微生物学实验讲义

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1、目录实验一微生物制片及形态观察1一、显微镜油镜的使用1二、细菌简单染色法及形态观察3三、革兰氏染色法6四、细菌的芽孢染色8五、放线菌的形态结构观察10六、霉菌的形态结构观察11七、酵母菌的形态结构观察12实验二微生物显微计数及活菌观察13一、血球计数板的使用及酵母菌的显薇计数（暗视野）13二、大肠杆菌活菌的运动观察15三、放线菌及霉菌的水悬液观察17实验三培养基的配制及灭菌18一、培养基的常规配制程序19二、细菌、放线菌常用培养基的配制24三、酵母菌、霉菌常用培养基的配制26四、高压蒸汽灭菌28实验四微生物的分离与纯化31一、微生物的接种技术32二、土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离

2、与纯化37实验五环境因素对微生物生长的影响45实验六微生物深层培养生产α-淀粉酶及其酶活测定47实验七链霉素发酵及管碟法测定生物效价微生物发酵50实验八硫酸二乙酯对枯草芽孢杆菌产生α-淀粉酶的诱变效应55附15升发酵罐操作示范5859实验一微生物制片及形态观察一、显微镜油镜的使用显微技术是微生物检验技术中最常用的技术之一。显微镜的种类很多，在实验室中常用的有：普通光学显微镜、暗视野显微镜、相差显微镜、荧光显微镜和电子显微镜等。1.结构光学显微镜是由光学放大系统和机械装置两部分组成。光学系统一般包括目镜、物镜、聚光器、光源等；机械系统一般包括镜筒、物镜转换器、镜台、镜臂和底座等（图1－1）

3、。图1－1　光学显微镜结构图标本的放大主要由物镜完成，物镜放大倍数越大，它的焦距越短。焦距越小，物镜的透镜和玻片间距离（工作距离）也小。油镜的工作距离很短，使用时需格外注意。目镜只起放大作用，不能提高分辨率，标准目镜的放大倍数是十倍。聚光镜能使光线照射标本后进入物镜，形成一个大角度的锥形光柱，因而对提高物镜分辨率是很重要的。聚光镜可以上下移动，以调节光的明暗，可变光栏可以调节入射光束的大小。59显微镜用光源，自然光和灯光都可以，以灯光较好，因光色和强度都容易控制。一般的显微镜可用普通的灯光，质量高的显微镜要用显微镜灯，才能充分发挥其性能。有些需要很强照明，如暗视野照明、摄影等，常常使用卤

4、素灯作为光源。2.原理显微镜的放大效能（分辨率）是由所用光波长短和物镜数值口径决定，缩短使用的光波波长或增加数值口径可以提高分辨率，可见光的光波幅度比较窄，紫外光波长短可以提高分辨率，但不能用肉眼直接观察。所以利用减小光波长来提高光学显微镜分辨率是有限的，提高数值口径是提高分辨率的理想措施。要增加数值口径，可以提高介质折射率，当空气为介质时折射率为1，而香柏油的折射率为1.51，和载片玻璃的折射率（1.52）相近，这样光线可以不发生折射而直接通过载片、香柏油进入物镜，从而提高分辨率。显微镜总的放大倍数是目镜和物镜放大倍数的乘积，而物镜的放大倍数越高，分辨率越高。3.使用方法1）低倍镜观察

5、先将低倍物镜的位置固定好，然后放置标本片，转动反光镜，调好光线，将物镜提高，向下调至看到标本，再用细调对准焦距进行观察。除少数显微镜外，聚光镜的位置都要放在最高点。如果视野中出现外界物体的图像，可以将聚光镜稍微下降，图像就可以消失。聚光镜下的虹彩光圈（即可变光栏）应调到适当的大小，以控制射入光线的量，增加明暗差。2）高倍镜观察显微镜的设计一般是共焦点的，低倍镜对准焦点后，转换到高倍镜基本上也对准焦点，只要稍微转动微调即可。转换物镜后，要同时调节虹彩光圈的大小，使之与所使用物镜放大倍数相同的刻度。稍微上下移动聚光镜，观察图像是否清晰。3）油浸镜观察　　油浸镜的工作距离很小，所以要防止载皮片

6、和物镜上的透镜损坏。使用时，一般是经低倍、高倍到油浸镜。当高倍物镜对准标本后，再加油浸镜观察。载玻片标本也可以不经过低倍和高倍物镜，直接用油浸镜观察。显微镜有自动止降装置的，载玻片上加油以后，将油浸镜下移到油滴中，到停止下降为止，然后用微调向上调准焦点。没有自动止降装置的，对准焦点的方法是从显微镜的侧面观察，将油浸镜下移到与载玻片稍微接触为止，然后用微调向上提升调准焦点。使用油浸镜时，镜台要保持水平，防止油流动。油浸镜所用的油要洁净，聚光镜要提高到最高点，并放大聚光镜下的虹彩光圈，否则会降低数值口径而影响分辨率。无论是油浸镜或高倍镜观察，都宜用可调节的显微镜灯作光源。4.注意事项显微镜是

7、精密贵重的仪器，必须很好地保养。显微镜用完后要放回原来的镜箱或镜柜中，同时要注意下列事项：1）观察完后，移去观察的载玻片标本。2）用过油浸镜的，应先用擦镜纸将镜头上的油擦去，再用擦镜纸蘸着二甲苯擦拭2—3次，最后再用擦镜纸将二甲苯擦去。3）转动物镜转换器，放在低倍镜的位置。594）将镜身下降到最低位置，调节好镜台上标本移动器的位置，罩上防尘套。镜头的保护最为重要。镜头要保持清洁，只能用软而没有短绒毛的擦镜纸擦拭。擦镜纸要放在纸盒中，