耐酸耐热菌库克的检测方法

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1、耐酸耐热菌（库克）的检测方法1适用范围本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。2仪器和试剂2.1恒温水浴：80±1℃。2.2恒温培养箱：40±1℃。2.3灭菌培养皿：直径为90mm。2.4灭菌试管：18×180mm。2.5滤膜：0.45um水系一次性滤膜。2.6酵母粉。2.7蛋白胨。2.8琼脂粉。2.9葡萄糖。2.10吐温80。2.1112.5%苹果酸。2.12灭菌蒸馏水。2.13K氏培养基平板：在1000ml的三角瓶中放入500ml蒸馏水，加入1.25g酵母粉、2.50g蛋白胨、6.50g琼脂粉、0.5g葡萄糖和

2、0.5ml吐温80，使其溶解，轻轻盖上三角瓶的盖子，在121℃灭菌25分钟；在一个小烧杯中加入10ml蒸馏水和1.25克的苹果酸，搅拌直至溶解，将苹果酸的水溶液用0.45um的滤膜过滤，将处理过的苹果酸水溶液加入到灭菌的K氏培养基中，搅拌均匀，使其pH值达到3.7±0.1。当冷却到大约50℃时，将K氏培养基倾注到培养皿中，凝固后在0-5℃的冰箱中储存，有效期60天，并记录配制日期。3操作步骤3.1样品处理3.1.1浓缩清汁：打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作，取10ml浓缩清汁于15ml灭菌的试管中，再移取10ml浓缩清汁

3、于另一带有温度计的15mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中，当温度达到80±1℃，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，用90-100ml的灭菌蒸馏水将热处理过的样品转入灭菌容器中，摇匀。将稀释后的样品溶液用0.45um的滤膜真空过滤。3.1.2清汁、水：打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作，取150ml清汁（或水）于已灭过菌的玻璃样品瓶中，再移取150ml清汁（或水）于另一带有温度计的玻璃样品瓶中，作为温度控制用，盖上样品瓶的盖子。将上述样品试管和温度控制

4、试管放在水浴锅中，当温度达到80±1℃，开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。将热处理过的样品冷却至室温，用0.45um的滤膜真空过滤。3.1.3浊汁：打开水浴锅，调整温度到80±1℃。以无菌操作,取20ml浊汁于已灭过菌的试管中,再移取20ml浊汁于另一带有温度计的20mL的试管中，作为温度控制用，盖上样品试管的盖子。将上述样品试管和温度控制试管放在水浴锅中,当温度达到80±1℃时,开始计时，维持13分钟（用计时器计时）。冷却至室温，将热处理的样品用0.45um的滤膜真空过滤。3.2培养及计数取掉过滤器的上部装置，用灭菌的镊子，

5、将过滤膜从过滤器上取下放在K氏培养基上，轻敲数次，以保证滤膜与培养基接触。倒置于40-41℃恒温培养箱中，在恒温培养箱底部放置一个有水的盘子，以调整恒温培养箱的湿度，培养5天。培养结束后，记录该培养温度下滤膜上的菌落数。根据对样品的污染情况，可选择稀释度。用灭菌吸管吸取25ml样品，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：10的稀释度；用灭菌吸管吸取1：10的稀释液25ml，加入到225ml灭菌蒸馏水中，做成1：100的稀释度，稀释后的样品的检测方法同上。培养结束后，记录滤膜上的菌落数，并按相应的稀释度进行计算。4数据处理结果报告10

6、ml的浓缩清汁样品中含有的菌落数,报告单位为cfu/10ml。结果报告150ml的清汁（或水）样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/150ml。结果报告20ml的浊汁样品中含有的菌落数，报告单位为cfu/20ml。参考资料：库克实验室耐热耐酸菌的检测方法。NDM耐酸耐热菌检验1适用范围本方法适用于清汁、浊汁、水和浓缩果汁中的耐酸耐热菌的检测。2仪器和试剂2.1恒温水浴锅：70±1℃2.2恒温培养箱：45±1℃。2.3灭菌培养皿：直径为90mm。2.4滤膜：0.45um水系一次性滤膜。2.5灭菌三角瓶：500ml。2.6灭菌蒸馏水。2

7、.7YSG培养基的配制：A组：酵母粉（MERCK）：2.0g葡萄糖：1.0g可溶性淀粉(MERCK)：2.0g蒸馏水：500ml把A组用1-2N硫酸或盐酸调至PH为3.7±0.1；B组：琼脂（MERCK）：15.0g蒸馏水：500ml把A组和B组分别在121℃15分钟条件下灭菌，冷却至50—60℃，把两者混合。3操作步骤3.1取样品50ml于一个无菌瓶中，另取同样品同体积于一个相同的瓶中做温度控制用，在温度控制瓶中插入温度计。3.2把两个瓶都放入到70℃的水浴中。(水浴锅中的水面应高于瓶中的样品)，当温度控制瓶中的温度计达到70℃时

8、，开始计时20分钟。3.320分钟后，迅速将样品放入冰浴。3.4将经过热处理的样品加灭菌水稀释，稀释倍数约10倍左右。用真空泵将此样品全部通过0.45µm的滤膜。用灭菌蒸馏水冲洗这个瓶子和过滤器。确信这张膜被真空抽干。将这张滤膜放到Y