利用同尾酶技术构建pet15b

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1、利用同尾酶技术构建pET15b：姚玲玲，王家宁，黄永章，郭凌郧[摘要]目的:利用同尾酶技术构建pET15b-PEP-1-CAT重组质粒，为制备PEP-1-CAT融合蛋白进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定基础。方法:设计并合成两端分别带SalⅠ和BglⅡ酶切位点的CAT引物，用PCR方法以pZeoSV2(+)-CAT质粒为模板，特异性扩增CAT全长cDNA。将扩增的CATcDNA与dATP反应,利用TaqDNA聚合酶具有的非模板依赖性末端转移酶活性在CATcDNA的3′末端加"A"并纯化，然后应用TA克隆策略将纯化后的CATcDNA插入至中间载体pGEM-TE

2、asyVector中，经PCR、限制性酶切分析鉴定重组子pGEM-T-CAT。人工合成编码PEP-1的双链寡核苷酸，两端分别引入NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，将其插入pET15b中得到重组质粒pET15b-PEP-1，然后酶切鉴定。pGEM-T-CAT和pET15b-PEP-1分别经SalⅠ-BglⅡ和XhoⅠ-BamHⅠ双酶切，利用同尾酶（SalⅠ与XhoⅠ，BglⅡ与BamHⅠ）能酶切产生相同黏性末端的特性，将回收得到的CATcDNA片段与pET15b-PEP-1相连，构建出重组质粒pET15b-PEP-1-CAT，经PCR及酶切鉴定，并通过核苷酸序列测

3、序证实。结果:获得pET15b-PEP-1-CAT重组子，经测序分析证实，克隆入pET15b的PEP-1序列与设计合成的PEP-1序列一致，CAT序列与GeneBank中登录号为“AY028632”的CATcDNA序列一致。结论:pET15b-PEP-1-CAT的成功构建为产生融合蛋白Histag-PEP-1-CAT进而为防治心肌缺血再灌注损伤奠定了基础。　　[关键词]同尾酶;过氧化氢酶;TA克隆;DNA重组;PEP-1肽　　Abstract:ObjectiveToconstructtherebinantplasmidpET15b-PEP-1-CATert

4、echniqueandprovideavectorexpressingPEP-1-CATfusionproteinforthepreventionandtherapyofmyocardialischemia-reprefusioninjury.MethodUsingpfuDNApolymerase,thefull-lengthhumancatalasecDNAplifiedviaPCRfrompZeoSV2(+)-CATplasmid.ThePCRproductplate-independentterminaltransferaseactivityofTa

5、qDNApolymerase.ThepurifiedproductsofCATcDNAedintoDH5α.ThecorrectrebinantedafterpGEM-T-CAT.TidedigestedandnamedafterpET15b-PEP-1.pET15b-PEP-1andpGEM-T-CATHIandSalI-BglⅡ,respectively.ThepurifiedlinearfragmentofpET15b-PEP-1andthepurifiedCATcDNAfragmentersididedthatthePEP-1andthehuman

6、CATcDNAsequenceofpET15b-PEP-1-CATbysequencingancatalasecDNAsequenceofGeneBank"AY028632",respectively.ThepET15b-PEP-1-CATofprokaryoticexpressionplasmididprovidesabasisforproductionofHistag-PEP-1-CATfusionproteintopreventandtreatmyocardialischemiareperfusioninjury.　　Keyarker）为北京华美生物

7、工程有限公司产品。PCR引物及PEP-1的寡核苷酸链由赛百盛公司合成。　　1．1．3质粒与菌株:模板质粒pZeoSV2(+)-CAT由美国西奈山医学院生化/药理学系白景香博士惠赠；质粒pET15b购自Novagen公司；pGEM-TEasy载体系统为Promega公司产品；大肠杆菌DH5α为本室保存。　　1．2方法　　1．2．1pET15b-PEP-1-CAT构建流程图（图1）　　1．2．2PCR扩增目的片段:根据GeneBank中登录号为“AY028632”的人CATcDNA设计合成CAT的引物，两端分别直接引入SalⅠ、BglⅡ酶切位点：上游引物：5′

8、SalⅠGTCGACATGGCTGACAGCCGGGATCCCGC