大肠杆菌phea及tyra基因敲除菌之构建

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1、大肠杆菌pheA及tyrA基因敲除菌之构建第一章绪论本章介绍了必需氨基酸L-色氨酸的理化性质，对人体和动物生长发育和新陈代谢十分重要的生理生化功能，包括调节蛋白质合成、调节免疫能力等。因此，L-色氨酸在医药方面、食品工业以及动物饲料方面被广泛地应用。日益增加的需求量对L-色氨酸工业化生产有了更高的要求。随着基因工程、代谢工程的引入及发展，已有的L-色氨酸的生产方法中站主导地位的直接发酵法在工程菌的构建上都得了积极的发展。1.1色氨酸的理化性质及作用色氨酸(Tryptophan，Trp),又名α-氨基-β-吲哚丙酸，分子式为C11

2、H12N2O2，相对分子质量为204.21，分子结构见图1-1，是含有吲哚基的中性芳香族氨基酸[1-4]。在常温下为片状晶体，稍有苦味，熔点289℃；水中溶解度为11.4g/L，微溶于乙醇，不溶于氯仿、乙醚，在稀酸或稀碱中较稳定存在[3]。L-色氨酸对人和动物的生长发育及新陈代谢起着重要的作用，被称为第二必需氨基酸[1]，色氨酸的作用一方面表现在它可以直接影响人和动物的生长、代谢等生理生化过程，另一方面可以在人和动物体内代谢转化而成的烟酞胺、烟酸和5-羟色胺（5-HT）等,这些转化产物在体内发挥重要作用。1.1.1调节蛋白质合成1.1.1.1色氨酸作

3、为原料参与蛋白质合成作为必须氨基酸，L-色氨酸是蛋白质合成的重要原料之一[5]。研究表明，色氨酸在体内对肝核蛋白合成的促进作用与其在体内分配后与特殊核酸受体的结合能力有关[6]。Sidransky等证明L-色氨酸能在肝脏蛋白质合成中影响肝脏细胞RNA和蛋白质的代谢[6,7]。L-色氨酸在人体内的存在状态(游离或结合)是否正确与精神障碍、抗炎类风湿药物的作用机理、乳腺癌等恶性肿瘤以及肝昏迷等症状的发生有关[7]。1.1.1.2色氨酸对蛋白质合成的调节色氨酸的含量对蛋白质的合成率有直接影响，体内较高的色氨酸浓度会加快合成蛋白质的速度，反之，色氨酸缺乏时，

4、氨基酸的不平衡会导致蛋白质合成速度下降[7]。Herschel等发现色氨酸能够改变细胞核膜的渗透性，并可以增强核膜上与运输有关的酶的活性，同时加速mRNA从细胞核进入细胞质的过程，并使mRNA的寿命延长，从而促进了肝细胞的蛋白质合成[6]。1.1.1.3对免疫功能的影响研究表明，L-色氨酸具有体液免疫功能[8]。L-色氨酸有促进骨髓T淋巴细胞前体分化为成熟T淋巴细胞的作用，因此，L-色氨酸缺乏会导致体液免疫功能的降低；同时L-色氨酸的代谢产物褪黑色素对于体液免疫也具有积极促进作用[8]。第二章用Red重组法构建大肠杆菌pheA和tyrA基因敲除菌的研

5、究2.1前言在大肠杆菌芳香族氨基酸的合成途径中，与L-色氨酸分支途径形成竞争关系的的分支途径由pheA和tyrA基因作为该路径的关键调控基因（图2.1），因此，对上述两个基因进行敲除，构建高产L-色氨酸基因工程菌。本章主要介绍了利用Red同源重组系统进行大肠杆菌中pheA和tyrA基因的敲除。通过构建含有pheA上游、tyrA下游各100bp同源基因，和硫酸卡那霉素抗性基因（Kan）的载体并获得如图2-2片段，转入大肠杆菌K12中进行第一次同源重组，达到基因pheA和tyrA敲除的目的。YeastExtract、Tryptone购自Oxiod公司，琼

6、脂糖购自Promega公司，氨苄青霉素、硫酸卡那霉素，L-阿拉伯糖购自宝泰克生物技术公司，其余试剂为国产分析纯试剂。离心柱型琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自BioFlux公司，质粒小量快速提取试剂盒购自TIANGEN生物技术公司。限制性内切酶FastDigestNcoI、FastDigestBamHI、FastDigestEcoRI、FastDigestXbaI、FastDigestHindIII、FastDigestkpnI、FastDigestBamHI、FastDigestSalI、EXTaq、dNTP购自Fermentas公司；2Taqplus

7、PCRmastermix、T4DNALigase购自TIANGEN生物技术公司；核酸分子量标准MarkerDL2000、MarkerDL15000、DNAMarkerIII购自TIANGEN生物技术公司。LB培养基：10g/L胰蛋白胨（Tryptone），5g/L酵母提取物（YeastExtract），10g/L氯化钠（NaCI），各组分溶于蒸馏水后调整pH至7.0，120℃高温高压灭菌20min；LBS培养基配制：胰蛋白胨（Tryptone），5g/L酵母提取物（YeastExtract），10g/L氯化钠（NaCI），15g/L琼脂粉，各组分溶于

8、蒸馏水后，调整pH至7.0，121℃高温高压灭菌20min，待温度降到40-50℃时，加入相应抗生素溶液混匀