阿卡波糖对糖尿病患者肠道双歧杆菌的影响

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阿卡波糖对糖尿病患者肠道双歧杆菌的影响　　【摘要】目的：探讨阿卡波糖对2型糖尿病（type2diabetesmellitus，T2DM）患者肠道菌群的影响。方法：2型糖尿病患者68例，随机分为A组（阿卡波糖治疗，34例）和B组（未服阿卡波糖，34例），利用荧光定量PCR方法测定粪便中双歧杆菌变化。结果：经3个月干预治疗，两组双歧杆菌数量均较前升高，但阿卡波糖的双歧杆菌数量升高程度更加显著，比较差异有统计学意义（P　　【关键词】2型糖尿病；阿卡波糖；肠道双歧杆菌　　有研究表明，2型糖尿病患者存在菌群失调，表现为粪便中肠杆菌科细菌增加，而双歧杆菌和类杆菌数量减少，服用阿卡波糖的患者肠道内类杆菌数量进一步减少，双歧杆菌和肠杆菌科细菌有所恢复[1]，因此推测，阿卡波糖可能通过改变肠道菌群，提高肠道有益菌群的含量、减轻缓解糖尿病。本实验旨在探讨阿卡波糖干预治疗对2型糖尿病患者肠道菌群中双歧杆菌数目的影响。　　1资料与方法　　1.1一般资料 选取符合1999年WHO诊断标准的2型糖尿病患者68例，随机分为两组：A组（34例）给予阿卡波糖50mg3次/d口服，B组（34例）给予除阿卡波糖外的降糖药，最终血糖控制相当。两组患者均无胃肠道疾患，近2周内未用过抗生素，近1个月内未用过葡萄糖苷酶抑制剂。两组在病程、年龄、BMI、血脂、血压等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。　　1.2方法　　1.2.1标本收集两组患者分别于入院时和治疗3个月后留取粪便，于-80℃冰箱保存待测，利用荧光定量PCR方法测定人肠道双歧杆菌数目的变化。　　1.2.2主要仪器设备及试剂低温高速离心机：德国Heraeus公司。紫外分光光度仪：美国SHIMADZU公司。双歧杆菌：购自辽宁生物医药公司。RT-PCR试剂盒：购自大连宝生物工程有限公司。引物由TaKaRa大连宝生物公司合成。　　1.2.3双歧杆菌提取及PCR定量分析法　　1.2.3.1DNA提取取大便0.2g加9ml的磷酸盐缓冲液充分颠倒混匀5～10min，然后低速离心（200r/min）5min取上清，上述过程重复3次，收集上清高速离心（9000r/min）3 min后取沉渣，沉淀的细菌用PBS液洗4次，水洗1次，后加蒸溜水悬浮细菌及溶菌酶破碎细胞壁，按TaKaRa试剂盒步骤提取DNA于-20℃保存待测。　　1.2.3.2PCR引物对设计如下。　　1.2.3.3标准曲线的建立将双歧杆菌16S目的基因PCR产物克隆到Pmd18-TVector（TaKaRaCodeNo.D101）上，纯化质粒，以HindⅢ限制酶进行线性化处理，得到质粒DNA标准品，再用灭菌三蒸水行10倍系列稀释，作为标准品，进行SYBRGreen为荧光染料的实时定量PCR反应。PCR反应体系（TaKaRaCode.TP800）为25μl，反应条件：95℃预变性30s，95℃变性5s，60℃退火30s，共40个循环。反应完毕后进行溶解曲线分析：95℃15s，60℃30s，95℃15s，共1个循环。根据读取的荧光数据，由系统软件iCyclerOpticalSystemInterfacesoftware（v2.0，Bio-Rda）自动分析Ct值，生成标准曲线，扩增曲线及溶解曲线。　　1.2.3.4待检粪便样品16SrDNA的定量分析 将待检粪便样品中提取的DNA分别进行两种细菌的16SrDNA荧光定量PCR反应，反应体系与反应条件与标准曲线制备时相同。每次实验同时设标准品校正和ddH2O代替DNA模板的阴性对照，每个样品均同时做3个平行复孔，反应完毕后根据溶解曲线分析PCR产物的特异性。　　1.3统计学处理统计学分析应用SPSS16.0软件，细菌数量采用秩和检验，指标用中位数及四分位数间距表示，P0.05），具有良好的可比性。见表1。　　2.23个月后两组肠道双歧杆菌数量及检验结果干预治疗前两组双歧杆菌数目比较差异无统计学意义（P>0.05），干预治疗后A组双歧杆菌数目较B组增加明显，比较差异有统计学意义（P