大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响

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1、大鼠不同分离纯化方法对胰岛细胞丢失的影响【关键词】胰岛细胞分离纯化大鼠　　ABSTRACT:ObjectiveToexplorethebestmethodofisolatingandpurifyingratisletcellstoimprovetheharvestandpurityofratisletcells.MethodsFortyratsfourgroupsethods(A,B,CandDgroups)varianceanalysis.Interclassmultipleparisonmanifestedth

2、attheharvestinAgroupthatinGroupC.ThepurityinAgroupthatinothergroups.ConclusionTheharvestandpurityofisletcellsisolatedthroughHanksperfusionand/orcollagenaseVdigestionethods.Thecostofthismethodisloethodforisletcellisolation.　　KEYSO)溶液中，过滤分装，贮存在-20℃。取0.1mL细胞悬浊液，加

3、入Hanks液0.4mL，DTZ工作液0.5mL，充分混匀，37℃孵育10min，注入血球记数板的记数池中，记数各方格中的阳性细胞数。显微镜下对阳性细胞团进行计数，每份样取3次，求其均数，再将均数转换成整份液体内的胰岛细胞数。通过镜检胰岛悬液中胰岛数量与外分泌组织量之比来估计纯度。每份样本取0.1mL液体涂片后再倒置显微镜下记数，每份样本取5个低倍视野，求其平均值。故胰岛细胞的纯度=(DTZ阳性细胞数/所有细胞数)×100%。　　1.4统计学处理采用SPSS10.0软件，对4组进行完全随机设计的方差分析(ANOVA

4、)及多样本均数间的两两比较(LSD)，以P<0.05为差异有统计学意义。　　2结果　　2.1胰岛形态学观察分离后胰岛呈圆形或椭圆形，大小不等，形态完整，呈淡黄色，表面包被有包膜；DTZ染色后，胰岛细胞呈猩红色，外分泌组织不着色。纯化后，外分泌组织明显减少(图1)。　　图1分离后胰岛细胞的DTZ染色（略）　　Fig.1DTZdyeingofisolatedisletcells(×400)　　2.2胰岛细胞收获量和纯度完全随机设计的方差分析显示，A、B、C、D组收获量及纯度比较均有显著性差异(P<0.05)

5、；组间多重比较显示，A组收获量均高于B、D组(P<0.05)，与C组比较差异无统计学意义(P>0.05)；A组纯度与其他组比较均无显著性差异(P>0.05，表1)。　　表1分离和纯化后单个胰岛细胞的收获量及胰岛细胞纯度（略）　　Table1Extractionquantityandpurityoftheisletcellsafterseparationandpurification　　A:Hanks+collagensV+Ficoll400;B:cut+filtere;C:collagensV+F

6、icoll400;D:collagensV+filtere.△P<0.05vs.Agroup　　胰腺导管灌注消化法是较常用的一种方法。但是，大鼠的胆总管相对细小，在灌注时操作难度较大。A组采用Hanks液经胰管灌注，通过机械扩张破坏外分泌腺泡，灌注Hanks液可以防止胰腺灌注后酶溶液的外漏，有利于摘取完整的胰腺，是一种价廉有效的分离方法。B组机械研磨法操作方法简单，但是胰岛细胞获取率低，胰岛细胞的损伤大,虽然在胰岛纯度方面与A组无显著性差异，但收获量低于A组，因此直接剪取胰腺剪碎消化法不可取。C组用胶原酶直接

7、灌注消化,在机械扩张破坏外分泌腺泡的同时，也对外分泌腺起到初步消化的作用，明显提高了产量，节省时间，胶原酶用量少，收获量纯度与A组没有显著性差异，但是价格较昂贵,临床推广有一定的难度，可能原因与胶原酶灌注所需要的时间、温度和掌握经验有关。在实验中为了得到大量的胰岛细胞，在各个方法的分离消化过程中，我们严格控制温度及pH值，以达到合适的消化浓度。由于胶原酶浓度没有统一的标准，到底多少为满意的胶原酶浓度，现在没有统一的标准。我们采用1.0g/L浓度进行消化，下一步还将对胶原酶的浓度进行进一步的研究，找到合适的胶原酶浓度

8、进行消化。据张桦等[10]报道，必须严格控制消化时间、温度及pH值，消化过度的胰岛容易破碎，增加分离胰腺的困难；而消化不足易形成大量片段胶原纤维，捕获游离的胰岛，减少胰岛的收获量。张雷等[11]的经验是，为减少胶状物的形成，以获取更多的胰岛，严格控制消化温度和时间，维持pH值，消化液与胰腺的体积比大于5∶1，终止消化时Hanks量必须足够。　　另外，本文结果