番荔枝内酯单体desacetyluvaricin对肝癌细胞株生长和凋亡的影响

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1、番荔枝内酯单体Desacetyluvaricin对肝癌细胞株生长和凋亡的影响：陈孝银，周光雄，赵昌林，夏芳，毛慧君，江振友，敖杰男【摘要】【目的】探讨Desacetyluvaricin在体外对肝癌HpG2.2.15细胞株生长和凋亡的作用及机制。【方法】处于生长期的人肝癌HepG2.2.15细胞分为3组：对照组，Desacetyluvaricin组和顺铂组。用MTT法检测各组肿瘤细胞增殖情况，流式细胞仪检测各组细胞周期、细胞调亡以及凋亡基因Fas的表达情况，比较Desacetyluvaricin与顺铂的疗效。【结果】Desacetyluvaricin对肝癌细

2、胞增殖的抑制率高达62.2%。Desacetyluvaricin抑制肝癌细胞增殖的机制可能为阻滞肝癌HepG2.2.15细胞从G1期进入S期，从而抑制了肿瘤细胞的增殖，同时通过促进Fas表达，诱导HepG2.2.15细胞凋亡。其诱导Fas表达的效果还优于顺铂。【结论】Desacetyluvaricin可能通过延缓细胞G1期及诱导细胞凋亡等机制，对肝癌细胞的增殖有一定的抑制作用。【关键词】Desacetyluvaricin;肝癌;细胞周期;细胞凋亡;Fas基因肝癌是常见的恶性肿瘤，早期手术切除是首选的、最有效的治疗方法[1]，但多数病人发现肝癌时已属晚期，失

3、去了手术机会[2]，因此，提高肝癌病人的生存率主要依赖早期诊断、早期手术及有效的综合治疗[3]。然而，包括顺铂在内的化疗药物均尚未被证实可提高肝癌病人的生存率[4]。番荔枝内酯是从番荔枝科植物中提取的一类化合物，研究显示大多数番荔枝内酯类化合物对体外培养的肿瘤细胞普遍具有强大的细胞毒作用[5]，其中一些单体如bullatacin还可逆转肿瘤细胞的多药耐药作用[6]，番荔枝内酯的研究已经成为国内外植物化学和肿瘤药理学研究的新热点。遗憾的是，目前已提纯的番荔枝内酯类化合物单体毒性太大,其体外的抗癌活性难以在体内重复,限制了其体内抗肿瘤作用的研究[7]。Desa

4、cetyluvaricin是从番荔枝科植物中提取出的一种新型化合物单体，为白色针状晶体，分子式为C37H66O6[8]，其毒性较低。我们前期研究[9]发现含有Desacetyluvaricin的复方中药具有一定的抗乙肝病毒和肝纤维化的作用，并对一些抑癌基因的表达有一定促进作用，但是其是否对乙肝后肝癌及肝癌癌前病变有治疗或预防作用，其是否有抗肿瘤作用，以及作用机制等尚不确切。本研究采用MTT法，免疫荧光染色结合流式细胞仪，观察Desacetyluvaricin在体外对肝癌细胞株的影响，探讨其可能的作用机制。1材料和方法1.1试剂与仪器1.1.1试剂RPMI-

5、1640培养基，美国GIBCO公司。胎牛血清，中国医学科学院血液病研究所（天津）产品。胰蛋白酶，华美公司产品。四噻唑蓝、碘化丙啶（PI）及免疫荧光标记的Fas抗体，胰酶抑制酶（RNase），美国Sigma公司产品。1.1.2器材倒置显微镜，37×AZ型，上海光学仪器厂。流式细胞仪（FACS）、酶联免疫检测仪，美国BectonDickinson公司生产。相差显微镜，日本Olymapus公司产品。台式高速及低速离心机，上海医用分析仪器厂。1.1.3药物顺氨氯铂（DDP），齐鲁制药厂生产，批号（91）861-82。Desacetyluvaricin（由暨南大学药

6、学院周光雄博士提纯提供）。1.1.4癌株肝癌HepG2.2.15细胞株，购自南方医科大学肝病研究中心。1.2方法1.2.1MTT法液氮冻存的人肝癌HepG2.2.15细胞株经复苏后培养于含10％胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5％CO2培养箱中孵育。细胞贴壁生长后取对数生长期的细胞以备试验之用。选择对数生长期细胞，用0.25％胰酶消化5～8min，按每孔5×104/mL的密度加于96孔培养板中，每孔200μL。分别加入200μg/mLDesacetyluvaricin、20μg/mL顺铂每孔10μL，同时设置每孔加10μL的培养液作为对照组和不接种

7、细胞的空白孔。置37℃，5％CO2培养箱中培养96h，每24h加入MTT10μL/孔，孵育4h后弃上清液，加入DMSO150μL/孔，轻轻振荡10min左右，充分融解结晶物；在酶联免疫检测仪上以570nm波长测定各孔光吸收值（A值）,并计算不同药物对HepG2.2.15细胞的生长抑制率[10]。1.2.2流式细胞仪法对数生长期的细胞，胰酶消化后，以5×104/mL的密度传代、接种，贴壁后加入DMEM培养基培养24h，分别加入200μg/mLDesacetyluvaricin、20μg/mL顺铂每孔10μL，加等体积的培养液作为对照组；继续培养48h，胰酶消

8、化成单细胞悬液，冰PBS洗涤2次，1000×g离心5min，弃上清