细胞内钙在人胃癌细胞缺氧诱导因子1表达及转录激活中的作用

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1、细胞内钙在人胃癌细胞缺氧诱导因子1表达及转录激活中的作用：兰梅，时永全，韩者艺，宁晓喧，樊代明【摘要】目的观察细胞内钙变化对氧调节性亚单位HIF1α表达及其HIF1转录激活的影响。方法常氧时，采用通透性细胞内钙的螯合剂BAPTAAM或钙的离子载体Ionomycin降低或升高细胞内钙，用edicine,theAffiliatedHospitalofMedicalCollegeofShaoxingUniversity,Shaoxing312000,China;InstituteofDigestiveDiseaseStateKeyLaboratoryofCance

2、rBiology,XijingHospital,FourthMilitaryMedicalUniversity　　Abstract：ObjectiveTostudythepossiblerolesofchangedintracellularcalciumlevelinSGC7901cellsonHIF1αexpressionandHIF1transcriptionalactivity.MethodsUndernormoxicconditions,theproteinexpressionofHIF1αinSGC7901cellsaftertreatmentean

3、tCa2+chelator),orionomycin(ancalciumionophore)ycinonnuclearlocationofHIF1α,HIF1luciferaseactivityasinedbyindirectimmunofluorescenceassay,dualluciferasereportersystemandenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)respectively.ResultsDecreasingtheintracellularcalciumlevelbyBAPTAinducedHIF1α

4、nuclearaccumulation,stimulatedHIF1dependenttranscriptionandenhancedexpressionofVEGFinSGC7901cellsundernormoxicconditions.Hoycinapplication,thoughitcanmediatedaulation.ConclusionChelationofcellularcalciummodulatesHIF1αexpressionandHIF1transcriptionalactivityinhumangastriccancercells

5、.Changesinintracellularfreecalciumconcentrationappearedtohaveacriticalroleinhypoxicsignaltransductioningastriccancercells.　　Key;HIF1;Proteinexpression;Transcriptionalactivity　　0引言　　近来发现[1]缺氧可使内皮细胞中的Ca2+明显增加，升高或降低细胞内Ca2+，可增加或降低缺氧诱导基因如血管内皮生长因子(vascularendothelialgroycin及βactin的单抗为Sigma

6、公司产品；HIF1α多抗为Santa公司产品；FuGENE6转染试剂购自Roche公司；双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自Promega公司；VEGF检测试剂盒购自上海森雄公司；pGL3SV40HRE质粒（在BamHⅠ位点插入2个拷贝的缺氧反应元件）为大阪大学医学院MayukoOsada教授惠赠。　　1.2方法　　1.2.1改变细胞内钙对HIF1α蛋白稳定的影响－BAPTAAM、1μMionomycin孵育0、2、4、8、12、24h，收获细胞。三去污裂解细胞制备总蛋白，Bradford法测定蛋白浓度；取100μg总蛋白上样，行SDSPAGE电泳，转膜，8%

7、脱脂奶粉封闭2h，加HIF1α多抗（稀释度1∶200）4℃孵育过夜，TBST漂洗10ｍin×3后，加二抗室温孵育2～3h，洗膜3次，ECL显影。　　1.2.2改变细胞内钙对HIF1α转位的影响－间接免疫荧光化学法胰酶消化并收获对数生长期的SGC7901细胞，传代于装有载玻片的无菌培养皿中，培养过夜；换无血清培养液，加入12.5μMBAPTA、1μMionomycin分别孵育0、2、4、8h后，PBS冲洗3次，95％乙醇固定，再次用PBS冲洗10min×3次后，加0.3%TritonX100室温10min，正常山羊血清37℃封闭10min，加HIF1α多抗