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《线粒体脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作综合征有基底节钙化者线粒体dna突变情况观察》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
1、线粒体脑肌病伴高乳酸血症及卒中样发作综合征有基底节钙化者线粒体DNA突变情况观察[摘要] 目的通过对脑CT示基底节钙化的线粒体脑肌病伴高乳酸血症和卒中样发作综合征(MELAS)患者的线粒体DNA(mitoehondrialDNA,mtDNA)突变进行研究,验证大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243,探讨基底节钙化是否可作为线粒体病的筛选诊断指标。方法应用聚合酶链反应一限制性片断长度多态性(PCR―RFLP)方法对20例MEIAS综合征患者肌肉或外周血mtDNA的A3243G点突变进行检测,并将PCR产物进行DNA序列分析。结果经AP
2、aI酶切13例检测到A3243G点突变。侧序共14例检测到A3243G点突变。20例均无T3271C点突变。结论大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243;基底节钙化与mtDNA异常关系密切,年轻患者的基底节钙化可作为线粒体病的筛选诊断指标。[关键词]线粒体脑肌病;高乳酸血症;卒中样发作综合征;基底节钙化;DNA[中图分类号]R743 [文献标识码]B [文章编号]1672-4208(2010)21-0066-039MELAS是线粒体病中一个常见的综合征,其临床特征有突发性偏瘫、头痛、恶心,同时可伴有身材矮小、智力低下、神经性耳聋等。颅
3、脑CT可见双侧基底节钙化,约占30%～70%(主要在苍白球占30%～80%),还可有脑梗死(其病灶范围与主要脑血管分布不一致)、脑室扩大、脑萎缩等。目前已知线粒体脑肌病是由线粒体DNA突变引起。为验证大部分MELAS综合征患者mtDNA突变位点在3243,进一步探索基底节钙化与mtDNA异常的关系,并探讨基底节钙化是否可作为线粒体病的筛选指标,笔者收集了20例有基底节钙化的MELAS综合征患者,并对这些患者的mtDNA片段进行检测,现报道如下。1 资料与方法1.1 临床资料收集1999-2004年就诊于齐鲁医院神经内科有基底节钙化的MELAS综合征
4、患者20例,其中男7例,女13例;年龄10～70岁,19例在40岁前发病,仅1例大于60岁,4例有家族史,2对为母子关系。20例中均有基底节钙化,肌肉病理均有不整边红纤维,电镜下可观察到异常线粒体。确诊为MELAS综合征。1.2 实验方法1.2.1 基因组DNA的提取用常规酚/氯仿法提取肌肉组织DNA,蛋白酶K-盐析法提取外周血DNA。1.2.2PCR的条件及检测方法 (1)引物设计:扩增A3243G的引物:上游引物:(5’-3’)3116~3135:CCTCCCTGTACGAAAGGACA;下游引物:(5’9-3’)3609―3590:GCCTA
5、GGGTIGAGGTrGACCA。扩增T3271C的引物:上游引物:同A3243G的上游引物。下游引物:(5’～3’)3301―3272:AATIECAGqL3ECAAGTrA-AGGAGAAGAAT;(2)PCR体系:10×Buffer(withMg2mmol/L)10ul,模板DNA2ul,MixeddNTP(400ul01)4ul,上游引物(400pmol/L)4ul,下游引物(400pmol/L)4ul,Taq酶(5U/100ul)1ul,其余体积用双蒸水补齐,PCR体系总体积100ul。(3)PCR循环:扩增:94度预变性3min,94%
6、变性1min,56度退火1min,72度延伸1min,共30个循环,最后1个循环72度延伸10min。(4)电泳:验证PCR产物。(5)PCR产物的纯化。(6)限制性片段长度多态性电泳上样缓冲液(Loadingbuffer)与10ul已酶切的PCR产物混匀,加入凝胶的上样孔中,同时在一上样孔加入5ul的DLl000DNAmarker。于1xTAE环境、100v电压,电泳60min。电泳完毕,将凝胶置于AlphaImag-erTM2200型凝胶成像仪中显像,并将图像存入计算机。另一部分PCR纯化产物送上海生工生物技术有限服务公司测序,以验证PCR/R
7、FLP结果。2 结果2.1 限制性内切酶酶切结果经APaI酶切13例检测到A3243G点突变,其余7例未检测到A3243G点突变,检测到突变的13例中4例为母子关系,20例均未检测到T3271C点突变。92.2 侧序结果共14例检测到A3243G点突变,其中13例PCR/RFLP酶切显示有A3243G点突变者,测序均检测到A3243G点突变;l例酶切未显示A3243G点突变而测序检测到此点突变者,同时有C3524G、C3527T碱基置换。20例均无T3271C点突变,但有C3524G碱基置换者3例,有A3537G的碱基置换者1例,有C3527T碱基
8、置换者5例,有C3527A碱基置换者1例,有C3527G碱基置换者2例,C3497A碱基置换者4例。3 讨论线粒体病是由于
