三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响论文

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1、三七总皂苷对骨髓间充质干细胞增殖和向心肌样细胞分化的影响论文【摘要】观察三七总皂苷（PNS）对大鼠骨髓间充质干细胞（MSCs）增殖和体外诱导其分化为心肌样细胞的作用。【方法】采用骨髓细胞体外培养技术分离大鼠MSCs，以流式细胞仪检测细胞表面标志；采用四甲基偶氨唑盐（MTT）法观察PNS对MSCs的增殖影响；采用第8代MSCs进行体外心肌细胞诱导分化；采用相差显微镜、免疫组化及逆转录含酶链反应（RTPCR）鉴定心肌细胞。【结果】大鼠MSCs细胞表面抗原CD44阳性，CD34阴性；经PNS作用后MSCs增长速度比空白对照组明显加快，体外诱导后细胞

2、形态发生变化，其细胞免疫组化呈结蛋白（Desmin）、肌钙蛋白(cTnI)阳性；RTPCR显示诱导后细胞转录肌球蛋白重链mRNA水平增加。【结论】PNS能促进大鼠MSCs体外增殖并可诱导MSCs分化为心肌样细胞，为细胞移植治疗心肌梗死提供了实验依据。【关键词】三七总皂苷/药现象骨髓间充质干细胞/病现象心肌梗死/中药疗法细胞培养心肌梗死后，如何促进心肌细胞的再生是心血管病学家面临的一个难题。人们一直试图寻找一种细胞移植材料以修复坏死心肌、改善心脏功能。近年来，干细胞的研究为人们提供了新的希望。骨髓间质干细胞（mesemchymalstemcel

3、ls,MSCs）是骨髓中除造血干细胞以外的另一类干细胞.freelodifiedDulberccosmedium）培养基购于Gibco公司；特级胎牛血清(FBS)购于Hyclone公司；5氮胞苷购于Sigma公司；PNS（批号：0870-200303）购于广州市药检所（纯度99％）；Percoll梯度分离液购于Pharmacia公司；荧光标记抗大鼠抗体CD34FITC、CD44FITC和小鼠抗人结蛋白抗体（Desmin）单抗、小鼠抗人肌钙蛋白I（cTnI）单抗购于SantaCruz公司；链霉亲含素-生物素复合物（SABC）试剂盒及二氨基

4、联苯胺（DAB）显色剂购于武汉博士德公司；Trizol为Gibco公司产品；聚合酶链反应（PCR）引物由上海申能博彩生物科技有限公司合成；AccessRTPCR试剂盒为Promega公司产品；倒置显微镜（日本，OLYMPUS）；CO2培养箱（美国力高公司）；流式细胞仪（美国BECKMANCOULTER）；PCR基因扩增仪（美国PE9600）。1.2方法1.2.1MSCs的分离与培养参照DM培养液冲出骨髓，用吸管吹打制成细胞悬液，并移入离心管中，1000r/min离心10min；弃上清及脂肪层，收集沉淀物用完全培养基（含IMDM、体积分数为1

5、0％FBS、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素）充分混匀，加入含1.073g/mL的Percoll分离液的离心管内，1500r/min离心20min；重复上一操作，收集中间云雾状的单核细胞层，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤后，用完全培养基接种于25mL培养瓶中，并标记为P"1，置37℃含体积分数5%CO2的孵箱中进行原代培养。在培养的第4天进行首次换液。在相差显微镜下观察细胞生长情况。1.2.2MSCs的传代及纯化参照Pittenger［3］的方法并加以改进：待原代培养的细胞增殖近整个培养瓶的底面时，用胰酶消化细胞后，用培养液中止消化并反复

6、吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液，按1：3传代培养，并标记为P2，以后每天观察细胞的生长情况，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传至第8代。1.2.3MSCs的鉴定取第3代MSCs，胰酶消化后，加入荧光标记的抗CD34、CD44抗体，4℃孵育30min，以多聚甲醛固定，采用FACScan流式细胞仪检查细胞表面抗原CD34和CD44。1.2.4PNS对MSCs增殖的影响取生长良好的第4代MSCs，胰酶消化后吹散，细胞计数后调整浓度至1×104/mL，加入96孔板，每孔200μL，37℃，体积分数5%CO2饱和湿度标准环境下以诱导培养液

7、孵育24h后，去培养液及未贴壁的细胞。实验组分别加入终浓度含PNS为50、100、150、250、400mg/L的诱导培养液各20μL，然后加上10%的胎牛血清培养液180μL，每组重复8孔，空白对照组仅为体积分数10%的胎牛血清培养液，每孔液量200μL。37℃，体积分数5%CO2饱和湿度下孵育1、3、5d后，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法［4］检测细胞增殖水平，用酶联免疫检测仪570nm波长处测光吸收值（D）。1.2.5骨髓MSCs的诱导分化将传至第8代的MSCs进行实验。实验分4组：①组PNS（浓度分别为50、100、150、250、40

8、0mg/L)，②组5aza组（浓度为10μmol/L），③PNS+5aza组（浓度分别为150mg/L、10μmol/L），3组都是诱导24h后改