crispr-cas9技术实现兔myostatin基因突变

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1、CRISPR/Cas9技术实现兔Myostatin基因突变　　基因修饰是一种通过同源重组直接改变基因信息的一种技术。TALEN和ZNF打开了基因编辑的大门，通过修饰动物的某些功能基因，为产生转基因模型、为基因功能的研究做出了巨大的贡献[1].虽然TALEN和ZFN已经成功的达到了基因修饰的目的，但是仍然有不尽人意之处。ZFN被认为是最有潜力的基因改造技术，但对于每一种打靶的基因，都需要构建庞大的锌指文库，筛选出特异的锌指蛋白，这种方法工作量大，花费昂贵，并且有一定的毒性。相比之下，尽管TALEN有其优势，但也有一个问题，需要复杂的构建质粒和有脱靶的问题。为了解决这一问题，人们

2、发现了更加精确的、更加经济、可操作性高的基因打靶技术-CRISPR/Cas9技术。成簇的规律间隔的短回文重复序列（ClusteredRegularlyInterspacedShortPalindromicRepeats,CRISPRs）是存在于细菌和古生菌中的获得性免疫系统。CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因打靶技术，修饰某一功能基因需要精确的基因编辑技术，CRISPR/Cas9技术是一种由RNA介导的DNA点突变的获得性免疫系统[2].　　1CRISPR/Cas9系统的简介　　CRISPR序列首次引起人们注意是在1987年，是在Escherichiacoli基因组中

3、发现的[3],所有细菌基因组的40%都存在该序列。CRISPR/Cas9是细菌和古生菌抵御外来侵略的一种重要手段，利用这一特点，将它对外源基因进行修饰。CRISPR系统主要有三类，I类主要是通过Cas3发挥作用。Ⅱ类的通过Cas9行使剪切作用，它的工作原理就比Ⅰ类、Ⅲ类CRISPR系统简单的多，所以研究的更为广泛，只需要一种蛋白就可以，并且利用小RNA干扰将外源DNA沉默[4].Ⅲ类主要是通过cas10发挥作用功能。　　CRISPR位点通常由短的高度保守的重复序列（re-peats）组成，首先是一系列Cas蛋白，有Cas9、Cas1、Cas2、Cas2.其次是一些重复序列，重

4、复序列的长度通常为21~47bp.重复序列之间被26~72bp间隔序列（spacer）隔开。CRISPR就是通过这些间隔序列（space）与靶基因进行识别。Ⅱ类CRISPR/Cas9系统发挥作用时仅需要三种组分：cas9蛋白、两个非编码RNA:有打靶位点的crRNA和反式激活crRNA（tracrRNA）。Cas9蛋白是一种具有剪切功能的核酸酶，编码1367个氨基酸，有1个HNH核酸酶结构域和3个RuvCI结构域[5],可以对打靶位点进行剪切。crRNA和tracrRNA形成一种复合物，称为gR-NA,由crRNA与打靶位点进行碱基互补配对，指导cas9蛋白对打靶位点进行剪切

5、。Cas9蛋白的HNH核酸酶结构域剪切互补链，而Cas9RuvCI结构域剪切非互补链。细胞会通过自身DNA同源重组或者非同源末端连接机制修复断裂的双链，在修复过程中会出现高几率的基因缺失、插入和改变（图1）。达到基因修饰的目的。打靶位点的3′端有一个PAM序列，称为前间区序列邻近基序（protospaceradjacentmotifs,PAM），碱基序列为NGG[6].正是由于此识别位点的存在，使Cas9蛋白在剪切的时候，能够识别与crRNA互补的位点，由于gRNA不存在PAM,所以也就避免了Cas9将gRNA进行剪切[7].在人类基因组中，平均每8bp就出现一个

6、NGG的PAM结构，这也就使得CRISPR/Cas9技术可以更彻底的为人类服务。对gRNA的结构进行分析（图1），经大量实验证明，67~85bp的tracrRNA有较高的打靶效率[10].肌肉生长抑制素（Myostatin,MSTN）又名GDF-8（转化生长因子）是1997年发现的骨骼肌生长发育负调控因子[8].研究证实人的MSTN由3个外显子和2个内含子组成，在骨骼肌中特异性表达。Myostatin突变或缺失均可以导致肌肉质量的显着增加。带有遗传突变的Myostatin基因，导致该基因功能失活，产生肌肉急剧增加的双肌表型，从而证明了Myostatin基因是骨骼肌特异性生长发

7、育的负调控因子。　　　　2材料与方法　　2.1材料　　根据,选择兔子（Oryc-tolaguscuniculus）为物种进行设计打靶位点。筛选的打靶位点为GCCATGGTAGTAGACCGCTGTGG,PAM结构为TGG.兔成纤维细胞由中国农业大学惠赠；Cas9与gRNA由金唯智公司合成；基因组提取试剂盒（TissueDNAKit货号：D3396-01）购自于OMEGA公司；dreamtaq购自于fermantas公司；T7Endonu-clease1购自于NEB公司。共2页:12　　2.2兔成纤维细胞