不同粒径的二氧化钛纳米颗粒对巨噬细胞凋亡的作用

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1、不同粒径的二氧化钛纳米颗粒对巨噬细胞凋亡的作用　　纳米二氧化钛(粒径＜100nm)具有超微性，紫外吸收性和高效光催化活性三大特性，这些特性与它的生物学特性密切相关。随着纳米二氧化钛在生活生产中的广泛运用，人们不可避免的接触到含纳米二氧化钛的物品，纳米二氧化钛可以通过吸入、摄食、皮肤渗透和注射等途径进入机体，过去的一段时间认为它是没有毒性的，并作为阴性对照进行粉尘的体内和体外研究。纳米级的颗粒通过吸入途经进入机体后，不同粒径的颗粒沉积在肺的不同位置，肺泡的巨噬细胞具有识别清除抗原性异物，参与和促进炎症

2、反应过程，对肿瘤和病毒感染等靶细胞的杀伤作用，专职的抗原提呈细胞，启动特异性免疫应答和免疫调节等作用。　　TiO2-NPs通过呼吸道进入体内首先与肺泡巨噬细胞接触，从而可能产生各种健康效应。凋亡指的是细胞在受到刺激之后启动的程序性死亡，是细胞产生的一种保护性措施。该研究以大鼠肺泡巨噬细胞NR8383作为研究对象，探讨不同粒径的二氧化钛纳米颗粒对巨噬细胞凋亡的影响。　　1、材料与方法　　1.1主要材料NR8383大鼠肺泡巨噬细胞由中山大学馈赠。二氧化钛纳米颗粒(TiO2-NPs)，共四种粒径:(10&

3、plusmn;1.5)nm、(30±3)nm、(50±3)nm、(100±5)nm，纯度为99.9%，购买于北京纳辰科技发展有限责任公司;CCK-8检测试剂盒，Hoechst33258染色液，抗荧光猝灭封片液，碘化丙啶(PI)染色液均购自碧云天;F12K培养基购自北京迈晨科技;胎牛血清购自Gibco;青链霉素，HEPES购自北京索莱宝，多聚甲醛购自上海生工。　　1.2方法　　1.2.1细胞培养:NR8383细胞培养于含20%FBS(55℃灭活30min)，1

4、%青链霉素，1%HEPES的F12K培养基，37℃5%CO2条件下培养。　　1.2.2二氧化钛纳米颗粒悬液制备:称取不同粒径TiO2-NPs50mg，分别溶于PBS，用电磁搅拌器初步混悬之后，并定容至100ml，超声振荡2h，制成500μg/mlTiO2-NPs储备染毒悬液，高压灭菌备用。使用前，超声振荡20min，将储备染毒悬液用F12K培养基逐级稀释成实验所需浓度使用。　　1.2.3细胞活力(CCK-8法):将NR8383细胞以5104个/孔，密度接种于96孔板，设三个复孔，在37℃5%C

5、O2条件下培养24h，分别加入等体积的浓度为0.2、1、5、25μg/ml的TiO2-NPs处理NR8383细胞，48h后，每孔加入10μlCCK-8试剂，37℃5%CO2继续培养3h后用酶标仪450nm波长下检测各组细胞OD值，630nm为参考波长，进行细胞比活力分析，正常细胞为对照组，培养基组为空白调零孔。　　活力比(%)=(实验孔OD值－调零孔OD值)/(对照孔OD值－调零孔OD值)100%1.2.4核形态(Hoechst33258染色):选取浓度为25μg/mlTiO2-N

6、Ps处理NR8383细胞48h后，离心收集细胞，PBS洗一次，重悬细胞，滴至干净载玻片上，尽量使细胞分别均匀，稍晾干，4%多聚甲醛避光固定15min，去多聚甲醛后，滴加Hoechst33258染色液覆盖细胞，避光染色5min，去染色液后滴加抗荧光猝灭封片液，盖上盖玻片于荧光倒置显微镜下观察，未经TiO2-NPs处理组为对照组。　　1.2.5细胞周期及凋亡实验(PI染色):各浓度1、5、25μg/ml组TiO2-NPs处理NR8383细胞48h后，离心收集细胞，预冷PBS洗一次，加入1ml冰浴预

7、冷75%乙醇中，轻轻吹打混匀，4℃固定过夜。每管细胞样品中加入0.5ml碘化丙啶(PI)染色液，缓慢并充分重悬细胞沉淀，37℃避光温浴30min，流式细胞仪检测。　　1.3统计学方法。实验数据采用统计软件SPSS18.0进行统计分析，均数比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD法，P＜0.05认为差异有统计学意义。　　2、结果　　2.1细胞活力分析结果。如图1示，不同浓度不同粒径TiO2-NPs作用48h后，NR8383细胞活力在同一粒径下随浓度增加而增加，同一浓度下随粒径增加而降低，粒径为10n

8、m，25μg/ml时细胞活力最大，设正常对照组细胞活力为100%。　　　　2.2Hoechst33258染色。如图2示，经Hoechst33258染色后荧光倒置显微镜下可见发生凋亡的细胞的细胞核呈致密浓染，或呈碎块状致密浓染，正常细胞核常呈现圆形，淡蓝色，内有较深蓝色颗粒。吞噬较高浓度TiO2-NPs后的细胞核被挤压到边缘，外周能见到吞入到巨噬细胞内部的模糊的纳米颗粒阴影边缘。从结果可以看出荧光着色致密的细胞核数量增加。　　2.3细胞周期及凋亡实验。如图3示，不