稳定表达bcl┐2蛋白的肝细胞癌细胞株的建立与鉴定

《稳定表达bcl┐2蛋白的肝细胞癌细胞株的建立与鉴定》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。

1、稳定表达Bcl┐2蛋白的肝细胞癌细胞株的建立与鉴定　　摘要:目的为了探讨抗凋亡基因bcl-2在肝细胞癌（简称肝癌）细胞凋亡过程中的调节功能及其作用机制，建立稳定表达Bcl-2蛋白的肝癌细胞株.方法提取含有人bcl-2基因的逆转录病毒真核表达载体pDOR-SB质粒，用限制性内切酶EcoRⅠ（酶切后经琼脂糖凝胶电泳鉴定.用脂质体介导的基因转染法分别将pDOR-SB和pDOR质粒导入不表达Bcl-2蛋白的人肝癌细胞系HCC-9204细胞中，通过G-418筛选获得转入目的基因的阳性细胞克隆.免疫细胞化学法检测Bcl-2蛋白的表达情况.经多次用有限稀释法连续克隆化直至获得100%稳定

2、表达Bcl-2蛋白的肝癌细胞株.结果琼脂糖凝胶电泳可见1.9kb的bcl-2基因片断.免疫细胞化学检测表明转染了pDOR-SB的HCC-9204细胞大部分有Bcl-2蛋白的表达，而转染了pDOR空载体或未转染的HCC-9204细胞均未见Bcl-2蛋白表达.经过连续3次克隆化后转染pDOR-SB的HCC-9204细胞100%表达Bcl-2蛋白.结论成功地获得了稳定表达Bcl-2蛋白的肝癌细胞株，命名为HCC-bcl2.　　Keya，hepatocellular;transfec-tion;geneexpression　　Abstract:AIMAhepatocellularc

3、arcinoma（HCC）cellstrainechanismofanti-apoptosisgenebcl-2intheapoptoticprocessofHCC.METHODSTheretroviruseukaryoticexpressionvectorpDOR-SBcontaininghumanbcl-2geneptyvectorpDORanHCCcelllineHCC-9204cells，e-mediatedgenetransfectionmethod.Thecellclonesintomunocytochemicalmethod.ThepDOR-SB-tranfe

4、ctedcellsescontinuallybylim-iteddilutionmethoduntilanHCCcellstrainthatcanexpressBcl-2proteinata100%positiverateonstrateda1.9-kbbcl-2genefragmentafterpDOR-SBbeingcutmunocytochemicaldetectionindicatedthatBcl-2pro-teinostofthepDOR-SB-transfectedcells，butthereescontinually.CON-CLUSIONHCCcellst

5、rainthatcanexpressBcl-2proteinstablyhasbeenestablishedsuccessfully，anditisnamedasHCC-bcl2.　　0引言　　Bcl-2是最早在B细胞淋巴瘤中发现的一个抗凋亡基因.许多研究表明，bcl-2能够抑制多种因素诱导的多种细胞的凋亡［1］.虽然Bcl-2在许多肿瘤中呈异常的高表达，但是原发性肝细胞癌（以下简称肝癌）只能低表达或不表达Bcl-2［2-6］.目前关于bcl-2基因与肝癌细胞凋亡关系的报道较少，对于bcl-2基因在肝癌细胞凋亡过程中是否具有调节作用尚不明确.我们用基因转染技术把bcl-2基

6、因转入不表达Bcl-2蛋白的肝癌细胞系HCC-9204细胞中，建立稳定表达Bcl-2蛋白的肝癌细胞株，为进一步进行bcl-2基因在肝癌细胞凋亡过程中作用的研究奠定基础.　　1材料和方法　　1.1材料　　插有正向bcl-2cDNA（1.9kb）的pDOR-SB逆转录病毒真核表达载体为本校生物化学教研室朱峰博士惠赠.大肠杆菌菌株HB101为本校生物化学教研室惠宏襄博士惠赠.人肝癌细胞系HCC-9204为本室建立，用含100mL・L-1新生牛血清的RPMI1640培养液在50mL・L-1CO2条件下培养.INE转染试剂盒和G-418为美国Gibco公司

7、产品.鼠抗人Bcl-2单克隆抗体（mAb）为美国Oncogene公司产品.免疫组化ABC试剂盒为美国Vector公司产品.1.2方法　　1.2.1pDOR-SB载体的鉴定及pDOR空载体的获得　　提取pDOR-SB质粒，经EcoRⅠ酶切后，8g・L-1琼脂糖凝胶电泳鉴定.回收并纯化6.5kb的基因片断，经T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌HB101.　　1.2.2基因转染和细胞克隆筛选　　用脂质体载体LipofectAMINE将pDOR-SB质粒转染HCC-9204细胞，同时设pDOR空载体转染对照和