成骨细胞分化调控概览

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1、TheRegulatoryLandscapeofOsteogenicDifferentiationAbstract间质干细胞（MSCs）向成骨细胞的分化是骨发育和动态平衡的一个完整的部分，当它被不恰当地调控时，可能产生疾病，比如骨癌或骨质疏松。利用无偏倚的高通量方法，我们描述了在人类MSCs向骨谱系分化的过程中，基因表达，组蛋白修饰，以及DNA甲基化方面整体改变的图景。此外，我们第一次提供了一份基因组范围上的，关于骨主要调控转录因子Runt相关转录因子2（RUNX2）在人类成骨细胞中DNA结合位点的描述，显示出目标基因与增殖，迁移及凋亡调控有关，并与p53调控的基

2、因有明显的重叠。这些发现扩展了正在出现的证据，这些证据是关于RUNX2在癌症，包括骨代谢，以及p53调控网络中有作用的。我们进一步揭示了RUNX2结合在远端的调控元件，启动子上，还有很高的频率结合在基因的3’末尾上。最后，我们识别出了TEAD2和GTF2I是一种新的成骨调控因子。Introduction间质干细胞或者基质细胞（MSCs）有多谱系潜能，可以向成骨，成脂，成软骨，还有其它谱系分化（1）。MSCs出现在骨髓和其它间质组织中，可能迁移到损伤或炎症处，参与组织修复（2）。MSCs可在体外条件下被纯化并向成骨细胞分化，这为从分子上研究成骨提供了方便的工具（1）

3、。关于这一过程的更多知识，对基础研究及MSCs在骨骼再生医学上的临床应用都是十分重要的（3），同样地，理解它在骨病中失调的情况也很重要，比如说癌症。在这点上，非常有意思的是骨肉瘤，最常见的骨原发恶性肿瘤，可能是由基因及表观遗传上的改变打断了MSCs向成骨的分化所致（4）。干细胞分化受基因表达的变化所高度调控，这种变化在转录水平上与DNA或染色质结合在转录调控子上有关，或是与染色质图像的局部改变有关（5~7）。高通量方法的发展，比如RNA测序（RNA-Seq），以及染色质免疫沉淀及测序（CHIP-Seq），使人们可以对这种改变。在基因组水平上进行描述（8，9）举例来

4、说，RNA-Seq可以系统性地发现启动子与外显子的轮流使用（10），而CHIP-Seq显示特定的组蛋白修饰区域，以及这些变化是如何改变基因活性的（5，8）。CHIP-Seq也使人们可以发现基因组结合位点，并为广泛的转录因子（TFs）寻找目标基因（11，12）。此外，综合基因组分析可以在整个基因组中识别功能区域，比如启动子和增强子，这些成果又可以被用来丰富新的转录因子结合位点（TFBS）分布，以帮助发现新的生物过程调控因子（5）。在单倍体RUNX2缺乏患者中的骨骼发育缺陷（13），或是Runx2缺合子（nullizygous）小鼠中骨化骨的缺失（14，15），揭示了

5、RUNT相关转录因子2（RUNX2，即CBFA1）对于骨的发育是不可或缺的。在成骨中，RUNX2涉及调控增殖，迁移，定型，以及向成骨谱系的分化（16~19）。RUNX2对上游信号起反应，调控基因的表达，这些上游信号包括TGFB，BMP及Wnt信号通路（20~23）；但是，成骨细胞中的下游目标被描述得就没有那么好。除了它在发育和失调中的作用，RUNX2还为人所知的是涉及肿瘤形成；RUNX2与MYC原癌基因协同，在造血谱系中启动瘤变发生（24），近期的证据提示在乳腺癌和前列腺癌细胞中，RUNX2的肿瘤生长和代谢属性（25~27）。在骨肉瘤中，RUNX2常常是过度表达的

6、，这与预后不良有联系（28）。有趣的是，关于RUNX2和p53相互作用的证据开始浮现，包括因DNA损伤所致的RUNX2抑制p53介导的基因表达（29），以及p53依赖性RUNX2蛋白水平调控的证据（30）。我们描述了从非肿瘤生成性，不死化的MSC细胞系向成骨分化过程中的转录组及表观基因组上的特征。此外，我们第一次报导了骨主要调控因子RUNX2在人类成骨细胞中的基因组范围的结合位点，并揭示了2000多个目标基因，这些目标基因为研究骨生物学中RUNX2的转录调控作用提供了新的亮光。我们也利用组蛋白CHIP-Seq产生的表观基因组特点来识别与分化诱导性染色质改变有关的启

7、动子，并预测TEAD2和GTF2I是这些启动子的新调控因子。最后，通过沉默TEAD2和GTF2I的表达，我们确认了这些转录因子在调控成骨分化方面的作用。MaterialsandMethods暂略RESULTSiMSC#3细胞向成骨谱系分化引起基因表达的整体改变为了研究从MSCs开始的成骨分化，我们使用了我们实验室产生的非肿瘤形成性细胞系（iMSC#3），办法是通过端粒酶的异位表达（Skarnetal.,manuscriptsubmittedforpublication）从而不死化。这个细胞系可以受转录操控，并且在多次传代后仍然有多谱系分化潜能。甚至，在基因表达水平

8、上，iMS