免疫组化实验步骤

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1、免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。（一）、仪器设备1.18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1.PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L,Na2HPO44.3mmol/L,KH2P

2、O41.4mmol/L.2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。3．0.5mol/LEDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA&8226;2H2O,用10mmol/LNaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4.1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水1000ml。5.酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。6.3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2

3、O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBSPH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。a组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b无水乙醇中浸泡五分钟c95%乙醇中浸泡五分钟d75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A抗原热修复a高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph

4、6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。b沸热修复电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。c微波炉加热在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原：Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.Chromograni

5、nA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等B酶消化方法常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括Collagen.GFAP.Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等3、免疫组化染色SP法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2-3次各5分钟（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟（4）PBS洗2-3次各5分钟（5）抗原修复（6

6、）PBS洗2-3次各5分钟（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（8）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟（10）PBS洗3次每次2分钟（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的tween-20.（13）PBS洗3次各5分钟（14）DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度（15）PBS或自来水冲洗10分钟（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗10-15分钟（18）脱水、透明、封片、镜检。4、SABC法（1）脱蜡、水化（2）PBS洗2次各5分钟（3）用蒸

7、馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复（5）PBS洗5分钟（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃20分钟（10）PBS洗3次各2分钟（11）滴加试剂SABC20℃-30℃20分钟（12）PBS洗4次各5分钟（