剪接因子srp55原核表达质粒的构建和表达

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1、剪接因子SRp55原核表达质粒的构建和表达【摘要】目的：本研究通过扩增剪接因子SR蛋白家族的SRp55基因，构建GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55，并在大肠杆菌中诱导表达并进行纯化。方法：用PCR法扩增SRp55基因，将扩增产物和载体pGEX-2T进行双酶切后回收，连接载体和目的片段，获得重组质粒。将重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。在大肠杆菌BL21（DE3）中通过IPTG进行诱导表达，然后用谷胱甘肽-琼脂糖球珠，亲和纯化得到纯的GST-SRp55融合蛋白。结果：SRp55基因以正确的阅读框架插入pGEX-2T。IPTG诱导大

2、肠杆菌BL21（DE3）表达，随诱导时间的增加蛋白表达量增高，4h以后接近最高表达量。通过亲和纯化得到分子量在60kD左右的蛋白，经蛋白印迹分析证实为GST-SRp55融合蛋白。结论：成功地构建了GST融合蛋白原核表达质粒pGEX-2T/SRp55，并获得GST-SRp55融合蛋白，为进一步研究tau蛋白可变剪接机制提供了必要的基础。【关键词】SRp55Tau原核表达剪接因子[Abstract]Objective:ToexpressandpurifyGlutathioneSTransferase(GST)-fusionproteinofSRp55,as

3、plicingfactor,inE.colicells.Methods:ThecDNAofSRp55plifiedbypolymerasechainreaction(PCR)andinsertedintopGEX-2TH1andEcoR1restrictionsites.TherebinantplasmidofpGEX-2T/SRp55edintoE.colicellstoexpressGST-SRp55.TheexpressedGST-SRp55intheE.colicellstheextractbyaffinitypurification.Thep

4、urityofGST-SRp55e.TheexpressionofGST-SRp55couldbeinducedbyaddingIsopropylβ-D-1-thiogalactopyranoside(IPTG)inatime-dependentmanner.TheexpressionlevelachievedthehighestafteraddingIPTGfor4hours.ThepurifiedGST-SRp55byglutathione(GSH)-agarosebeadsshoajorbandbycoomassiebluestaining,E.

5、colicells，ain）而得名[3]。SR蛋白通过它带有的1个或2个拷贝的RNA识别基序（RRM）与RNA结合，并决定各SR蛋白的底物特异性，因此RS结构域介导蛋白之间的相互作用[4]。Tau蛋白是存在于神经元中主要的微管相关蛋白，其功能是促进微管聚合和稳定微管结构。在正常人脑中，tau蛋白有6种变异体，而这6种变异体是由单一的基因编码通过不同的剪接而形成的。其中，外显子10的编码与否决定了tau蛋白含有4个或3个微管结合重复片断（4repeatsor3repeats,4R或3R）[5]。在正常人脑中，3R和4R的比例大约是1∶1，但在某些17号染

6、色体连锁性前额颞叶痴呆合并帕金森综合征(FTDP－17)的病人脑中，由于某些突变引起外显子10的编码，使得4R和3R的比例大于1[6]。而在某些神经退行性疾病中，由于tau基因第280位编码精氨酸的核苷酸缺失，只产生编码3R的tau蛋白，从而使得其结合微管的能力降低[7]。因此，tau蛋白的剪接正确与否与某些神经退行性疾病有关。在胚胎的人脑中，只有3R的存在，没有外显子10的编码[8]。基于胚胎和成年组织的DNA结构的同一性，造成胚胎和成年人脑tau蛋白表达不同显示反式作用因子在tau蛋白可变剪接中的重要调控作用。因此探讨和研究参与tau蛋白剪接的剪接

7、因子将有助于我们揭示tau蛋白的剪接机理，为某些神经退行性疾病的预防和治疗提供有价值的依据。SRp55是SR蛋白家族中的成员之一，已经发现它参与许多蛋白包括tau蛋白的剪接，它的功能受磷酸化调控。为了更好地研究SRp55，特别是SRp55蛋白磷酸化在tau蛋白剪接中作用的研究，我们构建了谷胱甘肽硫转移酶（GST）和SRp55融合的原核表达质粒，并在大肠杆菌中成功地诱导表达，分离纯化得到了GST-SRp55融合蛋白。这为以后我们对Tau可变剪接机制的研究提供了必要的基础。1材料和方法1.1材料（1）实验菌株和质粒：E.coli菌株BL21(DE3)由本实

8、验室保存，pGEX-2T为Amarsham公司产品，pCEP4-SRp55真核表达质粒由台湾中