脂质体转染技术步骤

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1、脂质体转染实验步骤脂质体（LR）试剂是阳离子脂质体DOTMA和DOPE的混合物（1：1）。它适用于把DNA转染入悬浮或贴壁培养细胞中，是目前条件下最方面的转染方法之一。转染率高，优于磷酸钙法，比它高5-100倍，能把DNA和RNA转染到各种细胞。用LR进行转染时，首先需要优化转染条件，应找出该批LR对转染某一特定细胞适合的用量、作用时间等，对每批LR都要做。先要固定一个DNA的量和DNA/LR混合物与细胞相互作用的时间，DNA可从1-5ug和孵育时间6h，开始，按这两个参数绘出相应LR需用量的曲线，再选用LR和DNA两者最佳的剂量，确定出转染时间。因LR对细胞有一定的毒性，转染时间以不

2、超过24h为宜。细胞种类：COS-7、BHK、NIH-3T3、Hela和Jurkat等任何一种细胞均可作为受体细胞。1、操作步骤（方法一）：（1）细胞培养：取6孔培养板，向每孔中加入2ml含（1-2）x10^5个细胞的培养基，37℃、18%CO2培养基40%-60%汇合时。（2）转染液制备：在聚苯乙烯管中制备以下两液（为转染1个空细胞所用的量）。A液：用不含血清培养基稀释DNA使浓度为1-10ug，终量100ul。B液：用不含血清培养基稀释LR，使终浓度为2-50ug，终量100ul。轻轻混合A液、B液，室温中置10-15min，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。（3）转染准备：用2

3、ml不含血清培养基漂洗2次，再加入1ml不含血清培养基。（4）转染：把A/B复合物缓缓加入培养基中，摇匀，置37℃温箱中6-24h，吸除无血清转染液，换入正常培养基继续培养。（5）其余处理：如观察、筛选、检测等与其他转染法相同。（6）注意：转染时切勿加血清，血清对转染效率有很大影响。2、快速脂质体转染法操作步骤（方法二）：l       将细胞以5x10^5个/孔接种于6孔板中培养24h，使其达到50%-60%板底面积。l       在试管中配制DNA-脂质体复合物。a、在1ml无血清DMEM中稀释PSV1-neo质粒DNA或供体DNA。b、旋转1s，再加入脂质体悬液，旋转。c、室温

4、下放置5-10min，使DNA结合在脂质体上。l       弃去细胞中的旧液，用1ml无血清DMEM洗细胞1次后弃去，向每孔中直接加入1mlDNA-脂质体复合物，37℃培养3-5天。l       再于每孔中加入含20%胎牛血清的DMEM，继续培养14-24h。l       吸出DMEM-DNA-脂质体混合物加入新鲜含10%胎牛血清的DMEM，2ml/孔，再培养24-48h。l       用细胞刮或消化法收集细胞，以备分析鉴定。3、稳定的脂质体转染法：l       接种细胞同前述，细胞长至50%板底面积可用于转染。l       DNA-脂质体复合物制备转染细胞同前。l    

5、   在每孔中加入1ml含20%胎牛血清的DMEM，37℃培养48h。l       吸出DMEM，用G418选择性培养基稀释细胞，使细胞生长一定时间，筛选转染克隆，方法参照细胞克隆筛选法进行。细胞转染技术总述一、细胞转染途径转染大致可分为物理介导、化学介导和生物介导三类途径。电穿孔法、显微注射和基因枪属于物理介导技术；化学介导方法很多，如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体 转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法，有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。1、   物理介导（1）   电穿孔法：靠脉冲电流在细胞膜上打孔而将核酸导入细胞。优点：转染效率较高缺

6、点：需要昂贵的仪器（电穿孔仪）；对细胞的损伤较大，每次转染需要更多的细胞和DNA；每种细胞电转的条件都需要进行多次优化。（2）显微注射：借助显微注射器直接把DNA注入核内，使之整合入受体细胞基因组中。优点：转染效率高，可用于瞬时转染和稳定转染缺点：导入DNA时需要一个细胞一个细胞注射，不适合大量转染（3）基因枪：依赖携带了核酸的高速粒子将核酸导入细胞内。2、 化学介导（1）磷酸钙共沉淀法：磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面结合，氯化钙+DNA+磷酸缓冲液按一定的比例混和，形成极小的磷酸钙-DNA复合物沉淀黏附在细胞膜表面，借助内吞作用进入细胞质。沉淀颗粒的大小和质量对于转染的成功至

7、关重要。优点：能用于任何DNA导入哺乳类动物，瞬时转染和稳定转染。缺点：转染效率低：进入细胞的DNA只有１％－５％可以进入细胞核，其中只有不到１％的DNA可以与细胞DNA整合，在细胞中进行稳定表达。重复性不佳：pH值、钙离子浓度、DNA浓度、沉淀反应时间、细胞孵育时间乃至各组分加入顺序和混合的方式都可能对结果产生影响。（2）   脂质体转染法：中性脂质体是利用脂质膜包裹DNA，借助脂质膜将DNA导入细胞膜内。带正电的阳离子脂质体，DNA并没有预