酿酒酵母发酵高浓度乳清粉产乙醇的研究

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1、分类号Q815学位代码308学校代码10298密级GK学号3140223硕士学位论文论文题目：酿酒酵母发酵高浓度乳清粉产乙醇的研究作者：孙叶专业：生物化工研究方向：发酵工程指导老师：欧阳嘉教授二○一七年六月致谢时光荏苒，我的硕士生涯已接进尾声。三年来，感谢陪我一起度过美好时光的各位良师益友。正是你们的帮助，我才能克服困难，正是你们的指导，我才能解决疑惑，直到学业的顺利完成。本人的学位论文是在我的恩师欧阳嘉教授和郑兆娟副教授的殷切关怀和耐心指导下进行并完成的。从课题的选择、项目的实施，直至论文的最终完成，倾注了两位老师大量的心血。恩师开阔的视野、严谨的治学态度、精益求精的工作

2、作风，深深地感染和激励着我，在此谨向两位恩师致以衷心的感谢和崇高的敬意。于此同时，感谢生化研究所全体老师生化研究所提供了良好的实验条件与工作秩序，尤其要感谢连之娜和陈牧老师在公共设备安全维护上的特殊贡献，是你们的默默奉献保证了我课题的顺利开展。此外，感谢朝夕相处的108和107实验室所有兄弟姐妹。三年来，感谢你们创造的欢乐融洽的实验室环境，也感谢你们给予我学业和生活上的所有关心和帮助。特别感谢姜婷师姐，臧颖师姐，徐颖师姐，梅文鼎师兄在课题上给与的帮助与指导。同窗之谊，我将终生难忘！作者：孙叶二○一七年六月二日摘要奶酪乳清是牛奶奶酪加工过程中的一种副产物，其富含乳糖（4.5-

3、5%，w/v）、可溶性蛋白质和脂质。世界年产乳清约9×107t，由于乳清的生化需氧量和化学需氧量都很高，乳清被认为是一种严重的环境污染物。近年来开发的乳清乳糖为发酵原料获取增值产品吸引了广泛的关注。乳清粉是乳清浓缩干燥的产物。其营养物质浓度高、可以长期稳定放置、乙醇得率高，是一种更好的乙醇生产原料。本论文探讨了以乳清粉为原料、以酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）为菌种，发酵制备乙醇的工艺条件。主要包括以下几部分研究工作：（1）鉴于酿酒酵母无法直接利用乳糖，需要借助于β-半乳糖苷酶将其分解为葡萄糖和半乳糖后方可发酵，本论文首先克隆了来源于Bacillu

4、scoagulanNL01的β-半乳糖苷酶基因（Gal），并在E.coliBL21(DE3)实现了诱导表达。该酶以水解活性为主，最适温度和pH为60oC和6.0。在pH6.5-8.0时β-半乳糖苷酶的pH稳定性最好。以oNPG为底物时重组β-半乳糖苷酶比酶活为666.35U/mg。Mn2+对酶活性具有显著促进作用；Ca2+、Zn2+、Cu2+对其有较强的抑制作用；Na2+、K+、Mg2+、Co2+、Ni2+则无显著影响。（2）利用酿酒酵母NL22对乳清粉进行分步糖化发酵（separatehydrolysisandfermentation,SHF）和同步糖化发酵（simult

5、aneouslysaccharificationandfermentation,SSF），对其生产燃料乙醇的条件进行了比较，分别考察了pH、温度和底物浓度对SHF和SSF过程的影响。结果表明，SHF工艺和SSF工艺都可以实现酿酒酵母NL22对高浓度乳清粉的发酵。对于分步糖化发酵，以含200g/L乳糖的乳清粉为底物，其酶解阶段的最适pH为6、最适温度为60oC、最适β-半乳糖苷酶用量为10U/g乳糖；发酵84h后，所得乙醇浓度为60.36g/L，产率为0.72g/L/h。对于同步糖化发酵，以含200g/L乳糖的乳清粉为底物，其最适pH为6，最适温度为30oC;发酵36h后，最

6、终乙醇浓度为58.58g/L，产率为1.63g/L/h。对于补料同步糖化发酵，含400g/L乳糖的乳清粉可生产118.52g/L的乙醇，产率为1.74g/L/h。与分步糖化发酵相比，同步糖化发酵生产乙醇可明显缩短生产周期，提高生产效率。（3）以酿酒酵母细胞壁蛋白α-凝集素为锚定蛋白，将BacilluscoagulanNL01β-半乳糖苷酶基因成功展示在S.cerevisiaeEBY100的细胞表面。对重组酿酒酵母EBY100/pYD1-Gal的诱导表达发现，经过25°C诱导48h，表面展示的β-半乳糖苷酶最高酶活为1.27U/mL，比酶活为3.30U/mg细胞干重，最适pH

7、为6，最适温度60°C。关键词：乳清粉；乙醇；酿酒酵母NL01；β-半乳糖苷酶；同步糖化发酵IStudyontheProductionofEthanolfromHighConcentrationofWheyPowderbySaccharomycescerevisiaeAbstractCheesewheyisabyproductintheprocessofmilkcheeseprocessing,itsrichinlactose(4.5-5%,w/v),solubleproteinandlipid.Theworlda