部子宫投影区按既定时间进行滑行扫查，对照组进行假辐照，其余条件一律相同。让母鼠自然分娩哺育幼仔，在生后的第3天，将各窝仔鼠随机减少到最多10只。待仔鼠生长至90d，每组随机选取10只（体重230g±20g）在进行OF实验后第二日进行MWM实验。MWM实验结束后-37- 第四军医大学博士学位论文第二天取仔鼠脑海马区进行光镜及电镜观察超微结构的改变。1.2辐照条件仪器采用AcusonSequoia-512型彩色电脑声像仪，辐照条件：4V1探头，二维频率3.0MHz,彩色频率3.0MHz,机械指数（MI）=1.6，热指数（Tis）＝1.8。2方法2.1Morris水迷宫实验装置图图3MWM实验装置示意图2.2Morris水迷宫实验利用Morris水迷宫（MWM）实验来观察大鼠的空间学习记忆能力。MWM为一直径160cm、高50cm的圆形水池，水池内壁被漆为黑色，池内水深23cm，水温保持在(22±2)℃，房间内光照恒定，无光线直射在水池内。池壁上以四个等距离点将水池分为四个象限，在目标象限（设为第一象限）内距离池壁35cm处放有一个直径为12cm、高21cm的圆形黑色站台，站台位于水面下[145]2cm，以炭素墨水将池水染黑，泳池内壁贴有不同形状及颜色的标记物。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机，同步记录大鼠运动轨迹。采用上海吉-38- 第四军医大学博士学位论文量软件科技有限公司研制开发的Morris水迷宫视频分析系统进行信息处理，该系统能动态记录大鼠在水迷宫中游泳的录像资料，设定分析参数，进行在线或离线数据分析，并提供大鼠上台潜伏期、目标象限活动时间百分比、穿台次数、游泳速度等指标。本实验我们选取上台潜伏期作为学习能力的评价指标，目标象限游泳时间比率作为评价记忆能力的指标。2.3定位航行实验实验前将大鼠置于站台上适应20s，随后将大鼠随机从不同象限（目标象限除外）面壁置入池内，大鼠登上站台5s后终止记录，最长记录时间为60s，若大鼠在60s内不能上台，则引导其登上站台适应10s，最后将大鼠擦干放入鼠笼。如此将大鼠置入游泳池3次为一组，定位航行训练5组。测量平均上台潜伏期，以评判大鼠的空间学习能力。2.4空间探索实验定位航行后1天撤除水面下的站台，然后将大鼠随机从不同象限（除目标象限外）面壁置入池内1次，每次记录大鼠在60s内游泳轨迹并进行分析，最后将大鼠擦干放入鼠笼。测量大鼠在目标象限游泳时间的比率，以评判大鼠的空间记忆能力。2.5仔鼠海马区HE切片及电镜检测水迷宫实验后第2天处死所有大鼠，每只大鼠用戊巴比妥钠(60mg／kg)行腹腔麻醉；5～l0min麻醉剂起效后，将大鼠固定于灌流台上，剖开胸腔，经左心室快速灌注37℃生理盐水(事先已在水浴锅内预热到37℃)150～200ml，继之灌注4℃的4％多聚甲醛溶液(用PBS配制，PH=7.4)250～300ral，持续灌注30～60min；然后剥离脑，对照大鼠脑立体定位图谱，修块，置于同浓度多聚甲醛溶液中后固定48h以上；梯度乙醇脱水，石蜡包埋后，行冠状切片，片厚7μm，用涂有明胶铬明矾的载玻片捞片。电镜标本取材将大鼠麻醉固定,打开动物心脏,自右心房放血,先用生理盐水心脏灌注,直至回流液变清后,再用4%的多聚甲醛灌注内固定20～30min,-39- 第四军医大学博士学位论文迅速断头取脑。按电镜取材标准约1mm3大小的海马组织,置于215%戊二醛磷酸缓冲液中固定过夜,然后置于1%锇酸溶液(pH714,45℃,30～60min)锇化,按常规电镜样品制备程序漂洗、脱水、浸透及环氧树脂包埋;超薄切片后,将切片捞至载网上,干燥后行铅铀(醋酸铀和柠檬酸铅)双染;透射电镜下观察细胞形态及其超微结构的变化并摄片。2.6统计学处理用SPSS13.0forwindows软件，实验所获的数据采用x±s表示，主要统计分析采用t检验，P<0.05被认为具有统计学意义。3结果第一天定位航行实验中，各孕期对照组、10min组、20min组及30min组上台潜伏期随着训练次数的增加逐渐缩短，与对照组相比，各孕期30min组的上台潜伏期较对照组延长（P<0.05），而10min组及20min组5次上台潜伏期与对照组无明显差别（P>0.05）。说明各孕期30min组较对照组学习能力降低。各孕期航行实验数据见表图4、5及6。在第2天的空间探索实验中，各孕期30min组目标象限游泳时间的比率均较对照组减低（P<0.05），而10min组及20min组则无明显差异（P>0.05）。说明在孕期不同阶段超声辐照30min组的记忆能力受到了影响。各孕期空间探索实验数据见图5、7及9。同时将阳性组之间做比较，结果发现个阳性组之间并无统计学上的明显差异（P>0.05）。结果见图10，11。说明无论在早、中还是晚孕照射，其对仔鼠的学习与记忆能力的虽都会形成影响，但这种影响没有差异。各照射组与对照组相比，海马区神经细胞超微结构并无明显差异。-40- 第四军医大学博士学位论文3.1早孕各组在MWM实验中获得数据表4早孕各组在MWM定位航行实验中潜伏期(x±s)组别Trial1Trial2Trial3Trial4Trial510min34.05±4.1320.24±1.2318.59±4.1113.57±3.809.98±2.1220min30.60±4.1618.60±1.9317.24±3.9214.52±3.6412.23±2.56***30min44.32±5.3922.87±4.2819.37±4.4017.44±3.8419.56±4.41对照组37.03±5.0617.74±1.6414.86±2.9612.69±1.7710.78±3.89*P<0.056010min5020min30min40对照组3020上台潜伏期（s）10012345图4早孕各组定位航行实验结果(图中显示：30min组潜伏期较其他组与对照组相比明显延长，P<0.05)-41- 第四军医大学博士学位论文5010min20min30min40对照组30(%)20100目标象限游泳时间比率图5早孕各组空间探索实验结果(图中显示照射30min目标象限游泳时间比率较对照组明显减少，P<0.05)3.2中孕各组在MWM实验中获得数据表5中孕各组在MWM定位航行实验中潜伏期(x±s)组别Trial1Trial2Trial3Trial4Trial510min38.83±4.8424.39±4.8911.91±1.6413.56±1.8912.83±1.6020min43.52±4.7722.84±4.3616.27±2.9812.12±3.2912.59±3.22***30min49.37±4.2926.94±5.3215.32±2.4517.87±2.7614.51±1.69对照组37.03±5.0617.74±1.6414.86±2.9612.69±1.7710.78±3.89*P<0.05-42- 第四军医大学博士学位论文6010min20min5030min对照组403020上台潜伏期（s）10012345图6中孕各组定位航行实验结果(图中显示：30min组潜伏期较其他组与对照组相比明显延长，P<0.05)5010min20min4030min对照组30(%)20100目标象限游泳时间比率图7中孕各组空间探索实验结果(图中显示照射30min目标象限游泳时间比率较对照组明显减少，P<0.05；照射10min与照射20min虽然目标象限游泳时间比率有所减少，但是这种减少在统计学上并无差异显著性，P>0.05)-43- 第四军医大学博士学位论文3.3晚孕各组在MWM实验中获得数据表6晚孕各组在MWM定位航行实验中潜伏期(x±s)组别Trial1Trial2Trial3Trial4Trial510min37.41±5.3219.99±5.0818.53±2.4116.54±4.8915.44±3.9620min39.28±4.1620.59±3.8218.43±3.4219.21±3.4215.99±1.77···30min48.98±4.8930.16±5.3919.99±4.4721.50±4.6121.96±5.29对照组37.03±5.0617.74±1.6414.86±2.9612.69±1.7710.78±3.89*P<0.056010min5020min30min40对照组3020上台潜伏期（s）10012345图8晚孕各组定位航行实验结果(图中显示：30min组潜伏期较其他组与对照组相比明显延长，P<0.05)-44- 第四军医大学博士学位论文5010min20min4030min对照组30(%)20100目标象限游泳时间比率图9晚孕各组空间探索实验结果(图中显示照射30min目标象限游泳时间比率较对照组明显减少，P<0.05；照射10min与照射20min与对照组相比则无差异显著性，P>0.05)3.4各孕期30min组组间相比较数据60早孕30min50中孕30min晚孕30min403020上台潜伏期（s）10012345图10各孕期潜伏期阳性组之间做比较，各阳性组之间并无差异显著性。（P>0.05）-45- 第四军医大学博士学位论文50早孕30min中孕30min40晚孕30min30(%)20100目标象限游泳时间比率图11各孕期目标象限游泳时间比率阳性组之间做比较，各阳性组之间并无差异显著性。(P>0.05)3.5各组海马区光镜及电镜结果3.5.1HE切片光镜观察各组仔鼠海马组织结构清晰，细胞核形态正常。见图12，13。图12辐照组仔鼠海马HE切片图13对照组仔鼠海马HE切片-46- 第四军医大学博士学位论文3.5.2电镜观察结果如图14，15所示,照射组与对照组电镜照片中,海马内神经元形态正常,细胞膜完整,胞质及细胞核电子密度均匀,线粒体结构完好,胞质内细胞器结构清晰可见,染色质在核内均匀分布,核仁完整。图14照射组仔鼠海马神经元电镜图片图15对照组仔鼠海马神经元电镜图片-47- 第四军医大学博士学位论文3.5各组在MWM实验中轨迹图图12对照组大鼠在MWM中运动轨迹(图中每个蓝色圆环代表水迷宫，以平台所在象限作为目标象限，即第Ⅰ象限。黑色曲线代表一只大鼠在一次测试中在水迷宫中的游泳轨迹，图中选取对照组较为典型的4只大鼠轨迹，我们可以看出其游泳轨迹大部分分布于目标象限即平台周围。)图13辐照30min在MWM中运动轨迹（图中显示照射30min组轨迹分布较为散乱和平均，目标象限轨迹分布并未较其他象限显著增多。）-48- 第四军医大学博士学位论文4讨论超声技术在产科应用渐渐趋于早期化和多次化，不仅在早孕、中孕、晚孕甚至从孕卵、胚胎发育进行监测，产期超声使用的安全性问题，越来越受[146-148]到关注。国外BarnettSB等证明了孕期超声辐照可引起脑组织细胞的凋[149]亡以及脑组织损伤，国内周宁等发现晚孕期，30min的诊断剂量的超声辐[150]照可对子代的学习、记忆能力造成影响。Hande等发现孕期重复超声辐射会对仔鼠成年后的脑功能产生损伤。然而针对于各个孕期仔鼠学习记忆功能是否都会受到影响，目前尚无系统性研究。因此本实验模拟临床实际，选用彩色多普勒超声不同孕期进行辐照，选用国际上公认的Morris全自动水迷宫作为评判指标，采用全程电脑收集分析数据，能较为客观而准确的对仔鼠的学习、记忆能力进行评定。并观察与学习记忆相关的海马区的神经元超微结构，从而进一步为临床超声辐照安全阈值提供较为系统的理论依据。4.1既往研究结果有研究表明在早孕期，由于胚胎组织疏松，浸于液体中，最有可能的引[151]起非热效应；而在中、晚孕期最有可能引起组织升温。因此我们选取不同孕期的大鼠作为研究对象，以观察是否各孕期超声辐照都会引起子代脑功能的改变。鉴于诊断用超声引起的生物学效应可能是细微的或潜在的，有学[152]者提出用凋亡或染色体畸变等较为敏感的指标来作为观察指标。凋亡是发育中的正常生理现象，组织器官的正常发生和发育都需要凋亡的参与，如果超声可引起组织细胞凋亡的变化，则有可能对机体构成影响。目前已经有[153]许多实验证明了孕期超声辐照可引起脑组织细胞的凋亡。BarnettSB等用0.02MHz的低频率超声照射小鼠，发现脑组织中许多区域呈现浓密的即刻早[154]2期基因（c-fos）蛋白的表达。Hande等用3.5MHz(Isptp=1W/cm,2Isata=240mW/cm)的超声重复照射孕6.5d和11.5d的胚胎10min，结果发现仔鼠死亡率明显升高，运动力、神经行为能力（包括学习、记忆力）下降。Oh[155][156]等发现诊断超声可引起胎鼠小脑外颗粒层细胞凋亡。Ang等发现孕期-49- 第四军医大学博士学位论文[157]超声辐照可引起仔鼠脑细胞发育过程中的正常迁移。程颜玲等用诊断级超声辐照孕18d胎鼠，发现照射20min以上会引起胎鼠脑组织凋亡细胞明显[158]增多，并可诱导胎鼠脑皮层组织神经细胞凋亡。Kieler等发现胎儿时期接受超声检查会导致左利手的几率增加。而对于超声辐照引起的子代脑功能影响却知之甚少，虽有研究表明晚孕期照射30min可影响子代学习记忆功能，但这只是在晚孕的实验结果，孕期超声检查的早期化，多次化，提示我们必须对超声安全性做出系统的评价。4.2Morris水迷宫在评价学习记忆能力的应用笔者采取国际上公认的Morris全自动水迷宫来对仔鼠的学习、记忆能力进行评定。在动物学习、记忆实验研究上,仪器和方法是重要的。迷宫、跳台是研究动物学习、记忆的经典仪器。本实验使用Morris全自动水迷宫有如下优点:用摄像系统代替了研究者在迷宫试验时长时间肉眼观察,不受任何人为因素误差影响,更为客观、真实;使用微机系统和设计的程序,不仅能测定学习获得成绩、记忆保持成绩,还能自动在计算机屏幕上显示动物游迷宫轨迹。在本实验中评价指标为潜伏期及目标象限游泳时间比率。在定位航行实验中，各孕期30min照射组潜伏期明显较对照组延长；在空间探索实验中，各孕期照射30min组成年期,动物游迷宫形式较其他各组大多是远离平台围绕周边，游泳形式呈周边型,很难接近平台。而其他各组动物定位航行实验中潜伏期较对照组并无明显差别，大部分经过5组加强训练我们可以看出其游泳轨迹大部分分布于目标象限即平台周围,学会游迷宫,能够快速、准确确定平台位置。实验结果表明：无论在孕期的任何阶段，超声辐照30min组，仔鼠出生后成年期在Morris水迷宫中的潜伏期及目标象限比率与对照组差异有显著性意义。以往的暗箱实验，迷宫实验对于动物通常是给予电击等较强的刺激，Morris水迷宫实验较其温和的多，也能减少误差。4.3引起功能改变的形态学基础实验证明，在孕期接受超过30min的诊断剂量的超声辐照可对子代的学-50- 第四军医大学博士学位论文习、记忆能力造成影响。出现这种结果主要考虑为处于发育期的脑组织对超声更为敏感，超声的生物学效应导致凋亡细胞的增多。哺乳动物从受精卵发育成一个新个体是一个复杂的演变过程，而在早孕分化期间的胚胎组织细胞，其细胞灵敏性高而耐受性差，若发生损伤，可导致胚胎的发育异常。而[159]Gastensen早在1987年指出在发育灵敏期的胎儿，即使是只损伤几个细胞，其结果也是不可容忍的。凋亡是脑发育过程中必然要经历的过程，在人类胚胎神经元的发育过程中，会产生约1.5倍于成人的神经细胞，多余的细胞以凋亡的方式逐渐消失。凋亡不是可有可无、无规律的现象，而是多细胞动物生命活动过程中不可缺少的组成内容，是保证个体成熟所必需的，也是动物维持个体正常生理过程所必需的。细胞自然凋亡规律一旦失常，个体既不能正常发育或发生畸形。大量研究表明，在神经系统发育过程中，各种脊椎动物的中枢神经系统和外周神经系统的各个部位都有凋亡的发生。以人类而言，从简单的神经板发育到神经管，进而发育成为脑与脊髓组成的中枢神经系统，外形的改变逐步走向器官定形。因此，神经元的过度增殖是为了神经系统形态及功能发育的变形的需要。整个神经系统的发育是在神经细胞的增[160]殖与自然凋亡的动态平衡中进行的。神经元达到成熟期的数目是在神经发生过程中细胞增殖与死亡平衡的结果。它无疑是受基因调控的。基因调控并不直接控制神经细胞的最终数量，但他们控制着细胞向上皮细胞还是神经母细胞分化。但激素、生长因子、营养和环境等内在和外在因素对他的作用也不可忽视。脑的各种结构在发育过程中还存在“生长喷发”现象。在该时期该结构的DNA、蛋白质和酶类等各种化学组分以及组织结构增长速度很快。一般说处于“喷发期”的脑区，对外界刺激敏感，易造成损伤。外界因素中，对脑细胞数影响较大的是温度的变化。豚鼠的孕期为68天，如在孕18~28天，给母鼠增高3~4℃，仅一小时，胎鼠脑重可减少10%。组织切片观察表明，温度破坏生发层细胞，减低其分裂活性，但不影响髓鞘形成。人类孕妇高烧也会影响胎儿中枢神经系统发育。超声的热效应、机械效应和空化效应-51- 第四军医大学博士学位论文[161]会成为为影响脑细胞凋亡的因素。Duggan等报道接受超声检查，可能使[162]颅骨下的脑组织因组织升温而造成影响。Beckett研究表明，中枢神经系统对热和超声等物理因子特别敏感，胚胎及胎儿脑组织温升达4℃，持续5min以上可引起脑组织不可复性损伤。神经元的发生时间因动物品种、孕期和不同脑区而异。虽然在实验中光镜及电镜显示海马区神经元超微结构辐照组与对照组并无明显差异。但是形态的改变很可能早于功能的改变，有可能早期的神经元损伤已经修复，但是它引起的功能上的改变却在仔鼠成年后表现出来。因此提醒我们应该在下一步实验中对仔鼠海马区的形态学改变进行动态检测，从而为功能上的改变提供理论基础。空间学习记忆能力还依赖于大脑中多个脑区以及不同神经递质系统的协同作用，大脑的一些脑区（如海马、纹状体、基底前脑、小脑、大脑皮层等）的损害都会对动物Morris水迷宫结果产生直接影响。我们在未来实验中还将针对多个脑区以及不同神经递质的协同作用进行研究,进一步证实超声的生物学效应引起仔鼠的大脑学习、记忆功能区细胞的神经递质的改变而引起了脑功能的改变。实验结果表明发育中的脑组织对理化等刺激较为敏感，孕期接受过量的超声辐射，虽然形态学上不存在远期效应，但有可能早期的损伤导致胎鼠的神经发育出现异常，成年后可能表现为学习记忆能力的降低。因此提示我们孕期监测胎儿时，无论在孕期的任何阶段都应尽量减少和避免长时间超声辐射。-52- 第四军医大学博士学位论文小结本实验应用了行为学上能够客观、真实评价脑功能的实验系统――开场实验及MWM实验系统的分析了各个孕期，不同剂量彩色多普勒超声对子代自发活动及学习记忆能力的影响。实验结果显示：1.早、中及晚孕期无论超声辐照10min，20min及30min，其子代在开场实验中数据与对照组相比无显著性差异（P>0.05），说明孕期彩超照射不会对仔鼠的自发活动产生影响。2.各孕期超声辐照30min，其仔鼠在MWM实验中潜伏期及目标象限时间比率与对照组相比均有显著性差异（P<0.05),说明无论在任何孕期，只要超声辐照超过30min都会对仔鼠的学习记忆功能产生影响。3.各孕期辐照30min组之间相比较，其潜伏期及目标象限游泳时间比率并无明显差异（P>0.05）4.照射组与对照组在光镜和电镜观察海马神经元超微结构相比并无明显差异。大脑的功能是复杂的，虽然孕期接受超声辐照不会对仔鼠自发活动及情绪产生影响，但超声辐照超过30min会对仔鼠的学习记忆能力产生影响；虽然在仔鼠生长至90d时，与学习既有有关的海马区神经元超微结构未见明显异常，说明彩色多普勒超声照射后成年期仔鼠结构虽无明显变化，但功能上却对学习记忆能力产生影响。因此提醒我们无论在早、中还是晚孕期临床产科超声检查时，都要避免对胎儿的长时间照射。-53- 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第四军医大学博士学位论文UltrasoundMedBio.2000,26(9):1377-1385160.蔡文琴，李海标.发育神经生物学.北京:科学出版社，2001.106－112.161.DugganPM,MurcottMF,McPheeAJ,etal.TheinfluenceofvariationsinbloodflowonpulsedDopplerultrasonicheatingofthecerebralcortexoftheneonatalpig.UltrasoundMedBiol,2000,26:647-654.162.BeckettSR,DuxonMS,AspleyS,etal.Centralc-fosexpressionfollowing20kHzultrasoundinduceddefencebehaviourintherat.BrainResBull,1997,42:421-426-69- 第四军医大学博士学位论文个人简历和研究成果姓名:周宁性别:女出生日期:1980年3月5日籍贯:陕西省宝鸡市民族:汉族政治面貌:党员婚姻状况:未婚现学习单位:第四军医大学学习经历1997年8月－2002年6月第四军医大学学员旅本科学习2002年7月－2005年6月第四军医大学研究生管理大队硕士学习2005年7月－至今第四军医大学研究生管理大队博士学习-70- 第四军医大学博士学位论文论文发表情况1.ZhouNing,WangYong,YuanLiJun,etal.TheeffectofDopplerultrasoundduringdifferentdurationsofpregnancyonoffsprings’learningandmemorizingabilities.Journalofultrasoundinmedicine.2008（已修回）2.ZhouNing,DuanYunYou,JiaHuaPing,etal.TheeffectsofDopplerultrasoundwithdiagnosticintensityonoffspring’slearningandmemorizingabilitiesinrats..JournalofUS-Chinamedicalscience.已录用3.周宁，段云友，王勇等.孕期诊断剂量超声辐照对仔鼠自发活动的影响。中国医学影像技术.已录用4.周宁，段云友，王勇等.孕期彩色多普勒超声对仔鼠肾小管上皮细胞bcl-2远期表达的影响。中国医学影像技术.已录用5.贾化平，段云友，赵晶，周宁，曹铁生.中孕期彩超辐照对肽鼠肾脏P53蛋白表达的影响.中国临床医学影像杂志，2006，17（1）：326.贾化平，段云友，曹铁生，袁丽君，李娟，周宁.右心功能衰竭患者上腔静脉频谱呼吸性变化特点研究.中华超声影像学杂志，2006，15（5）：3507.陈洪茂，段云友，周宁，李娟，杨玉辉，曹铁生.兔急性肺动脉高压的上腔静脉血流速度频谱分析.中华超声影像学杂志，2007，16（8）：7188.陈洪茂，段云友，李娟，周宁，曹铁生，杨玉辉.超声引导下兔急性肺动脉高压模型的建立及其意义.中国超声医学杂志，2007，23（1）：129.陈洪茂，段云友，李娟，周宁，曹铁生.兔急性肺动脉高压模型的建立及其二维超声检测分析.医学影像学杂志，2007，17（2）：20010.ChenHongMao,DuanYunYou,LiJuan,ZhouNing.CharacteristicsofthesspectraofsuperiorvanacavaflowDopplervolocitiesinprimarypulmonaryhypertensionwithtricuspidregurgitation.JournalofUS-Chinamedicalscience,2007,4(1):1011.李娟，段云友，陈洪茂，周宁，曹铁生，杨玉辉.兔急性肺动脉高压模型的左心功能变化.中国医学影像技术，2007，23（4）：61312.ChenHongMao,DuanYunYou,LiJuan,ZhouNing,YuanLiJun,CaoTie-71- 第四军医大学博士学位论文Sheng.Arabbitmodelwithacutethrombo-embolicpulmonaryhepertensioncreatedwithechocardiographyguidance.Ultrasoundinmedicineandbiology.2008,34(2):221-227-72- 第四军医大学博士学位论文致谢首先，感谢导师段云友教授从硕士到博士这六年来对我的悉心指导和倾心关怀。经过导师辛勤指导，圆满的完成了科研课题，并且从对超声医学知之甚少到现在的已经能够独立完成常规的临床工作，导师为此倾注了大量的心血。他作为导师，点拨迷津，让人如沐春风；作为长辈，关怀备至，让人感念至深。能师从段云友教授，我为自己感到庆幸。这六年来，我的每一点进步、每一份成果，无不包含着他的敦敦教诲和殷殷期望。段云友教授更让我领悟了“学高为师、身正为范”的真谛！段云友教授的治学严谨、学识广博以及为人正直都使我受益终身！感谢曹铁生教授在这六年学习生活中曾经给予的指导和帮助。曹铁生教授严谨的治学态度，对知识孜孜不倦的追求，还有高尚的人生观同样让我获益匪浅！感谢唐都医院超声科的全体老师和同学！我要感谢所有教导过我、关心过我的老师。特别是袁丽君老师，杨一林老师、李群老师、宋海棠老师、张勇老师、闫凯麟老师、李军老师。他们为我的学业倾注了大量心血，你们为人师表的风范令我敬仰，严谨治学的态度令我敬佩。他们在临床技能的学习，以及科研课题的完成以及生活方面都给予了我无私的帮助，使我顺利完成了学习任务。感谢感谢众位学姐、同学、学弟妹，刘禧、张莉、巴咏梅、任聃、王勇、王宇、李俏颖，熊华强的共同砥砺，你们的陪伴让三年的研究生活变得绚丽多彩。感谢西京医院心身科王文老师在开场实验及Morris水迷宫实验中给与的指导。感谢动物中心的老师们及时，准确地提供试验所需的动物。最后要把我的谢意留给我的家人。父母无私的关爱与付出，为我的成长含辛茹苦，一篇博士论文远非我报答养育之恩的终点，我将继续努力，以更大的成绩回报父母，以及所有关心过我成长的人们！-73-