src、fyn激酶对脑缺血-再灌注大鼠海马nmda受体nr2a亚基磷酸化水平的影响

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1、Src、Fyn激酶对脑缺血/再灌注大鼠海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响：孙亚峰裴冬生张光毅【摘要】目的观察脑缺血再灌注后海马Src家族酪氨酸蛋白激酶（Srcfamilyofproteintyrosinekinase,SrcPTKs）成员Src、Fyn激酶对NMDA受体(N-methyl-D-aspartatereceptors,NMDAR,NR)NR2A亚基磷酸化水平的影响。方法采用Pulsinelli-Brierley四动脉阻断（four-vesselocclusion,4-VO）大鼠全脑缺血模型，缺血前连续3天脑室注射Src、Fyn反义寡

2、核苷酸（antisenseoligodeoxynucletides，AS-ODNs）及错义寡核苷酸组（missenseoligodeoxynucletides，MSODNs）后缺血15min，用免疫沉淀和免疫印迹法检测NR2A亚基酪氨酸磷酸化水平的变化。结果Fyn反义寡核苷酸使脑缺血再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平下降，而Src反义寡核苷酸对脑缺血/再灌注海马NR2A亚基磷酸化水平影响更加明显。结论脑缺血/再灌注过程中NMDA受体NR2A亚基的磷酸化主要是由Src激酶介导的。【关键词】Src；Fyn；NR2A；反义寡核苷酸；脑缺血Abstract:Obj

3、ectiveToinvestigateiafolloin)brainischemiaia.DAreceptorsubunitNR2AduringcerebralischemiafolloarilymediatedbykinaseScr.Keyia近年来，最受人们关注的缺血性脑损伤机制是兴奋性氨基酸（excitatoryaminoacid,EAA）的神经毒性作用及神经元内钙超载触发的级联反应［1］，其中NMDA受体（NR）的NR2亚基在缺血性脑损伤中起着非常重要的作用，在缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）过程中其蛋白表达、磷酸

4、化水平均有改变。对NR2亚基有磷酸化调节作用的是Src家族酪氨酸蛋白激酶（Srcfamilyofproteintyrosinekinase,SrcPTKs），这是一类膜结合的非受体酪氨酸蛋白激酶；现已知Src家族成员中Src、Fyn、Yes、Lyn、Lck在中枢神经系统中均有表达。本实验采用四动脉阻断（4-VO）大鼠全脑缺血模型，观察Src家族成员中Src、Fyn激酶对海马NMDA受体NR2A亚基磷酸化水平的影响。1材料和方法1.1材料1.1.1动物成年雄性SD大鼠,体重230～250g，中国科学院上海实验动物中心提供(Ⅱ级,证书号005)。1.1.2药

5、物Src、Fyn反义、错义寡核苷酸均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，硫代磷酸修饰。Src蛋白的反义寡核苷酸（SrcAs-ODNs）序列是:①5′ATGGGTAGCAACAAGAGCAAGCC3′；②5′CACAAGCGACGGTGAGAAGCTAA3′。Fyn蛋白的反义寡核苷酸（FynAs-ODNs）序列是:①5′CGTCAGTTTCGCTGCTTCTTT3′；②5′CGTTGTCAAGCTTGCGGATTT3′；③5′TCCAGGTACCCATCCATACTT3′。临用前混合溶于Tris-EDTA缓冲液（10mmol/LTris-Hcl，pH8

6、.0，1mmol/LEDTA）。Src蛋白的错义寡核苷酸（SrcMs-ODNs）序列是：5′ACAGAGCACCAGTGAGTAAGCAG3′，Fyn蛋白的错义寡核苷酸（FynMs-ODNs）序列是：CTCGAGTCACACCTCAATTCT3′。1.2方法1.2.1四动脉阻断全脑缺血模型按Pulsinelli［2］法进行。水合氯醛麻醉大鼠，分离双侧颈总动脉，挂线备用，然后用电凝针电凝双侧椎动脉。12h后,在大鼠清醒状态下，游离出双侧颈总动脉，用动脉夹阻断血流，缺血15min，在缺血时大鼠肛温维持在36.5～37.5℃。随机分组：①Sham组，手术不缺血

7、；②I/R6h组；③溶剂对照组（saline），脑室注射相同剂量的生理盐水；④I/R6h+SrcAs-ODNs组；⑤I/R6h+FynAs-ODNs组；⑥I/R6h+SrcMs-ODNs组。⑦I/R6h+FynMs-ODNs组。每只8只大鼠。缺血前3天经脑室注射给药，注射第3天缺血。术后再灌注6h。1.2.2脑室注射及取材SD大鼠乙醚麻醉后固定于大鼠脑定位仪上，消毒剪开头皮，暴露前囟点，钻孔脑室注射Src、FynAs-ODNs和Ms-ODNs（后开0.8mm，旁开1.5mm，深3.5mm），注射体积10μl，速度1μl/min，留针5min，以1mm/m

8、in速度取针，缝合切口。连续注射3天后缺血15min，再灌注6h，立即断头取双侧