抗果蝇trio蛋白抗体的制备及鉴定

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1、抗果蝇Trio蛋白抗体的制备及鉴定【摘要】目的：制备兔抗果蝇Trio蛋白的抗体。方法：以RTPCR扩增Trio的1173bp的基因片段并克隆入pET28a(＋)和pGEX4T1(His)6C表达载体中，表达并纯化TrioHis、TrioGST融合蛋白。用纯化的TrioHis融合蛋白免疫家兔产生抗Trio的抗体，用TrioGST亲和层析法进行纯化并采用ega公司，限制性内切酶、T4连接酶及高保真DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品；小量胶回收试剂盒为TaKaRa公司产品；His亲和层析柱购自Clontech公司，Br活化的抗体纯化亲和层析柱Sephar

2、ose4B为AmershamPharmarcia公司产品；a公司,HRP标记的羊抗兔IgG为Promega公司产品；雄性新西兰家兔体质量约2.5kg,购自本校实验动物中心。1.2方法〔3〕1.2.1目的基因的扩增从野生型黑腹果蝇幼虫中提取总RNA，并逆转录为cDNA进行PCR扩增。上游引物的序列为5＇GCGCGGATCCGCCAGCCCCGGCAAATGG3＇，下游引物的序列为5＇GCGCCTCGAGTTTGGTTGACAGGGGATTGG3＇（划线部分分别为BamHⅠ、XhoⅠ酶切位点）。PCR反应的参数为：94℃预变性3min；94℃变性30s，53℃

3、变性1min，72℃延伸1min，共34个循环;最后72℃延伸10min。获得Trio1173bp的基因片段。1.2.2重组质粒的构建与鉴定PCR产物分别经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳。割胶回收酶切片段，与经同样酶切的质粒pET28a(＋)和质粒pGEX4T1(His)6C于16℃连接过夜。以连接产物转化大肠杆菌DH5α，并涂布于含相应抗生素[质粒pET28a(＋)为卡那抗性,终质量浓度为25mg·L-1；质粒pGEX4T1(His)6C为氨苄抗性，终质量浓度为50mg·L-1]的固体培养基上，于37℃过夜培养。挑阳性菌落，提取质粒，进

4、行BamHⅠ、XhoⅠ酶切和测序鉴定，得到重组质粒pET28a(＋)-Trio和pGEX4T1(His)6CTrio。1.2.3目的蛋白的原核表达及纯化将经酶切和测序鉴定的重组质粒pET28a(＋)Trio和pGEX4T1(His)6CTrio分别转入大肠杆菌BL21（DE3）中，于37℃培养过夜。次日按1∶50接种至1L含卡那霉素（终质量浓度为25mg·L-1）的新鲜LB液体培养基中，于37℃振荡培养至细菌浓度的A600nm约为0.6，加IPTG至终浓度为0.1mmol·L-1，于37℃诱导表达3h，离心收集菌体。菌体用1×PBS(pH7.4)重悬

5、，经超声裂解后，以10000r·min-1离心10min收集上清和沉淀。经SDSPAGE分析表明，表达的目的蛋白主要位于包涵体内。用缓冲液A(8mol·L-1尿素、100mmol·L-1NaH2PO4、10mmol·L-1TrisHCl，pH8.0)溶解包涵体，取上清于Ni2+NTA树脂层析柱中;用缓冲液B(8mol·L-1尿素、100mmol·L-1NaH2PO4、10mmol·L-1TrisHCl，pH6.3)洗柱，直至A280nm0.01;用缓冲液C(8mol·L-1尿素、100mmol·L-1NaH2PO4、10mmol·L-1TrisHCl，p

6、H4.5)洗脱目的蛋白。收集的目的蛋白用SDSPAGE进行分析。1.2.4动物免疫及抗血清的制备〔4〕将纯化的TrioHis融合蛋白用BCA蛋白定量试剂盒进行定量后免疫家兔2只，每只每次融和蛋白的用量为200μg。初次免疫用完全弗氏佐剂乳化蛋白,皮下多点注射，2周后加强免疫，用不完全弗氏佐剂乳化蛋白。以后每间隔2周加强免疫1次,共加强免疫3次。经心脏取血,并分离血清，加0.2g·L-1叠氮钠后于-70℃保存备用。1.2.5抗体的纯化将纯化的GSTTrio融合蛋白分别与Br活化的Sepherase4B层析柱结合，制备亲和层析柱(按Sigma公司操作手册)。将免

7、疫血清加于该层析柱中于4℃结合过夜。次日依次用1×PBS(pH7.4)、1×PBS(含2mol·L-1NaCl,pH7.4)、1×PBS(pH4.5)洗涤杂蛋白，最后用0.1mol·L-1甘氨酸溶液(pH2.8)进行洗脱。将洗脱液与1mol·L-1TrisHCl(pH9.5)溶液按20∶1的比例混合,加入1g·L-1NaN3,于4℃保存备用。1.2.6抗Trio抗体特异性的in后，取10μl进行SDSPAGE(分离胶浓度为12.5%)分离（稳流250mA电泳1.5h）并转移至PVDF膜上。在含有200ml·L-1T/A280nm=1.92。经琼脂糖凝胶电泳显示

8、，出现28