去透明带仓鼠卵母细胞穿透试验

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1、去透明带仓鼠卵母细胞穿透试验人精子与仓鼠卵母细胞融合的过程在功能上同与人卵母细胞融合的过程是一样的，因为与卵母细胞质膜融合的过程都是通过质膜覆盖在已发生顶体反应的人精子赤道段而启动的。仓鼠卵母细胞穿透（HOP）试验，或称精子穿透试验，由于去除了透明带，因此它不等同与生理状态。此试验的标准方案见后。注释：常规穿卵试验是依赖精子的自发性顶体反应而实现的，这需要延长精子在体外的孵育时间。由于此步骤不如生理过程有效，且可能涉及不同的机制，因此常常出现假阴性结果（病人的精子在仓鼠卵母细胞穿透试验中失败，而在体内或体外可使人的卵母

2、细胞授精，WHO，1986）。尽管如此，穿卵试验仍可以反应获能精子头部质膜与卵细胞膜发生融合能力的信息。继精子-透明带之间的相互作用后，引起顶体反应的细胞内信号是钙内流和胞浆碱化，两者均可由二价阳离子载体A23187人工诱发。另一种方法是使用A23187激发的精子，该方法在文中亦有所描述。4.5.1实验方案4.5.1.1试剂1．BWW储存液：见附录4，A4.1节。2．透明质酸酶（300-500IU/mg）。3．Ⅰ型胰酶（10000BAEEU/mg）。4．蜡块（融点为48-66℃）。5．凡士林6．矿物油7．去除透明带的仓

3、鼠卵：可购买商品化的卵或通过对仓鼠超排卵获得。（见框4.1）8．二甲基亚砜（DMSO）。9．钙离子载体（用于可选择方案）1mm储存液。4.5.1.2不用钙离子载体的标准方案1．将精液标本混合均匀。（见框2.3）2．用密度梯度离心法（见5.5节）或上游法处理精液标本（见5.4节）。3．弃去大部分上清液，留下沉淀。4．轻轻吹打重悬精子沉淀，并计数精子密度。（见2.7节和2.8节）5．在约0.5ml培养液中将精子密度稀释至约10×106/ml。6．将试管倾斜，与水平面呈45°角，以增加气体交换面积。7．精子悬液置于含5%（V

4、/V）CO2的37℃孵箱中培养18-24小时，使精子获能。（将试管盖子拧松以利于气体交换）。如果没有CO2孵箱，可用Hepes缓冲的培养液并将试管盖拧紧后，于37℃孵育。8．将试管复原到垂直位，放置20分钟使获能后不动的精子沉淀下来。9．从液面顶部1/3吸取活动精子转移到另一新试管中，注意要小心操作，不要搅动起下部的死精子。10．在培养液中调整活动精子密度至3.5×106/ml。11．每滴吸取50-150µl精子悬液，缓慢地加入到一个小的Petri盘中；用一次性吸头吸取已经预温并在CO2孵箱中平衡好的矿物油覆盖液滴，小

5、心操作不要搅动精子液滴，并保证加入足够的矿物油以覆盖每一滴精子悬液。4.5.1.3掺入钙离子载体的可选择方案1．用密度梯度离心法制备获得高活力的精子悬液，详细描述见5.5节。2．从80%密度的梯度离心液底部吸取沉淀物，并转移至8mlBWW液中。3．500g离心5分钟。4．弃去沉淀上方大部分上清液，轻轻吹打重悬沉淀物。5．计数精子密度（见2.7和2.8节）,用新鲜配制的BWW液将活动精子密度稀释至约5×106/ml。6．分别加入1.25和2.5µlA23187储存液（1mmol/l）至1ml精子悬液中，达到1.25和2.

6、5µmmol/l两个终浓度。7．精子与钙离子载体于37℃条件下孵育3小时。8．500g离心细胞5分钟。9．弃去沉淀上方大部分上清液，轻轻吹打重悬沉淀物。10．评估精子活动率。11．用新鲜配制的BWW液将活动精子密度稀释至约3.5×106/ml。活动精子密度低于1×106/ml时仍可以获得有效结果（Aitken&Elton,1986）。12．将精子液滴用矿物油覆盖，详细描述见4.5.1.2,步骤11。注：钙离子载体处理的剂量-效应曲线有个体差异，因此最好两个浓度的钙离子载体都检测。框4.1仓鼠诱导排卵确保注射活体动物的流

7、程都符合法律程序。准备好合适剂量的孕马血清（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素溶液。小量分装后储存于-20℃备用。经腹腔注射30单位PMSG给未成熟仓鼠或动情期第一天的成熟仓鼠。48-72小时后，经腹腔再注射40单位的hCG。用一只手抓住动物背部并向腹部上方拉紧腹部皮肤，另一只手拿一个带21号针头的1ml注射器将激素注入仓鼠腹腔（从髋关节上方进针）。注射每只动物都更换针头，这样易于穿透皮肤并减轻动物的不适。4.5.1.4收集卵巢1．注射hCG后18小时内，按照动物饲养使用委员会批准的方法处死动物以回收卵母细胞。2．仓鼠腹部

8、朝上放置，用95%（v/v）酒精蘸湿腹部皮毛。3．用齿镊夹住皮肤，用剪刀剪开皮肤和肌肉，暴露子宫及卵巢。4．用95%酒精擦拭镊子和剪刀，擦净上面的毛发。5．将小肠拉出腹腔，暴露双角子宫。6．用镊子夹住双角子宫的一边，将其拉出腹腔外以暴露输卵管、卵巢及卵巢韧带。7．持住子宫最远端的位置，紧贴镊子下方从子宫末端切断。切下卵巢，放入装有