人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究

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1、人脐带间充质干细胞的分离培养及向成骨成脂分化的实验研究：孙国栋，李志忠，王晶，林永新，洪亮，吴波文，焦根龙，邵建立【摘要】　　目的探讨并优化人脐带间充质干细胞(hUCMSCs)体外获取及培养增殖的方法并鉴定；诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化，为其进一步应用奠定基础。方法用酶消化法分离培养hUCMSCs，通过传代培养、扩增，倒置光学显微镜及原子力显微镜下观察细胞形态；MTT法检测细胞增殖曲线，流式细胞仪检测免疫表型；体外向成骨、脂肪方向诱导分化，并通过特异性染色鉴定其分化能力。结果采用酶消化法能有效分离纯化hUCMSCs。接种24h，贴壁细胞形态多为

2、长梭型、多边形或成纤维细胞样形态，大小均一。P3、P7代细胞的生长曲线基本一致，增殖能力强。流式细胞仪分析，第3代细胞强烈表达CD29、CD44、CD105，不表达CD34、CD45和HLADR。经成骨诱导分化后4周，碱性磷酸酶染色呈强阳性，茜素红染色可见明显钙结节；经成脂诱导3周，油红O染色呈阳性，有明显的脂滴出现。结论本实验建立了一套体外稳定培养扩增hUCMSCs的方法。所培养的细胞成分单一、扩增迅速、生物学形状稳定，并能使其在体外诱导向成骨细胞和脂肪细胞分化，有望成为组织工程较为理想的种子细胞。【关键词】脐带；间充质干细胞；分化；成骨细胞

3、；脂肪细胞　　ABSTRACT:ObjectiveToestablishanoptimizedmethodtoisolate,cultureandidentifyhumanumbilicalcordmesenchymalstemcells(hUCMSCs)invitroandinducetheirosteogenicandadipogenicdifferentiation.MethodsThehUCMSCshumanumbilicalcordbydigestioncellsicroscopeandatomicforcemicroscope.The

4、proliferationrateeasuredbyMTTassay.Cellcycleandsurfaceantigenseasuredbyfloetry.Theosteogenicandadipogenicdifferentiationethods.ResultsTheisolationofhUCMSCsbydigestionogeneous.ThesimilargroetryanalysisrevealedthatCD29,CD44andCD105edium,thecellsineralizationpresentedore,liquidv

5、acuolesethodforisolationandpurificationofhUCMSCsfromhumanumbilicalcordhasbeenestablished.Theculturedcellscellsoftissueengineering.　　KEYSCs);differentiation;osteocyte;adipocyte　　人脐带间充质干细胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells,hUCMSCs)是一类具有自我更新、增殖和多向分化潜能的干细胞,具有丰富，易于采集、保存和运输，无异

6、体排斥，避免伦理争议等诸多优点。大量研究表明，hUCMSCs具有多向分化潜能，在体内外可以分化为骨细胞、软骨细胞、肝细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞以及神经元细胞等[1]。因此，其在组织工程、造血干细胞移植以及基因治疗等领域具有广阔的应用前景，成为干细胞研究的热点。本研究探讨hUCMSCs的体外分离、纯化、扩增以及定向分化条件，为hUCMSCs在组织工程中的进一步应用提供理论依据和技术支持。　　1材料与方法　　1.1材料　　Ⅱ型胶原酶(GIBCO，美国)；DMEM/F12培养基(HYCLONE，美国)；胎牛血清(HYCLONE，美国)；地塞米松、吲哚美

7、辛、胰岛素、β甘油磷酸钠和抗坏血酸(Sigma，美国)。恒温恒湿培养箱(SHELLAB，美国)；倒置相差显微镜(Olympus，日本)；原子力显微镜(THERMO，美国)；流式细胞仪(BectonDickinson，美国)；恒温摇床(哈尔滨市东明医疗仪器厂)；超净工作台(苏州净化设备厂)；培养瓶、培养皿、离心管(Corning，美国)。　　1.2方法　　1.2.1hUCMSCs的分离与培养　　从手术台取正常足月产健康婴儿脐带组织(根据医院规定并经家属同意)，浸泡于DMEM中。超净台内取出脐带，DHanks平衡液充分洗涤残留的血液，去除脐静脉

8、、脐动脉及脐带外膜，剥离EM，在37℃恒温震荡仪内消化，直至EM反复吹打稀释，1500r/min离心10min，弃上清液，用含150mL