苦参碱诱导a549细胞凋亡的机制研究

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1、苦参碱诱导A549细胞凋亡的机制研究【摘要】目的：观察苦参碱抑制人肺腺癌细胞A549的增殖作用，并探讨其分子机制.方法：采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法、电子显微镜、细胞周期分析法检测A549细胞凋亡；采用流式细胞术(FCM)测定细胞Bcl2,Bax及caspase3蛋白表达水平.结果：苦参碱对A549细胞的增殖具有明显的抑制作用，并呈现剂量和时间依赖关系；电镜观察呈现典型的凋亡形态改变；细胞周期分析显示细胞增殖发生S/G2期阻滞；苦参碱能显著降低Bcl2蛋白表达(P<0.01)；而显著升高Bax蛋白表达水平及caspase3活性.结论：苦参碱可显著抑制A549

2、细胞的增殖并诱导其凋亡，其机制可能与下调Bcl2表达水平改变线粒体膜通透性有关.【关键词】苦参碱；肺腺癌；凋亡；Bcl2；Bax；caspase3　　【Abstract】AIM:TostudytheinhibitoryeffectofmatrineontheproliferationofA549lungadenocarcinomacellsanditsmechanism.METHODS:MTTassay,electronmicroscopy,andcellcycleanalysisinetheapoptosisinA549cells.ExpressionlevelsofBc

3、l2,Baxandcaspase3proteinseasuredetry.RESULTS:MatrineexertedantiproliferativeactivityonA549cellsinadoseandtimedependentmanner.TypicalapoptoticmorphologicalchangesofA549lungadenocarcinomacellsicroscope.CellcycleanalysisindicatedthatSphaseproportionaticallydecreased(P<0.01)atrine.CONC

4、LUSION:Matrinecanexertthesignificantgroeabilityofmitochondrialmembrane.　　【Keyatrine;lungadenocarcinoma;apoptosis;Bcl2;Bax;caspase3　　0引言　　苦参碱作为中药苦参的主要活性成分，临床主要用于镇痛、抑菌、抗病毒以及防治肝纤维化.近年研究显示，苦参碱具有明显的抗肿瘤作用［1-2］.雷怀定等［3］研究发现苦参碱对体外人肺癌A549细胞具有增殖抑制作用，我们观察苦参碱诱导人肺癌A549细胞凋亡及其机制，为苦参碱用于临床抗肿瘤提供理论依据.　　1材料和方法　

5、　1.1材料　　苦参碱购自宁夏盐池，配制为20g/L的无菌溶液备用.MTT购自Sigma公司.流式细胞术（floetry,FCM）用mAb（FITCconjugatedmouseantihumanBaxmonoclonalantibodyandIgG1isotypecontrol,FITCconjugatedAmericanHamsterantihumanBcl2monoclonalandAmericanHamstermonoclonalIgGisotypecontrol）为美国Caltag产品.A549细胞株购自中科院上海细胞生物学研究所.细胞贴壁生长于含100mL

6、/L小牛血清（杭州四季青生物工程公司）的RPMI1640（GibcolBRL公司）完全培养基中，用含2.5g/L胰酶的消化液进行传代,置37℃,50mL/LCO2孵箱中培养.实验时选用对数生长期细胞.　　1.2方法　　1.2.1细胞增殖活性检测采用MTT比色法，将细胞密度调整为1×108/L，接种于96孔培养板（Costar），每孔100μL,实验组分别加入不同浓度（30,60,120,240mg/L）苦参碱,对照组加入等体积PBS,另设培养液对照组,每组4个复孔,饱和湿度条件下,37℃,50mL/LCO2培养箱中培养,分别于24,48,72h加入MTT10μL/孔.继续培养4

7、h，每孔加入100mL/L的SDS100μL终止培养，37℃过夜，用酶联免疫检测仪测定570nm波长处A值，计算细胞生长抑制率和半数抑制浓度（IC50）.细胞经240mg/LMATRINE作用48h后用2.5g/L胰酶消化，收集细胞悬液离心（900r/min）5min，30g/L冷戊二醛固定48h，10g/L四氧化锇染色，经梯度脱水，Epon812包埋，超薄切片，铀铅双染子显微镜（JEM1230，日本电子公司）观察细胞超微结构，美国Gatan公司CCD采集系统照相［4］.　　1.2.2细胞